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Dokumentenidentifikation DE3743903C2 23.08.1990
Titel Verfahren zur Bestimmung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern im menschlichen Blut und Verwendung einer entsprechenden diagnostischen Ausrüstung
Anmelder Eniricerche S.p.A., Mailand/Milano, IT
Erfinder Nuzzolo, Carlo Antonio, Rom/Roma, IT;
Bernardi, Adriano, Monterotondo, Rom/Roma, IT;
Pessi, Antonello, Rom/Roma, IT;
Verdini, Antonio Silvio, Monterotondo, Rom/Roma, IT
Vertreter Zumstein, F., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Klingseisen, F., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 8000 München
DE-Anmeldedatum 23.12.1987
DE-Aktenzeichen 3743903
Offenlegungstag 07.07.1988
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 23.08.1990
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.08.1990
IPC-Hauptklasse G01N 33/569
IPC-Nebenklasse G01N 33/535   G01N 33/543   C07K 7/10   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue immunoenzymatische Methode zur Diagnose von Malaria im menschlichen Blut auf der Basis eines Verfahrens zur Bestimmung und zur Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Derivaten, sowie die Verwendung einer entsprechenden diagnostischen Ausrüstung zu diesem Zweck.

Malaria stellt eine der schwersten parasitären Erkrankungen dar und befällt jedes Jahr Hunderte von Millionen von Menschen, vor allem in den tropischen Regionen von Asien, Afrika und Amerika, und verursacht dabei eine hohe Kindersterblichkeit.

Die Ursache der Malaria ist ein Protozoon, das zum Genus Plasmodium gehört, das auf den Menschen durch den Stich der Anophelesmücke übertragen wird.

Unter den Hunderten von Species von Plasmodium, die in der Natur existieren, sind nur vier für den Menschen pathogen: Plasmodium ovale, Plasmodium maleriae, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum.

Dieses letztere stellt insbesondere die am meisten verbreitete Species dar und verursacht die meiste Erkrankungshäufigkeit und Mortalität im Zusammenhang mit Malaria.

Die Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern im Blut von Individuen, die verdächtig sind, malariainfiziert zu sein, stellt einen wesentlichen klinischen Parameter für die Diagnose von Malaria dar und die Auswertung der Wirksamkeit einer Antimalaria-Vakzine.

Im allgemeinen wird die Diagnose von Malariainfektionen mittels der Blutprüfung unter dem Mikroskop oder durch immunologische Methoden durchgeführt, die auf Messungen der Fluoreszenz (IFA), der Radioaktivität (IRMA) und der enzymatischen Aktivität (EIA) basieren.

Die mikroskopische Analyse des Blutes ist jedoch schwierig und für eine epidemiologische Untersuchung, wo hunderte oder tausende Proben geprüft werden, ungeeignet.

Ein nicht sehr geeignetes Ergebnis liefern weiterhin die immunologischen Methoden IRMA und IFA, die, abgesehen davon, daß sie lange Arbeitszeiten benötigen, durch viele Schritte, die sie erfordern, kompliziert sind und durch die Verwendung von Substanzen, die instabil und für den Menschen schädlich sind.

Unter den EIA-immunoenzymatischen Methoden ist die üblicherweise verwendete der ELISA (Enzyme-Linked-Immuno- Sorbent-Assay)-Test, der umfaßt:

  • (a) Fixieren durch Absorption oder durch kovalente chemische Bindung eines natürlichen oder synthetischen Antigens auf einen festen Träger;
  • (b) Blockieren der restlichen Stellen auf dem Träger mit einem geeigneten Protein;
  • (c) Inkubieren des an den Träger gebundenden Antigens mit dem zu untersuchenden Serum, und
  • (d) aufeinanderfolgende Zugabe eines Anti-Human- Immunoglobulin-Antikörpers, gebunden an ein Detektorenzym, und eines farblosen Substrats für das Enzym, das im Falle einer positiven Reaktion des Serums ein gefärbtes Produkt ergibt.


Dieser Test erfordert jedoch, obzwar er es ermöglicht, einige der Nachteile der IRMA- und IFA-Methoden zu überwinden, durch Verwendung stabiler und nicht-radioaktiver Substanzen, lange Arbeitszeiten (etwa 6 Stunden) und die Verwendung von Reaktanten, wie Anti-Immunoglobolin- Antikörper-Enzym, das nur mittels komplexer und kostspieliger Methoden erhalten werden kann.

Somit existiert das Bedürfnis in der Fachwelt für eine rasche, preiswerte und empfindliche diagnostische Methode, die für Massenuntersuchungen in Gegenden, wo Malaria endemisch ist, oder in Gegenden, wo eine genaue Kontrolle durchgeführt werden muß, um infektiöse Herde zu lokalisieren und diesen vorzubeugen, nützlich ist.

Diesem Bedürfnis wird gemäß der vorliegenden Erfindung nach einer neuen immunoenzymatischen Methode nachgekommen, welche mit einem synthetischen Antigen-Enzym-Konjugat arbeitet, das fähig ist, mit den Antisporoit- bzw. Antisporozoitantikörpern einen stabilen Antikörper-Antigen- Enzym-Komplex zu bilden und mit den Proteinen, welche gleichfalls den Antisporozoitantikörper dieses Komplexes binden.

Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine immunoenzymatische Methode zum Nachweis und zur Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Abkömmlingen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung und Messung von Anti-P. falcimparumsporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Derivaten durch enzymimmunologische Bestimmung und Messung ist dadurch gekennzeichnet, daß

  • (a) diese Proben mit einem synthetischen Antigen- Enzym-Konjugat, das mit den in der Probe vorhandenen Antisporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper-synthetisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden vermag, ohne die enzymatische Aktivität zu entaktivieren, inkubiert werden;
  • (b) der Antikörper dieses Komplexes an ein auf einem festen Träger adsorbiertes oder daran chemisch gebundenes Protein, welches seinerseits in der Lage ist, menschliche Immunglobuline zu binden, gebunden wird, und schließlich
  • (c) die enzymatische Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes bestimmt wird durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im Falle eines positiven Ergebnisses ein gefärbtes Produkt zu liefern vermag.


Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieses synthetischen Antigen-Detektorenzym- Konjugats zur Herstellung einer Ausrüstung für die Diagnose von Malaria.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin die Verwendung einer diagnostischen Ausrüstung, bestehend aus einem synthetischen Antigen-Enzym-Konjugat, wie vorstehend unter a) definiert und Proteinen, wie vorstehend unter b) für das erfindungsgemäße Verfahren definiert, für die Bestimmung und Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern.

Die Erfindung wird aus der Lektüre der folgenden Beschreibung und den Beispielen noch weiter ersichtlich.

Aus der EP 2 09 643 A2 ist bereits ein synthetisches mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch reagierendes Antigen bekannt. Das dort angegebene (besonders Spalte 10, Beispiel 4) Nachweisverfahren ist jedoch anders als das erfindungsgemäße Verfahren. Weiterhin sind aus DE-PS 24 30 357 Proteine bekannt, die mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen eine Bindung eingehen, wenn deren Fab-Teil an ein Antigen gebunden ist. Jedoch trägt dieses Protein zusätzlich die markierende Gruppe, während gemäß vorliegender Erfindung die Markierung mit dem Antigen verbunden ist und das nachzuweisende Immunglobulin an einen festen Träger adsorbiert oder gebunden ist.

Das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat, das für die erfindungsgemäße Methode geeignet ist, wird durch eine Polypeptid-Sequenz gebildet, die in der Lage ist, die Antisporozoit-Antikörper zu erkennen und zu binden, und durch ein Enzym gebildet.

Insbesondere ist gemäß der vorliegenden Erfindung das Sequenz-Polypeptid bzw. die Polypeptid-Sequenz (Asn-Ala- Asn-Pro)n, worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40, vorzugsweise von 10 bis 20, hat, und exakt das polypeptidische Segment des natürlichen Circumsporozoit-Proteins bzw. Circumsporozoitoize-Proteins der Membran des Sporozoits von P.falciparum reproduziert.

Die Anwesenheit von nur zwei endständigen, funktionalen, chemischen Gruppen, NH2 und COOH, in diesem Polypeptid macht es besonders geeignet für die Herstellung des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung, da es ermöglicht, daß eine stabile, kovalente Bindung zwischen dem Polypeptid und dem Enzym gebildet wird, ohne der katalytischen Aktivität desselben Enzyms schädlich zu sein.

Dieses Polypeptid wird in reiner Form und in hoher Ausbeute nach dem Verfahren, wie es in der europäischen Patentanmeldung 2 09 643 beschrieben ist, mittels Polymerisation des HCl.H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP-Polypeptids in einem inerten, polaren Lösungsmittel in Anwesenheit einer tertiären organischen Base hergestellt.

Enzyme, die für die Herstellung des Konjugats der vorliegenden Erfindung nützlich sind, werden unter solchen ausgewählt, die auf einem chromogenen Substrat zu wirken in der Lage sind. Beispiele solcher Enzyme sind Peroxidase, α-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Vorzugsweise wird Peroxidase verwendet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat hergestellt mittels eines Verfahrens, das umfaßt:

  • 1. Oxidieren des gereinigten Enzyms in einer 0,1 M Lösung von NaHCO3, wie z. B. Natriummetaperjodat, bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln während etwa 2 Stunden;
  • 2. Zugabe des Polypeptids, gelöst in NaHCO3 (pH 9,2) zu dieser Lösung in einem Polypeptid/Enzym-Molverhältnis von etwa 40/1 und Halten der entstandenen Lösung durch Stehen bei Raumtemperatur im Dunkeln während etwa 16 Stunden;
  • 3. Zugabe eines reduzierten Mittels zu dieser Lösung, wie z. B. NaBH4, und schließlich
  • 4. Abtrennen des Polypeptid-Enzym-Konjugats.


Insbesondere wird gemäß einer praktischen Durchführungsform der vorliegenden Erfindung ein Konjugat hergestellt, worin das Polypeptid (Asn-Ala-Asn-Pro)17 und das Enzym Peroxidase ist. Der Kojugationsgrad, d. h. das Molverhältnis von Polypeptid zu Enzym in diesem Konjugat ist 0,9-0,92, nahe bei dem erwarteten Wert (1) für das reine Konjugat.

Die spezifische Aktivität der Peroxidase, bestimmt durch Spektrophotometrie bei 405 nm, wie von H. Galloti (1979), J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 1-7, berichtet, ist 75% derjenigen des nichtkonjugierten Enzyms.

Gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung wird dieses Konjugat in einer Pufferlösung während etwa 20 bis 30 Minuten mit einer Probe von ganzem menschlichen Blut, Humanserum oder Humanplasma inkubiert.

Das Reaktionsgemisch wird dann weitere 20 bis 30 Minuten auf einem festen Träger inkubiert, auf dem das A-Protein adsorbiert und/oder kovalent gebunden ist.

Von diesem Protein ist bekannt, daß es leicht die menschlichen Immunoglobuline, ausgenommen IgM und IgG3, bindet und daher mit dem Antisporozoit-Antikörper, der an das Antigen-Enzym-Konjugat gebunden ist, einen stabilen Komplex bildet.

Feste Träger, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, sind Polysaccharid-Materialien, wie Cellulose und Agarose, sowie Kunststoff-Materialien.

Am Ende der Reaktion und nach geeigneten Waschungen wird zu den Mischungen eine Lösung gegeben, welche das chromogene, enzymatische Substrat und H2O2 enthält, und nach 2 bis 3 Minuten wird die Entwicklung von Farbe beobachtet.

In dem Fall, wo das gesamte Blut analysiert wird, wird die Ausgangsmischung vor der Zugabe zu dem A-Protein zentrifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen.

Der Threshold-Wert, d. h. die minimale Menge an positivem Serum, welche eine Farbentwicklung, die mit dem bloßen Auge sichtbar ist, erzeugt, war 0,1 µl bzw. 0,4 µl für zwei untersuchte Seren.

Weiterhin wird keine Farbentwicklung beobachtet für die Leerprobe, welche aus einem Gemisch, das das Konjugat ohne die Probe von Blut und/oder seinen Derivaten enthält, besteht, für Serum und Plasma von gesunden Personen, für nicht-malariainfiziertes Gesamtblut, entweder haemolysiert oder nicht, und für γ-Globuline (Globuman- Bern).

Dies zeigt eine vollständige Abwesenheit von Überschneidungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an.

Die Möglichkeit eines raschen Durchlaufs, etwa 60 Minuten, verglichen mit den 6 Stunden, die für den ELISA- Test erforderlich sind, und die Verwendung einer kleinen Anzahl von Reaktanten, d. h. nur das Antigen-Enzym und die Proteine, stellen einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.

Ein beträchtlicher Vorteil dieser Methode besteht weiterhin in der Möglichkeit, die Antisporozoit-Antikörper im Gesamtblut bestimmen und messen zu können. Dies ist verursacht durch die hohe Stabilität des Konjugats der vorliegenden Erfindung, verglichen mit den im Blut enthaltenen Proteasen.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren absolut spezifisch, und tatsächlich bestätigten alle Proben, welche nach dem IRMA-, IFA- und ELISA-Tests als positiv befunden wurden, bei der Analyse mit der erfindungsgemäßen Methode die Positivität.

Infolgedessen ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet für eine epidemiologische Studie von Malaria und insbesondere für Massenprüfungen von Malariainfektion in Gegenden, in denen sanitäre Einheiten und Strukturen fehlen.

Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Herstellung von (Asn-Ala-Asn-Pro)17-Peroxidase-Konjugat

Peroxidase-Enzym (Sigma) wurde gereinigt und gefriergetrocknet, bevor es mit dem Peptid konjugiert wurde.

10 mg reines Enzym (E) wurde dann in 1 ml 0,1 M NaHCO3 gelöst und 2 h mit 1 ml 16 mM NaJO4 (Natriummetaperjodat) bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln oxidiert.

Am Ende dieses Zeitraums wurde zu dem Reaktionsgemisch 1 ml NaHCO3 (pH 9,2) enthaltend 70 mg (Asn-Ala-Asn- Pro)17-Peptid (P) in einem Molverhältnis von Peptid/ Enzym gleich 40/1, zugesetzt.

Die so erhaltene Mischung wurde quantitativ in das Innere einer Pasteur-Pipette überführt, die am Ende mit Glaswolle verschlossen wurde, und dazu gab man 500 mg Sephadex(R) G-25 (Pharmacia Uppsala)-Pulver. Die Pipette wurde dann weitere 16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln stehengelassen.

Zu dem Reaktionsgemisch, das aus der Pipette eluiert wurde, wurden 150 µl 0,1 mM NaOH, enthaltend 5 mg/ml NaBH4, zugesetzt und 30 min später wurden dazu 450 µl der gleichen Lösung gegeben.

Nach etwa 1 h wurde das Gemisch, welches das Enzym- Peptid-Konjugat (E-P) und das nichtreagierte Peptid (P) und Enzym (E) enthielt, mit 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, in einer Säule von Sephadex G-10, die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, ins Gleichgewicht gebracht (äquilibriert). Das Gemisch wurde dann auf eine Säule (0,9 × 10 cm) von Carboxymethylcellulose (CM- Cellulose), äquilibriert mit 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, gegeben und mit 65 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, eluiert und auf Sephadex G10-Säule, äquilibriert mit destilliertem Wasser, entsalzt. Das die E-P-Verbindung enthaltende Eluat und das nichtreagierte Enzym wurden gefriergetrocknet.

Das nichtreagierte Peptid wurde zuvor mit dem eingeführten Puffer eluiert und seine Unversehrtheit wurde durch IR-Spektroskopie analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigten das gleiche Spektrum für das eluierte Peptid und für das als Rohmaterial verwendete Peptid. So war es möglich, zu schließen, daß keine Veränderungen in dem Peptid während der Konjugationsreaktion aufgetreten waren und daß das an das Enzym gebundene Peptid unbeschädigt war.

Der Grad der E-P-Konjugation, d. h. das Molverhältnis von Peptid zu Enzym in dem Konjugat, wurde bestimmt, indem die Erhöhung an Asn, Ala und Pro-Aminosäureresten in dem E-P + freies E enthaltenden Gemisch im Verhältnis zu dem Ausgangsenzym E berechnet wurde.

Die Analyse der Aminosäuren wurde nach saurer Hydrolyse von E-P + E und mit 6 N HCl bei 100°C während 24 h innerhalb verschlossener Ampullen mittels eines automatischen Beckman-Aminosäureanalysators durchgeführt.

In Anbetracht der Tatsache, daß die Aminosäurezusammensetzung der beiden peroxidasischen Isoenzyme (B und C), die in dem Ausgangs-E vorliegen, bekannt ist (L. M. Shannan et. al., 1966, J. Biol. Chem. 241, 2 166), war es möglich, für ein E : P-Molverhältnis von 1, entsprechend dem reinen E-P-Konjugat, eine theoretische Erhöhung an Asp, Ala und Pro von 63% bzw. 68% bzw. 100% zu berechnen.

Für die obenerwähnten Aminosäuren wurden Zunahmen von 58%, 62% und 90% gefunden,was einem E : P-Molverhältnis von 0,90-0,92 entspricht, annähernd äquivalent dem errechneten Verhältnis für das reine Konjugat.

Die spezifische Restaktivität des an das Peptid gebundenen Peroxidase-Enzyms, bestimmt durch Spektrophotometrie bei 405 nm mit 1,7 nM ABTS [2,2&min;-Azino-di-(3-ethylbentothiazolyl-sulfonsäure)] und 0,83 mM H2O2 in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 1-7, 1979), war etwa gleich 75% derjenigen des Ausgangsenzyms.

Beispiel 2

Für diesen Test wurden 8 malariainfizierte Seren, das heparinisierte Plasma von 4 gesunden Spendern, das Serum von 3 gesunden Personen und eine Probe von malariainfiziertem Gesamtblut verwendet, indem in einem Volumenverhältnis 1 : 1 das malariainfizierte Serum mit dem hämolysierten und nicht-hämolysierten Gesamtblut einer gesunden Person vermischt wurde.

Zu 100 µl von 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20 (PBS-T) und 200 ng E-P-Konjugat, wurden zugesetzt: 1 bis 5 µl Blut oder Plasma oder Serum von geunden Personen; oder 10 µl von PBS-T, enthaltend 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 µl Serum von malariainfizierten Personen.

Die Lösungen wurden 15 bis 20 min bei Raumtemperatur stehengelassen.

Im Falle des Gesamtbluts wurde die Lösung zentrifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen.

Anschließend wurden die Lösungen in farblose und transparente Mikropipettenspitzen aus Kunststoffmaterial gegeben, die an ihrem Ende Glaswolle und darauf ein Bett, bestehend aus einer Menge von etwa 6 µl A-Protein-Sepharose Cl-4B (Pharmacia Uppsala), vorgewaschen mit PBS-T, enthielten.

Die Lösungen wurden durch Schwerkraft während einer Zeit von 20 bis 30 min perkoliert, die Mikrosäulen wurden dreimal mit jeweils 200 µl PBS-T und zweimal mit jeweils 200 µl PBS (der Puffer ohne Tween-20) gewaschen.

Anschließend wurden zu jeder Mikrosäule 200 µl einer Substratlösung von 4-Chlor-1-naphtol (Biorad) und H2O2, hergestellt durch Vermischen zum Zeitpunkt der Verwendung von 1 Vol-Teil 4-Chlor-1-naphtol (Biorad) (3 mg/ml in kaltem Methanol) und 5 Vol-Teilen einer Lösung von 6 µl H2O2 von 30% (Vol/Vol), zugesetzt zu 10 ml PBS, gegeben. Nach 2 bis 3 min wurde die Entwicklung einer tiefblauen Farbe für die positiven Proben beobachtet.

Der Threshold-Wert, d. h. die minimale Menge an positivem Serum, welche eine leicht sichtbare blaue Bande bzw. Ring erzeugte, ergab 0,1 µl-0,4 µl für zwei getestete positive Seren.

Die Spezifität des Tests wurde an einem positiven, malariaverseuchten Serum (Entwicklung eines blauen Ringes mit E-P) überprüft unter Verwendung von 200 ng freiem Enzym ohne E-P in einem Test und in einem anderen Test eines großen Überschusses (3 µg) (etwa 100fach) von freiem P in Konkurrenz mit dem vorhandenen E-P-Konjugat (200 ng). Am Ende der Reaktion wurde keine Farbentwicklung beobachtet.

Keine Farbentwicklung wurde ferner in der Mikrosäule beobachtet für die Leerprobe, gebildet durch das Reaktionsgemisch mit E-P ohne Zugabe von Blut, Serum oder Plasma; für das Serum oder Plasma von gesunden Personen; für das nicht-malariainfizierte Gesamtblut; oder für menschliche γ-Globuline (Globuman-Bern), getestet in einer Menge, äquivalent etwa 60 µl Serum. Dies zeigte eine vollständige Abwesenheit von Störungen bzw. Überlagerungen in dem Test unter Verwendung des E-P-Konjugats an.

Die Stabilität des an das Peptid gebundenen Peroxidase-Enzyms (E-P) wurde auf spektrophotometrischem Wege bestimmt, indem in Zeiträumen von 0 bis 2 h von einer Lösung von PBS-T (100 µl), enthaltend 200 ng E-P, zu der Proben von Serum oder Plasma zugesetzt waren, Zeichnungen bzw. Skizzen gemacht wurden.

Nach 2 h zeigten die erhaltenen Ergebnisse eine unveränderte Peroxidase-Aktivität.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Bestimmung und Messung von Anti-P. falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Derivaten durch enzymimmunologische Bestimmung und Messung, dadurch gekennzeichnet, daß
    1. (a) diese Proben mit einem synthetischen Antigen- Enzym-Konjugat, das mit den in der Probe vorhandenen Antisporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper-synthetisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden vermag, ohne die enzymatische Aktivität zu entaktivieren, inkubiert werden;
    2. (b) der Antikörper dieses Komplexes an ein auf einem festen Träger adsorbiertes oder daran chemisch gebundenes Protein, welches seinerseits in der Lage ist, menschliche Immunglobuline zu binden, gebunden wird, und schließlich
    3. (c) die enzymatische Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes bestimmt wird durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im Falle eines positiven Ergebnisses ein gefärbtes Produkt zu liefern vermag.
  2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Antigen die Polypeptid-Sequenz

    (Asn-Ala-Asn-Pro)n

    ist, worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40 hat, und das Protein ein A-Protein ist.
  3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n im Bereich von 10 bis 20 liegt.
  4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Enzymen, die eine colorimetrische Reaktion mit einem spezifischen Substrat zu liefern vermögen.
  5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Peroxidase und/oder alkalische Phosphatase ist.
  6. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat hergestellt wird, indem in homogener Phase in NaHCO&sub3; bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln das oxidierte Enzym mit einem molaren Überschuß von (Asn-Ala-Asn-Pro)n-Polypeptid, worin n die oben angegebene Bedeutung hat, umgesetzt wird.
  7. 7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis des Polypeptids zu dem Enzym in dem Konjugat gleich oder etwa gleich 0,92 ist.
  8. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25°C) während einer Reaktionszeit im Bereich von 15 bis 20 Minuten durchgeführt wird.
  9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Polysaccharid oder Kunststoffmaterial ist.
  10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharid-Träger Cellulose oder Agarose sind.
  11. 11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25°C) während einer Reaktionszeit im Bereich von 20 bis 30 Minuten durchgeführt wird.
  12. 12. Verwendung einer diagnostischen Ausrüstung, bestehend aus einem synthetischen Antigen-Enzym-Konjugat, definiert im Anspruch 1(a), und Proteinen, definiert im Anspruch 1(b), für die Bestimmung und die Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern.






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