PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE4028622A1 12.03.1992
Titel Verfahren zum Herstellen von Kollagenschwämmen
Anmelder Dr. Otto Suwelack Nachf. GmbH & Co, 4425 Billerbeck, DE
Erfinder Suwelack, Wolfgang, 4425 Billerbeck, DE;
Tewes-Schwarzer, Petra, 4400 Münster, DE;
Eckmayer, Zdenek, 6940 Weinheim, DE
Vertreter Uexküll, Frhr. von, J., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Stolberg-Wernigerode, Graf zu, U., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Suchantke, J., Dipl.-Ing.; Huber, A., Dipl.-Ing.; Kameke, von, A., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Voelker, I., Dipl.-Biol.; Franck, P., Dipl.-Chem.ETH Dr.sc.techn., Pat.-Anwälte, 2000 Hamburg
DE-Anmeldedatum 08.09.1990
DE-Aktenzeichen 4028622
Offenlegungstag 12.03.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.03.1992
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse C07K 15/20   A61K 9/70   A61K 7/48   A61K 9/127   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von vernetzten Kollagenschwämmen ohne chemische Vernetzungshilfen. Die Vernetzung wird durch eine gegenüber den üblichen Verfahren intensivierte Alkalibehandlung des Kollagenmaterials sowie dadurch bewirkt, daß man während der Gefriertrocknung Temperaturen zwischen 110 und 150°C bei einem Vakuum zwischen 0,5 und 3,0 mbar 12 Stunden lang auf das im wesentlichen bereits trockene Material einwirken läßt. Das erhaltene Produkt ist als Trägermaterial für die transdermale Applikation von Wirkstoffen und insbesondere für die Herstellung von Gesichtsmasken geeignet.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenschwämmen, welche für die transdermale Applikation von pharmazeutischen und kosmetischen Wirkstoffen, und insbesondere zur Verwendung als Gesichtsmasken geeignet sind.

Kollagenschwämme sind im Stand der Technik bekannt und es sind zahlreiche Verfahren zu deren Herstellung beschrieben worden.

Einige der älteren Veröffentlichungen betreffen die Herstellung von Kollagenschwämmen des unvernetzten Typs aus löslichem Kollagen durch Gefriertrocknen oder durch Auswaschen des Wassers mittels organischer, mit Wasser mischbarer Lösungsmittel aus einer aufgeschäumten Kollagenmasse (vgl. US 26 10 625 und 31 57 524 sowie DE 26 25 289). Man erhält auf diese Weise ein leicht formbares Produkt mit einer schwammähnlichen Struktur. Die Produkte können jedoch nicht für die transdermale Applikation von Wirkstoffen und insbesondere nicht als Gesichtsmasken verwendet werden, da sie beim Anfeuchten sofort quellen und zerfallen. Sie besitzen in feuchtem Zustand keinerlei Festigkeit.

Die Herstellung wasserfester Schwämme auf Kollagenbasis erfolgt durch den Zusatz von Vernetzungsmitteln (vgl. beispielsweise die in den DE 27 34 503, 29 43 520 und 32 03 957 beschriebenen Verfahren).

So wird in der DE-PS 32 03 957 ein Verfahren zur Herstellung von wasserfesten Kollagenschwämmen aus Rinder- oder Schweinekollagen beschrieben, bei dem man die Kollagenrohstoffe auf übliche Weise aufschließt und von Begleitstoffen befreit, sie anschließend zur Reinigung einer Behandlung mit wäßrigem Alkali und einer Säurebehandlung bei einem pH-Wert von etwa 3 unterwirft, das erhaltene Material mechanisch zerkleinert, auf etwa 2 Gew.% Trockenmasse verdünnt und die Suspension mit einem Vernetzungsmittel versieht. Das so behandelte Material wird anschließend, gegebenenfalls unter Beimischung von Textilfasern innerhalb von 30 Minuten bis 4 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 1 1/2 bis 2 1/2 Stunden tiefgefroren und darauffolgend nach üblichen Verfahren gefriergetrocknet.

Nach dem Verfahren der DE-PS 32 03 957 hergestellte Kollagenschwämme sind auch in wäßrigem Medium stabil, sie enthalten jedoch Reste der verwendeten Vernetzungsmittel, welche bei empfindlicher Haut Reizwirkung ausüben können.

Da es sich bei den Vernetzungsmitteln um niedermolekulare Substanzen handelt, können diese sogar die Haut penetrieren und im Körper unerwünschte Reaktionen hervorrufen.

Obwohl daher durch die vorgenannten Verfahren hochwertige Kollagenmassen zur Verfügung gestellt werden, welche in Kosmetik und Medizin einsetzbar sind und deren Struktur durch kontrollierte Kristallbildung eine durch im allgemeinen pharmakologisch verträgliche Vernetzungsmittel stabilisierte gleichmäßige, feinporige Matrix aufweist, so ist es bisher nicht gelungen, ein vernetzungsmittelfreies Kollagenschwamm-Material herzustellen, welches auch bei extrem empfindlicher Haut beispielsweise als Gesichtsmaske eingesetzt werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es demgemäß, ohne den Einsatz chemischer Vernetzungsmittel, Emulgatoren oder Konservierungsmittel in wäßrigem Medium stabile Kollagenschwämme zu schaffen, welche für die transdermale Applikation von pharmazeutischen und kosmetischen Wirkstoffen geeignet sind.

Zur Lösung der Aufgabe dienen die nach den Ansprüchen 1 bis 8 hergestellten Kollagenschwämme.

Erfindungsgemäß ist es gelungen, völlig ohne den Einsatz chemischer Zusatzstoffe vernetzte, in wäßrigem Medium stabile Kollagenschwämme herzustellen, bei denen es sich um reine Naturprodukte handelt. Sie können mit pharmazeutischen und kosmetischen Wirkstoffen unterschiedlicher Natur beladen werden, wobei insbesondere bei Gesichtsmasken durch ein Zusammenspiel der kosmetischen Wirkstoffe mit dem Kollagen eine Intensivierung erfolgen kann. Es entsteht auf diese Weise ein echtes, kosmetisches "drug delivery system".

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zunächst übliche hochwertige Rohstoffe zur Herstellung von Kollagen, wie beispielsweise Rinder- oder Schweinehäute oder Rinderachillessehnen einer üblichen Vorbehandlung durch Weichen, Äschern, Entfleischen und Abspalten der Narbenschicht des entweder durch Einsalzen oder durch Kühlen konservierten Ausgangsmaterials unterworfen. Bei gesalzenem Material kann die Lagerungszeit bis zu einigen Monaten betragen, während das gekühlte Material innerhalb einer Woche verarbeitet werden muß. Da die Art und Weise der Konservierung den Quellungszustand und die Quellungseigenschaften beeinflußt, muß die Vorbehandlung der Konservierungsart angepaßt werden, insbesondere durch intensiveres Waschen und Äschern von gesalzenem Material.

Erfindungsgemäß wird das Material anschließend mit Alkalien und unmittelbar darauf mit Säure behandelt. Dieser Schritt ist grundsätzlich im Stand der Technik bekannt und führt zu einer Reinigung des Rohstoffes von allen nichtkollagenen Begleitstoffen. Ein Maß für die chemische Reinigung ist die Bestimmung des Amid-Stickstoffes, welcher gegenüber dem Ausgangswert um etwa 0,3 bis 0,5 mmol/g gesenkt werden sollte. Im vorliegenden Fall sollte der Amid-Stickstoff nach Abschluß der chemischen Behandlung etwa 0,20 bis 0,40 mmol/g betragen. Der Reinigungs- und Quellungsgrad des Kollagens wird wie im Stand der Technik beschrieben (vgl. beispielsweise DE 32 03 957) bestimmt.

Anders als in den bisher verwendeten Verfahren wird jedoch erfindungsgemäß die Alkalibehandlung erheblich intensiviert. Die Alkalibehandlung wird über einen Zeitraum von 1 bis 5, vorzugsweise 2 bis 4 Wochen durchgeführt, und die Konzentration des eingesetzten Natriumhydroxids beträgt 1 bis 3 Gew.%. Zum Vergleich sei darauf hingewiesen, daß bei dem in der DE 32 03 957 beschriebenen Verfahren (vgl. Spalte 6, 1.2) die alkalische Behandlung bei einer NaOH-Konzentration von weniger als 0,4% über einen Zeitraum von nur 12 bis 24 Stunden durchgeführt wurde.

Anschließend wird das Material gründlich mit Wasser gewaschen, um die Alkalireste möglichst vollständig zu entfernen.

Die darauf folgende Säurebehandlung erfolgt, wie im Stand der Technik beschrieben (vgl. 32 03 957) etwa 10 bis 20 Stunden lang mit etwa 2 bis 4%-iger Salzsäure. Der pH-Wert des Mediums sollte 0,5 bis 1,5 und vorzugsweise 1 betragen.

Die erfindungsgemäße Alkalibehandlung führt zum Denaturieren eines Teils des Kollagens, wobei dieser Teil etwa 3 bis 6 Gew.%, bezogen auf die Gesamtkollagenmenge, betragen sollte.

Die so behandelte Masse wird anschließend mit fließendem Wasser solange ausgewaschen, bis der pH-Wert des Materials etwa 2,5 bis 3,5, vorzugsweise 2,7 bis 3,3 beträgt.

Die erfindungsgemäß behandelte Kollagenmasse ist nach dem Waschen gleichmäßig durchgesäuert und die Oberfläche des Materials und der einzelnen Fasern ist klebrig. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich bezüglich dieser Maßnahme grundsätzlich von den bisher bekannten Verfahren, bei welchen die chemische Behandlung ausdrücklich so schonend durchgeführt werden soll, daß jede Beschädigung der Fasern verhindert wird (vgl. beispielsweise DE 32 03 957).

Überraschenderweise wird durch die erfindungsgemäße, intensive Alkalibehandlung des Ausgangsmaterials eine bessere Haftung der Fasern in dem fertigen Schwamm bewirkt, ohne daß die Biegsamkeit und Weichheit des Schwammes beeinträchtigt ist. Es ist jedoch erforderlich, die Verfahrensführung so zu lenken, daß der Denaturierungsvorgang nur die Oberfläche der Fasern betrifft und die Menge der denaturierten Produkte etwa 3 bis 6 Gew.% beträgt (siehe oben).

Die Kontrolle des Denaturierungsgrades erfolgt über eine Bestimmung des Hexosamin- und Aminosäuremusters, sowie über eine Bestimmung des "nativen" Kollagengehaltes (vgl. Beispiele 2 und 3).

Die Bestimmung des Hexosamingehaltes ist ein Maß für die kollagenen Bindegewebs-Begleitstoffe, wie Glykosaminoglykane, Glykoproteine und Proteoglykane. Diese Stoffe werden durch die alkalische Behandlung hydrolisiert und ausgewaschen. Erfindungsgemäß sind weniger als 1 Mol Hexosamin auf 1000 Aminosäuren vorhanden, ein Indiz für den hohen Reinheitsgrad des erhaltenen Produktes.

Die Aminosäurenbestimmung dient der Erfassung des Aminsäuremusters des erfindungsgemäßen Produktes. Auch in diesem Falle zeigen die Analysen (vgl. Beispiel 1) die Reinheit des Produktes. So entspricht der gefundene Wert von 349 Glycinresten je 1000 Aminosäurresten weitestgehend dem theoretischen Wert für reines Kollagen (jede dritte Aminosäure ist Glycin). Entsprechendes gilt für die Hydroxyprolinreste sowie für die übrigen Aminosäuren, deren Gehalt demjenigen des reinen Kollagen entspricht.

Der Anteil des denaturierten Kollagens an der Gesamtmasse des Kollagens wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Trypsin ermittelt. Da letzteres nur denaturiertes Kollagen hydrolisieren kann, läßt sich mit diesem Enzym der denaturierte Anteil selektiv erfassen, während das Gesamtkollagen durch Säurehydrolyse (vgl. Beispiel 2) oder mit Kollagenase bestimmt werden kann. Wie oben angegeben, sollte erfindungsgemäß der Anteil des denaturierten Kollagens etwa 3 bis 6%, bezogen auf das Gesamtkollagen betragen.

Im Anschluß an die erfindungsgemäße partielle Denaturierung und das Waschen bis zu einem pH-Wert von 2 bis 4, vorzugsweise 2,7 bis 3,3, wird das Material nach bekannten Verfahren, wie beispielsweise in der DE 32 03 957 angegeben, vorzerkleinert, homogenisiert und zerfasert und eine wäßrige Dispersion hergestellt. Das Trockengewicht der Dispersion sollte etwa 1,5 bis 3 Gew.%, vorzugsweise 2 Gew.% betragen und der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf etwa 2,5 bis 3,5, vorzugsweise 3 eingestellt werden.

Sollen Wirkstoffe enthaltende Schwämme hergestellt werden, so werden erstere der Dispersion beigemischt. Der erfindungsgemäße Kollagenschwamm besitzt ausgezeichnete Eigenschaften als Trägermaterial für Wirkstoffe und ist für die Beladung mit pharmazeutischen oder kosmetischen Wirkstoffen geeignet. In diesem Zusammenhang wirkt das Kollagen selbst wie ein Ionenaustauscher, indem es zahlreiche Elektrolyten, Metaboliten und Arzneimittel bindet.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden der Dispersion mit ATP-beladene Liposome zugegeben. Die Menge dieser Liposome kann, bezogen auf das Kollagentrockengewicht in der Dispersion etwa 2 Gew.% betragen.

Die erfindungsgemäße Kollagendispersion, gegebenenfalls angereichert mit Wirkstoffen, wird anschließend über einen Zeitraum von 0,5 bis 4 Stunden, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden bei einer Temperatur von -10 bis -30°C, vorzugsweise -25°C in Form von Platten eingefroren. Die Dicke der Platten kann 1 bis 3 cm, vorzugsweise 1,5 bis 2,0 cm betragen. Die Porengröße wird im wesentlichen über die Einfriergeschwindigkeit gesteuert, sie kann jedoch zusätzlich durch Hinzufügen oberflächenaktiver Substanzen beeinflußt werden.

Die Platten können gegebenenfalls bei -3 bis -5°C zwischengelagert werden. Bei der Lagerung tritt ein Konditionierungseffekt ein, der sich vorteilhaft auf das Endprodukt auswirkt. Es erfolgt dabei ein leichter Viskositätsabfall, der die Reproduzierbarkeit des Produktes verbessert. Vorzugsweise werden die eingefrorenen Platten mindestens 24 Stunden lang gelagert.

Nach dem Einfrieren und gegebenenfalls Zwischenlagern gelangen die Platten zur Gefriertrocknung.

Bei den bisher im Stand der Technik beschriebenen Verfahren ging man davon aus, daß der nun folgende Trocknungsvorgang für die Qualität des Produktes nicht mehr entscheiden sei. Erfindungsgemäß hat es sich jedoch überraschenderweise gezeigt, daß die Führung der Gefriertrocknung für die Stabilität der Schwammprodukte in nassem Zustand von entscheidender Bedeutung ist. Läßt man nämlich die Gefriertrocknung bei Temperaturen zwischen 110 und 150°C über einen langen Zeitraum ablaufen, so findet offenbar eine Vernetzung der Kollagenmoleküle statt, welche das Kollagen modifiziert und seine Stabilität in nassem Zustand vergrößert.

Diese Vernetzung verläuft sehr langsam und wird durch das Einwirken erhöhter Temperatur auf das bereits im wesentlichen trockene Material unter Vakuum erreicht. Erfindungsgemäß läßt man daher mindestens etwa 12 Stunden lang Temperaturen von 110 bis 150°C bei einem Vakuum von etwa 0,5 bis 3,0 mbar auf das im wesentlichen bereits trockene Material einwirken, wobei der Endpunkt der eigentlichen Gefriertrocknung in bekannter Weise anhand der Druckanstiegsmethode bestimmt und damit der Beginn der Temperatur-Nachbehandlung festgelegt wird.

Die Vernetzungsreaktion ist ihrer Natur nach unbekannt, der Vernetzungseffekt kann jedoch mit allen üblichen Bestimmungsmethoden nachgewiesen werden. So ist beispielsweise die Resistenz einer Kollagenstruktur gegenüber Kollagenase ein Maß für die Vernetzung, wobei nicht vernetztes Material erheblich schneller abgebaut wird, als dies bei nicht vernetztem Material der Fall ist (vgl. Beispiel 4).

Das fertige Produkt kann auf die gewünschte Stärke geschnitten werden, wobei die mechanischen Eigenschaften des trockenen Materials durch die Hitzebehandlung nicht beeinflußt werden. Gegenüber herkömmlich getrocknetem Material hat das erfindungsgemäß hergestellte Produkt jedoch in nassem Zustand eine höhere Festigkeit und seine Quellfähigkeit ist niedriger. Die Wasseraufnahme wird bestimmt durch Eintauchen in Wasser und anschließendes Abtropfen ohne mechanische Einwirkung. Durch die Wärmevernetzung während der Gefriertrocknung wird eine Verringerung der Wasseraufnahmefähigkeit um 20 bis 50 Gew.% bewirkt.

Die Stabilität des Materials in nassem Zustand wird in einem solchen Umfang verbessert, daß es möglich ist, die Wirkstoffe aus dem Material in die Haut einzumassieren.

Das erfindungsgemäße Vernetzungsverfahren ist physiologisch absolut unbedenklich und nicht vergleichbar mit Verfahren, welche von chemischen Vernetzungsmitteln Gebrauch machen. Vielmehr handelt es sich möglicherweise um einen Vorgang, der analog der natürlichen Alterung verläuft.

Die erfindungsgemäßen Produkte sind ausgezeichnete Träger für kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe welche aus der Kollagenmatrix topisch oder transdermal appliziert werden können. Die Wirkstoffe können beispielsweise in mikroverkapselter Form vorliegen und durch Benetzen freigesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Schwämme können ferner einseitig mit einer wasserundurchlässigen Beschichtung versehen sein und sie haben sich insbesondere als wirkstoffangereicherte Gesichtsmasken bewährt.

Lösliche Kollagene werden schon seit langem in der Kosmetik eingesetzt, um eine Steigerung der Hautfeuchtigkeit zu erzielen. Durch einen Okklusionseffekt läßt sich dieses Ergebnis mit Gesichtsmasken jeweils für einen begrenzten Zeitraum auch erreichen. Erfindungsgemäß wurde jedoch durch Gesichtsmasken, welche mit ATP-beladene Liposome enthielten, eine unerwartete und außergewöhnliche Steigerung dieses Effektes erreicht, der sich durch Messung der Hautfeuchtigkeit und Hautglätte nachweisen läßt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von Kollagenschwämmen, angereichert mit ATP-beladenen Liposomen

Kalkspaltflanken aus gesalzenen Rinderhäuten wurden nach dem bei der Lederherstellung üblichen Verfahren durch Weichen, Äschern, Entfleischen und Abspalten der Narbenschicht vorbereitet. Anschließend wurde das Material etwa 30 Minuten lang gewaschen und mit festem Kochsalz konserviert. Die Salzmenge betrug etwa 300 g/kg. Danach wurde das Material in Chargen von jeweils etwa 20 kg in Polyethylensäcken abgepackt und 3 Wochen lang bei -30°C gelagert.

Anschließend wurde das Material aufgetaut und in fließendem Wasser gründlich gewaschen. Danach erfolgte die Behandlung mit 1,5 Gew.% wäßriger NaOH-Lösung; die Behandlungszeit betrug 15 Tage.

Der Amid-Stickstoffgehalt des Materials, bezogen auf Trockengewicht, betrug im Anschluß an die Alkalibehandlung 0,28 mmol/g.

Nach gründlichem Waschen wurde das Material mit 4%-iger Salzsäure 20 Stunden lang gesäuert. Das Verhältnis von Blöße zu Flotte betrug dabei 1 : 1,5 und das Material wies nach dem Säuern einen pH-Wert von 0,8 auf.

Es wurde nun mit fließendem Wasser gewaschen, bis ein pH-Wert von etwa 3,0 erreicht war. Das Trockengewicht der Flanken betrug nach dieser Behandlung 14%.

Die gesäuerten Spalten wurden nun in Stücke geschnitten, mit einem Fleischwolf (Lochscheibendurchmesser 5 mm) zerkleinert und nachfolgend kolloidal vermahlen, indem man es insgesamt viermal über zwei hintereinander geschaltete Kolloidmühlen führte.

Die Masse wurde dann mit Wasser auf einen Trockensubstanzgehalt von 2,0% und mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Zu der so erhaltenen Dispersion wurden 2 Gew.%, bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens, handelsübliche, mit ATP beladene Liposome gemischt. Nach gründlicher Durchmischung und Entgasung wurde die Dispersion in Aluminiumformen gefüllt (Füllhöhe etwa 2 cm), wobei während dieses Vorganges auf blasenfreies und gleichmäßiges Abfüllen geachtet wurde.

Die Dispersion wurde anschließend im Solebad bei -25°C etwa 90 Minuten lang eingefroren, die gefrorenen Platten wurden entformt und im Kühlraum bei einer Temperatur von -5°C 24 Stunden lang zwischengelagert.

Die 2 cm dicken Platten wurden anschließend einer Gefriertrocknung unter einem Vakuum von etwa 1,5 mbar mit dem nachfolgend angegebenen Temperaturprogramm zugeführt:

Temperatur Zeit 160°C 13 Stunden 120°C 6 Stunden 110°C 6 Stunden 90°C 6 Stunden


Die trockenen Platten wurden nachfolgend auf eine Dicke von 0,8 mm gespalten und der üblichen Testung unterzogen. Sie waren für die kosmetische Anwendung als Kollagenmasken einwandfrei geeignet.

Beispiel 2 Bestimmung des Hexosamin- und Aminosäuren-Musters

Es wurden parallele Proben des nach Säuern und Waschen erhaltenen Materials mit einem Gewicht von jeweils 10 mg, bezogen auf Trockengewicht, in 10 ml 3 mol/l bzw. 6 mol/l HCl bei 105°C 15 bzw. 20 Stunden lang in zugeschmolzenen Bombenrohren unter Stickstoff (nachgereinigtes N2) hydrolysiert. Nach Abkühlen der Bombenrohre im Kühlschrank und Öffnen derselben wurde der Inhalt in 25 ml Spitzkolben überführt und in einem Vakuumrotationsverdampfer (Rotavapor RE 120, Büchi, Schweiz) bei 40°C im Wasserstrahlvakuum zur Trockne gebracht. Der Rückstand wurde in 5 ml H2O gelöst und abermals im Wasserstrahlvakuum bis zur Trockne eingedampft. Anschließend wurde der Rückstand in 5 ml 0,2 mol/l Na&spplus;-Puffer mit einem pH-Wert von 2,75 bestehend aus 16,9 g Tri-Lithiumcitrat-4-hydrat, 15 ml 32%ige HCl, 1 ml flüssiges Phenol, 2 ml Brij-Lösung gelöst in 1000 ml aqua dest. aufgenommen.

Zur Bestimmung der Glucosamin- und Galactosamin-Werte wurden aliquote Teile der Lösung mit dem oben genannten Puffer im Verhältnis 1 : 10 verdünnt und 150µl der in 3 mol/l HCl hydrolysierten Probe in die Kartusche eines Aminosäurenanalysators (Alphaplus, Typ 4151, Pharmacia-LKB, Freiburg) injiziert und die Ergebnisse ausgewertet.

Das Verfahren wurde mit der in 6 mol/l HCl hydrolysierten Probe wiederholt, wobei jedoch nur 50µl in eine Aufgabe-Kartusche injiziert wurden.

Die doppelte Hydrolyse stellte sicher, daß sämtliche Aminosäuren erfaßt wurden, da Maximalwerte für die Hexosamine und Thyrosin nur nach Hydrolyse in 3 mol/l HCl, Maximalwerte für Valin, Isoleucin und Leucin jedoch nur nach Hydrolyse in 6 mol/l HCl erhalten werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle

Beispiel 3 Bestimmung des Anteils an denaturiertem Kollagen

30 mg, bezogen auf Trockengewicht, des säurebehandelten und gewaschenen Materials wurden in 30 ml 0,1 mol/l Natriumhydrogencarbonat-Lösung mit einem pH-Wert von 8,2, welcher 1,5 ml einer 6 mg/ml Trypsin-Lösung (lyophilisiertes Präparat aus Rinder- Pankreas, Boehringer, Mannheim), zugesetzt waren, 8 Stunden lang bei etwa 23°C in einem Schüttler-Wasserbad inkubiert. Man ließ die Probe anschließend in einer Kühlkammer auf 4°C abkühlen und sie wurde sodann bei 4°C und 32000 UpM 30 Minuten lang ultrazentrifugiert.

Nach dem Auslaufen der Zentrifuge wurde der Überstand unter Rühren in einer Ultrafiltrationszelle durch einen Diaflo-Filter PM10, Durchmesser 25 mm, filtriert und 1 ml des Filtrats wurden in 6 mol/l HCl, wie in Beispiel 1 beschrieben, 20 Stunden lang bei 105°C hydrolysiert. Die weitere Aufarbeitung und Analyse des Hydrolysats erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben, mit dem Unterschied, daß die Probe nach zweimaligem Einengen zur Trockne in 500µl Puffer aufgenommen wurde und eine Teilmenge von 150µl in die Aufgabe-Kartusche des Aminosäurenanalysators injiziert wurde. Der nach Durchführung der Aminosäurenanalyse ermittelte Hydroxyprolin-Wert wurde anschließend als µmol Hydroxyprolin/g Ausgangssubstanz ermittelt. Er betrug 38µmol und repräsentierte den mit Trypsin abbaubaren denaturierten Teil des Gesamtkollagens.

Parallel zu der oben beschriebenen Analyse wurden 30 mg der Ausgangssubstanz, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 6 mol/l HCl hydrolysiert und analysiert. Der aus dieser Analyse erhaltene Hydroxyprolinwert, welcher den Gesamtkollagengehalt repräsentiert, betrug 764µmol/g Ausgangssubstanz (Trockengewicht).

Die Ergebnisse zeigen, daß etwa 5% des Kollagens denaturiert waren.

Beispiel 4 Bestimmung der Kollagenaseresistenz des erfindungsgemäßen Produktes

1 mg (bezogen auf Trockengewicht) einer Probe des erfindungsgemäßen Endproduktes wurde mit 100 Einheiten Kollagenase zu 2,0 ml Stammpuffer gegeben und bei 37°C inkubiert. Die Probe wurde im Abstand von 15 Minuten überprüft und der Zeitpunkt festgehalten, zudem die Pufferlösung klar wurde. Die Zeit betrug insgesamt 325 Minuten.

Parallel dazu wurde ein Probe von nicht-vernetztem, auf herkömmliche Weise gefriergetrocknetem Kollagen auf die gleiche Weise wie oben beschrieben untersucht. Die Kollagenlösung wurde in diesem Falle nach 73 Minuten klar.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zum Herstellen von Kollagenschwämmen, bei dem man das auf übliche Weise vorbehandelte Rohmaterial einer Alkalibehandlung und nachfolgend einer Säurebehandlung unterwirft und es anschließend wäscht, zerkleinert, gefriert und gefriertrocknet, dadurchgekennzeichnet, daß man
    1. a) während der Alkalibehandlung die Oberfläche des Materials soweit denaturieren läßt, daß 3 bis 6 Gew.% desselben, bezogen auf die Gesamtmenge des Rohmaterials, zu makromolekularen Peptiden abgebaut werden, und
    2. b) während des Gefriertrocknens auf das im wesentlichen bereits trockene Material Temperaturen zwischen 110 und 150°C bei einem Vakuum zwischen 0,5 und 3,0 mbar einwirken läßt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkalibehandlung mit einer 1 bis 3 gew.%-igen Natriumhydroxidlösung über einen Zeitraum von 1 bis 5 Wochen durchführt.
  3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte Material als wäßrige Dispersion bei -10 bis -30°C über einen Zeitraum von 0,5 bis 4 Stunden einfriert und anschließend mindestens 24 Stunden lang bei -3 bis -5°C lagert.
  4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man dem zerkleinerten Material vor dem Einfrieren kosmetische oder pharmazeutische Wirkstoffe beimengt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirkstoff mit ATP-beladene Liposome beimengt.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Material durch Benetzen mit Wasser freisetzbare, mikroverkapselte Wirkstoffe beimengt.
  7. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit Wirkstoffen beladene Material nach dem Gefriertrocknen einseitig mit einer wasserundurchlässigen Beschichtung versieht.
  8. 8. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 hergestellten Kollagenschwämme zur topischen oder transdermalen Applikation von Wirkstoffen.
  9. 9. Verwendung nach Anspruch 8 als Gesichtsmaske.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com