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Dokumentenidentifikation DE3875841T2 08.04.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0301977
Titel Verfahren zur Vernetzung von Kollagen durch Einführung von Azidgruppen und durch dieses Verfahren hergestellte Gewebe oder Biomaterialien.
Anmelder Coletica, Lyon, FR;
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale I.N.S.E.R.M., Paris, FR
Erfinder Petite, Herve, F-69500 Bron, FR;
Menasche, Philippe, F-75006 Paris, FR;
Huc, Alain, F-69110 Sainte Foy Les Lyon, FR
Vertreter Witte, A., Dipl.-Ing. Dr.-Ing.; Weller, W., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Gahlert, S., Dipl.-Wirtsch.-Ing.Dr.-Ing., Pat.-Anwälte, 7000 Stuttgart
DE-Aktenzeichen 3875841
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 08.07.1988
EP-Aktenzeichen 884202409
EP-Offenlegungsdatum 01.02.1989
EP date of grant 11.11.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.04.1993
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse A61L 27/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vernetzungsverfahren für Kollagen durch Einführen von Azidgruppen sowie die bei der Anwendung des Verfahrens erzeugten Gewebe und Biomaterialien.

Beim Ersetzen einer pathologischen Herzklappe beim Menschen werden gegenwärtig im wesentlichen zwei Arten von Ersatz verwendet: Die mechanischen Prothesen und die heterologen biologischen Klappen (auch Heterotransplantate oder Bioprothesen genannt). Obwohl die ersteren den Vorteil einer nahezu unbegrenzten Haltbarkeit haben, weisen sie als prinzipielle Beschränkung ein permanentes Thrombose-Embolierisiko auf, was eine lebenslange Antikoagulationsbehandlung erforderlich macht, deren charakteristische Risiken (Blutungen) zu einem nicht vernachlässigbaren Teil zu der Krankhaftigkeit und der Gesamtsterblichkeit beitragen, die bei den Patienten beobachtet werden, die Träger dieser Prothesen sind.

Im Gegensatz dazu haben die Bioprothesen heute klar bewiesen, daß sie auch ohne Antikoagulationsbehandlung nur eine geringe Thrombogenizität mit sich bringen. Dafür ist ihre Langlebigkeit durch plötzliches Auftreten von Calcifizierungen stark beeinträchtigt, die isoliert oder in Verbindung mit Beeinträchtigungen sozusagen durch die Strapazen zu einem erneuten Eingriff innerhalb einer mittleren Frist von 6 Jahren führen, wobei diese Frist bei sehr jungen Kranken übrigens viel zu kurz ist.

Übrigens, eine der gängigen Grundlagen bei der Suche nach Material für künstliche Klappen ist heute auf Techniken gerichtet, welche es ermöglichen, die Verschlechterung der Bioprothesen zu verzögern.

Diese Verschlechterung ist offensichtlich ein multifaktorielles Phänomen, wobei bestimmte "wirtseigen" genannte Faktoren schwer kontrollierbar sind.

Es ist jedenfalls klar, daß die Art der Behandlung des Gewebes zum Zeitpunkt der Fertigung der Klappe, eine Behandlung auf welche Einfluß genommen werden kann, eine wesentliche Rolle spielen kann.

Unabhängig von dem tierischen Ursprung dieses Gewebes (Aortaklappen vom Schwein oder Rinderherzbeutel) werden bis zur Stunde, für die gegenwärtig auf dem Markt befindlichen Bioprothesenmodelle, bei dessen Verarbeitung praktisch immer Gerbtechniken eingesetzt, welche Glutaraldehyd (G.T.A.) verwenden.

Tatsächlich kennt man die Fähigkeit dieses Gerbstoffes, starke intermolekulare Bindungen zu erzeugen, die es ermöglichen, daß das so behandelte Gewebe die erforderlichen mechanischen Eigenschaften aufweist und der enzymatischen Beschädigung "in vivo" widersteht.

Ein zusätzliches Argument für die Verwendung von Glutaraldehyd beruht darauf, daß es bei der Bildung der Bindungen zwischen den Kollagenmolekülen bestimmte antigene Determinanten maskiert, was es ermöglicht, die Antigenitität des Gewebes zu begrenzen.

Obwohl der genaue Zusammenhang zwischen dem Glutaraldehyd und der Calcifizierung noch nicht vollständig aufgeklärt ist, existiert sicher eine Kausalitätsbeziehung. Tatsächlich erscheint es, daß im Gegensatz zu nicht behandelten Implantaten mit G.T.A. behandelte Implantate von Aortaklappen vom Schwein stark verkalken.

Mehr noch, es wurde gezeigt, daß Aortaklappen vom Schwein oder vom Herzbeutel des Kalbs, jeweils mit GTA behandelt, in ähnlicher Weise calcifzieren wie bei der Ratte (Schoen et al Am.J. Pathol 1986, 193 Seiten 134-145).

Obwohl die Faktoren, welche diesen Verkalkungsmechanismus regulieren und von dem Wirt und dem Implantat abhängen, aufgezeigt worden sind (durch Lévy, Schoen, Howard et al), hat man den dieser Calcifizierung zugrundeliegenden Mechanismus noch nicht bestimmen können.

Die Rolle der Seitengruppierungen des Kollagens ist übrigens von Urist im Jahre 1966 und Glimcher im Jahre 1968 untersucht worden.

So hat Urist zeigen können, daß die Behandlung der Sehne eines Rattenschwanzes in Lösungen von anorganischen Salzen wie CaCl2, SrCl2 oder von organischen Kationen, welche die Carboxylgruppen der Seitenketten blockieren, die Calcifizierung von in eine hypercalzämische Ratte implantierten Sehnen wirksam hindert.

Glimcher hat versucht, die Calcifizierung von Knochenkollagen in vitro durch Verestern der Carboxylgruppierungen zu inhibieren. In diesem Falle inhibiert die Blockierung der Gruppierungen das Calcifizieren. Dennoch mag ein Teil dieser Inhibierung auf der Dehydratation des Moleküles in dem Methanol beruhen.

Die vorliegende Erfindung hat es sich zum Ziel gemacht, ein chemisches Verfahren vorzuschlagen, das geeignet ist, die Blockierung der seitlichen Säuregruppierungen des Kollagen sicherzustellen und die Verwendung von Glutaraldehyd zu vermeiden, dessen Nachteil neben der Induzierung der Calcifizierung eine bestimmte Toxizität ist.

In der FR-A-2 559 666 und der EP-A-156 740 hatten die Erfinder bereits ein Herstellungsverfahren für Kollagenröhren vorgeschlagen, gemäß dem die Kollagenröhre, einmal getrocknet, einer Vernetzung durch Dehydratation unterzogen wurde, welche in einem Trockenofen bei ungefähr 80ºC unter einem Unterdruck von ungefähr 0,1 mm Quecksilbersäule für ungefähr 24 Stunden durchgeführt wurde.

Die Röhre von vernetztem Kollagen wurde dann einer Behandlung unterzogen, welche es ermöglicht, Azidgruppen in das Molekül einzuführen, ohne jedoch zur Kopplung des Kollagens mit was für einem Molekül auch immer zu führen.

Die Erfinder haben ihre Untersuchungen auf diesem Wege weiterverfolgt, insbesondere um zu versuchen, den der Vernetzung durch Hydratation vorausgehenden Schritt zu eliminieren, um zu einer Blockierung der endständigen Säuregruppierungen des Kollagens zu gelangen, was die mechanischen Eigenschaften des erhaltenen Gewebes verbessert und jedes wieder in Lösunggehen des Kollagens vermeidet, wobei es das Ziel ist, einen Vernetzungsgrad des Kollagen zu erhalten, der demjenigen äquivalent ist, der mit Glutaraldehyd erreicht wird, was folglich auf eine Verringerung der Calcifizierungsphänomene und gleichermaßen auf eine Verringerung der auf der sekundären Wiederabgabe von Glutaraldehyd beruhenden Toxizitätsphänomene hoffen läßt.

Das Interesse an dem Verfahren ist dadurch verstärkt, daß es das Glutaraldehyd nicht durch einen anderen Gerbstoff ersetzt, der spezifisiche Probleme bringen kann, da es Vernetzungsverbindungen zwischen den Seitenketten des Kollagens hervorruft, ohne auf permanente Weise ein fremdes chemisches Agens einzuführen.

In konzeptioneller Hinsicht zeigt sich folglich das erfindungsgemäße Verfahren darin, daß es einen neuen Weg in der Maßnahme aufzeigt, in der es die gleichbleibend auf die Verwendung von Glutaraldehyd gestützte traditionelle Fixierung durch eine Fixierung ersetzt, die auf einer Modifizierung der Struktur der seitlichen Gruppierungen des Kollagen beruht, die ohne Rückgriff auf irgendeinen Gerbstoff erhalten wird.

Die Erfinder haben während ihrer Untersuchung feststellen können, daß es möglich war, sowohl die seitlichen Gruppierungen des Kollagen derart wirksam zu blockieren, daß jegliches wieder in Lösunggehen des letzteren vermieden wird, als auch in wichtiger Weise die mechanischen Eigenschaften der erhaltenen Biomaterialien zu verbessern, wenn man eine chemische Vernetzung des Kollagens durch Einführung von Azidgruppen in Anwesenheit von Natriumchlorid bewirkt.

Erfindungsgemäß umfaßt ein Verfahren zur Behandlung eines nicht vernetzten Kollagenes durch Einführung von Azidgruppen die folgenden Schritte:

a) Verestern der freien Säuregruppierungen des Kollagen.

b) Transformation der veresterten Gruppierungen in Hydrazidgruppierungen

c) Transformation der Hydrazidgruppierungen in Azidgruppierugen durch die Wirkung von salpetriger Säure,

und ist dadurch gekennzeichnet, daß man im Hinblick auf eine Vernetzung des nicht vernetzten Kollagens in einem Schritt d) die in dem Schritt c) erhaltenen Azidgruppierungen mit den Aminogruppierungen desselben Kollagens reagieren läßt, und daß man zwischen den Schritten a) und b) und/oder zwischen den Schritten b) und c) das behandelte Kollagen mit einer wässrigen Salzlösung wäscht, wobei dieses Salz keinerlei denaturierenden Einfluß auf das Kollagen hat, und daß die Schritte a, b und c in Anwesenheit eines das Kollagen nicht denaturierenden Salzes durchgeführt werden.

Das Salz ist aus den das Kollagen nicht denaturierenden Salzen der Alkalimetalle ausgewählt. Die wässrigen Salzlösungen werden bei Konzentrationen verwendet, die zwischen 3 und 15 % liegen. Die Reaktion der Vernetzung durch Einführung von Azidgruppen vollzieht sich an nicht vernetzten Kollagenen.

Die Erfindung betrifft gleichfalls die bei der Durchführung des vorstehenden Verfahrens erhaltenen Biomaterialien und insbesondere die Bioprothesen sowie jedes andere Biomaterial auf der Basis des so erhaltenen vernetzten Kollagens, wie Filme, Schwämme, Röhren etc..

Aufgrund der Beschreibung, die einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens folgt, wird die vorliegende Erfindung besser verstanden werden und ihre Vorteile werden hervortreten.

A Präparation des Ausgangsmaterials

In den Schlachthöfen entnimmt man 100 Tage alten Kälbern weniger als eine Stunde nach ihrer Tötung die Herzbeutel. Diese Herzbeutel werden dann vom Fett befreit, gesichtet und in einer wässrigen Lösung von 9 Natriumchlorid gewaschen. B Vernetzung des Kollagens durch Einführung von Azidgruppen Diese Vernetzungsreaktion kann wie folgt zusammengefaßt werden:

Der erste Schritt a), die Veresterung der Carboxylgruppierungen erfolgt durch Immersion der Proben in einer 0,2 Mol Salzsäure enthaltenden Methanollösung für 7 Tage bei Umgebungstemperatur.

Zwei Waschvorgänge werden in Methanol ohne Säure durchgeführt.

Dann fährt man mit zwei Waschvorgängen mit einer wässrigen Lösung von 6 % Natriumchlorid fort (Schritt a').

Die Proben werden dann für eine Nacht in eine 1 %ige Hydrazinlösung mit 6 % NaCl eingetaucht, um ausgehend von den veresterten Gruppierungen Hydrazide zu erhalten. Die Reaktion geht bei Umgebungstemperatur vonstatten (Schritt b).

Man fährt dann mit einem Waschvorgang bei 4ºC mit einer wässrigen Lösung von 6 % Natriumchlorid fort (Schritt b').

Der folgende Schritt (Schritt c) besteht darin, die erhaltenen Proben in einer Lösung zu immergieren, die in einer wässrigen Lösung mit 6 % Natriumchlorid 0,3 Mol Salzsäure und 0,5 Mol Natriumnitrit enthält.

Die Proben werden dann gewaschen (Schritt c'), um die Säure vollständig von ihnen zu entfernen; sie werden dann unmittelbar für 4 Stunden bei Umgebungstemperatur in einem 6 %igen Borat- Natriumchlorid Puffer gehalten.

Die ausgehend von den Carboxylgruppierungen der Seitenketten des Kollagens gebildeten Azylnitride werden folglich während des Schrittes d) mit den Aminogruppierungen, insbesondere von dem Lysin, reagieren können, um eine Amidbindung zu bilden. Man erzeugt auf diese Weise Vernetzungsverbindungen in dem Inneren des Kollagengeflechts.

Die Proben werden dann für wenigstens 3 Stunden bei Umgebungstemperatur in einem Borat-Glyzin-Natriumchlorid Puffer von 9 % inkubiert.

Um steriles Biomaterial zu erhalten, ist es bevorzugt, die so erhaltenen Proben in Alkohol bei 70º zu konservieren.

Der durch die Zugabe von Natriumchlorid während der verschiedenen Schritte des Verfahrens ausgeübte Einfluß wird nun untersucht werden.

In der beigefügten schematischen Darstellung:

Die Figuren 1 und 2 stellen Kurven der programmgesteuerten Differenzkalorimetrie für einen frischen nicht behandelten Herzbeutel bzw. einen erfindungsgemäß behandelten Herzbeutel dar.

Die Figuren 3 und 4 sind Kurven, welche die physikalischen Eigenschaften (Reißkraft in N auf der Abszisse und Dehnung in mm auf der Ordinate) für eine frische Sehne bzw. eine erfindungsgemäße behandelte Sehne darstellen.

Figur 5 ist eine Kurve, welche die Entwicklung der Ausdehnung einer Haut in Funktion des pH-Wertes darstellt.

1) Untersuchung mit programmgesteuerter Differenzkalorimetrie

Die programmgesteuerte differenzkalorimetrische Analyse (C.D.P.) erlaubt eine dynamische kalorimetrische Untersuchung der experimentellen Proben.

Die Technik besteht darin, während eines linearen Temperaturanstieges die Differenzenergie zu messen, die einer Probe und einer Referenz zugeführt werden muß, um sie auf einer gleichen Temperatur zu halten. Wenn das Protein denaturiert, erscheint auf dem Registriergerät ein Wärmeabsorbtionspeak. Tatsächlich ist der statische Helix-Knoten Übergang für Kollagen endothermisch.

Man definiert folglich:

- die Temperatur am Beginn der Denaturierung

- die Temperatur am Denaturierungspeak

- die Temperatur am Ende der Denaturierung.

Die Untersuchung ist vergleichend durchgeführt worden:

- mit einem Vergleichsfilm und einem Vergleichsherzbeutel, nicht behandelt (Vergleich)

- mit einem Film und einem Herzbeutel, welche verschiedenen Schritten der Vernetzung durch Einführung von Azidgruppen in Anwesenheit von Wasser unterzogen wurden.

- mit einem Film und einem Herzbeutel, welche verschiedenen Schritten der Vernetzung durch Einführung von Azidgruppen gemäß der Erfindung unterzogen wurden, d.h. in Anwesenheit einer wässrigen Lösung von 6 % Natriumchlorid (Nacl).

- mit einem Film und einem Herzbeutel, welche mit einer Lösung von 0,6 % Glutaraldehyd (G.T.A.) behandelt wurden.

Die erhaltenen Resultate sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt:

Tabelle 1
Temperatur in ºC Beginn Temperatur in ºC Peak Temperatur in ºC Ende Film Vergleich Wasser Herzbeutel

Figur 1 zeigt die Energie/Temperatur-Kurve für einen frischen Herzbeutel und Figur 2 die selbe Kurve für einen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Herzbeutel, und zwar in einem Millieu, das in den Schritten Nr. a', b, b', c, c' kein Natriumchlorid enthält, dieser Herzbeutel hat am Ende der Behandlung eine Temperatur für den Beginn der Denaturierung von 70ºC.

Ein Herzbeutel, der unter den gleichen Bedingungen aber erfindungsgemäß in Anwesenheit von 6 % NaCl während der Schritte Nr. a', b, b', c, c' behandelt wurde, hat am Ende der Behandlung eine Temperatur für den Beginn der Denaturierung von 78ºC.

Gleiche Resultate sind für die Filme erzielt worden, wo man für den Fall der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Filme eine Zunahme der Temperatur für den Beginn der Denaturierung um 12ºC beobachtet.

2) Aufschluß mit Kollagenase

Um die durch die Differenzkalorimetrie erhaltenen Resultate zu bestätigen und die Leistungen der Materialien im Hinblick auf "Angriffe" abzuschätzen, welche denen nahekommen, die man in-vivo wiederfinden kann, sind die verschiedenen Materialien (in Abwesenheit von Salz behandelt, in Anwesenheit von Natriumchlorid behandelt, mit G.T.A. behandelt) für 7 Tage in Anwesenheit von Bakterienkollagenase (600 U/ml) inkubiert worden.

Am 7. Tage bestimmt man quantitativ die Menge des sich in den Überstand wiederfindenden Proteins. Die Menge des Proteins ist proportional zu dem Maß des Angriffs durch die Kollagenase.

Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt:

Tabelle II
Behandlung Proteingehalt Behandlung in Abwesenheit von NaCl Behandlung in Abwesenheit von 6 % NaCl Behandlung mit 0,6 % G.T.A.

Man stellt gleichfalls ein sehr deutlich verbessertes Verhalten des Materials fest, wenn die Behandlung in Gegenwart von Natriumchlorid durchgeführt worden ist.

3) Untersuchung der mechanischen Eigenschaften

Der Einfluß der Bedingungen des Verfahrens der chemischen Vernetzung auf die physikalischen Eigenschaften des Kollagens ist für Sehnen vom Schwein untersucht worden. Im Gegensatz zum Herzbeutel trägt die Sehne Kollagenfasern, die alle in die selbe Richtung ausgerichtet sind, was die Interpretation der Ergebnisse erleichtert.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle III und in den Figuren 3 und 4 zusammengefaßt.

Figur 3 ist die Kurve der Reißkraft in N in Abhängigkeit von der Dehnung in mm für eine frische Sehne und Figur 4 eine ähnliche Kurve für eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Sehne.

Wenn die Sehne gestreckt ist, erhält man eine Kurve, ausgehend von der man bestimmen kann:

- die Reißkraft: sie ist durch die zum Zerreißen der Probe notwendige minimale Kraft gegeben

- die Dehnung bei dem Bruch, ausgedrückt in % von der ursprünglichen Länge der Probe

- das Elastizitätsmodul: das ist die Steigung des linearen Abschnitts der Kurve; je größer das Elastizitätsmodul ist, desto steifer ist das Gewebe.

Tabelle III Untersuchung der physikalischen Eigenschaften bei einachsigem Zug
Reißkraft in N Dehnung bei Bruch in % Elastizitätsmodul in MPa Frische Sehne mit Wasser aktivierte Sehne mit 6 % NaCl aktivierte Sehne Sehne, 0,6 % GTA

Die Reißkräfte der behandelten Gewebe sind ähnlich und signifikant unterschiedlich zu der Reißkraft eines nicht behandelten Testgewebes. Man stellt weiterhin eine Zunahme der Werte für die Dehnung bei Riß für erfindungsgemäß behandelte und mit G.T.A. gegerbte Gewebe fest.

Schließlich beobachtet man eine signifikante Zunahme des Elastizitätsmoduls, die eine Zunahme der Steifigkeit aufdrückt.

Wie kann man die vorstehend dargelegten wichtigen Unterschiede insbesondere zwischen den auf klassische Weise behandelten, den einer Vernetzung durch Einführung von Azidgruppen unterzogenen und den erfindungsgemäß in Anwesenheit von Natriumchlorid behandelten Materialien erklären?

Wenn die Einführung der Azidgruppen in Abwesenheit von Natriumchlorid erfolgt, bewirkt die Salzsäure am Ende der Veresterung ein Aufblähen des Gewebes; dieses wird also dicker und lichtdurchlässiger. Diese Aufblähung entspricht einer begrenzten Auflösung des Gewebes, weil zahlreiche inter- und intramolekulare Verbindungen existieren, welche eine totale Auflösung des Gewebes verhindern. Am Ende der Veresterung ist die thermische Stabilität des Gewebes die eines säurelöslichen Kollagens (die Temperatur zu Beginn der Denaturierung beträgt 36ºC, die Dicke des Herzbeutels reicht von 0,38 mm bis 0,82 mm).

Für andere Schritte der Behandlung ist das Phänomen identisch aber von geringerer Amplitude.

Wenn die Einführung der Azidgruppen unter den Bedingungen des erfinderischen Verfahrens, d.h. in Anwesenheit von Natriumchlorid geschieht, erhält man am Ende der Veresterung ein Gewebe, das unter einem makroskopischen Gesichtspunkt sich nicht verändert hat.

In der CDP liegt die thermische Stabilität eines so behandelten Gewebes nahe der eines nicht behandelten frischen Gewebes (die Temperatur zu Beginn der Denaturierung ist 53,9ºC für ein erfindungsgemäß behandeltes Gewebe und 58ºC für ein frisches Gewebe).

Während der anderen Schritte der Behandlung beobachtet man keine Denaturierung des Gewebes mehr.

In der Theorie kann man das die Aufblähung begrenzende Wirken von Natriumchlorid wie folgt erklären.

Das Kollagen besitzt polare seitliche Gruppierungen, welche von sauren und basischen Aminosäuren herrühren.

Entsprechend dem pH-Wert des Millieus können diese Gruppierungen folglich ionisiert sein oder auch nicht.

Im sauren Millieu: COOH und NH&sub3;&spplus;

im basischen Millieu: COO&supmin;und NH&sub2;

Diese Ionisierungen erklären die Phänomene der Aufblähung: D.h. die Absorption von Wasser durch die Faser.

Sie sind in der Gerberei gut bekannt und werden verwendet, um das Enthaaren von Häuten zu erleichtern. Man hat folglich Kurven für das Aufblähen der Haut als Funktion des pH-Wertes (Fig. 5) aufstellen können.

Die in Anwesenheit von Salzsäure realisierte Veresterung bewirkt die Anlagerung von H+ Ionen an dem Gewebe. Folglich wird man eine Wanderung von H+ und von Cl- aus der wässrigen Phase in die kollagene Phase haben. Um die Elektroneutralität beizubehalten, werden die Chlor- und Wasserstoffionen in Form von Molekülen statt in Form von freien Ionen zirkulieren. Die Wasserstoffionen sind an dem Protein angelagert und die Konzentration an Chlorionen in der Faser ist bedeutender als die Konzentration an Chlorionen in der wässrigen Phase. In Übereinstimmung mit dem Massenwirkungsgesetz muß das Produkt aus der Konzentration an Chlorionen und der Konzentration an Wasserstoffionen in der Faser und in der wässrigen Lösung gleich sein. Es wird sich also ein osmotischer Druck in der Faser einstellen, welcher durch Absorption von Wasser das Volumen vergrößert, woher das Aufblähen des Herzbeutels rührt.

Die gleiche Überlegung kann für das basische Millieu angestellt werden, weil sich das Gewebe in Anwesenheit von Hydrazin (pH-Wert 10) befindet.

Durch Anwesenheit von Salz unterstützt man eine Unterdrückung der Aufblähung des Gewebes. In diesem Fall ist der Konzentrationsunterschied an Chlorionen durch die Zugabe von Natriumchlorid tatsächlich abgeschwächt. Der osmotische Druck ist schwach und die Aufblähung gering.

Nach der Veresterung in Anwesenheit von Salz stellt man eine Konstanz in der Dicke des Gewebes fest, sowie eine Zunahme der thermischen Stabilität; eine Konzentration an Natriumchlorid von 6 % hat sich als ganz besonders wirksam erwiesen, um ein ausreichendes Gerben von guter Qualität zu erzielen.

Um zusammenzufassen, es erscheint, daß die Vernetzung von Kollagen durch Einführung von Azidgruppen in Anwesenheit von Natriumchlorid es ermöglicht, ein vernetztes Material von besserer Qualität als bei gleicher Behandlung in Abwesenheit von Salz zu erhalten.

Das in Anwesenheit von Natriumchlorid vernetzte Material weist eine bestimmte Zahl an Eigenschaften (thermische Stabilität, Aufschluß mit Kollagenase) auf, die nahe denen eines mit Glutaraldehyd behandelten Materials sind.

Bezogen auf ein mit Glutaraldehyd behandeltes Material weist das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Material eine deutlich verbesserte Biokompatibilität auf.

Tatsächlich hat das erfindungsgemäße Verfahren den großen Vorteil, überhaupt kein fremdes chemisches Agens in das Kollagen einzuführen, während die Behandlung mit Glutaraldehyd die Anlagerung von Substanzen mit sich bringt, die zytotoxisch sind und die aus diesem Grund das Gewebe den Kern seiner biologischen Eigenschaften verlieren lassen.

Mehr noch, ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandeltes und in einen lebenden Organismus implantiertes Gewebe wird keinerlei toxisches Material wieder abgeben, was ansonsten über kurz oder lang unerfreuliche Effekte hervorrufen kann.

Wie dem auch sei und wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, kann das Verfahren, das wie beschrieben auf Herzbeutel angewendet wird, auf alle anderen kollagenen Gewebe angewendet werden. Es kann wohlgemerkt bei der Herstellung jeglichen Biomaterials auf der Basis von wiederaufgebautem Kollagen so wie Filmen, Schwämmen, Röhren etc. anwendbar sein.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Behandlung eines nicht vernetzten Kollagens durch Einführung von Azidgruppen, das im wesentlichen die folgenden Schritte umfaßt:

a) Verestern der freien Säuregruppierungen des Kollagens

b) Transformation der veresterten Gruppierungen in Hydrazidgruppierungen

c) Transformation der Hydrazidgruppierungen in Azidgruppierungen durch die Wirkung von salpetriger Säure dadurch gekennzeichnet, daß man im Hinblick auf eine Vernetzung des nicht vernetzten Kollagens in einem Schritt d) die in dem Schritt c) erhaltenen Azidgruppierungen mit den Aminogruppierungen desselben Kollagens reagieren läßt, und daß man zwischen den Schritten a) und b) und/oder zwischen den Schritten b) und c) das behandelte Kollagen mit einer wässrigen Salzlösung wäscht, wobei dieses Salz keinerlei denaturierenden Einfluß auf das Kollagen hat, und daß die Schritte a), b) und c) in Anwesenheit eines das Kollagen nicht denaturierenden Salzes durchgeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz aus den Salzen der Alkalimetalle ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der wässrigen Salzlösung zwischen 3 und 15 % liegt.

4. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Erhalten von Bioprothesen.

5. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Erhalten von Biomaterialien.







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