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Dokumentenidentifikation DE3688311T2 28.10.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0219791
Titel Verfahren zum Züchten von rekombinanten Zellen.
Anmelder Hitachi, Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Shimizu, Norio, Hitachi-shi, JP;
Fukuzono, Shinichi, Hitachi-shi, JP;
Nishimura, Nobuko, Katsuta-shi, JP;
Fujimori, Kiyoshi, Hitachi-shi, JP;
Odawara, Yoji, Hitachi-shi, JP
Vertreter Strehl, P., Dipl.-Ing. Dipl.-Wirtsch.-Ing.; Schübel-Hopf, U., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Groening, H., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 3688311
Vertragsstaaten DE, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 13.10.1986
EP-Aktenzeichen 861141596
EP-Offenlegungsdatum 29.04.1987
EP date of grant 21.04.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.10.1993
IPC-Hauptklasse C12N 1/38
IPC-Nebenklasse C12P 1/00   C12N 15/56   C12N 15/70   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein wirksames Verfahren zum Züchten rekombinanter Zellen, das eingesetzt werden kann, wenn in die genomische DNA von Zellen ein vorgesehenes Gen aus einem Tier, einer Pflanze, einem Mikroorganismus oder dergl. eingeführt ist und das vorgesehene Gen exprimiert wird, wobei die resultierenden Produkte anschließend gewonnen werden.

Hintergrund der Erfindung

In neuerer Zeit sind genetische Rekombinationstechniken unter Verwendung von Wirtszellen entwickelt worden, die komplexe DNA (Desoxyribonucleinsäure) enthalten, die aus einem Vektorplasmid oder dergl. und einem darin eingeführten Gen, das eine Informationssequenz für ein nützliches Produkt enthält, zusammengesetzt ist. Diese Zellen läßt man dann eine große Menge des nützlichen Produkts herstellen. Menschliches Interferon, menschliches Insulin und dergl. werden bereits unter Verwendung dieser Technik hergestellt, und Escherichia coli, Hefen, Bacillus subtilis, Actinomyces, tierische Zellen, pflanzliche Zellen und dergl. werden dazu als Wirte verwendet.

Bisher ist jedoch noch kein Verfahren für die großtechnische Herstellung großer Mengen eines gewünschten Produkts unter Verwendung rekombinanter Zellen mit einem vorgesehenen Gen entwickelt worden, und daher ist es wünschenswert, wenn ein wirksames Verfahren zum Züchten rekombinanter Zellen sobald wie möglich entwickelt wird.

Als eine Methode, damit rekombinante Zellen eine große Menge eines gewünschten Produkts herstellen, ist eine Erhöhung der Zellkonzentration in der Kulturbrühe in Erwägung gezogen worden. Selbst wenn jedoch ein Substrat zugeführt wird, um die Zellkonzentration zu erhöhen, endet das Zellwachstum im Verlauf der Kultur, und es wird schwierig, die Zellkonzentration zu erhöhen. Daher ist ein Verfahren bereitgestellt worden, bei dem zur Entfernung der das Zellwachstum hemmenden Substanz, die zur Beendigung des Zellwachstums führt, die Kulturbrühe diskontinuierlich oder kontinuierlich entnommen wird, wobei die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und dann wieder in den Kulturbehälter gefüllt werden (JP-A 29985/78). Dieses Verfahren zielt allein auf das Züchten von Hefezellen zur Herstellung einer großen Menge der Zellen ab, und es handelt sich nicht um ein Verfahren zum Züchten von Zellen mit komplexer DNA, die den Zellen die Herstellung eines gewünschten Produkts erlaubt. Beim Züchten von Bäckerhefe ist ein Verfahren bekannt, das den Nachweis der Bildung von Ethanol durch Messung des respiratorischen Quotienten, das Zuführen eines Substrates und dabei die Erhöhung der Hefekonzentration umfaßt (JP-A 36983/82 und 78584/83). Dieses Züchtungsverfahren ist jedoch kein Verfahren zum Züchten von Zellen mit komplexer DNA.

Andererseits ist ein Verfahren zum Züchten von Zellen mit komplexer DNA vorgeschlagen worden, bei dem die Zellen bei einer Temperatur unterhalb der optimalen Wachstumstemperatur der Zellen gezüchtet werden (JP-A 141796/83). Dieses Züchtungsverfahren wurde jedoch ohne Berücksichtigung der Entfernung von das Zellwachstum hemmenden Substanzen, die zu einer Beendigung des Zellwachstums führen, entwickelt. Es ist bereits bekannt, daß eine Wachstumshemmung in Zellkulturen durch einen sauren pH-Wert (US-A-021304, EP-A-0022341) verursacht werden kann, und entsprechend diesen Druckschriften kann dieser Typ von Hemmung durch Einstellung des pH-Wertes des Mediums durch Zugabe eines Neutralisierungsmittels vermieden werden.

Aus Patent Abstract of Japan, 1978, Bd. 2 (72), S. 838 C 78, ist ein Verfahren zum aeroben Züchten von Hefen bekannt, bei dem das Kulturmedium kontinuierlich oder diskontinuierlich aus dem System entnommen wird, die Zellen von dem Medium abgetrennt werden und die abgetrennten Zellen mit oder ohne Waschen in das Züchtungssystem zurückgeführt werden, während der Sauerstoffpartialdruck erhöht wird. Entsprechend dieser Druckschrift ist das Verfahren geeignet zum Entfernen nicht assimilierbarer Saccharide und metabolischer Produkte, die Hefezellen betreffen.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines wirksamen Verfahrens zum Züchten rekombinanter E.coli- Zellen mit komplexer DNA, das die Herstellung einer großen Menge eines gewünschten Produkts erlaubt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines wirksamen Verfahrens zum diskontinuierlichen ("fed batch culture") oder kontinuierlichen Züchten von E.coli mit komplexer DNA.

Die vorstehend genannten Ziele und Vorteile der Erfindung können durch das nachstehend beschriebene Züchtungsverfahren erreicht werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten rekombinanter E.coli-Zellen, die eine komplexe DNA aufweisen, die ein für ein gewünschtes Produkt kodierende Gen und einen Promotor umfaßt, und die die Fähigkeit zur Bildung des gewünschten Produkts besitzen, wobei das Verfahren das Verursachen der Expression des vorgesehenen Gens und die Gewinnung des resultierenden gewünschten Produkts umfaßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

(a) die weitgehende Entfernung einer das Zellwachstum hemmenden Substanz, die Essigsäure darstellt,

(b) die weitgehende Entfernung einer die Induktion des gewünschten Produkts hemmenden Substanz, die Essigsäure darstellt, und

(c) die Induktion der Bildung des gewünschten Produkts.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 stellt Graphen dar, die die Ergebnisse eines Beispiels einer diskontinuierlichen Kultur rekombinanter Zellen zeigen.

Fig. 2 zeigt die Hemmung des Zellwachstums durch eine das Zellwachstum hemmende Substanz in der Kulturbrühe.

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Analyse auf Essigsäure mit Hilfe eines isotachophoretischen Analysators.

Fig. 4 zeigt zeitabhängige Änderungen der Essigsäurekonzentration, der spezifischen Wachstumsrate und der Zellkonzentration in einer diskontinuierlichen Kultur rekombinanter E.coli.

Fig. 5 zeigt Ergebnisse des Züchtens von Zellen im Fall der Entfernung eines Kulturüberstands während einer diskontinuierlichen Kultur von rekombinanten Zellen.

Fig. 6 zeigt Ergebnisse von wiederholten diskontinuierlichen Kulturen rekombinanter E.coli.

Fig. 7 zeigt Ergebnisse der Herstellung von β-Galactosidase, wenn Essigsäure aus einer diskontinuierlichen Kultur rekombinanter E.coli entfernt wird.

Fig. 8 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichsbeispiels einer diskontinuierlichen Kultur rekombinanter E.coli.

Fig. 9 ist die schematische Darstellung eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Züchtungsvorrichtung.

Ausführliche Darstellung der Erfindung

Die Erfindung ist anwendbar auf E.coli-Zellen mit komplexer DNA und der Fähigkeit zur Bildung eines gewünschten Produkts, nämlich Zellen mit komplexer DNA, die ein vorgesehenes Gen und einen Promotor umfaßt. Beispiele umfassen E.coli mit der Fähigkeit zur Bildung von β-Galactosidase (β-gal) und rekombinante E.coli mit der Fähigkeit zur Bildung von Interferon oder Hormonen, wie Insulin.

Das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren umfaßt mindestens eine Stufe, die aus der aus (a) einer Stufe zum Entfernen einer das Zellwachstum hemmenden Substanz und (b) einer Stufe zum Entfernen einer Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Diese Stufen werden nachstehend erläutert.

Als eine Ausführungsform des hochgradig wirksamen, erfindungsgemäßen Verfahrens zum Züchten von rekombinanten E.coli- Zellen wird nachstehend ein Züchtungsverfahren unter Verwendung des E.coli-Stamms HB 101 beschrieben, der das komplexe Plasmid pTREZ1 aufweist, das den Tryptophan-Promotor (trp) und das β-Galactosidase-Gen (β-gal) umfaßt.

Die Ergebnisse einer diskontinuierlichen Kultur von rekombinanten E.coli sind in Fig. 1 gezeigt. Glucose und Casaminsäure-Medium wurden als Substrate in Abhängigkeit vom Anstieg der Konzentration des gelösten Sauerstoffs zugeführt. Nach 18-stündiger Kultur erreichte die Zellkonzentration 13,1 g/l, aber zu diesem Zeitpunkt endete das Zellwachstum. 3-β-Indolacrylsäure (IA) als Induktionsmittel und Casaminsäure als Nährmedium wurden nach 32-stündiger Kultur zur Induktion der Bildung von β-Galactosidase zugegeben, aber eine Bildung von β-Galactosidase wurde nicht induziert. Die Beendigung des Zellwachstums schien also auf die Gegenwart von Substanzen im Kulturüberstand, die das Zellwachstum oder die Bildung von β- Galactosidase hemmen, zurückzuführen zu sein. Daher wurden zum Kulturüberstand gegeben, wobei das Zellwachstum noch andauerte, und zum Kulturüberstand nach 19-stündiger Kultur, wobei das Zellwachstum bereits beendet war, und die Zellen wurden gezüchtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Im Fall des Kulturüberstands nach 19-stündiger Kultur wuchsen die Zellen überhaupt nicht, und im Fall des Kulturüberstands nach 12-stündiger Kultur war das Zellwachstum so gering, daß die spezifische Zellwachstumsrate etwa die Hälfte des als Kontrolle gemessenen Wertes betrug. Wenn andererseits gefrorene und gelagerte Zellen in frisches Medium übergeimpft wurden, um die Wachstumsaktivität der Zellen zu untersuchen, dann war die spezifische Wachstumsrate der Zellen nach 12-stündiger Kultur und der Zellen nach 19-stündiger Kultur im wesentlichen die gleiche wie die für die Kontrolle gemessene; die Wachstumsaktivität der Zellen war also nicht verringert. Außerdem wurde die Bildung von β-Galactosidase durch Zugabe eines Induktionsmittels induziert. Auf der Grundlage dieser Tatsachen wurde festgestellt, daß mit einem Fortschreiten der Kultur Substanzen angereichert wurden, die das Zellwachstum oder die Induktion der Bildung von β-Galactosidase hemmten.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß es zur Stimulierung des Wachstums rekombinanter Zellen und zur Erhöhung der Zellkonzentration wichtig ist, die das Zellwachstum hemmende Substanz, die sich in der Kulturbrühe angereichert hat, zu entfernen und/oder die Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, zu entfernen.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben daher genauere Untersuchungen über die das Zellwachstum hemmende Substanz und über die Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, durchgeführt.

Im einzelnen wurde bei der vorstehend erwähnten Kultur von E.coli der Kulturüberstand nach 19-stündiger Kultur nach Beendigung des Zellwachstums gewonnen, und die Abtrennung der das Zellwachstum hemmenden Substanz wurde untersucht. Es wurde untersucht, ob eine durch Fraktionieren des Kulturüberstands entsprechend dem Molekulargewicht mit Hilfe einer Ultrafiltermembran mit einem Rückhaltevermögen für ein Molekulargewicht von 1000 erhaltene Flüssigkeit das Zellwachstum hemmt. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht von 1000 oder weniger hemmte das Zellwachstum, und aus dieser Tatsache wurde geschlossen, daß die hemmende Substanz ein niedriges Molekulargewicht aufweist. Sodann wurden ionische Substanzen von dieser Fraktion unter Verwendung eines Anionenaustauschharzes der Bezeichnung "IRA-400" und eines Kationenaustauschharzes der Bezeichnung "IR-120B" abgetrennt und hinsichtlich ihrer Wirkung auf das Zellwachstum untersucht, wobei festgestellt wurde, daß eine anionische Substanz das Zellwachstum hemmte. Aufgrund dieser Tatsache wurde festgestellt, daß es sich bei der das Zellwachstum hemmenden Substanz um eine anionische Substanz mit niedrigem Molekulargewicht handelt, und es wurde angenommen, daß es sich um eine organische Säure handelt, von der bekannt ist, daß sie von Zellen abgesondert wird. Dementsprechend wurde die die anionische Substanz mit niedrigem Molekulargewicht enthaltende Flüssigkeit auf organische Säuren mit Hilfe eines isotachophoretischen Analysators untersucht. Das Ergebnis der Analyse ist in Fig. 3 gezeigt. Die Elektrophorese wurde bei einem Elektrophoresestrom von 100 uA unter Verwendung von 0,01 m β- Alaninhydrochlorid-Lösung als Endlösung durchgeführt. Als Ergebnis eines Vergleichs mit den Komponenten des Kulturmediums wurde festgestellt, daß Essigsäure auf eine hohe Konzentration von 33 g/l angereichert wurde. Wenn die entsprechende Menge an Acetat einem frischen Medium zugegeben wurde und eine Züchtung durchgeführt wurde, dann wurde das Zellwachstum gehemmt. Diese Tatsache beweist, daß die Substanz, die die wichtigste Rolle bei der Hemmung des Zellwachstums spielt, Essigsäure war. Außerdem bestätigte eine Analyse des Kulturüberstands mit Hilfe der Gaschromatographie ebenfalls, daß es sich bei der Substanz um Essigsäure handelte.

Es ist bekannt, daß mit fortschreitender Kultur Mikroorganismen, tierische Zellen und pflanzliche Zellen organische Säuren abgeben, aber es ist überhaupt nicht bekannt, daß unter diesen organischen Säuren Essigsäure in einer großen Menge gebildet wird und das Zellwachstum rekombinanter E.coli Zellen hemmt. Dieser Befund wurde erstmals von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung erhalten.

Die Beziehung zwischen Zellwachstum und der Menge von in der Kulturbrühe angereicherten organischen Säuren, insbesondere von Essigsäure, wurde untersucht. Fig. 4 zeigt zeitabhängige Änderungen der Zellkonzentration, der spezifischen Wachstumsrate pro Stunde und der Essigsäurekonzentration in der Kulturbrühe, die auftraten, wenn Glucose und Casaminsäure-Medium kontinuierlich ab 4 Stunden und 15 Minuten nach dem Start der Kultur der rekombinanten E.coli-Zellen zugegeben wurden. Wie durch die Pfeile gezeigt ist, wurden rasche Änderungen der spezifischen Wachstumsrate zwischen 10-stündiger und 11-stündiger Dauer der Kultur und zwischen 18-stündiger und 19-stündiger Dauer der Kultur beobachtet. Die Zellwachstumsrate nach 19-stündiger Kultur wurde sehr gering, was andeutete, daß das Zellwachstum weitgehend beendet war. Die Essigsäurekonzentration betrug 6 g/l nach 10-stündiger Kultur und 17 g/l nach 18-stündiger Kultur. Aus dieser Tatsache ist ersichtlich, daß die Essigsäurekonzentration in der Kulturbrühe so eingestellt werden sollte, daß sie höchstens 17 g/l oder weniger vorzugsweise 6 g/l oder weniger beträgt. Mit anderen Worten, die das Zellwachstum hemmende Substanz kann entfernt werden, indem die Essigsäurekonzentration in der Kulturbrühe auf 17 g/l oder weniger und vorzugsweise auf 6 g/l oder weniger gehalten wird.

Ferner wurde festgestellt, daß bei Auslösen der Expression eines Gens durch Zugabe eines Induktionsmittels bei einer Essigsäurekonzentration von 8 g/l eine IA-Zugabe keine Bildung von β-Galactosidase verursacht, daß aber die Bildung von β- Galactosidase bei einer Essigsäurekonzentration von 3 g/l oder weniger induziert wird (vergl. Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1). Dies bedeutet also, daß die die Induktion des gewünschten Produkts hemmende Substanz entfernt werden kann, indem die Essigsäurekonzentration in der Kulturbrühe auf vorzugsweise 3 g/l oder weniger gehalten wird.

Aus den vorstehenden Ergebnissen sowie aus der Tatsache, daß organische Säuren als das Zellwachstum hemmende Substanzen wirken, und aus der gut bekannten Tatsache, daß Bacillus subtilis, Actinomyces, Hefen, tierische Zellen, pflanzliche Zellen und dergl. weitgehend das gleiche Verhalten wie E.coli zeigen, sind die nachstehenden Ergebnisse verständlich.

Das Züchten von Zellen von E.coli mit komplexer DNA und der Fähigkeit zur Bildung eines gewünschten Produkts erfordert (a) eine Stufe zur Entfernung der das Zellwachstum hemmenden Substanz, die Essigsäure darstellt, und/oder (b) eine Stufe zur Entfernung der Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, d. h. Essigsäure (nämlich eine Stufe zur Einstellung der Konzentration von Essigsäure auf einen niedrigeren Wert als den in Stufe (a) erhaltenen). Erfindungsgemäß wird ein Züchtungsverfahren, daß die beiden Stufen (a) und (b) umfaßt, bevorzugt. Vorzugsweise wird die Konzentration an Essigsäure im Nährmedium auf etwa 17 g/l oder weniger durch das Verfahren (a) und auf einen Wert von etwa 3 g/l oder weniger durch das Verfahren (b) eingestellt.

Erfindungsgemäß werden z. B. folgende Verfahren zur Entfernung der das Zellwachstum hemmenden Substanz oder der Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, eingesetzt: ein Verfahren, das die Entnahme eines Teils der Kulturbrühe, die Gewinnung der Zellen durch Zentrifugation und das Zurückführen der erhaltenen Zellen in den Kulturbehälter umfaßt; ein Verfahren unter Verwendung einer permeablen Membran, einer Ultrafiltermembran oder dergl.; und ein Verfahren unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes. Diese Verfahren können kontinuierlich ausgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren erfordert im wesentlichen (c) eine Stufe der Induktion der Bildung des gewünschten Produkts, zusätzlich zum vorstehend beschriebenen Verfahren (a) und/oder Verfahren (b). Als Verfahren zur Induktion der Bildung des gewünschten Produkts wird ein Verfahren angewandt, das die Zugabe eines Induktionsmittels für einen Promotor, der in der komplexen DNA in den Zellen enthalten ist, umfaßt. Dies bedeutet, daß z. B. im Fall des trp-Promotors die Zugabe von 3-β-Indolacrylsäure (IA) wirksam ist, und daß im Fall des lac-Promotors und des tac-Promotors die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) wirksam ist. Als weiteres Verfahren ist z. B. die Erhöhung der Temperatur der Kulturbrühe wirksam für den PL-Promotor.

Das Verfahren (c) wird vorzugsweise nach mindestens einem der vorstehend beschriebenen Verfahren (a) und (b) ausgeführt. Die Stufe (c) kann kontinuierlich ausgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren umfaßt vorzugsweise (d) eine Stufe der Förderung des Zellwachstums, zusammen mit der vorstehend beschriebenen Stufe (c). Als Verfahren zur Durchführung der Stufe (d) wird ein Verfahren angewandt, das die Zugabe eines für die verwendeten Zellen geeigneten Nährmediums umfaßt. Als Nährmedium ist z. B. Casaminsäure, ein aus Aminosäuren, Glucose, Hefeextrakt, Brühe und dergl. zusammengesetztes Gemisch, wirksam. Die Stufe (d) kann auch kontinuierlich durchgeführt werden.

Insbesondere wenn das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Züchtungsverfahren kontinuierlich oder diskontinuierlich angewandt wird, erlaubt es eine sehr wirksame Züchtung von Zellen mit komplexer DNA und auf diese Weise die Herstellung einer großen Menge eines gewünschten Produkts.

Als Verfahren zur Durchführung der vorstehend beschriebenen Verfahren (a), (b), (c) und (d) können herkömmliche Verfahren je nach Art der verwendeten Wirtszellen, der hemmenden Substanzen und des gewünschten, herzustellenden Produkts ausgewählt werden.

Als nächstes wird ein Beispiel einer Vorrichtung, die zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich ist, in Fig. 9 gezeigt. Ein Kulturmedium und Zellen werden in den Kulturbehälter 1 gegeben, und die rekombinanten Zellen werden gezüchtet, während Luft in den Kulturbehälter 1 durch die Rohrleitung 13 geleitet wird und die Kulturbrühe mittels eines Rührers 2 gerührt wird. In diesem Fall wird die Konzentration des in der Kulturbrühe gelösten Sauerstoffs in jeder Stufe mittels eines Fühlers 6 und eines Meßgerätes 5 für gelösten Sauerstoff gemessen, wobei beide im Kulturbehälter 1 angeordnet sind. Die Meßdaten werden an eine Steuereinrichtung 3 gesandt, die die Änderung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs aufzeichnet und die zum Zeitpunkt des raschen Anstiegs der Konzentration des gelösten Sauerstoffs Signale an die Dosierpumpe 9 übermittelt, um Substrat aus dem Substratbehälter 7 zuzuführen. Nach Züchten für eine gegebene Zeitspanne wird ein Teil der Kulturbrühe über die Rohrleitung 16 entnommen, und hemmende Substanzen werden daraus mit einer Vorrichtung 4 zur Entfernung hemmender Substanzen entfernt, wonach die so erhaltene Zellsuspension über eine Rohrleitung 15 in den Kulturbehälter zurückgeführt wird. Wenn die Zellkonzentration einen hohen Wert erreicht, dann werden die hemmenden Substanzen auf ähnliche Weise mittels der Vorrichtung 4 zu Entfernung hemmender Substanzen entfernt. Danach werden ein Induktionsmittel und Substrat aus dem Induktionsbehälter 8 mit Hilfe der Dosierpumpe 10 zugegeben, um die Bildung des gewünschten Produkts zu induzieren, wobei die Massenerzeugung des gewünschten Produkts durchgeführt wird. Vorzugsweise wird der Kulturbehälter 1 mit einer Vorrichtung zur Messung der Essigsäurekonzentration ausgestattet. Das innerhalb oder außerhalb der Zellen gebildete gewünschte Produkt wird durch Abtrennen und Reinigen in das endgültige Produkt übergeführt.

Wie vorstehend ausführlich beschrieben, können erfindungsgemäß durch bloße Entfernung der das Zellwachstum hemmenden Substanz und/oder der Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, und durch Induktion der Bildung des gewünschten Produkts während der Kultur hohe Zellkonzentrationen erreicht und die Herstellung einer großen Menge des gewünschten Produkts induziert werden.

Die Erfindung wird nachstehend mit Hilfe von Beispielen erläutert, die jedoch der Verdeutlichung und nicht der Beschränkung dienen.

Beispiel 1 Zellen:

E.coli-Stamm HB 101 mit komplexem Plasmid pTREZ1.

Anfangsmedium:

M9-Casaminsäure-Medium, das aus 1 g NH&sub4;Cl, 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 5 g NaCl, 0,1 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 15 mg CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 0,1 g Thiaminhydrochlorid, 0,1 g Prolin, 0,01 g Tryptophan, 5 g Glucose, 2,5 g Casaminsäure, 1,5 g Hefeextrakt und 1 l destilliertem Wasser besteht und einen pH-Wert von 7,0 aufweist. Zu dem Medium wurden 50 mg/l Ampicillin (Ap) gegeben, um nur E.coli mit dem komplexen Plasmid zu züchten.

Nährmedium:

Dieses Medium bestand aus 200 g Glucose, 4 g Prolin, 100 g Casaminsäure, 60 g Hefeextrakt, 0,4 g Tryptophan und 1 l destilliertem Wasser und wies einen pH-Wert von 7,0 auf.

Kulturbedingungen:

E.coli mit dem komplexen Plasmid wurden in vier 500 ml fassende Schüttelkolben mit jeweils 50 ml M9-Casaminsäure-Medium gegeben und über Nacht unter Schütteln mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Oszillation von 115 Mal pro Minute bei einer Temperatur von 37ºC gezüchtet. In einen 5 l fassenden Glasfermenter mit M9-Casaminsäure-Medium wurden 200 ml der so erhaltenen Vorkultur gegeben, und die Kultur wurde bei einem Anfangsvolumen der Kulturbrühe von 2 l, bei einer Temperatur von 370c, bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Belüftungsrate von 2 l/min gestartet. Die Änderung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs während der Kultur wurde nachgewiesen, und zum Zeitpunkt eines raschen Anstiegs der Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurden 50 ml Nährmedium zugegeben.

Wenn der Kulturüberstand nach 20-stündiger Kultur durch Zentrifugation entfernt und die Zellen gewonnen und in frischem Medium resuspendiert wurden, gefolgt von einer Zugabe an Substrat, dann erreichte die Zellkonzentration einen hohen Wert von 19,2 g/l nach 28,5-stündiger Kultur, wie in Fig. 5 gezeigt ist. Nach 31-stündiger Kultur wurden die Zellen erneut durch Zentrifugation gewonnen und dann in frischem Medium suspendiert, und wenn die Glucose verbraucht war, wurden 50 mg/l IA und 25 mg/l Casaminsäure zugegeben. Als Folge davon stieg die Menge der gebildeten β-Galactosidase auf das 1,4- fache des vor der Zugabe erhaltenen Wertes.

Beispiel 2

Es wurde erneut eine diskontinuierliche Kultur durchgeführt, wobei der Kulturüberstand während der Kultur durch Zentrifugation entfernt wurde, um Essigsäure zu entfernen, d. h., die im Kulturmedium angereicherte, das Zellwachstum hemmende Substanz.

Zellen:

E.coli-Stamm HB 101 mit komplexem Plasmid pTREZ1.

Anfangsmedium:

M9-Casaminsäure-Medium, das aus 1 g NH&sub4;Cl, 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 5 g NaCl, 0,1 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 15 mg CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 0,1 g Thiaminhydrochlorid, 0,1 g Prolin, 0,01 g Tryptophan, 5 g Glucose, 2,5 g Casaminsäure, 1,5 g Hefeextrakt und 1 l destilliertem Wasser besteht und einen pH-Wert von 7,0 aufweist. Zu dem Medium wurden 50 mg/l Ampicillin (Ap) gegeben, um nur E.coli mit dem komplexen Plasmid zu züchten.

Nährmedium:

Dieses Medium bestand aus 200 g Glucose, 4 g Prolin, 100 g Casaminsäure, 60 g Hefeextrakt, 0,4 g Tryptophan, 1 g Ampicillin und 1 l destilliertes Wasser und wies einen pH-Wert von 7,0 auf.

Kulturbedingungen:

E.coli mit dem komplexen Plasmid wurden in vier 500 ml fassende Schüttelkolben mit jeweils 50 ml M9-Casaminsäure-Medium gegeben und über Nacht unter Schütteln mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Oszillation von 115 Mal pro Minute bei einer Temperatur von 37ºC gezüchtet. In einen 5 l fassenden Glasfermenter mit M9-Casaminsäure-Medium wurden 200 ml der so erhaltenen Vorkultur gegeben, und die Kultur wurde bei einem Anfangsvolumen der Kulturbrühe von 2 l, bei einer Temperatur von 37ºC, bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Belüftungsrate von 3 l/min gestartet. Die Änderung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs während der Kultur wurde nachgewiesen, und zum Zeitpunkt eines raschen Anstiegs der Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurden 50 bis 150 ml Nährmedium für eine diskontinuierliche Kultur zugegeben. Essigsäure wurde in der Kulturbrühe durch Einführen des Kulturüberstands in einen Gaschromatographen mit einer Füllung der Bezeichnung "Unicarbon A-300 60/80" bestimmt, und der Kulturüberstand wurde entfernt, wenn sich etwa 10 g/l Essigsäure angereichert hatten. Die Entfernung des Kulturüberstands wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren der Kulturbrühe bei 6000 U/min durchgeführt, und die Zellen wurden gewonnen und in frischem Anfangsmedium suspendiert, so daß man ein Gesamtvolumen von 2 l erhielt. Anschließend wurde die Kultur erneut gestartet.

Ergebnisse:

Wenn in einer diskontinuierlichen Kultur nach 12, 18, 22 und 26 Stunden der Kulturüberstand durch Zentrifugieren entfernt wurde, dann erreichte die Zellkonzentration, wie in Fig. 6 gezeigt ist, einen hohen Wert von 21,3 g/l, bezogen auf die Trockenmasse. Wenn 50 mg/l an IA als Induktionsmittel und 25 mg/l an Casaminsäure als Material für die Bildung von β-Galactosidase nach 26,5-stündiger Kultur zugegeben wurden, dann erreichte die gebildete Menge an β-Galactosidase nach 41,5- stündiger Kultur 16 Einheiten/ml (was etwa dem 8-fachen Wert der vor der IA-Zugabe gebildeten Menge an β-Galactosidase entsprach).

Erfindungsgemäß können also Zellen so gezüchtet werden, daß durch Entfernen von Essigsäure, d. h. einer das Zellwachstum hemmenden Substanz, durch Zentrifugation eine hohe Zellkonzentration erreicht werden kann. Eine große Menge an nützlichem Produkt kann erhalten werden, indem die Expression eines vorgesehenen Gens unter Verwendung eines Induktionsmittels bewirkt wird.

Beispiel 3

Da das Zellwachstum durch Essigsäure, d. h., einer das Zellwachstum hemmenden, in der Kulturbrühe angereicherten Substanz, beendet wurde, wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugieren entfernt, und danach wurde ein Induktionsmittel zugegeben, um die Bildung von β-Galactosidase zu bewirken.

Eine diskontinuierliche Kultur wurde unter Verwendung der gleichen Zellen unter gleichen Kulturbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß während des Zellwachstums keine Entfernung des Kulturüberstands durch Zentrifugation durchgeführt wurde.

Ergebnisse:

Wie in Fig. 7 gezeigt ist, endete das Zellwachstum weitgehend nach 14-stündiger Kultur, wobei die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium 14 g/l erreichte. Die Zugabe an Substrat führte daher nur zur Bildung einer großen Menge an Essigsäure. Daher wurde der Kulturüberstand nach 22-stündiger Kultur durch Zentrifugation entfernt, und danach wurden die Zellen in frischem Medium resuspendiert, und die Kultur wurde erneut gestartet. Wenn 50 mg/l an IA und 25 g/l an Casaminsäure 30 Minuten nach dem Start der Kultur zugegeben wurden (zu diesem Zeitpunkt war Glucose als Substrat verbraucht), dann wurden nach 45-stündiger Kultur 9,1 Einheiten/ml an β- Galactosidase gebildet. Wenn IA und Casaminsäure zu diesem Zeitpunkt in der gleichen Menge wie vorstehend zugegeben wurden, dann wurde β-Galactosidase nach 68-stündiger Kultur in einer großen Menge von 22,1 Einheiten/ml gebildet. Die Essigsäurekonzentration in der Kulturbrühe betrug in diesem Fall 2,8 g/l zu dem Zeitpunkt, zu dem die Kultur nach Entfernen des Kulturüberstands erneut gestartet wurde, aber dann fiel sie allmählich ab, und erreichte im wesentlichen 0 nach 68- stündiger Kultur.

Wenn also Essigsäure, d. h. eine das Zellwachstum hemmende Substanz, und eine Substanz, die die Induktion des gewünschten Produkts hemmt, erfindungsgemäß entfernt wird, dann kann die Expression eines vorgesehenen Gens unter Verwendung eines Induktionsmittels bewirkt werden, so daß es möglich wird, eine große Menge eines gewünschten Produkts zu erhalten.

Vergleichsbeispiel 1

Eine Kultur wurde ohne Entfernung von Essigsäure, d. h. einer das Zellwachstum hemmenden, in der Kulturbrühe angereicherten Substanz, durchgeführt, und ein Induktionsmittel (IA) wurde zugegeben.

Eine diskontinuierliche Kultur wurde unter Verwendung der gleichen Zellen unter gleichen Kulturbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß keine Entfernung des Kulturüberstands durch Zentrifugation durchgeführt wurde.

Ergebnisse:

Wie in Fig. 8 gezeigt ist, wurden 50 mg/l an IA und 25 g/l an Casaminsäure nach 12-stündiger Kultur zugegeben, wobei die Zellkonzentration 9,5 g/l und die Essigsäurekonzentration 8,2 g/l erreichte, aber die Bildung von β-Galactosidase wurde nicht induziert.


Anspruch[de]

Verfahren zum Züchten rekombinanter E.coli-Zellen, die eine komplexe DNS aufweisen und zur Bildung eines gewünschten Produkts befähigt sind, bei dem die Expression eines vorgesehenen Gens verursacht wird und das resultierende gewünschte Produkt gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Stufen umfaßt:

(a) die wesentliche Entfernung einer das Zellwachstum inhibierenden Substanz, die Essigsäure darstellt,

(b) die wesentliche Entfernung einer die Induktion des gewünschten Produkts inhibierenden Substanz, die Essigsäure ist, und

(c) die Induktion der Bildung des gewünschten Produkts.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches (d) eine Stufe, in der das Zellwachstum gefördert wird, zusammen mit Stufe (c) umfaßt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Essigsäurekonzentration in der Kulturbrühe durch Stufe (a) auf 17 g/l oder weniger eingestellt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Konzentration an organischer Säure in der Kulturbrühe durch Stufe (b) auf etwa 3 g/l oder weniger eingestellt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches in Form einer diskontinuierlichen Kultur oder einer kontinuierlichen Kultur durchgeführt wird.







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