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Dokumentenidentifikation DE3879740T2 28.10.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0286171
Titel Dipeptidase, deren Isolierung aus Milchsäure-Bakterien, Immunkörper gegen diese Dipeptidase, Verwendung dieser Dipeptidase und dieser Immunkörper.
Anmelder Campina Melkunie B.V., Veghel, NL
Erfinder Konings, Willem Nicolaas, NL-9752 CJ Haren, NL;
Van Boven, Aart, NL-9717 BA Groningen, NL
Vertreter Zinngrebe, H., Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 64283 Darmstadt
DE-Aktenzeichen 3879740
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 31.03.1988
EP-Aktenzeichen 882006075
EP-Offenlegungsdatum 12.10.1988
EP date of grant 31.03.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.10.1993
IPC-Hauptklasse C12N 9/52
IPC-Nebenklasse C12P 21/00   C07K 3/18   C07K 15/00   G01N 33/573   G01N 33/577   A23C 19/032   A23L 1/03   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Milchsäurebakteriendipeptidase in isolierter Form, d.h. in einem weitgehend reinen Zustand im Vergleich zu dem Zustand, in dem sie in vivo in Milchsäurebakterien vorkommt.

Milchsäurebakterien, insbesondere Milchsäure- Streptococci wie z.B. Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis und Streptococcus diacetylactis, sowie andere Milchsäurebakterien, wie z.B. Leuconostoc-Arten, werden in großem Maßstab in der Lebensmittelindustrie, insbesondere in der Molkereiindustrie, zur Herstellung von fermentierten Milchprodukten, wie Käse, verwendet. Aufgrund der Produktion von Milchsäure aus Lactose wird das Lebensmittel gesäuert, wodurch Verderb des Produkts verhindert wird. Weiterhin spielen die Bakterien in der Aroma- und Geschmacksentwicklung des Nahrungsmittels eine Rolle. Ein wichtiger Vorgang hierbei ist die Zersetzung von Eiweiß.

Für Wachstum und Milchsäureproduktion brauchen die Bakterien ein Nährmedium, das essentielle Wachstumsfaktoren, wie z.B. Vitamine und Aminosäuren, zur Verfügung stellt. Milch ist ein geeignetes Nährmedium und gestattet Wachstum bis zu hohen Zelldichten. Der freie Aminosäuregehalt der Milch ist jedoch nicht hoch genug für diesen Zweck, so daß die Bakterien für ihre Aminosäureversorgung von ihrem proteolytischen System, das Milchproteine, insbesondere Kasein, abbaut, abhängig sind. Das proteolytische System von Milchsäurebakterien bleibt noch nach dem Wachstumsstop erhalten, d.h. in der Reifungsphase von Käse, wo die Zersetzung von Kasein zu Peptiden und anschließend Aminosäuren einen Beitrag zur Aromaentwicklung des Käses leistet.

Das proteolytische System von Milchsäurestreptokokken besteht aus verschiedenen Proteasen und verschiedenen Peptidasen. Die Proteasen befinden sich in der Zellwand der Bakterien, während sich die Peptidasen in der cytoplasmatischen Membran und innerhalb der Zelle befinden können.

Bis heute wurden lediglich einige Peptidasen aus Streptokokken isoliert und beschrieben. Hwang et al., Agric. Biol. Chem. 45 (1981) 159 - 165 und 46 (1982) 3049 - 3053 isolierten eine Dipeptidase mit geringer Substratspezifität aus Streptococcus cremoris H61. Geis et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 23 (1985) 79 - 84 extrahierten und reinigten eine mit der Zellwand assoziierte Aminopeptidase aus S. cremoris ACl. Desmazeaud und Zevaco, Milchwissenschaft 34 (1979) 606 - 610 isolierten zwei intrazelluläre Aminopeptidasen aus S. diacetylactis.

In der holländischen Käseindustrie ist S. cremoris das wichtigste Milchsäurebakterium. Ein gutes Verständnis des proteolytischen Systems von Milchsäurestreptokokken, wie z.B. S.cremoris, kann zur Verbesserung von Säurewecker-Kulturen und zu einer besseren Regulierung des Reifungsvorgangs beitragen, so daß, zum Beispiel, die Käsereifung beschleunigt oder die Bildung einer bitteren Geschmacksnote verhindert werden kann. Die Dissertation von R. Otto: "An ecophysiological study of starter streptococci" [Ökophysiologische Untersuchungen von Säurewecker-Streptokokken], Bereichsuniversität Groningen (1981) und die Dissertation von J. Hugenholtz: "Population dynamics of mixed starter cultures" [Populationsdynamik von Säurewecker-Mischkulturen], Bereichsuniversität Groningen (1986) enthalten viel grundlegendes Wissen. Die letztgenannte Dissertation enthält eine Untersuchung über die Proteasen von S.cremoris Wg2.

Der vorliegenden Erfindung liegt eine Untersuchung über die Peptidasen von S.cremoris Wg2 zu Grunde, in der eine bisher nicht beschriebene spezifische Dipeptidase isoliert und beschrieben wurde. Die Dipeptidase wurde durch Reinigung eines zellfreien Rohextrakts von S.cremoris Wg2 mittels DEAE-Sephacel - Säulenchromatographie und anschließende präparative Elektrophorese erhalten. Die Dipeptidase hat bezüglich verschiedener Dipeptide hydrolytische Wirkung und ist im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit gegen die metallchelatisierende Verbindung EDTA ein Metallenzym mit einem PH-Optimum bei ca. 8 und einem Temperaturoptimum bei ca. 50ºC. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des gereinigten Enzyms zeigt eine einzelne Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 55 kD. Das Enzym wird durch Verbindungen wie Mercaptoethanol und Dithiothreit, die Disulfidbrücken reduzieren können, stark gehemmt und reagiert nicht mit Sulfhydrylgruppenreagenzien wie z.B. Naphthylmaleinimid, Jodessigsäure und 5,5-Dithio-bis(2- nitrobenzoesäure). Eine Untersuchung der Kinetik der Leucylleucin- und Alanylalanin-Hydrolyse zeigt, daß das Enzym eine relativ niedrige Affinität zu diesen Substraten hat (Km 1,6 bzw. 7,9 mM), aber sehr hohe maximale Hydrolysegeschwindigkeiten (Vmax 3700 bzw. 13000 uMol/Min. mg Protein). Diese Werte stimmen mit Umsatzraten von ca. 3000 und ca. 1000 sec&supmin;¹ überein. Der pI (isoelektrischer Punkt) des Enzyms ist relativ niedrig (ca. 4,4), was die Tatsache erklärt, daß das Enzym mittels präparativer PAA-Gelelektrophorese gereinigt werden kann.

Die neue Dipeptidase nach der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von der aus S. cremoris H61 von Hwang et al. isolierten Dipeptidase bezüglich des Molekulargewichts, der Substratspezifität und der Peptidhydrolysegeschwindigkeiten und unterscheidet sich von den vorbeschriebenen Aminopeptidasen zumindest bezüglich der Substratspezifität. Die neue Dipeptidase hydrolysiert eine Reihe verschiedener Dipeptide, unter anderem Leu- Leu, Leu-Met, Leu-Val, Leu-Gly, Val-Leu, Phe-Leu und Ala- Ala. Andererseits ist die neue Dipeptidase nicht fähig, Dipeptide wie z.B. His-Leu, γ-Glu-Leu, Gly-Leu, α-Glu-Ala und Pro-Leu, welche Prolin, Histidin, Glycin oder Glutamat als N-endständige Aminosäure enthalten, wesentlich zu hydrolysieren, ebensowenig wie sie Tripeptide, Tetrapeptide und höhere Polypeptide zu hydrolysieren vermag.

Die neue erfindungsgemäße Dipeptidase hat mit den vorbeschriebenen bekannten Peptidasen aus Milchsäurestreptokokken gemein, daß das metallchelatisierende Mittel EDTA eine starke Hemmung auf die hydrolytische Aktivität ausübt, die anschließend durch Zusatz verschiedener zweiwertiger Kationen wie z.B. Co&spplus;&spplus; und Mn&spplus;&spplus; wiederhergestellt werden kann. Es ist jedoch überraschend, daß höhere Co&spplus;&spplus;-Konzentrationen wiederum eine Hemmwirkung ausüben.

Die Hydrolysegeschwindigkeit der neuen Dipeptidase ist wesentlich höher als die Geschwindigkeit, mit der die Zellen Peptide aufnehmen, so daß die Peptidaufnahme einen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt beim Peptidabbau durch die Streptokokken darstellt. Das läßt zum Beispiel darauf schließen, daß die Käsereifung beschleunigt werden kann, wenn die Bakterien Peptidasen aus der Zelle ausschleusen, oder wenn gereinigte Peptidase zum Nährmedium zugesetzt wird.

Die neue Dipeptidase ließe sich auch dazu verwenden, die Bildung eines unerwünschten bitteren Geschmacks während der Käsereifung zu verhindern. Tatsächlich wurde gefunden, daß einige S. cremoris-Stämme nach dem Kaseinabbau in verschiedenem Ausmaß Bitterkeit hervorrufen, offenbar wegen einer Akkumulation von Peptiden mit einem hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren, die durch die Peptidasen der in der Säureweckerzusammensetzung anwesenden Bakterien nur langsam abgebaut werden. Diese Problem ließe sich durch Verwendung der vorliegenden Dipeptidase verringern.

Weitere Anwendungszwecke, für die die Dipeptidase möglicherweise verwendet werden kann, sind die Klärung von Bier und alkoholfreien Getränken sowie natürlich eine Verwendung in der DNA-Technik im weiteren Sinn.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist zunächst die Dipeptidase als solche, d.h. eine Dipeptidase aus Milchsäurebakterien in isolierter Form, die durch ein Molekulargewicht von 55 kD ± 5kD, einen isoelektrischen Punkt von 4,4 ± 0,4, einer Reihe von Substraten, unter anderen die Dipeptide Leu-Leu, Leu-Met, Leu-Val, Leu-Gly, Val-Leu,Phe-Leu und Ala-Ala, jedoch nicht die Dipeptide His-Leu, γ-Glu-Leu, α-Glu-Ala sowie Peptide mit drei oder mehr Aminosäureresten, eine hydrolytische Aktivität mit einem Temperaturoptimum von 50ºC ± 10ºC, einem pH-Optimum bei 8 ± 1, sowie Empfindlichkeit gegen metallchelatisierende EDTA sowie die Reduktionsmittel Dithiothreit und Mercaptoethanol gekennzeichnet ist.

Obwohl die Dipeptidase, die tatsächlich gemäß dem Versuchsteil dieser Druckschrift isoliert und beschrieben wurde, von einem spezifischen Organismus stammt, nämlich einer proteinase-negativen Variante von S. cremoris Wg2, umfaßt die Erfindung ebenfalls die entsprechenden Dipeptidasen aus anderen Milchsäurebakterien, da sie entsprechende Eigenschaften haben und aus den Bakterien isoliert und auf ähnliche Weise gereinigt werden können. "Entsprechende Dipeptidasen" im obengenannten Sinn heißt nicht, daß die Peptidasen genau gleich sind, d.h. die gleiche Aminosäuresequenz haben, sondern daß sie der obengenannten Beschreibung der Dipeptidase entsprechen.

Eine genauere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf die Dipeptidase aus Milchsäurestreptokokken, insbesondere S.cremoris, vorzugsweise S. cremoris Wg2.

Die Begriffe "in isolierter Form" und "aus" sind nicht dahingehend zu verstehen, daß sie die Erfindung auf eine Dipeptidase beschränken, die aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert worden ist. Tatsächlich schafft die Erfindung die Möglichkeit, das Dipeptidasegen zu identifizieren und anschließend die Dipeptidase in transformierten Zellen oder Organismen mittels rekombinanter DNA- Technik zu produzieren. Für diesen Zweck könnte z.B. zuerst die Aminosäuresequenz der Dipeptidase oder eines Teils der Dipeptidase ermittelt werden. Auf dieser Grundlage können mittels des genetischen Kodes entsprechende DNA-Sequenzen abgeleitet werden, wonach geeignete DNA-Proben synthetisiert werden können, womit sich Dipeptidase-Boten-RNA (mRNA) der Zellen identifizieren und isolieren läßt. Mit Enzymen wie z.B. reverse Transcriptase und DNA-Polymerase läßt sich diese mRNA unter Verwendung an sich bekannter Verfahren zur Herstellung von Copy-DNA (cDNA) verwenden. Diese cDNA läßt sich anschließend mittels geeigneter Vektoren (hauptsächlich Plasmide) klonieren und in geeigneten Wirtszellen exprimieren, und die produzierte Dipeptidase kann auf einfache Weise aus diesen Wirtszellen gewonnen werden.

Die Erfindung schafft weiterhin die Möglichkeit, Antikörper gegen die Dipeptidase zu produzieren und diese anschließend zur Entfernung oder Isolierung der Dipeptidase aus ihrer natürlichen Umgebung oder aus den obengenannten transformierten Zellen oder Organismen zu entfernen oder zu isolieren.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher die Verwendung der neuen Dipeptidase zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper mit einer Affinität zu, und/oder Spezifität für, die Dipeptidase, die polyklonalen und monoklonalen Antikörper selbst und ihre Verwendung zum Nachweis der Dipeptidase in, oder zur Entfernung oder Isolierung der Dipeptidase aus, einer die Dipeptidase enthaltenden Mischung.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist natürlich die Verwendung der neuen Dipeptidase zur Herstellung von Nahrungsmittelprodukten wie z.B. Käse, schlagfähigen Produkten und Fleischprodukten, wobei die hydrolytischen Eigenschaften der Dipeptidase z.B. zu einer Beschleunigung der Käsereifung oder zur Verhinderung der Bildung eines bitteren Geschmacks verwendet werden. Die Erfindung umfaßt auch die so erhaltenen Nahrungsmittelprodukte.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung der neuen Dipeptidase aus Milchsäurebakterien, dadurch gekennzeichnet, daß ein roher zellfreier Extrakt aus den Milchsäurebakterien mittels Ionenaustausch-Säulenchromatographie fraktioniert wird, eine oder mehrere Fraktionen mit leucylleucin- hydrolytischer Aktivität elektrophoretisch getrennt und eine oder mehrere Fraktionen mit leucylleucin- hydrolytischer Aktivität gewonnen werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauschersäule eine DEAE-Sephacel -Säule verwendet und daß die Fraktionierung mittels Gradientenelution durchgeführt wird. Bei der Elektrophorese handelt es sich vorzugsweise um eine präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einer Säule, wobei der Säulenabfluß fraktionsweise gesammelt wird.

Die Erfindung wird im und durch den folgenden Versuchsteil und die beigelegten Zeichnungen näher beschrieben.

Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung der für die präparative Elektrophorese verwendeten Versuchsanordnung. Bezugsziffer 1 bezeichnet die PAA-Säule, Bezugsziffer 2 den Pufferstrom, Bezugsziffer 3 die Elutionskammer, Bezugsziffer 4 die Agarose, Bezugsziffer 5 den Gummistöpsel, Bezugsziffer 6 die Negativseite des Puffervorratsbehälters, Bezugsziffer 7 die Positivseite des Puffervorratsbehälters und Bezugsziffer 8 die Dialysemembran.

Abbildung 2 stellt die Ergebnisse der DEAE- Sephacel -Säulenchromatographie eines zellfreien Rohextrakts von S. cremoris Wg2 dar.

: Proteingehalt (A&sub2;&sub8;&sub0;)

º º : Mit der Cd/Ninhydrin-Methode gemessene Leucyl-Leucin-Peptidaseaktivität

x x : NaCl-Konzentration.

Fraktionen 148 - 175 wurden vereinigt.

Abbildung 3 stellt die Auswirkung der Temperatur auf die nach der Cd/Ninhydrin-Methode ermittelte Leucyl- Leucin-Aktivität in 20 mM HEPES pH 7,8 dar.

Abbildung 4 stellt die pH-Wirkung auf die Peptidaseaktivität dar, Messung in 20 mM Apfelsäure, 20 mM MES, 20 mM HEPES und 20 mM Borsäure, Einstellung der verschiedenen pH-Werte mit KOH. Die Peptidaseaktivität wurde nach der Cd/Ninhydrin-Methode mit Leucyl-Leucin bestimmt.

Abbildung 5 stellt die Reaktivierung von EDTA- behandelte Dipeptidase mit zweiwertigen Kationen dar:

( )Mn&spplus;&spplus;; ( )Co&spplus;&spplus;; (O)Zn&spplus;&spplus;; (v)Ca&spplus;&spplus;; (φ)Cu&spplus;&spplus;.

Material und Methoden Organismus und Herstellung eines zellfreien Extrakts

Für die Versuche wurde eine proteinase-negative Variante von S. cremoris Wg2 verwendet. Der Organismus wurde routinemäßig in einer 10% (G/V) sterilen rekonstituierten Magermilch mit 0,1% (G/V) Trypton bei einer Temperatur von -20ºC aufbewahrt. Für die Kultur von S. cremoris Wg2 wurde MRS-Bouillon (De Man et al., J. Appl. Bacteriol. 23 (1960), 130 - 135) verwendet, und die Fermentation erfolgte unter pH-Kontrolle bei 6,3 in einem 5-Liter-Fermenter. Membranvesikel von S. cremoris Wg2 wurden nach der Methode von Otto et al., J. Bacteriol. 149 (1982), 733 - 738 isoliert. Der Überstand, der durch Entfernung der Membranvesikel und ganzen Zellen aus der mit Lysozym behandelten Zellsuspension erhalten worden war, wurde als zellfreier Rohextrakt verwendet.

Enzymtests

(i) Die Werte für Leucyl-Leucin-Hydrolyseaktivität wurden dadurch bestimmt, daß die Freisetzung von Leucin nach der modifizierten Cd/Ninhydrin-Methode, wie von Van Boven und Konings, Appl. Environ. Microbiol. 51 (1986), 95-100 beschrieben, gemessen wurde.

(ii) Die Hydrolyse von alaninhaltigen Peptiden wurde durch Messung der Alaninfreisetzung mittels einer gekoppelten Enzymreaktion nach Grassl (1974) (L-alanine determination with GPT and LDH [L-Alanin-Bestimmung mit GPT und LDH], Seiten 1682-1685 (in H.U. Bergmeyer (Hrsg.) Methods in enzymatic analysis, Academic Press, Inc., New York, San Francisco und London) bestimmt. In einem Gesamtvolumen von 1 ml enthielt der Reaktionsansatz 0,1 M Tris-HCl pH 7,6, 50 ul einer geeigneten Enzymmenge, 100 ul 0,2 M Oxoglutarsäure, 50 ul 12 mM NADH, 10 ul Lactatdehydrogenase (1 mg/ml in 3,2 M (Na&sub4;)&sub2;SO&sub4;) und 25 ul Glutamatpyruvattransaminase (8 mg/ml in 3,2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ul Peptidlösung induziert, und die Hydrolyse der Peptide wurde laufend mittels eines Doppelstrahl-Spektralphotometers bei 340 nm als NADH-Abnahme überwacht. Die Enzymaktivitäten wurden unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten für NADH von 6,22 10³ M&supmin;¹cm&supmin;¹ berechnet.

(iii) Die Hydrolyse von leucinhaltigen Peptiden wurde durch Messung der Leucinfreisetzung bestimmt. Die Leucinmenge läßt sich mit einer gekoppelten Enzymreaktion nachweisen, in der o-Dianisidin (im reduzierten Zustand) oxidiert wird. In einem Gesamtvolumen von 1 ml enthält der Reaktionsansatz 0,2 M Triethanolamin pH 7,6, 50 ul einer geeigneten Enzymmenge, 5 ul 23,2 mM o-Dianisidin (in 0,5 N HCl), 5 ul Meerrettichperoxidase (10 mg/ml in 3,2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, und 30 ml L- Aminosäureoxidase. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ul Peptidlösung induziert, und die Hydrolyse wurde laufend spektralphotometrisch bei 436 nm über die Menge des gebildeten oxidierten o-Dianisidins überwacht. Die Enzymaktivitäten wurden unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten für oxidiertes o-Dianisidin von 8,1 10³ M&supmin;¹cm&supmin;¹ berechnet.

(iv) Die Hydrolyse von Leucyl-p-nitroanilid wurde nach der Methode von Exterkate, Neth. Milk Diary J. 29 (1975), 303-318 bestimmt. Leucyl-p-nitroanilid (200 ul 2mM) wurde 40 Minuten mit einer geeigneten Enzymmenge inkubiert. Die Reaktion wurde nach einem Zusatz von 200 ul 30% Essigsäure abgestoppt, und das Nitroanilid wurde bei 410 nm quantitativ bestimmt.

Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Enzymaktivitäten bei 30ºC gemessen.

DEAE-Sephacel -Säulenchromatographie

Eine DEAE-Sephacel -Säule (3,2 20 cm) wurde mit 10 mM K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0, mit 0,12 M NaCl equilibriert. Der nach Isolierung der Membranvesikel erhaltene zellfreie Extrakt von S. cremoris Wg2 wurde mit destilliertem Wasser auf die gleiche Konzentration wie der für die Equilibrierung der Sephacel -Säule verwendete Puffer verdünnt und anschließend auf die Säule aufgetragen. Nachdem die Säule mit 2 Volumina Equilibrierungspuffer gewaschen worden war, wurde das Enzym im gleichen Puffer mit einem linearen Gradienten von 0,12 -0,3 M NaCl eluiert. 2,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und nach der Cd/Ninhydrin-Methode auf Leucylleucin-Hydrolyseaktivität geprüft. Die Fraktionen mit der höchsten Enzymaktivität wurden zusammengegeben.

Präparative Elektrophorese

Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung der für die präparative Polyacrylamid-Elektrophorese (unter Verwendung einer 7,5% Polyacrylamidsäule, 1,5 x 14 cm) verwendeten Versuchsanordnung. Die Proteine werden auf der Polyacrylamidsäule mittels Elektrophorese getrennt. Diese Proteine werden aus der Säule eluiert und durch einen gleichbleibenden Pufferstrom, der quer zur Elektrophoreserichtung verläuft, gesammelt. Aus der DEAE- Sephacel -Säule erhaltene peptidasehaltige Fraktionen wurden auf 0,2 ml (19,8 mg Protein) konzentriert, im Verhältnis 1 : 1 mit Probenpuffer (25 mM Tris-Borat, pH 8,0, 18% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau) vermischt und auf die Polyacrylamidsäule aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einem Konstantstrom von 4 mA begonnen. Das Bromphenolblau erreichte das Säulenende nach 15-stündiger Laufzeit. Ein gleichmäßiger Pufferstrom (0,2 ml/Minute; 25 mM Tris-Borat pH 8,0) wurde durch die Elutionskammer gepumpt und an die Polyacrylamidsäule angeschlossen, und die Elektrophorese wurde weitere 10 Stunden bei einem Konstantstrom von 40 mA laufen gelassen. 5 ml Fraktionen wurden aus dem Eluat der Elutionskammer gesammelt und nach der Cd/Ninhydrin- Methode auf Leucylleucin-Hydrolyseaktivität geprüft. Fraktionen mit den höchsten Enzymaktivitäten wurden zusammengegeben.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid (PAA)-Gelelektrophorese wurde nach der Methode von Laemmli und Faure, J. Mol. Biol. 80 (1973), 575 - 599 durchgeführt. Die Proteinproben wurden im Verhältnis 1 : 1 mit Probenpuffer (0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 0,3% SDS, 8,6% Glycerin, 10% Mercaptoethanol und 7,07% Bromphenolblau) vermischt und auf die Gele aufgetragen.

Das Molekulargewicht der Enzyme wurde mittels der folgenden Bezugsproteine bestimmt: Phosphorylase B (92,5 kD), Rinderserumalbumin (66,2 kD), Ovalbumin (45,0 kD), Kohlensäureanhydrase (31,0 kD), Sojatrypsin (21,5 kD) und Lysozym (14,4 kD).

Die Silberfärbung der Gele wurde nach der Methode von Wray et al., Anal. Biochem. 118 (1981), 197-203 durchgeführt.

CIE

Eine Kreuzimmunelektrophorese (CIE) wurde wie von Van der Plas et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 1027 - 1037 beschrieben durchgeführt. Die zweite Dimension wurde 10 - 15 Stunden lang bei 2,5 V/cm durchgeführt. Die CIE- Gele wurden mit 0,5% Coomassie-Brilliantblau oder mit der Zymogramm-Färbemethode für Peptidaseaktivität wie von Van Boven und Konings, loc. cit. beschrieben, gefärbt.

PAA/CIE

PAA-Gelelektrophorese wurde mit einem 7,5% PAA- Gel durchgeführt. Von den vereinigten DEAE-Fraktionen wurden 0,75 mg Protein im Verhältnis 1 : 1 mit Probenpuffer (ohne SDS) verdünnt und auf das Gel aufgetragen. Nach 8-stündiger Laufzeit wurde eine Bahn mit Silber gefärbt. Die zweite Bahn wurde als erste CIE-Dimension verwendet, auf eine Glasplatte (5 10 cm) übertragen und in 6 ml 1% Agarose mit Antikörpern gegen zellfreien Extrakt von S.cremoris Wg2 eingebettet. Die zweite Dimension wurde wie oben für CIE beschrieben laufen gelassen, und das Gel wurde nach der Zymogramm-Methode für Peptidaseaktivität gefärbt.

Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung (IEF) auf Gelplatten wurde unter Verwendung von Servalyt Precotes Fertigplatten pH 3 - 10 durchgeführt (Serva Heidelberg, Westdeutschland). Der isoelektrische Punkt des Enzyms wurde unter Verwendung der folgenden Bezugssubstanzen bestimmt: Glucoseoxydase (pI = 4,15), Rinderserumalbumin (pI = 4,7), Kohlensäureanhydrase (pI = 6,5) und Cytochrom c (pI = 10,65).

Aminosäureanalyse

Eine Aminosäureanalyse des gereinigten Enzyms wurde unter Verwendung eines Kontron Liquimat III Aminosäureanalysator durchgeführt.

Wirkung von zweiwertigen Kationen und chemischen Reagenzien auf die Enzymaktivität

Gereinigtes Enzym (116 ug) wurde 10 Minuten lang bei 20ºC mit 0,25 mM EDTA inkubiert. Überschüssiges EDTA wurde durch 30-stündige Dialyse gegen 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-2-morpholinoethansulfonsäure (HEPES), pH 7,8, entfernt, wobei der Puffer zweimal gewechselt wurde. Das mit EDTA behandelte Enzym wurde mit verschiedenen zweiwertigen Kationen in verschiedenen Konzentrationen 10 Minuten lang bei 20ºC in 200 ul 20 mM HEPES pH 7,8 vorinkubiert. Die Enzymaktivitäten wurden mit Leucyl- Leucin als Substrat nach der Cd/Ninhydrin-Methode bestimmt.

Die Wirkung der chemischen Reagenzien wurde durch 10-minütige Inkubation von 200 ul einer geeigneten Enzymlösung mit verschiedenen Chemikalien bei 20ºC bestimmt. Nach der Zugabe von Leucylleucin wurde die Enzymaktivität nach der Cd/Ninhydrin-Methode bestimmt.

Wirkung oxidierender und reduzierender Reagenzien auf die Enzymaktivitäten

Gereinigtes Enzym wurde 5 Minuten lang mit Eisen(III)cyanid oder oxidiertem Glutathion vorinkubiert, um oxidierende Bedingungen zu erhalten, und mit Dithiothreit (DTT) oder reduziertem Glutathion, um reduzierende Bedingungen zu erhalten. 2 mM Leucylleucin wurden zugegeben, und die Peptidhydrolyse wurde nach 45 Minuten durch Zugabe von 3,5 mM Mercaptoethanol abgebrochen. Der Reaktionsansatz wurde 40-fach mit 40 mM Na&sub2;CO&sub3; pH 9,5 verdünnt, und die Peptide wurden durch Mischen der Proben mit gleichem Volumina 1,5 mg/ml Dansylchlorid in Acetonitril dansyliert. Dansyliertes Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C&sub1;&sub8;-Säule quantitativ bestimmt.

Proteinbestimmung

Soweit nicht anders angegeben, wurden die Proteinkonzentrationen nach der Methode von Lowry et al., J. Mol. Chem. 193 (1951), 265 - 275 mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.

Chemikalien

Bei allen verwendeten Chemikalien handelte es sich um im Handel erhältliche Substanzen.

ERGEBNISSE Enzymreinigung Schritt a.

Der zellfreie Rohextrakt wurde auf eine DEAE- Sephacel -Säule aufgetragen. Nach Elution mit einem NaCl- Gradienten wurden die höchsten leucylleucin-hydrolysierenden Aktivitäten in den mit den Nummern 150 bis 175 bezeichneten Fraktionen erhalten (Abbildung 2), was 0,18 - 0,19 M NaCl entsprach. Diese Fraktionen wurden vereinigt und nach Dialyse der Fraktionen gegen 10 mM KH&sub2;PO&sub4;/K&sub2;HPO&sub4; pH 7,0, um NaCl zu entfernen, nochmals auf eine DEAE-Sephacel -Säule aufgetragen. Fraktionen mit leu- leu-hydrolysierenden Aktivitäten wurden vereinigt und in einer Amicon-Filtereinheit mit PM-10 -Membran (Ausschlußgrenze Molekulargewicht 10 000) konzentriert.

Schritt b.

Nach Elektrophorese dieser konzentrierten Probe auf einem nicht denaturierenden PAA-Gel ergaben PAA/CIE- Versuche, daß sich das leucylleucin-hydrolysierende Enzym auf der positiven Seite des Gels befand. Das Enzym wurde deshalb weiter durch präparative Elektrophorese gereinigt. Fraktionen mit leu-leu-hydrolysierenden Aktivitäten wurden vereinigt und auf 7,5 ml konzentriert.

Die Enzymreinigung wird in Tabelle A zusammengefaßt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß das Enzym 1240-fach gereinigt wurde, wobei die Ausbeute aus dem zellfreien Rohextrakt 21,5% betrug.

Die nach präparativer Elektrophorese erhaltene gereinigte Enzymfraktion wies bei SDS/PAA- Gelelektrophorese eine einzige Bande auf, wenn das Gel mit Silber gefärbt wurde, was auf ein hochgereinigtes Enzym schließen läßt (die Verunreinigungen im SDS/PAA-Gel sind auf den Probenpuffer zurückzuführen). Dies wurde mit CIE-Versuchen mit dem gereinigten Enzym bestätigt. Von verschiedensten Fällungslinien in einem CIE-Muster eines zellfreien Extrakts gegen Antikörper, die mit einem zellfreien Extrakt als Antigen induziert worden waren, wies nur eine einzige Fällungslinie Leucylleucin- Aktivität auf. Bei Verwendung des gereinigten Enzyms als Antigen wurde eine Fällungslinie mit leucylleucin- hydrolysierender Aktivität beobachtet.

Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt

Das Molekulargewicht wurde mittels SDS/PAA- Gelelektrophorese und Gelfiltration auf einer Sephadex G- 100-Säule als 55 000 geschätzt. Die unter denaturierenden und natürlichen Bedingungen erhaltenen identischen Resultate lassen darauf schließen, daß es sich bei dem Enzym um ein aus einer einzigen Untereinheit bestehendes Monomeres handelt.

Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes des Enzyms mittels isoelektrischer Fokussierung auf Gelplatten bei pH 3 - 10 ergab einen Schätzwert von 4,4.

Temperaturabhängigkeit und Wirkung des pH-Wertes auf die Enzymaktivität

Die Temperaturabhängigkeit wurde durch Messung der leucylleucin-hydrolysierenden Aktivität in einem Bereich von 5 - 70ºC nach der Cd/Ninhydrin-Methode bestimmt. Vor der Zugabe von Leucylleucin wurde die Enzymmischung bei Versuchstemperatur equilibriert. Es wurde gefunden, daß die Optimaltemperatur für leucylleucin-hydrolysierende Aktivität ungefähr 50ºC war (siehe Abbildung 3). Bei 70ºC wurden noch immer 15% der Optimalaktivität gefunden.

Die pH-Wirkung wurde in einem Bereich von pH 4 - 10 in einem Puffer bestimmt, der jeweils 20 mM Apfelsäure, 2-N-Morpholinoethansulfonsäure (MES), HEPES und Borsäure enthielt und auf den erwünschten pH-Wert gebracht worden war (siehe Abbildung 4). Es wurde gefunden, daß der nach der Cd/Ninhydrin-Methode bestimmte optimale pH für die Hydrolyse von Leucylleucin ungefähr 8 betrug. Bei pH-Werten unter 5 wurde keine hydrolysierende Aktivität des Enzyms nachgewiesen, während bei pH 10 ungefähr 50% der Aktivität gefunden wurde.

Aminosäureanalyse

Die Aminosäurezusammensetzung des Enzyms wird in Tabelle B dargestellt. Das Enzym enthält sehr wenig Tyrosin und Tryptophan, was die Schwierigkeiten bei der quantitativen Bestimmung des gereinigten Enzyms mit dem Lowry-Proteintest erklärt.

Substratspezifität

Die hydrolytische Wirkung des Enzyms auf verschiedene Peptide wurde untersucht. Die Aktivitäten wurden durch Messung der Leucin- oder Alaninfreisetzung mittels einer gekoppelten Enzymreaktion bestimmt. Tabelle C stellt die relative Hydrolyserate verschiedener Peptide dar. Das Enzym war gegen verschiedene Dipeptide mit relativ hydrophoben und neutralen amino-endständigen Aminosäuren aktiv, woraus sich schließen läßt, daß der N-endständigen Aminosäure eines Peptids eine wichtige Bedeutung bei der Spezifität zukommt. Peptide verschiedener Zusammensetzungen, die drei oder mehr Aminosäuren enthielten, wurden nicht hydrolysiert. Andererseits wurden die meisten Peptide durch den zellfreien Extrakt hydrolysiert. Auch stellte sich heraus, daß den C-endständigen Aminosäuren eine Bedeutung bei der Enzym/Substrat-Wechselwirkung zukommt. Die Hydrolyseaktivität wurde mit Leucyl-p-nitroanilid als Substrat bestimmt. Tabelle D zeigt einen Vergleich der Aktivität bei der Hydrolyse von Leucyl-p-nitroanilid bei verschiedenen Stufen der Enzymreinigung. Der zellfreie Extrakt und die von der zweiten DEAE-Sephacel -Säule erhaltenen Fraktionen hydrolysieren Leucyl-p-nitroanilid, aber es stellte sich heraus, daß das gereinigte Enzym nicht zur Hydrolyse dieses Substrats befähigt war, was darauf schließen läßt, daß die C-endständigen Aminosäuren eines Dipeptids die Spezifität des Enzyms mitbestimmen. Peptide mit modifizierten Peptidbindungen konnten nicht hydrolysiert werden, weder durch den zellfreien Extrakt noch durch das gereinigte Enzym.

Aus diesen Beobachtungen wurde geschlossen, daß das Enzym gewisse Dipeptide, zu deren Hydrolyse es befähigt ist, bevorzugt, weshalb es als Dipeptidase bezeichnet werden kann.

Wirkung von Metallionen auf die Enzymaktivität

Nach Behandlung des Enyzms mit dem metallchelatisierenden Mittel EDTA war die Aktivität vollständig gehemmt. Ein Zusatz von 100 uM CoCl&sub2; oder MnCl&sub2; stellte die Aktivität wieder her (siehe Abbildung 5). Co&spplus;&spplus; erwies sich als das wirksamste Metallion, bei Konzentrationen über 200 uM wurde Co&spplus;&spplus; jedoch zum Hemmstoff. Andererseits hatte MnCl&sub2; eine maximale stimulierende Wirkung bei Konzentrationen über 200 uM, und bis 750 uM wurde keine Hemmwirkung auf die Enzymaktivität beobachtet. Die Enzymaktivität wurde auch durch ZnCl&sub2; oder CaCl&sub2; stimuliert, jedoch in geringerem Ausmaß. Eine Wiederherstellung der Enzymaktivität mit CuCl&sub2; war nicht möglich. Alle Metallionen wurden in der Form von Chloridsalzen zugegeben, um etwaige Auswirkungen der Anionen zu verhindern. Die Ergebnisse zeigen, daß bei der Dipeptidaseaktivität eine Abhängigkeit von zweiwertigen Metallionen vorliegt.

Wirkungen anderer potentieller Hemmstoffe

Verschiedene Sulfhydryl- und Disulfidgruppenreagenzien wurden auf Hemmung der Dipeptidaseaktivität geprüft. Die Dipeptidaseaktivität wurde stark durch DTT oder Mercaptoethanol gehemmt, welche Disulfidbrücken im Enzym zu reduzieren vermögen (siehe Tabelle E). Die zugabe von Sulfhydrylgruppenreagenzien, wie z.B. Naphthylmaleinimid, Jodessigsäure und 5,5-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) hatte keine Hemmwirkung auf die Dipeptidaseaktivität. Auch Phenylarsenoxid, ein Sulfhydrylreagenz, zeigte keine Hemmwirkung. p-Chlorquecksilber(II)benzoat hingegen hemmte die Dipeptidaseaktivität, vermutlich aufgrund einer sehr unspezifischen Hemmwirkung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß die Hydrolyseaktivität der Dipeptidase vom Oxidations/Reduktionszustand des Enzyms abhängt. Dies wurde durch Versuche bestätigt, in denen die Dipeptidaseaktivität durch einen Zusatz von DTT reduziert und anschließend durch einen Zusatz von Eisen(II)cyanid wieder oxidiert wurde (Tabelle F). Eine Oxidation der Dipeptidase hatte keine Auswirkungen auf die Aktivität, aber eine Reduktion mit DTT ergab eine starke Hemmung der Aktivität, die anschließend durch Eisen(III)cyanid wiederhergestellt werden konnte. Eine Veränderung des Redoxzustandes des Enzyms mit oxidiertem und reduziertem Glutathion zeigte ebenfalls, daß eine optimale Leucylleucin-Hydrolyse dann stattfindet, wenn sich die Dipeptidase im oxidierten Zustand befindet.

Tabelle A Reinigung einer aus S.cremoris Wg2 erhaltenen Leu-Leu- Dipeptidase.
Reinigungsstufe Volumen (ml) Gesamtprotein (mg) Gesamtaktivitäta) ( 10&supmin;&sup5;) Ausbeute (%) spezifische Aktivitätb ( 10&supmin;&sup5;) Reinigung zellfreier Extrakt I DEAE-Sephacel Glimmstrom-Elektrophorese

a) Die Gesamtaktivität wird ausgedrückt in nMol pro Minute hydrolysiertes Leucylleucin.

b) Die spezifische Aktivität wird als nMol pro Minute und mg Protein hydrolysiertes Leucylleucin ausgedrückt.

*) Die Proteinkonzentration wurde aus der Aminosäurezusammensetzung des Enzyms, dem Molekulargewicht und der in den Aminosäureanalysator eingegebenen Probenmenge bestimmt.

Tabelle B Aminosäurezusammensetzung einer aus S. cremoris Wg2 gewonnenen Dipeptidase.
Aminosäure Prozentsatz Anzahl Aminosäurereste pro Enzymmoleküla) Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Cystein Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Lysin Histidin Arginin Tryptophan a) Die Bestimmung des Molekulargewichts des Enzyms ergab einen geschätzten Wert von 55 000 N.N. = nicht nachweisbar
Tabelle C Substratspezifität einer aus S. cremoris Wg2 gewonnenen Dipeptidase
Substrat (2mM) Hydrolyse durch Peptidase(%) Hydrolyse durch zellfreien Extrakt(%) Leu-Leu Leu-Met Leu-Val Leu-Gly Val-Leu Phe-Leu Pro-Leu Bis-Leu γ-Glu-Leu Gly-Leu Ala-Ala α-Glu-Ala Leu-Leu-Leu Leu-Gly-Gly Ala-Ala-Ala (Ala)&sub4; (Ala)&sub8;
Tabelle D Hydrolyse von Leucyl-p-nitroanilid und Leucylleucin bei verschiedenen Stufen im Reinigungsverfahren einer aus S. cremoris Wg2 gewonnenen Dipeptidase.
Reinigungsschritt Hydrolyse von Leucyl-p-nitroanilid Hydrolyse von Leucylleucin zellfreier Extrakt Zweite DEAE-Sephacel-Säule Präparative Elektrophorese
Tabelle E Hemmung der Dipeptidaseaktivität
Hemmstoff (1 mM) Relative Aktivität Kein Zusatz Mercaptoethanol Phenylarsenoxid Jodessigsäure Naphthylmaleinimid 5,5-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure) p-Chlorquecksilber(II)benzoat
Tabelle F Dipeptidaseaktivität unter oxidierten und reduzierten Bedingungen
Zusatz Leucylleucin (mM)*) Hydrolysiertes Leucylleucin, relative Menge (%) Keiner Dipeptidase *) Nach Hydrolyse in der Inkubationsmischung verbleibendes Leucylleucin in mM


Anspruch[de]

1. Dipeptidase aus Milchsäurebakterien in isoliertem Zustand, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht von 55 kD ± 5kD und einen isoelektrischen Punkt von 4,4 ± 0,4 hat, unter anderem Substrate wie die Dipeptide Leu-Leu, Leu-Met, Leu-Val, Leu-Gly, Val-Leu, Phe-Leu und Ala-Ala, jedoch nicht die Dipeptide His-Leu γ-Glu-Leu, Gly-Leu, α-Glu-Ala und Peptide mit 3 oder mehr Aminosäureresten verwerten kann, eine Hydrolyseaktivität bei einem Temperaturoptimum von 50ºC ± 10ºC und ein pH- Optimum bei 8 ± 1 aufweist und gegen metallchelatisierendes EDTA und die Reduktionsmittel Dithiothreit und Mercaptoethanol empfindlich ist.

2. Dipeptidase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Milchsäure-Streptokokken gewonnen wird.

3. Dipeptidase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Streptococcus cremoris gewonnen wird.

4. Dipeptidase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Streptococcus cremoris Wg2 gewonnen wird.

5. Verfahren zur Isolierung einer Dipeptidase gemäß Anspruch 1 aus Milchsäurebakterien, dadurch gekennzeichnet, daß ein zellfreier Rohextrakt aus den Milchsäurebakterien mittels Ionenaustausch-Säulenchromatographie fraktioniert wird, eine oder mehrere Fraktionen mit leucylleucin-hydrolytischer Aktivität elektrophoretisch getrennt und eine oder mehrere Fraktionen mit leucylleucin-hydrolytischer Aktivität gewonnen werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DEAE-Sephacel -Säule als Ionenaustauschersäule verwendet und die Fraktionierung mittels Gradientenelution durchführt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichent, daß man eine präparative Polyacrylamid- Gelelektrophorese in einer Säule durchführt und den Säulenabfluß fraktionsweise sammelt.

8. Verwendung der Dipeptidase gemäß Ansprüchen 1 - 4 zur Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit Affinität zu und/oder Spezifität für die Dipeptidase.

9. Polyklonale und monoklonale Antikörper mit Affinität zu und/oder Spezifität für die Dipeptidase gemäß Ansprüchen 1 - 4.

10. Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gemäß Anspruch 9 zum Nachweis von Dipeptidase in, oder zu ihrer Entfernung oder Isolierung aus, einer die Dipeptidase enthaltenden Mischung.

11. Verwendung der Dipeptidase gemäß Ansprüchen 1 - 4 zur Herstellung von Nahrungsmittelprodukten wie z.B. Käse, schlagfähigen Produkten und Fleischprodukten.







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