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Dokumentenidentifikation DE3880573T2 28.10.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0301600
Titel Verfahren zum Nachweis unerwünschter Mikroorganismen.
Anmelder Sumitomo Electric Industries, Ltd., Osaka, JP
Erfinder Miyake, Shinichi c/o Osaka Works of, Konohana-ku Osaka-shi Osaka-fu, JP;
Yonemori, Fumihiko c/o Osaka Works of, Konohana-ku Osaka-shi Osaka-fu, JP;
Kometani, Masayuki c/o Osaka Works of, Konohana-ku Osaka-shi Osaka-fu, JP
Vertreter Eitle, W., Dipl.-Ing.; Hoffmann, K., Dipl.-Ing. Dr.rer.nat.; Lehn, W., Dipl.-Ing.; Füchsle, K., Dipl.-Ing.; Hansen, B., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Brauns, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Görg, K., Dipl.-Ing.; Kohlmann, K., Dipl.-Ing.; Kolb, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Ritter und Edler von Fischern, B., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 81925 München; Nette, A., Rechtsanw., 8000 München
DE-Aktenzeichen 3880573
Vertragsstaaten DE, FR, GB, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 01.08.1988
EP-Aktenzeichen 881124523
EP-Offenlegungsdatum 01.02.1989
EP date of grant 28.04.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.10.1993
IPC-Hauptklasse G01N 21/59
IPC-Nebenklasse C12Q 1/06   C12M 1/34   G01N 15/14   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung von unerwünschten Mikroorganismen, die eine Zellkultur kontaminieren.

Eine Zellkultur, die viele nahrhafte Substanzen enthält, ist aufnahmefähig für Kontaminationen durch unerwünschte Mikroorganismen, die in der Luft schweben, so wie unvollständige Bakterien und gramnegative aerobatische Bakteria, besonders wenn ein Austausch eines Kulturmediums oder eine Prüfung dem Wachstumsrate erwünschter Zellen im Verlauf der Kultivierung durchgeführt wird. Die Mikroorganismen, die in eine Zellkultur eindringen, wachsen gewöhnlich schneller als die erwünschten Zellen. Folglich wird es oft beobachtet, daß die Mikroorganismen, die einen Behälter auf einer Mikrotiterplatte befallen, sich auf andere Behälter ausbreiten und es ist nicht selten, daß alle Platten eines Brutschrankes mit unerwünschten Mikroorganismen kontaminiert werden.

Es ist daher notwendig, die An- oder Abwesenheit von Kontamination der Zellkultur durch Mikroorganismen so früh wie möglich zu prüfen, so daß die kontaminierten Behälter oder Platten sterilisiert oder ausgewechselt werden können, um die Mikroorganismen am weiteren Ausbreiten zu hindern.

Die Kontamination durch Mikroorganismen wurde lange visuell mittels Mikroskop geprüft. Jedoch erfordert eine solche Maßnahme eine Handhabung durch Mitarbeiter und bietet folglich eine zusätzliche Möglichkeit einer Kontamination durch unerwünschte Mikroorganismen. Zusätzlich ist die visuelle Prüfung nicht zufriedenstellend in Bezug auf Genauigkeit oder Zuverlässigkeit der Erfassung von Mikroorganismen und erfordert einen beachtlichen Zeitaufwand. Darüber hinaus hat die visuelle Prüfung einen zusätzlichen Nachteil, besonders wenn viele Mikrotiterplatten zu prüfen sind, da die Aktivität der kultivierten Zelle dahin tendiert, sich bei einem langzeitigen Ausgesetztsein einer Atmosphäre außerhalb der Kultivierung zu vermindern, was bei der Prüfung erforderlich ist.

EP-A-O 189 599 zeigt ein Messen einer Änderung im pH-Wert, das durch eine Änderung der Lichtabsorbtion angezeigt wird, um die Verschlechterung eines Zellkulturmediums zu erfassen.

Die Seiten 13-17 der "Electronic Application", Nr. 45, Dez./Jan. 1985/86, zeigen eine automatische Analyse von Proben, die mit einer fluoreszierenden Farbe gefärbt worden sind. Eine Quecksilberdampflampe beleuchtet die Proben zur Prüfung und Zählung unter Verwendung eines Mikroskops und einer Kamera.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Erfassung von unerwünschten Mikroorganismen in einem Zellkultivierungsgerät bereitzustellen und die unerwünschten Mikroorganismen automatisch, fehlerlos und schnell zu erfassen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erfassung unerwünschter Mikroorganismen beim Kultivieren von Zellen in einem lichtdurchlässigen Behälter bereitgestellt, das die Verfahrensschritte umfaßt:

- Erhalten eines digitalen Bildes der kultivierten Zelle von einem Bildverarbeitungsgerät zur Verarbeitung von Bildsignalen, die von einer Fernsehkamera übermittelt werden, die mit einer Beobachtungseinrichtung, die zur Beobachtung des Behälters bereitgestellt wird, gekoppelt ist,

- Zählen der Anzahl kultivierter, lebender Zellen, die in dem digitalen Bild der kultivierten Zellen erscheinen, und

- Messen einer Änderung der Lichtabsorbtion durch die Kulturflüssigkeit.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen erfaßt werden, wenn die Anzahl lebender Zellen klein ist, aber die Absorbtion von sichtbarem Licht gegenüber der Absorbtion gemessen in einer vorausgehenden Messung gestiegen ist. Es wird bevorzugt, daß das sichtbare Licht ein Licht einer Wellenlänge ist, die nicht von einem Indikator enthaltenin der Kulturflüssigkeit absorbiert wird.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht, die Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen zu erfassen, wenn die Anzahl von kultivierten Zellen klein und der pH-Wert der Zellkulturlösung stark gegenüber einer vorhergehenden Messung des pH-Wertes gefallen ist. Es ist vorteilhaft, den pH-Wert durch eine Änderung der Absorbtion des sichtbaren Lichtes zu messen.

Es ist ebenfalls vorteilhaft, daß die Änderung der Lichtabsorbtion mehr als zwei Lichtarten umfaßt, die ein erstes Licht, das eine Wellenlänge, die durch den Indikator, der in der Kulturflüssigkeit enthalten ist, absorbiert wird und ein zweites Licht einer Wellenlänge, die nicht durch den Indikator absorbiert wird, einschließt. Es wird darüber hinaus bevorzugt, daß mindestens eine Änderung der Lichtabsorbtion zur Erfassung der Änderung des pH-Wertes auf die Änderung der Absorbtion durch rotes Phenol in der Kulturflüssigkeit zurückzuführen ist.

Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung werden die Bilddaten, die in einem Bildverarbeitungssystem aufgenommen werden, verarbeitet, und die Anzahl der lebenden kultivierten Zellen wird durch einen Rechner gemessen. Zusätzlich wird die Änderung der Absorbtion des sichtbaren Lichtes durch die Kulturflüssigkeit gemessen oder der pH-Wert der Kulturflüssigkeit wird indirekt durch die Absorbtion des sichtbaren Lichtes unter Einsatz eines Indikators gemessen. Die Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen kann aufgrund der gemessenen Größen mit einer halbquantitativen Bestimmung erfaßt werden.

Vorteilhafterweise kann die Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen erfaßt werden, wenn die gemessene Anzahl von lebenden Zellen klein ist und die Absorbtion von sichtbarem Licht durch die Kulturflüssigkeit größer ist als die Absorbtion, die bei einer vorhergehenden Messung gemessen wurde oder wenn die gemessene Anzahl der lebenden Zellen klein ist und der pH-Wert der Kulturflüssigkeit stark gesunken ist im Vergleich zu dem pH-Wert, der bei einer vorhergehenden Messung gemessen wurde.

Im Fall, daß die Zellen noch nicht kultiviert sind, ist die Zahl der gemessenen Werte von lebenden Zellen klein. Bei dieser Bedingung kann als Weg der Messung der Anzahl von lebenden Zellen eine derartige Methode angewandt werden, die die Differenz der Helligkeit, die eine Eigenschaft lebender Zellen ist, nutzt oder eine andere Methode zur Durchführung eines Prozesses, bei dem ein räumliches Filter oder ein angepaßtes Filter, wie in der Japanischen Patentanmeldung 60-256154 gezeigt ist, genutzt wird.

Unter einer derartigen Bedingung, daß lebende Zellen spärlich vorhanden sind, ist die Absorbtion klein, da das sichtbare Licht einer Wellenlänge, die nicht von dem in der Kulturflüssigkeit enthaltenen Indikator absorbiert wird, nur von der Absorbtion und Streuung durch die toten Zellen und der Mikrotiterplatten in der Lichtdurchlässigkeit vermindert wird. Wenn die unerwünschten Organismen gemischt sind und unter den obigen Bedingungen wachsen, wächst die Absorbtion und Streuung des Lichtes durch unerwünschte Organismen, obwohl die gemessene Anzahl von lebenden Zellen klein ist. Als Ergebnis folgt wenn die gemessene Anzahl von lebenden Zellen klein ist und die Änderüng der Absorbtion von sichtbarem Licht erheblich größer als die Lichtabsorbtion ist, die in einer vorangegangenen Meßperiode gemessen wurde, kann die Anwesenheit von unerwünschten Organismen erfaßt werden.

Vorteilhafterweise kann die Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen durch die Messung der Lichtabsorbtion durch Verwendung nicht nur von derartigem Licht, einer Wellenlänge , die nicht durch den in der Kulturflüssigkeit enthaltenen Indikator absorbiert wird, erfaßt werden, sondern auch durch solch ein Licht einer Wellenlänge, die durch den Indikator absorbierbar ist. Außerdem kann sich die Lichtabsorbtion durch den Indikator enthaslten in der Kulturflüssigkeit durch die Änderung des pH- Wertes der Kulturflüssigkeit ändern. Folglich ist die letztere Methode zur Erfassung der Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen, die das Licht einer Wellenlänge, die durch den Indikator absorbierbar ist, nutzt, problematisch. Deshalb wird in einer Ausbildung der vorliegenden Erfindung der pH-Wert gemessen, ohne die Kulturflüssigkeit zu kontaktieren. Als Methode zur Erfassung des pH-Wertes ohne Kontaktierung der Kulturflüssigkeit ist es zur Berechnung des pH-Wertes wünschenswert, die Änderung der Lichtabsorbtion durch den Indikator wie rotes Phenol, das in der Kulturflüssigkeit enthalten ist, zu erfassen.

Um die Änderung des pH-Wertes zu erfassen, ist rotes Phenol mit einer derart niedrigen konzentration in der Kulturflüssigkeit enthalten, daß sie die Zellen nicht schädigt. Mit dem roten Phenol in einer derart niedrigen Konzentration ist es möglich, den pH-Wert der Kulturflüssigkeit unter Verwendung eines oder beider Lichtabsorbtionsspitzen bei 430 bis 440 nm (Nanometer) Wellenlänge und bei 560 nm zu erfassen.

Um den pH-Wert genau zu berechnen, ist es notwendig, den pH- Wert ausschließlich der Lichtabsorbtion und Streuung aufgrund von Färbungen des Behälters, wie einer Mikrotiterplatte, einer Schale oder einer Kulturflasche, und der Lichtabsorbtion und Streuung aufgrund von lebenden und toten Zellen, die im Behälter vorhanden sind, zu bestimmen. Deshalb ist es wünschenswert, den pH-Wert zu berechnen durch Subtraktion der Lichtabsorbtion bei der Wellenlänge von 650 nm von den Lichtabsorbtionen bei Wellenlängen von 430 bis 440 nm und der Wellenlänge von 560 nm und daraus ein Verhältnis zu bilden. Gemäß dieser Methode ist es möglich, den genauen pH-Wert zu berechnen, indem die unerwünschten Effekte durch Lichtabsorbtion und Streuung außer der Änderung des pH-Wertes eliminiert werden.

Wie oben erwähnt, ist es gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung möglich, automatisch das Eindringen von unerwünschten Mikroorganismen in sehr kurzer Zeit mit einer hohen Genauigkeit verglichen mit der konventionellen manuellen und visuellen Messung mittels Mikroskop zu erfassen.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine schematische Skizze, die eine Ausführungsbeispiel eines Systems zur Erfassung unerwünschter Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt,

Fig. 2 ist eine schematische Skizze, die ein Beispiel eines räumlichen Filters, das in dem System nach Fig. 1 benutzt wird, zeigt,

Fig. 3 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen der Änderung der Lichtabsorbtion in der Probe und dem pH-Wert zeigt, und

Fig. 4 und 5 sind Flußdiagramme, die wesentliche Teile der Arbeitsweise des Systems nach Fig. 1 zeigen.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSART

Bezogen auf Fig. 1 wird dort ein Mikroskop 2 zum Überwachen von unten eines Behälter 1 einer Mikrotiterplatte, die 96 Behälters aufweist (im folgenden Mikrotiterplatte mit 96 Positionen genannt) bereitgestellt. Jeder der Behälter ist lichtdurchlässig, so daß das Mikroskop die gesamte Fläche des Bodens des Behälters 1 übersehen kann, um den Inhalt im Behälter 1 zu beobachten. Das Mikroskop 2 ist mit einer CCD-Kamera gekoppelt, um elektrische Signale zu erzeugen, die das Bild, das durch das Mikroskop beobachtet wird, in bekannter Weise für jedes Pixel der CCD-Kamera wiedergeben. Die CCD-Kamera 3 ist mit einem Abbildverarbeitungsgerät 5, dessen Ausgang mit einem Rechner 6 und einem Fernsehmonitor 4 verbunden ist, gekoppelt. Das Verarbeitungsgerät 5 für ein Bildsignal digitalisiert die Bildsignale der CCD-Hamera 2 und verarbeitet die Bildsignale, um die Daten zu erzeugen, die lebende Zellen im Behälter 1 unter Verwendung von angepaßten Filtern zeigen. Ein Beispiel eines angepaßten Filters zeigt Fig. 2. Der Prozess zur Erzeugung der Daten, die die lebenden Zellen vertreten, wird in einem Flußdiagramm, das Fig.4 darstellt, gezeigt. In der Stufe S1 werden die Bildsignale von der CCD-Kamera 2 in das Bildverarbeitungsgerät 3 verbracht. Die Bildsignale werden digitalisiert und in einem Speicher (nicht gezeigt) in Stufe 2 gespeichert. Die digitalisierten Bildsignale, die in 7x7 Bildzellen enthalten sind, werden einem Anpassungsvorgang ausgesetzt, unter Verwendung des Anpassungsfilters oder des räumlichen Filters in bekannter Weise für eine Faltungsberechnung. Dieser Vorgang wird allgmein durch die folgende Gleichung ausgedrückt:

wobei Ax,y : die digitale Helligkeit an der Position x und y des eingegebenen Bildes ist,

A'x,y : die digitale Helligkeit an der Position x und y nach Filterung ist,

f(i,j) : der Koeffizient, der jedem Pixel des Filters entspricht, ist,

C1 : ein Koeffizient ist.

Die Bilddaten, die in der Stufe S3 passieren oder durch das angepaßten Filter angepaßt sind und die die kultivierten Zellen vertreten, werden verglichen mit einem Sollwert T1 in Bezug auf die Helligkeit der Zelle, um die lebenden Zellen zu selektieren, so daß Ax,y zu Bx,y einer binären digitalisierten Form (Bx,y=1 oder 0) konvertiert wird. Danach wird eine Reihenentwicklung für die 8 nächsten Nachbarn für jede Bildzelle in Stufe S5 durchgeführt.

Anschließend wird die Anzahl lebender Zellen in der Stufe S6 unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet.

Anzahl der lebenden Zellen

C&sub2; = Anzahl der Pixel, die eine lebende Zelle einnimmt.

Die oben erläuterte Vorgehensweise wird im Bildverarbeitungsgerät 5 und im Rechner 6 durchgeführt.

Um die Änderung der Lichtabsorbtion zu berechnen, führt der Rechner 6 den Arbeitsablauf nach Fig. 5 durch, der auf dem Lichtwertsignal, das vom Phototransistor 7 erhalten wird, basiert und in eine digitalisierte Form durch den A/D-Wandler 8 umgesetzt wird.

Gemäß Fig.5, Stufe S20, nimmt der Rechner den Anfangslichtwert I&sub0; auf, wenn keine Probe im Behälter 1 vorhanden ist. Nachdem die Probe in den Behälter 1 in der Stufe S21 eingebracht ist, nimmt der Rechner 6 vom Ausgang des A/D-Wandlers 8 den Lichtwert I&sub1; auf, der dem Betrag des Durchlichtes der Probe in Behälter 1 entspricht. Danach wird die Lichtabsorbtion in Stufe S23 berechnet basierend auf der Gleichung " - log I&sub1;/I&sub0; ". Die Messung und Berechnung wird in jeder vorbestimmten Periode wiederholt. Die berechnete Lichtabsorbtion erhalten in der gegenwärtigen Periode wird in Stufe S24 mit der Lichtabsorbtion, die in der vorangegangenen berechnet wurde, verrechnet, so daß ob, oder ob nicht eine Änderung in der Lichtabsorbtion erfolgt ist, erfaßt werden kann.

Im Fall, daß die Anzahl der lebenden Zellen, die in Stufe S6 berechnet wurden kleiner als eine vorbestimmte Größe ist, und die Änderung der Lichtabsorbtion größer ist, als eine weitere vorbestimmte Größe, stellt der Rechner 6 fest, daß unerwünschte Organismen im Behälter 1 vorhanden sind.

Die Einzelheiten des Vorgangs der Zählung der lebenden Zellen sind in der PCT/JP 87/00750 offenbart und der Offenbarungsgehalt davon wird als Referenz zitiert.

Der Anpassungsprozess zum Herausnehmen von lebenden Zellen kann in bekannter Weise durchgeführt sein, jedoch müßte dort eine Anpassungs-Filteranordnung in Form von Hardware eingesetzt werden.

BEISPIELE

Myeloma-Zellen Sp2/0, enthalten in einer Kulturflüssigkeit DULBECCO MEM von 10³ ml, wuden in jeden Behälter einer Mikrotiterplatte mit 96 Positionen gegossen und in einem CO&sub2;- Brutschrank für einen Tag kultiviert. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte dem CO&sub2;-Brutschrank entnommen und die Anzahl der lebenden Zellkulturen und die Änderung der Lichtabsorbtion gemessen.

Die Anzahl der lebenden kultivierten Zellen wurde gezählt in der Weise, daß Bildsignale, die von einer CCD-Kamera 3 erhalten wurden, die mit einem Mikroskop 2 zum Beobachten der Zellen im Behälter 1 gekoppelt ist, in ein Bildverarbeitungsgerät 5 (PIAS-1 hergestellt von Nippon PC Systems) eingegeben und digitalisiert wurden. Das Bild, das von der CCD-Kamera 3 erhalten wurde, wurde gleichzeitig in einen Fernsehempfängermonitor 4 eingegeben.

Eine Vergrößerung war derart, daß, wie in Fig.2 gezeigt die Konturen oder Außenlinien von einer Zelle in die peripheren Kanten eines räumlichen Filters, das aus 7 x 7 Matrix-Pixeln aufgebaut ist, eingeschrieben wurden. Die Größe eines einzigen Pixels war 1,8 um x 1.8 um. Die Bildsignale erhalten durch die CCD-Kamera wurden in 64 Graustufen digitalisiert. Das Muster des räumlichen Filters zur Anpassung war eingestellt, wie in Fig.2 gezeigt. In Fig. 2 zeigt die 0 einen Pixelbereich, in dem das Bild der Zelle nicht vorhanden ist, und 1 einen Pixelbereich, in dem die Helligkeit einer lebenden Zelle hoch ist und -1 den Pixelbereich, in dem die Helligkeit einer lebenden Zelle gering ist.

Nachdem die Bildsignale in eine binäre digitalisierte Form umgesetzt waren, wurde die Anzahl lebender Zellen vom Rechner 6 gemäß Gleichung (1) ermittelt.

N = Np/Nx (1)

wobei N die Anzahl der lebenden Zellen ist, Np die Anzahl der Pixel, in denen lebende Zellen vorhanden sind, ist, und Nx die Anzahl der Bildelemente ist, die von einer einzelnen Zelle eingenommen werden,

Um die Änderung der Lichtabsorbtion zu messen wurde als das Testmittel rotes Phenol (Phenolsulhophtalein) in einer derart niedrigen Konzentration verwendet, daß die lebenden Zellen nicht geschädigt wurden. Die Lichtabsorbtion wurde unter Berücksichtigung beider Lichtaussendungen von 430 nm und 558 nm Wellenlänge, bei denen Absorbtionsspitzen auftraten, und der Lichtaussendung einer Wellenlänge von 650 nm bei der die Absorbtion durch rotes Phenol nicht auftrat, gemessen. Danach wurde der pH-Wert unter Verwendung der Gleichung 2 berechnet.

wobei Abs558, Abs650 und Abs430 die Absorbtionen von Licht einer Wellenlänge von 558 nm, 650 nm und 430 nm sind.

Der pH-Wert wurde gemäß dem linearen Beziehung, das Fig. 3, zeigt berechnet.

Nach den Messungen der Anzahl lebender Zellen, der Lichtabsorbtion bei 650 nm Wellenlänge und des pH-Wertes wurde die Mikrotiterplatte, die lebende Zellen enthielt, der Luft für einen Tag ausgesetzt. Danach wurde die Mikrotiterplatte für einen Tag in den Brutschrank zur Kultivierung gestellt. Anschließend wurde die Anzahl der lebenden Zellen, die Lichtabsorbtion bei 650 nm Wellenlänge und der pH-Wert wieder gemessen.

Das Ergebnis der Messung zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1
Behälter Nr. vor Aussetzung an Luft nach Aussetzung an Luft Anzahl lebender Zellen N/mm²

Durch die Beobachtung der Behälter durch ein Mikroskop wurden lediglich lebende Zellen im Behälter Nr.1 beobachtet. Im Behälter Nr.2 war die Anzahl lebender kultivierter Zellen klein und die Absorbtion von sichtbarem Licht war beträchtlich erhöht und es wurde erkannt, daß unerwünschte Mikroorganismen wuchsen. Im Behälter Nr.3, in dem die Anzahl lebender kultivierter Zellen klein war und bei dem der aus der Änderung der Absorbtion des sichtbaren Lichtes berechnete pH-Wert stark abgesunken war, wurde erkannt, daß gramnegative aerobatische Bakteria wuchsen. Aufgrund dieser Ergebnisse ist es augenscheinlich, daß eine Kontamination durch unerwünschte Mikroorganismen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfaßt werden kann.

In Anbetracht des Vorangegangenen ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, wenn Zellen in einem Behälter, der sichtbares Licht durchscheinen läßt, wachsen, die Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen in der Kulturflüssigkeit zu erfassen durch die Änderung der Absorbtion von sichtbarem Licht und durch die Anzahl von lebenden kultivierten Zellen, die aus dem digitalen Bild kultivierter Zellen erhalten wird, das durch die Fernsehkamera, die mit einem Beobachtungsgerät wie einem Mikroskop gekoppelt ist, in das Bildverarbeitungsgerätgebracht wird. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das Eindringen unerwünschter Mikroorganismen vermindert werden, weil das Eindringen durch die unerwünschten Mikroorganismen in einer kurzen Zeitspanne automatisch und kontaktfrei erfaßt werden kann. Es ist möglich, die negative Wirkung der unerwünschten Mikroorganismen auf wunschenswerte Organismen zu vermindern, durch Kürzung der Zeitspanne, in der die Zellen der Kultivierungsatmosphäre entnommen werden. Insbesondere ist esvorteilhaft, daß bei einer großen Menge zu kontrollierender Zellbehälter das Eindringen von unerwünschten Mikroorganismen mit hoher Genauigkeit und in einer kürzen Zeitspanne leicht erfaßt werden kann.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Erfassung unerwünschter Mikroorganismen beim Kultivieren von Zellen in einem lichtdurchlässigen Behälter (1), das die Verfahrensschritte umfaßt:

- Erhalten eines digitalen Bildes der kultivierten Zelle von einem Bildverarbeitungsgerät (5) zur Verarbeitung von Bildsignalen, die von einer Fernsehkamera (3) übermittelt werden, die mit einer Beobachtungseinrichtung (2), die zur Beobachtung des Behälters bereitgestellt wird, gekoppelt ist,

- Zählen der Anzahl kultivierter, lebender Zellen, die in dem digitalen Bild der kultivierten Zellen erscheinen, und

- Messen einer Änderung der Lichtabsorbtion durch die Kulturflüssigkeit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das darüber hinaus den Verfahrensschritt umfaßt, bei dem beurteilt wird, ob die Anzahl der lebenden Zellkulturen kleiner als ein vorbestimmter Wert ist und ob die Absorbtion des sichtbaren Lichtes größer ist als die Lichtabsorbtion in einer vorangegangenen Messung.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das sichtbare Licht ein derartiges Licht ist, das nicht von einem in der Kulturflüssigkeit enthaltenen Indikator absorbiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, das darüber hinaus den Verfahrensschritt umfaßt, bei dem beurteilt wird, ob die Anzahl der lebenden Zellkulturen kleiner als ein vorbestimmter Wert ist und ob der pH-Wert der Kulturflüssigkeit im Vergleich zu einem vorhergehenden gemessenen pH-Wert um mehr als einen vorbestimmten Betrag gesunken ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der pH-Wert aus der Änderung der Absorbtion des sichtbaren Lichtes in der Kulturflüssigkeit berechnet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Änderung der Absorbtion des sichtbaren Lichtes eine Änderung der Lichtabsorbtion von mehr als zwei Lichtarten ist, von denen eine die Lichtabsorbtion von Licht ist, das durch den in der Kulturflüssigkeit enthaltenen Indikator absorbierbar ist, und von denen eine andere die Lichtabsorbtion von dem Licht ist, das nicht in dem Indikator absorbiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Änderung der Absorbtion des sichtbaren Lichtes mehr als zwei derartige Änderungen einschließt und mindestens eine derartige Änderung von der Lichtabsorbtion durch rotes Phenol, das in der Kulturflüssigkeit enthalten ist, verursacht wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche außerdem umfassend:

- einen Verfahrensschritt eines Bestrahlens eines lichtdurchlässigen Behälters, der Organismen enthält, mit mindestens einer Lichtart,

- einen Verfahrensschritt eines Überwachens eines Bilds der Mikroorganismen im Behälter durch Empfang des Lichtes, das den Behälter passiert mittels einer Fernsehkamera, die an ein Mikroskop angebracht ist,

- einem Verfahrensschritt eines Umsetzens der Bildinformation, die von der Kamera erhalten wird, in eine digitale Information, die das Bild der lebenden kultivierten Zelle im Behälter darstellt,

- einem Verfahrensschritt eines Erfassens einer Änderung der Lichtabsorbtion des Durchlichts durch den Behälter, und

- einem Verfahrensschritt eines Beurteilens, ob der Zählwert der lebenden Zellen kleiner ist als ein vorbestimmter Wert und die Änderung der Lichtabsorbtion größer ist als ein weiterer vorbestimmter Wert zur Erfassung der Anwesenheit von unerwünschten Mikroorganismen im Behälter.







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