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Dokumentenidentifikation DE3689071T2 10.02.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0247071
Titel IMMUNHEILBEHANDLUNG.
Anmelder The Australian National University, Acton, Australian Capital Territory, AU
Erfinder COOPER, Peter, Dodd, Monash, ACT 2904, AU
Vertreter Feiler, L., Dr.rer.nat.; Hänzel, W., Dipl.-Ing.; Kottmann, D., Dipl.-Ing, Pat.-Anwälte, 81675 München
DE-Aktenzeichen 3689071
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 17.10.1986
EP-Aktenzeichen 869062281
WO-Anmeldetag 17.10.1986
PCT-Aktenzeichen AU8600311
WO-Veröffentlichungsnummer 8702679
WO-Veröffentlichungsdatum 07.05.1987
EP-Offenlegungsdatum 02.12.1987
EP date of grant 22.09.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.02.1994
IPC-Hauptklasse C08B 37/18
IPC-Nebenklasse A61K 31/715   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft die Herstellung und Identifizierung einzelner polymorpher kristalliner Formen von Inulin, inulinhaltige immuntherapeutische Zubereitungen und ein Verfahren zur Antitumorbehandlung durch Verarbreichen der betreffenden Zubereitungen, in denen Inulin in einer unlöslichen oder teilchenförmigen Form vorliegt.

"Inulin" ist ein einfaches inertes Polysaccharid aus einer Familie linearer β-D- (2→1) polyfructofuranosyl-α-D- Glucosen, bei denen eine unverzweigte Kette von bis zu 100 Fructoseeinheiten an eine einzige endständige Glucose gebunden ist, wobei das End-Fructose-Glucose-Paar zufällig mit Saccharose identisch ist. Es gibt keine weiteren Komponenten. Inulinzubereitungen sind folglich molekular polydisperse (Molekulargewichte bis zu 16000) neutrale Polysaccharide einfacher bekannter Zusammensetzung. Inulin ist das Depotkohlenhydrat von Compositen und billig aus Dahlienknollen erhältlich. Es besitzt ein relativ hydrophobes, polyoxyethylenartiges Rückgrat. Diese ungewöhnliche Struktur plus seine nicht-ionisierte Natur gestatten ein Umkristallisieren und eine einfache Zubereitung in sehr reinem Zustand.

Obwohl die molekulare Zusammensetzung von Inulin gut bekannt ist, sind die berichteten Bestimmungen seiner Löslichkeit widersprüchlich. So beschreibt beispielsweise der Merck Index Inulin als "in kaltem Wasser schwach löslich, löslich in heißem Wasser", während eine quantitative Untersuchung ("Biochem. J." 1965, 95, 41-47) andeutet, daß zwei unterschiedliche Inulinformen existieren, die erste erhält man durch Fällen aus Wasser, die zweite durch Fällen aus Ethanol. Beide Formen sind in Wasser bei 37ºC im wesentlichen löslich. Es ist ferner bekannt, daß Inulinsuspensionen beim Stehenlassen weniger löslich werden. Die durch Fällung aus Wasser erhaltene Form wird als α-Inulin bezeichnet, die durch Fällung aus Ethanol erhaltene Form ist als β-Inulin bekannt. Die Konformationsunterschiede zwischen den beiden Formen wurden jedoch nicht bestimmt. Es gibt auch (noch) kein Verfahren, das zwischen den verschiedenen polymorphen Inulinformen zu unterscheiden vermag.

Bei der Entwicklung eines Verfahrens zum Unterscheiden der verschiedenen Inulinformen wurde eine dritte, bislang unbekannte Polymorphe aufgefunden und isoliert.

Diese dritte Polymorphe, im folgenden als "gamma- Inulin" bezeichnet, ist in Wasser bei 37ºC praktisch unlöslich, bei Temperaturen im Bereich von 70 bis 80ºC jedoch wie die α- und β-Formen löslich. Die Reihe polymorpher Formen, in denen Inulin kristallisiert, lassen sich durch ihre unterschiedlichen Lösungsgeschwindigkeiten in wäßrigen Medien, die von praktisch augenblicklich bei 23ºC löslich (β0/23-Inulin) über eine bei 37ºC mit einer Halbwertszeit von 8 min lösliche Form (α 3/37-Inulin) zu einer bei 37ºC praktisch unlöslichen Form (gamma-Inulin) reichen, kennzeichnen. Sämtliche Formen sind ineinander überführbar, die stärker löslichen und instabilen gehen beim Stehenlassen in weniger lösliche und stabilere Formen über. Dies ist lediglich durch vollständiges Auflösen und anschließendes Umkristallisieren reversibel. Das Endprodukt ist das stabile gamma- Inulin.

Erfindungsgemäß wird eine Zubereitung bereitgestellt, die teilchenförmiges Inulin oder ein teilchenförmiges Inulinderivat enthält und dadurch gekennzeichnet ist, daß die Teilchen nach 18 Tagen bei 37ºC in Wasser in durch den Brechungsindex nicht nachweisbarer Form (im folgenden als "gamma-polymorphe Form" bezeichnet) löslich sind, wobei die Zubereitung von den α- und β-polymorphen Formen praktisch frei ist.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren aktiven Komponenten umfassen nicht nur Inulin, β-D-[2-1]-polyfructofuranosylα-D-Glucose, sondern auch dessen Derivate einschließlich β-D-[2-1]Polyfructose, die man durch enzymatische Entfernung der Endglucose aus Inulin, beispielsweise unter Verwendung eines Invertase- oder Inulaseenzyms mit der Fähigkeit zur Entfernung dieser Endglucose, erhält. Andere unter die Erfindung fallende Inulinderivate sind solche, bei denen die freien Hydroxylgruppen verethert oder verestert sind, beispielsweise in üblicher bekannter Weise chemisch alkyl-, aryl- oder acylsubstituiert sind.

Die aktive Komponente besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht über 3000, insbesondere über 8000.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Zubereitung Teilchen von gamma-Inulin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

(a) sein Molekulargewicht im Bereich von 8000 bis 16000 liegt und

(b) es nach 18 Tagen bei 37ºC in Wasser in durch den Brechungsindex nicht nachweisbarer Form löslich ist.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft diese Erfindung eine Zubereitung mit einem zuvor beschriebenen gamma-Inulin in einer stabilen, sehr reinen Suspension von Teilchen eines Durchmessers < 1um. Eine solche Suspension hat sich als für eine in-vivo- und invitro-Aktivierung des später detaillierter beschriebenen alternativen Komplementwegs (APC) spezifisches Reagenz erwiesen.

Man hat sich vorgestellt, daß diejenigen Inuline oder Inulinderivate, deren Molekulargewichte zu niedrig sind, um in die gamma-Form überzugehen, weniger löslich gemacht werden können und folglich einfacher in unlöslicher Kristallform hergestellt werden können, wenn man sie in geeigneter Weise, beispielsweise mit Alkyl-, Aryl- oder Acylgruppen, chemisch substituiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von gamma-Inulin aus einer beliebigen Quelle, z. B. handelsüblichem Inulin.

Allgemein gesagt umfaßt das Verfahren folgende Stufen:

1. Im allgemeinen erfolgt zunächst eine Entfernung von Spurenverunreinigungen;

2. Dann wird aus Wasser (vorzugsweise bei alkalischem pH-Wert) bei einer Temperatur erheblich unterhalb von 37ºC umkristallisiert, um ein feinteiliges Teilchenmaterial in Suspension zu erhalten;

3. Anschließend wird die Suspension 1 bis 4 Tag(e), beispielsweise 1 bis 3 Tag(e), auf eine Temperatur im Bereich von 25 bis 45ºC erwärmt;

4. Nun wird die Suspension 0,5 bis 1,5 h lang auf eine Temperatur im Bereich von 40 bis 55ºC weiter erwärmt und

5. das hierbei erhaltene unlösliche gamma-Inulin wird aus der Suspension isoliert.

Die folgenden Stufen bilden ein Reinigungsverfahren für die Herstellung von endotoxin(ET)-freiem "gamma-Inulin zu Injektionszwecken":

1. Inulinpulver (beispielsweise) solches aus dem Handel wird zunächst zur Entfernung von Spurenverunreinigungen behandelt. Dies erreicht man durch Waschen, durch Suspendieren in Wasser und Resedimentieren, Umkristallisieren aus Wasser unter minimalem Erwärmen (vorzugsweise auf eine Temperatur unter 70ºC) und Abkühlen oder Gefrieren und Auftauen, und Hindurchleiten (des Inulins) in gelöstem Zustand durch Ionenaustauscher, z. B. DEAE-Cellulose und sulfoniertes Polystyrolharz. Der pH-Wert wird vorzugsweise über 6,5 gehalten. Danach wird die Lösung sterilisiert und die Endotoxinfreiheit durch Filtrieren durch ein geeignetes Filter (beispielsweise) Zetapor 0,2 um SP-Grad, ladungsmodifizierte Nylon 66-Membran) sichergestellt.

2. Die Lösung wird in einen feinteiligen Niederschlag (der Teilchendurchmesser beträgt vorzugsweise weniger als 1 um) eines löslichen Inulins (hauptsächlich die α-Form) durch Umkristallisieren bei einer Temperatur weit unter 37ºC, vorzugsweise bei 5ºC, und vorzugsweise bei hohem pH-Wert (beispielsweise unter Verwendung einer 0,1%igen Ammoniaklösung) und einer Konzentration vorzugsweise über 50 mg/ml Inulin überführt. Nach einigen Tagen, in der Regel 5 bis 7 Tagen, ist der Hauptteil des Inulins kristallisiert.

3. Danach wird die Suspension auf eine höhere Temperatur, vorzugsweise im Bereich von 30º bis 40ºC, etwa 1 bis 3 Tag(e) lang weiter erwärmt. Hierbei geht der Hauptteil des Inulinniederschlags in die gamma-Form über.

4. Danach wird die Suspension eine kürzere Zeit lang (etwa 1 h) auf eine höhere Temperatur, vorzugsweise eine solche im Bereich von 45 bis 50ºC, weiter erwärmt, um die Umwandlung zu vervollständigen und jegliches zur Umwandlung unfähiges α-Inulin in Lösung zu bringen.

5. Die Suspension kann durch Sedimentieren und Resuspendieren in Wasser in hohem Maße von löslichen Substanzen befreit werden. Danach wird die Suspension auf eine Standardkonzentration, beispielsweise 62,5 mg festes Inulin/ml, die beim Vermischen mit 1/4 Volumen 4%iger g/v Kochsalzlösung eine 50 mg/ml isotonische Kochsalzlösung liefert, resuspendiert.

Die Konzentrationen lassen sich mit einem Refraktometer bestimmen. Der Dispersionsgrad wird durch geeignete Maßnahmen, z. B. durch Dichtegradientzentrifugieren oder mittels eines Elektronenmikroskops, geprüft.

Bei sämtlichen beschriebenen Stufen nach Stufe 1 bedient man sich endotoxinfreier Materialien und vollaseptischer Techniken. Die Suspension kann vor oder nach dem Stehenlassen bei 5ºC mit Kochsalzlösung auf Isotonizität eingestellt werden. Abgesehen von einer schwachen Hydrolyse ist sie bis zu 45ºC stabil, vorzugsweise wird sie jedoch nicht weiter erwärmt. Nach dem Gefrieren und Auftauen ist die Suspension immer noch aktiv, die Teilchen können jedoch verbacken sein.

Frühere Forschungen lassen vermuten, daß es ein fundamentales Immunprinzip gibt, das möglicherweise bei der Krebstherapie ausnutzbar ist. Unglücklicherweise ist die Rolle des Immunsystems bei der Genese/Beseitigung von Krebs (noch) nicht vollständig geklärt, es verbleibt vielmehr ein Bereich erheblicher Widersprüche und Zweifel. Es sind zahlreiche Faktoren beteiligt. Das derzeitige Verständnis des Mechanismus der Wirkung des Immunsystems auf Tumore im Zellulärbereich ist (noch) gering.

Aus einer Untersuchung praktisch sämtlicher bekannten immunpotenzierenden Mittel (etwa 20 Verbindungen) mit gründlich substanzierter Antitumoraktivität (P. D. Cooper in "Advances of Immunology and Cancer Therapy" Band 1, Kap. 4, S. 125-166 (1985), Herausgeber P. K. Ray, Springer Verlag, N.Y.) wurde die Erkenntnis gewonnen, daß sie entweder den alternativen Komplementweg und/oder Makrophagen (offensichtlich über ihren endogenen APC) aktivieren. So ist offensichtlich die APC-Aktivierung trotz erheblicher chemischer Unterschiede in der Molekülstruktur dieser Antitumoraktivität aufweisenden Verbindungen eine (diesen) gemeinsame Eigenschaft. Weiterhin hat es sich gezeigt, daß zwei gereinigte Mittel mit hoher Spezifität für eine APC-Aktivierung (d. h., daß die Zytotoxizität und andere Faktoren ausgeschlossen werden konnten) bei sorgfältig gesteuerten Versuchen mit speziellen Mäusestämmen eine signifikante Antitumoraktivität entfalten. Diese beiden Mittel waren isolierte Komplementkomponente C3b und isolierter Kobragiftfaktor (P. D. Cooper und R. B. Sim in "Int. J. Cancer" 33, 683-687 (1984)). Aus diesen früheren Untersuchungen wurde der Schluß gezogen, daß von anderen spezifischen APC-Aktivatoren ebenfalls eine Antitumoraktivität zu erwarten ist.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es folglich, ein Präparat bereitzustellen, das nach Verabreichung an einen Krebspatienten den alternativen Komplementweg beeinflußt, um reproduzierbar und signifikant die Überlebensdauer des betreffenden Patienten zu steigern und dessen Lebensqualität zu verbessern.

Eine andere Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Präparats, das bei Verabreichung an scheinbar gesunde Personen in Intervallen während ihrer Lebenszeit veränderte Zellen in ihren präcancerösen Stufen eliminiert und die Chance eines offenkundigen Erscheinens irgendeiner Krebsart in einem späteren Lebensstadium vermindert.

Es konnte gezeigt werden, daß Inulin bei Verabreichung in seiner unlöslichen Form oder Teilchenform, insbesondere in der beschriebenen gamma-polymorphen Form, ein starker APC-Aktivitator ist und bei Mäusen eine signifikante Antitumorwirkung entfaltet.

Standards für (gelöstes) "Inulin zu Injektionszwekken" finden sich in den britischen und US-Pharmacopoeien. Gelöstes Inulin und wahrscheinlich (auch) seine Hydrolyseprodukte werden bei Menschen mit einer Halbwertszeit von 1 h ausgeschieden. Die endgültigen Hydrolyseprodukte (Fructose und Glucose) stellen einfache Nährstoffe dar. Der britische Arzneimittelkodex (1979) stellt fest, daß die einzige pharmakoligische Wirkung von (gelöstem) Inulin in einer osmotischen Diurese bei höheren Dosen besteht. Somit dürfte der einzige Effekt von teilchenförmigem Inulin, wenn überhaupt (vorhanden), in Beziehung zu seinem physikalischen Zustand stehen. Bei Kaninchen, die massive iv-Dosen von teilchenförmigen Inulin erhalten haben, fanden sich keine Nephrotoxizität bzw. antigenen Wirkungen. Die einzige berichtete immunologische Wechselwirkung neben der APC-Aktivierung besteht in einer gewissen Kreuzreaktion mit bestimmten Myelomproteinen von zuvor erprobten Bakterienlävanen. Es sei darauf hingewiesen, daß offensichtlich bislang noch keine Versuche durchgeführt wurden, um die physikalischen Formen des verwendeten Inulins zu reinigen oder zu definieren.

Bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten hat es sich gezeigt, daß hochreines Inulin bei Verabreichung in seiner unlöslichen oder teilchenförmigen Form selbst in niedriger Dosierung einen starken Aktivator für APC in vitro in Mäuse- oder Humanserum darstellt. Die Größenordnung der Aktivität entspricht den meisten bekannten starken Aktivatoren. per klassische Komplementweg bleibt unbeeinflußt. Es hat sich auch gezeigt, daß unlösliches oder teilchenförmiges Inulin eine starke Antitumorwirkung auf B-16 Melanomzellen ausübt, wenn es i.p. an C57 schwarze Mäuse verabreicht wird. Hierbei zeigt sich eine 55%ige Zunahme in der mittleren Überlebensdauer.

Die Erfindung betrifft folglich in einer weiteren Ausführungsform ein immuntherapeutisches Präparat zur Aktivierung des alternativen Komplementwegs in vitro oder im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Antitumorbehandlung, das als (seine) aktive Komponente teilchenförmiges Inulin oder ein teilchenförmiges Inulinderivat enthält und dadurch gekennzeichnet ist, daß die Teilchen nach 18 Tagen bei 37ºC in Wasser in durch den Brechungsindex nicht nachweisbarer Form löslich sind (hierin als "gamma-polymorphe Form" bezeichnet), wobei das Präparat im wesentlichen von den α- und β-polymorphen Formen frei ist und wobei die aktive Komponente mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Träger und gegebenenfalls einem pharmazeutisch akzeptablen Konservierungsmittel kombiniert ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer zuvor im breitesten Sinne erläuterten immuntherapeutischen Zubereitung zur Aktivierung des alternativen Komplementwegs im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Antitumorbehandlung im menschlichen oder tierischen Körper.

Vorzugsweise handelt es sich bei der aktiven Komponente um ein zuvor gekennzeichnetes gamma-Inulin.

Die Verabreichung eines immuntherapeutischen Präparats der beschriebenen Art kann in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch intraperitoneale, subcutane oder intravenöse Injektion oder Injektion in den Tumor erfolgen.

Von den drei derzeit bekannten polymorphen Inulinformen, α, β und gamma, wird erfindungsgemäß vorzugsweise praktisch reines gamma-Inulin eines Molekulargewichts von mindestens 8000, vorzugsweise 9000 bis 12000, eingesetzt und zu einem injizierbaren Präparat verarbeitet. Die gamma-Form wird bevorzugt, da es sich gezeigt hat, daß die Fähigkeit von Inulin zur Aktivierung von APC und seine Antitumorwirkung in Bezug zu seiner Unlöslichkeit steht und die gamma-Form die unlöslichste und folglich die aktivste ist. Weiterhin können gelöstes Inulin und polymorphe Formen mit der Fähigkeit zu einer weitestgehenden Lösung bei 37ºC diese Aktivitäten stören. Folglich muß die Inulinsuspension von α- und β-polymeren Formen frei sein.

Gamma-Inulin zu Injektionszwecken wird vorzugsweise als sterile milchige Suspension mit 30 bis 60, vorzugsweise 50 mg reiner unlöslicher Inulinteilchen pro ml Kochsalzlösung, die in hohem Maße von gelöstem Inulin und Endotoxin (weniger als 0,1 pg/ml, bestimmt durch einen Limulusamoebocytenlysat-Test) frei ist, formuliert. Eine solche Zubereitung zeigt eine signifikante, jedoch sehr niedrige, eigene, Fieber erzeugende Wirkung, sie besteht jedoch den Pyrogentest der britischen Pharmacopoeia (1980) bei einer Dosis von 10 mg/kg. Erwartungsgemäß sollte sie von Spuren Protein, Lipid, Nucleinsäure und geladenen Polysacchariden und von von Inulin und Inulinhydrolyseprodukten verschiedenen löslichen Materialien frei sein. Die Suspension ist im Temperaturbereich von beispielsweise 0º bis +45ºC stabil und wird vorzugsweise bei 2 bis 8ºC als wäßrige Suspension gelagert. Aus dieser setzt es sich langsam ab. Der Suspension kann ohne Verlust der in-vivo- oder in-vitro-Aktivität ein Konservierungsmittel, wie Phenylquecksilber(II)nitrat (britische Pharmacopoeia, 1980), beispielsweise 20 ug/ml, einverleibt werden. Die Suspension ist einfach handhabbar und injizierbar, sie braucht nicht gefroren oder über 45ºC erwärmt zu werden. Die Teilchen können als Ovoide einen Durchmessers von unter 1 um hergestellt werden und neigen nicht zum Verbacken. Folglich dürften sie auch das Mikrogefäßsystem nicht blockieren.

Das folgende Beispiel enthält weitere Angaben über die Herstellung und den Einsatz der aktiven Komponenten gemäß der Erfindung. In dieser Beschreibung kommt sämtlichen Temperaturangaben in ºC und technischen Ausdrücken und Abkürzungen die übliche Bedeutung auf dem einschlägigen Fachgebiet zu. Rohe Reagentien, Produkte und Zubereitungen lassen sich nach den hierin beschriebenen Maßnahmen oder in sonstiger üblicher bekannter Weise reinigen.

Beispiel 1 Inulinpräparate

a. Inulin (90% g/g, Sigma, St.Louis, MO, aus Dahlienknollen) wurde aseptisch behandelt. Die endgültigen Lösungen wurden durch Membranfiltration sterilisiert. Das Trockengewicht wurde durch den Brechungsindex bei 26ºC bestimmt. Sämtliche luftgetrockneten Präparate enthielten ungefähr 10% H&sub2;O (g/g) und bestanden aus momerenfreien Fructosepolymeren, bestimmt durch Reaktion mit Fehling'scher Lösung und die Beweglichkeit bei aufsteigender Papierchromatographie nach, jedoch nicht vor kurzem Sieden in 2 M Trifluoressigsäure, unter Verwendung von AgNO&sub3;- (W. E. Trevelyan und Mitarbeiter (1950) in "Nature" London, 166, S. 444-445) und Resorcin- (C. F. Phelps (1965) in "Biochem. J." 95, S. 41-47) (Sprays). Die Haupt- bzw. Mindestgehalte an Fructose und Glucose wurden in sämtlichen Präparaten durch Chromatographie in Chloroform/Essigsäure/H&sub2;O (6/1/1) und wassergesättigtem Phenol nach der Hydrolyse bestätigt. Andere reduzierende Zucker waren nicht nachweisbar (< 1%). Sämtliche Präparate waren frei von N und S. Die C- und H-Gehalte und die spezifischen Drehungen entsprachen den Erwartungen.

b. Inulin I Rohinulin wurde verrührt und zweimal bei 23ºC mit 0,1% (v/v) Ammoniak in entionisiertem Wasser (40 ml/g Inulin) gewaschen; -80% waren unlöslich.

c. Inulin II Inulin I, gelöst in 0,1% Ammoniak (5 ml/g Inulin, 69ºC), wurde mit 1% (g/g) DEAE-Cellulose (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.), die für chromatographische Zwecke aufbereitet war (S. R. Himmelhoch (1971) in "Methods in Enzymology", herausgegeben von W. B. Jakoby, Band 22, S. 273, Academic Press, New York), aufgeschlemmt. Das gefrorene Filtrat wurde dann stehengelassen (23ºC, 48 h). Der Filterkuchen wurde gewaschen (5ºC, 0,1% Ammoniak, dann trockenes Aceton) und luftgetrocknet (Ausbeute 65-70%). Inulin II bildete das Ausgangsmaterial für die hierin beschriebenen Präparate. Eine Phenol/Wasser-Chromatographie nach der Hydrolyse gestattete ein Eluieren und Testen nach der Phenol/Schwefelsäure-Methode (M. Dubois und Mitarbeitern (1956) in "Analyt. Chem." 28, 350-356), was ein Fructose/Glucose-Verhältnis von 20 bis 80/1 ergab. Dies stimmte mit einem Glucoseende bei dem beschriebenen Molekulargewichtsbereich überein. Asche-, P- und O.D. -Werte (260 nm) konnten nicht festgestellt werden (Rohinsulin enthielt 0,6% g/g, 0,08% g/g bzw. Spuren). Die Acetonwaschflüssigkeiten enthielten kein Lipid. Beim Titrieren von Inulin II (10% g/v, pH-Wert: 6,7, 20ºC) mit N/100te1 HCl konnten keine Carboxylgruppen nachgewiesen werden. Keine Asche und kein Stickstoff nach der Kristallisation aus 0,1% Ammoniak deuteten auf das Fehlen anionischer Gruppen hin. Kein Schwefel und kein Phosphor zeigten, daß ionisierbare Verunreinigungen nicht nachweisbar waren. O.D.-Abtastungen (62,5 mg/ml) zeigten keine Peaks von 700-240 nm. Dies zeigt, daß sich eine Karamelisierung vermeiden ließ. Die Teilchen aus einer wäßrigen Kristallisation sind bei rascherer Kristallisation kleiner. Diese wurde durch höhere Konzentration und höheren pH-Wert, eine niedrigere Temperatur und Ionenstärke und durch kolloidales Beimpfen induziert.

d. ET-freies gamma-Inulin zu Injektionszwecken Chargen unterschiedlichen ursprünglichen α-, β- und gamma-Gehalts können zum Einsatz gelangen, sofern ausreichend viele Moleküle ein Molekulargewicht von > 8000 aufweisen. Die Metallwaren sollten in einem alkalischen Detergenz vorher eingeweicht werden (Decon 90, 5% v/v; Selby, Sydney); das Glasgut sollte auch im Ofen erhitzt (3 h, 195ºC) und dann mit ofenlabilen Materialien vereinigt und im Autoklaven behandelt werden (Weinberg, 1981). Wasser wird durch Milli-RO-Umkehrosmose entionisiert und dann durch Milli-Q-Filtration (Millipore, Sydney) "verfeinert". Es ist dann ET-frei (Limulus-Test). Wasser oder Lösungen sollten zur Entfernung von ET zusätzlich durch Filtrieren durch sterile 0,2 um Zetapor SP-Grad ladungsmodizierte Nylon 66-Membranen (AMF Cuno, Meriden, CONN) behandelt und danach im Autklaven behandelt werden.

Rohinulin wurde durch Rühren (40 g, 800 ml 0,1% Ammoniak, 75ºC) gelöst, heiß geklärt (Whatman Nr. 42 Papier), eingefroren (-15ºC) und danach mit 1 ml CHCl&sub3; stehengelassen (37ºC, 3 bis 4 Tage). Der Niederschlag wurde zweimal (800 ml Wasser, 23ºC) gewaschen, in eben zum Sieden gebrachten Wasser gelöst (pH-Wert: 6,5-7, 250 ml, 75ºC) und langsam mit 5-6% g/v und < 40ºC durch ein einen Durchmesser von 7 cm aufweisendes und 2 cm tiefes Bett gewaschener DEAE- Cellulose filtriert. Das Filtrat (das mit Ammoniak 0,1%ig gemacht wurde und eine Temperatur von 70ºC aufwies) wurde durch eine ähnliches Bett von Amberlite-Sulfonsäureharz (CG-120, BDH, Poole, eingestellt auf die Ammoniakform) filtriert, mit weiterem Ammoniak erneut erwärmt (0,1%, 70ºC) und danach filtriert (Zetapor).

Die sterile ET-freie Lösung (pH-Wert: 9-10, 5% g/v) wurde gerührt (bei 5ºC, 5 bis 7 Tage); wenn die Kristalle zu groß waren, sollten sie mit weiterem Ammoniak (auf 0,2%) wieder in Lösung gebracht und kurz bis zur schwachen Trübe erwärmt werden. Die Trübe liefert dann Saatkeime. Danach wird erneut gerührt (5ºC, 3 bis 5 Tage, danach 2 bis 4 Tage bei 37ºC). Die Teilchen (90 bis 99% gamma-Inulin) wurden zentrifugiert (30 min, 4000 g), durch Schütteln resuspendiert (400 ml Wasser, 50ºC) dann erwärmt (1 h, 50ºC) und schließlich zweimal gewaschen (5ºC). Die Ausbeuten betragen 40 bis 50%, sie hängen jedoch vom Molekulargewicht des Ausgangsmaterials ab. Die endgültige Suspension mit 62,5 mg/ml wurde auf gelöstes Material (< 0,2% g/v), die Teilchengröße (vgl. unten), die Unlöslichkeit (< 10% Tropfen in O.D.&sub7;&sub0;&sub0; bei < 1 mg/ml, 37ºC, 24 h), den ET-Gehalt (Limulus-Test, "E-Toxat" Sigma) und die Sterilität bei 23 und 37ºC hin untersucht. Sie wurde bei 2 bis 8ºC (obwohl sich nach 18 Tagen bei 37ºC über die Bestimmung des Brechungsindex nichts löst) gelagert. Sie braucht nicht gefroren oder über 45ºC erwärmt zu werden. In ungefrorenem Zustand erfolgt keine Aggregatbildung. Die unverdünnte Suspension setzte sich (nur) sehr schwach ab und war einfach resuspendierbar. Gamma- Inulin zu Injektionszwecken ist eine sterile, ET- freie (< 6 pg ET/mg) Suspension von 50 mg fein dispergiertem unlöslichem gamma-Inulin pro ml 0,8% NaCl mit 20 ug/ml Phenyl-Quecksilber(II)nitrat, PMN (Fluka, Buchs, Schweiz, umkristallisiert (britische Pharmacopoeia, 1980) und Zetapor-filtriert), um einen mehrfachen Zugriff zu erleichtern. Gamma-Inulin (50 mg/ml) besaß keinen Einfluß auf die antibakterielle Wirkung von PMN. Die Suspension ist mindestens 22 Monate bei 5ºC stabil.

e. Charakterisierung von gamma-Inulin Elektronenmikrofotografien (Phosphowolframatflecken) von gamma-Inulin zu Injektionszwecken zeigten Ovoide eines Durchmessers von 0,7 bis 1,4 um.

Auf Gelchromatographiesäulen auf PBS wurden Molekulargewichtsbestimmungen durchgeführt. Die Eichung einer Biogel P-30-Säule mit Standardpolysaccharidmarkern zeigte einen Peak von 8500 bis 10000 (Mittelwert - 9300) Molekulargewicht für gamma-Inulin entsprechend 52-65 Hexosen. Gamma-Inulin auf einer Sephadex G-50-Säule besaß ein Molekulargewicht von ungefähr- 9300.

f. Löslichkeitsformen von Inulin Von der Instabilität der polymorphen Inulinformen herrührende Schwierigkeiten ließen sich auf folgende abnehmende Trübheitswerte (O.D. 700nm) < 1 mg/ml feinteiliger Inulinsuspensionen in Küvetten bei 37ºC als ein gewisses Maß ihrer Lösungsgeschwindigkeit in vivo zurückführen. Sie wurden durch Pipettieren resuspendiert und danach vor der Ablesung im Spektralphotometer kurz stehen gelassen. Es hat sich gezeigt, daß sich die Trübheitskurven verschiedener Präparate in konsistenter Weise ändern (vgl. Fig. 1).

Die Trübungsänderungen waren reproduzierbar und scharf und lieferten eine bequeme Grundlage zur Identifizierung mindestens folgender Löslichkeitsformen (bezüglich der Nomenklatur "α" und "β" vgl. E. J. McDonald (1946) in "Adv. Carbohyd. Chem." 2, 253-277).

1. β0/23-Inulin (sehr rasch bei 23ºC löslich);

2. β0/37-Inulin (langsam bei 23ºC, jedoch sehr rasch bei 37ºC löslich);

3., 4. und 5. α2/37-, α8/37- undα15/37-Inulin (jeweils löslich mit Halbwertszeiten bis zum Erreichen eines Trübungsplateaus von 2-4, 8 bzw. 15 min bei 37ºC);

6. gamma-Inulin (nach 18 Tagen bei 37ºC in durch den Brechungsindex nicht nachweisbarer Weise löslich).

g. Toxizität von gamma-Inulin Eine Gruppe von 5 Mäusen erhielt im Verlaufe von 9 Tagen 3 Dosen von jeweils 25 mg gereinigten gamma- Inulins ohne ersichtliche Schmerzen (Gesamtdosis: 2,5 g/kg). Wurden sie am Tag 10 getötet, zeigte es sich, daß ihre Leber und Milz vergrößert waren. Eine intravenöse Verabreichung von 25 mg/kg bedingte ein Kollabieren der Versuchstiere in 15-20 min mit anschließender vollständiger Erholung. Die auf diesem Verabreichungsweg bestimmte LD&sub5;&sub0; bei Mäusen betrug etwa 100 mg/kg.

Beispiel 2

a. Tests auf eine APC-Aktivierung Die Tests beruhen auf der bekannten Fähigkeit von APC in mit EGTA/Mg²&spplus;-Puffer verdünntem Mäuse- oder Humanserum, spezifisch rote Blutkörperchen von Kaninchen (RBC) zu lysieren. Eine Aktivierung von APC führt zu labilen reaktionsfähigen Zwischenprodukten, die rasch abnehmen. APC-"Aktivatoren" zerstören somit das APC im Serum, das dann die Fähigkeit verliert, anschließend zugesetzte rote Blutkörperchen von Kaninchen zu lysieren. Die Menge an verlorener lytischer Aktivität ist ein Maß für das Ausmaß an Aktivierung. Nähere Einzelheiten bezüglich dieser Tests finden sich bei P. D. Cooper und M. Carter (1986) in "Molecular Immunology" 23, 8, 895-901 und 903 bis 908.

1. In-vitro-Aktivierung Standardisierte Serumportionen, die in EGTA/Mg²&spplus;-Puffer verdünnt wurden, werden bei 37ºC mit abgemessenen Dosen an einer Aktivatorsuspension 30 min lang inkubiert. Danach wird der Aktivator durch Zentrifugieren entfernt. Standardportionen des Überstands werden eine Standard-Zeit lang mit einer bekannten Zahl gewaschener roter Blutkörperchen von Kaninchen bei 37ºC reinkubiert. Das Ausmaß an Aktivierung wird als Anteil an nicht-lysierten Zellen, deren Menge auf Grund der optischen Dichte bei 640nm bestimmt wurde, ermittelt.

2. In-vivo-Aktivierung Abgemessene Dosen gamma-Inulin werden i.p. in Gruppen von 3 oder 4 Mäusen pro Zeitpunkt eingepflanzt. Die Mäuse werden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet. Danach wird Blut abgezapft und das Serum gepoolt. Es wird unter Einhaltung bekannter Maßnahmen dafür Sorge getragen, Komplementaktivität zu erhalten. Standardportionen einer Reihe von Verdünnungen in EGTA/Mg²&spplus;-Puffer dieser Seren werden im Vergleich zu ähnlichen Verdünnungen eines zeitgleich gepoolten Serums aus unbehandelten Mäusen derselben Charge eine Standard-Zeit lang mit einer geeichten Zahl gewaschener roter Blutkörperchen von Kaninchen bei 37ºC inkubiert. Das Ausmaß an Aktivierung wird als Anteil nicht-lysierter Zellen, deren Menge auf Grund der optischen Dichte bei 640 nm bestimmt wurde, ermittelt.

b. Antitumoraktivität Nähere Einzelheiten bezüglich einer Antitumoraktivität von gamma-Inulin bei Mäusen finden sich bei P. D. Cooper und M. Carter (1986) in "Molecular Immunology" 23, 8, 903-908. Mäusemelanomzellen wurden in mit 5% fötalem Rinderserum ergänztem DMEM-Medium (beide von Gibco, Paisly, Schottland) wachsen gelassen. Die Kulturen wurden alle 7 Tage 1 : 8 geteilt, wobei 1 bis 1,5·10&sup7; Zellen pro 75-cm²-Kolben erhalten werden. In Mäuse werden i.p. 1·10&sup6; frisch geerntete Zellen in 0,2 ml PBS in der zuvor beschriebenen Weise (P. D. Cooper und G. R. Masinello in "Int. J. Cancer" 32, 737-744 (1983)) eingepflanzt. Sämtliche Präparate wurden i.p. verabreicht. Die Versuchstiere zeigten nach Gabe jeder Dosis keine Anzeichen von Schmerzen. Die Überlebensdauer der einzelnen Mäuse wurde täglich aufgezeichnet. Die Signifikanz von Unterschieden in der mittleren Überlebensdauer wurde nach dem Student's t-Test berechnet. Sämtliche Mäuse bestanden aus C57BL/6J Mäusen passenden Geschlechts und passenden Alters. Für die Testproben wurden jeweils 7 Mäuse verwendet. Zur Kontrolle dienten jeweils 14 bzw. 21 Mäuse.

Ergebnisse

a. APC-Aktivierung Es hat sich gezeigt, daß gamma-Inulin ein starker Aktivator von APC in-vitro in Mäuse- oder Humanserum bei 2-8 ug/ml ist. Diese Aktivität liegt in der Aktivitätsgrößenordnung, ähnlich derjenigen der stärksten bekannten Aktivatoren.

Fig. 2, links, vergleicht bei Simultan-Tests die invitro-Aktivierung von APC in Humanserum durch gamma- Inulin mit 2 anderen gut bekannten Aktivatoren, Zymosan und SAC (Staphylococcus aureus Cowan Typ I, durch Erwärmen abgetötete Suspension). Bei diesen Tests zeigt ein hoher Wert für unlysierte RBC einen hohen Grad an APC-Aktivierung im Serum.

Fig. 2, rechts, vergleicht nach dem selben Verfahren die APC-Aktivierungsfähigkeit verschiedener Inulinformen in Humanserum. Mäuseserum lieferte nahezu identische Ergebnisse.

Wenn i.p. an Mäuse verabreicht, sorgte eine Mindestdosis von 50 ug Inulin (2,5 mg/kg) für eine nachweisbare in-vivo-APC-Aktivierung im Serum, wenn das Serum 2-16 h nach Inulininjektion gesammelt wird (Fig. 3). Dies ist eine mit der Mindestdosis für eine in-vitro-APC-Aktivierung durch Inulin (Fig. 2) vergleichbare Konzentration.

Der klassische Komplementweg blieb unbeeinflußt.

b. Antitumoraktivität Die Fig. 4 zeigt Kurven, die die verlängerte Überlebensdauer nach gammavinulinbehandlung von C57 schwarzen Mäusen, denen am Tag 0 B16 Melanomzellen i.p. eingepflanzt worden waren, veranschaulichen. Die Mäuse erhielten 15 ug gamma-Inulin i.p. am Tag 1 und erneut am Tag 4 nach der Einpflanzung (p.i.).

Diskussion

Es hat sich gezeigt, daß gamma-Inulin eine starke Antitumor-Wirkung auf B16 Melanomzellen ausübt. Behandelte Mäuse zeigten bei bereits so geringen Dosen wie 1 mg/kg eine 55%ige Zunahme der mittleren Überlebensdauer. Somit stehen die niedrigsten Dosen für eine APC- Aktivierung in-vitro und in-vivo in enger Beziehung zu der wirksamen Antitumor-Mindestdosis. Diese Wirkung geht bei so hohen Dosen wie 5 mg/Maus (250 mg/kg) nicht verloren. Die schneller löslichen Formen von Inulin (α und β) sind nahezu ebenso aktiv, in diesen Fällen wird die Wirkung jedoch bei höheren Dosen blockiert. Wird Inulin durch kurzes Erwärmen auf 60 bis 70ºC gelöst, gehen gleichzeitig seine in-vitro-APC-Aktivierung und seine invivo-Antitumorwirkung verloren, sie kehren jedoch beim Umkristallisieren bei niedrigeren Temperaturen wieder. Diese Wirkung und sein geringes Dosiserfordernis zusammen mit seiner hohen Reinheit bestätigen, daß es das teilchenförmige Inulin ist, das den aktiven Bestandteil bildet.

Aus dem, was derzeit über eine nicht-spezifische aktive Immuntherapie bekannt ist, dürfte die optimale Verabreichung der erfindungsgemäßen Präparate möglichst nah am Tumor sein, d. h. die Verabreichung in den Tumor plus eine intravenöse Verabreichung stellen eine Kombination örtlicher und systemischer Behandlung dar. Die Verabreichung in Höhlen (Bauchhöhle oder Brusthöhle) dürften ebenfalls wirksam sein, und zwar insbesondere für Ergüsse. Sie dürfte innerhalb einiger Stunden in eine Aktivierung von APC im Blut übersetzt werden. Intramuskuläre, subcutane und intradermale Einpflanzungen dürften eine mäßige Depotwirkung zeigen und sich besonders zur Behandlung befallener Lympfknoten eignen, da gamma-Inulin dazu neigt, in diese einzusickern. Bei Wahl dieser Routen wurde bei Mäusen, Katzen und Hunden keine Granulombildung festgestellt. Oral wird Inulin wahrscheinlich verdaut, es kann jedoch mit Hilfe einer eine verzögerte Freigabe ermöglichenden Rezeptur in geeigneter Weise bis zur Intestinalschleimhaut weitergeleitet werden. Erwartungsgemäß dürfte auch eine topische Applikation wirksam sein. Empfindliche Tumortypen sind unbekannt, diejenigen, die direkt für Inulin zugänglich sind, beispielsweise im Blut, oder mit einer guten Blutversorgung, dürften anfälliger sein. Es ist zu erwarten, daß der Patient immunokompetent sein dürfte. Somit muß sein wahrscheinlichster Einsatz als Hilfsbehandlungsmittel im Hinblick auf die jeweiligen zytotoxischen oder Bestrahlungsvorschriften sorgfältig abgewogen werden. Vorher können die zeitliche Festlegung und Dosierung bestimmt werden. Der maximale Sicherheitsgrad einer Aktivierung von APC beim Menschen muß gewährleistet sein. Eine solche Aktivierung muß wahrscheinlich so oft wiederholt werden, wie es die natürliche Regenerierung des alternativen Wegs, der wahrscheinlich in 24-48 h auf den Normalwert zurückkehrt, erlaubt. Zunächst wird davon ausgegangen, daß folgende Dosiervorschrift wirksam sein könnte -5-50 mg pro Erwachsenen alle 14 Tage, etwa die Hälfte i.v. oder s.c. und die Hälfte in den Tumor (zum Vergleich: die übliche Dosis von gelöstem Inulin beträgt zunächst 3 g i.v. plus 7 g während der nächsten paar Stunden). Auf Grund von von Nierendialysepatienten tolerierten Raten an APC-Aktivierung dürfte es richtig sein, die Gesamtdosis an gamma-Inulin intravenös sehr langsam, beispielsweise 5 mg/10 min, vielleicht durch Infusion in verdünnter Form oder mittels einer Mikropumpe, zu geben. Der Grad an APC-Aktivierung sollte durch in-vitro-Tests sorgfältig überwacht und die Inulindosis solange erhöht werden, bis eine nachweisbare, jedoch subtoxische APC-Aktivierung zu beobachten ist. Zweckmäßigerweise sollten auch die verschiedensten anderen immunologischen Parameter, z. B. Makrophagen-, T- und B-Zellenaktivierung und natürliche Killerzellenaktivität verfolgt werden.

Die beim Menschen zu erwartende Hauptnebenwirkung rührt aus einer direkten akuten Aktivierung des Alternativwegs hauptsächlich über die Anaphylatoxine C3a und C5a her. Mäuse sind glücklicherweise gegenüber einem dadurch bedingten Schock sehr resistent. Wenn C5a bei Menschen einen bestimmten Blutgehalt übersteigt, scheint das Ergebnis irreversibel zu sein. Es gibt auch noch andere unerwünschte Effekte, beispielsweise aus Granulozytenembolie. Eine Studie mit gelöstem Inulin bei Menschen zeigte, daß 10 bis 14% APC-Aktivierung ohne klinische Beachtung durchging, eine weitere zeigte bei Hämodialyse- Patienten jedoch, daß eine durch die Dialysemembranen hervorgerufene Produktion von mehr als 8,5 ug/ml des Aktivierungsprodukts C3a des Arg unerwünschte klinische Symptome hervorrief.

Man kann sich vorstellen, daß gamma-Inulin in vorteilhafter Weise aufinnere oder externe Körperoberflächen appliziert werden kann und die Inulinteilchen von dieser in den Körperkreislauf eintreten können. Andererseits kann das in einer äußeren Wunde oder auf inneren feuchten Oberflächen vorhandene gamma-Inulin Leukozyten aktivieren. Diese dürften dann ihrerseits in den Körper wandern und (dort) ihren Immuneinfluß ausüben. Zu diesen Zwecken kann gamma-Inulin topisch auf die Haut appliziert oder in einem eine verzögerte Freigabe bewirkenden Träger nach der Passage durch den Magen an die Darmschleimhaut abgegeben werden. In anderen Trägern, zum Beispiel Suppositorien, Tropfen oder Aerosolen kann es in das Rektum, die Vagina, die Nase, den Rachen, die Augen oder in die oberen und unteren Atmungstrakte eingeführt werden.

Gamma-Inulin ist bei Raumtemperatur stabil und kann in üblichen pharmazeutisch akzeptablen Formulierungen, Trägern und Präparaten, nämlich als getrocknete Pulver oder Suspensionen in destilliertem Wasser, physioligischer Kochsalzlösung oder isotonischer Lösung, mit oder ohne Konservierungsmittel bereitgestellt werden. Es kann ohne Schwierigkeiten durch Filtrieren sterilisiert und zu einem endotoxinfreien injizierbaren Präparat verarbeitet werden.

Gamma-Inulin ist auf Grund seiner preiswerten Verfügbarkeit für einen Einsatz sowohl in der Tiermedizin als auch Humanmedizin geeignet.

Die Wirkung von gamma-Inulin besteht aus einem einzigen klaren Signal an das Immunsystem, nämlich der Aktivierung des alternativen Komplementwegs (APC). Die Reinheit dieses Signals ist für die Eleminierung unerwünschter Nebenwirkungen von Bedeutung. Das Immunsystem ist jedoch extrem komplex und antwortet üblicherweise in der Natur auf eine Anzahl unterschiedlicher Immunsignale aus stimulierenden Einheiten (beispielsweise unter anderem eine Schadmikrobe oder ein Parasit, eine Krebszelle, ein Impfantigen oder eine allergische Substanz). Es ist auf die Wechselwirkung solcher Signale zurückzuführen, daß der Körper seine kräftige Antwort auf eine sehr große Anzahl der verschiedensten Fremdstimulantien erreicht. Die Erwartung, daß gamma-Inulin seinen stärksten Effekt in einer synergistischen Wirkung mit anderen immunstimulierenden Signalen erreicht, ist somit ganz natürlich.

Ein wichtiges Anwendungsgebiet für gamma-Inulin ist als Verstärker oder Immunhilfsmittel für ein Impfantigen oder Substanzen, die immunologisch die dreidimensionale Struktur des reaktiven Bereichs des Antigens, d. h. seines Epitops nachahmen. Diese Substanzen sind oftmals von Hause aus (nur) schwach antigen. Sie können sorgfältig konstruierte Peptidsequenzen umfassen oder aus Antiidiotyp- Immunglobulinen bestehen. Letztere besitzen als ihr auslösendes Antigen den Ideotyp (an einen Epitop bindenden Bereich) der durch das ursprüngliche Antigen ausgelösten Immunglobuline. Der Antiidiotyp entspricht somit diesem Antigen in seiner dreidimensionalen Struktur, da er zu einer als solche zum ursprünglichen Antigen komplementären Struktur komplementär ist.

Es hat sich gezeigt, daß gamma-Inulin eine Impfstoffhilfsaktivität aufweist. Beispielsweise löste ein Mäusen eingepflanztes Antigen (entweder Rinderserumalbumin oder Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin) wesentlich mehr Antikörper aus, wenn es - anstatt alleine - in Form einer Mischung mit gamma-Inulin appliziert wird. Gruppen von Mäusen erhielten Injektionen von jedem Präparat, worauf durch Radioimmun- oder Elisa-Tests die mittlere Antikörperkonzentration in Microgramm/ml bestimmt wurde. Bei einem Test lag die durch die Mischung von gamma-Inulin und Antigen ausgelöste Antikörperkonzentration 6,2 mal höher als die durch das Antigen alleine (p< 0,001) ausgelöste Antikörperkonzentration. Die durch das Antigen in einer Emulsion mit Freund'schem Kompletthilfsmittel (ein bekanntes starkes Hilfsmittel, das für einen Einsatz bei Menschen zu toxisch ist) ausgelöste Antikörper(konzentration) war 10,4 mal höher als die durch das Antigen alleine (p< 0,001) ausgelöste Antikörper(konzentration).

Andere zusammen mit gamma-Inulin wahrscheinlich synergistisch wirkende Immunmodulatoren sind:

a. die Interleukine, die Interferone, die Tumornekrosefaktoren und zahlreiche andere identifizierte immunstimulierende Faktoren, die insgesamt als Lymphokine oder Cytokine bekannt sind;

b. Thymozytenstimulatoren, wie Levamisol oder die verschiedenen Thymus stimulierenden Hormone, von denen eines Thymosin ist;

c. Macrophagenstimulatoren, z. B. die Muramylpeptide oder andere Mikrobenkomponenten;

d. Endotoxin;

e. Vollmikroben

Als Beispiel eines solchen Synergismus hat es sich gezeigt, daß ein zusammen mit gamma-Inulin Mäusen, denen zuvor das B16 Melanom eingepflanzt worden war, injiziertes Gemisch aus Rohinterferon und Rohtumornekrosefaktor eine mittlere Überlebensdauer bewirkte, die mehr als 30% größer war als gamma-Inulin oder das Lymphokingemisch alleine, keine der Komponenten sicherte das Überleben eines Versuchstiers. Noch wichtiger ist, daß gamma-Inulin plus die Lymphokine bei etwa 30% der Mäuse den Tumor vollständig beseitigten. Diese Erkenntnis wurde bei diesem System (noch) kaum gewonnen. Ähnliche Ergebnisse erhält man mit dem Thymocytenstimulator Succinylconcanavalin A.

Ein Immunstimulator, wie gamma-Inulin, dürfte sich auch auf irgendwelche menschlichen oder tierischen Störungen mit einer immunologischen Komponente vorteilhaft auswirken. Krebszellen können vom Immunsystem als körperfremd oder "nicht-eigen" erkannt werden. Der günstige Einfluß von gamma-Inulin auf Krebs bei einem Mäusemodell wurde in der zuvor geschilderten Weise belegt. Dieser Vorteil, mit oder ohne synergistische(r) Wirkung anderer Immunmodulatoren, dürfte sich auch auf menschliche oder tierische Krebspatienten erstrecken.

Eine Ausdehnung dieses Nutzens geschieht wie folgt: Der carcinogene Prozeß, bei dem eine normale Zelle zu einer vollständig malignen Zelle umgewandelt wird, nimmt bei Menschen bekanntlich mehrere Jahre in Anspruch. Während dieses Prozesses von dem das mögliche Opfer in der Regel nichts wahrnimmt, vervielfacht sich die geschädigte Zelle langsam und durchschreitet mehrere Stufen, in denen ihre Abkömmlinge noch nicht vollständig maligne sind, nichts desto weniger aber vom Immunsystem als abnormal oder nicht-eigen erkannt werden können. Dies dürfte in Fällen die sonst dazu bestimmt sind, sich dem Auffinden durch die körpereigene Immunabwehr zu entziehen, einen verstärkenden Immunstimulus erfordern. Folglich dürfte wahrscheinlich eine Behandlung mit einem Immunstimulator mit vernachlässigbaren Nebenwirkungen, wie gamma-Inulin, während des carcinogenen Prozesses die prämalignen Zellen eliminieren und die Chance eines späteren Auftretens vollmaligner Zellabkömmlinge verringern. Somit dürfte eine regelmäßige Behandlung mit gamma-Inulin mit oder ohne sonstige(n) Immunmodulatoren und - sagen wir - in dreijährigen Intervallen von Risikopersonen, beispielsweise solchen über 40 Jahren und/oder solchen mit identifizierbaren hohen Risikofaktoren das Gesamtauftreten maligner Erkrankungen in der Gesamtheit senken.

Infektionen mit Mikroben, Würmern oder Parasiten, insbesondere solche mit stärker chronischem Verlauf, dürften wahrscheinlich durch eine geeignete Behandlung mit gamma-Inulin mit oder ohne sonstige(n) Immunmodulatoren bekämpfbar sein. Weitere Immunstörungen, z. B. allergische oder rheumatische Erkrankungen, Immundefekterkrankungen oder neurologische oder gastrointestinale Störungen, die auf eine Fehlfunktion des Immunsystems zurückzuführen sind, dürften wahrscheinlich in ähnlicher Weise ansprechen.

Für den Fachmann dürfte selbstverständlich sein, daß ohne Abweichung von dem der Erfindung zu Grunde liegenden Konzept Modifikationen und Änderungen der zuvor beschriebenen Erfindung möglich sind.


Anspruch[de]

1. Zubereitung, umfassend Teilchen von Inulin oder eines Inulinderivats, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen in durch den Brechungsindex nicht nachweisbarer Form nach 18 Tagen bei 37ºC in Wasser löslich sind (als "gamma-polymorphe Form" bezeichnet), wobei die Zubereitung im wesentlichen von den α- und β-polymorphen Formen frei ist.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Inulin oder Inulinderivat ein Molekulargewicht über 8000 aufweist.

3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend Teilchen von gamma-Inulin, das durch sein Molekulargewicht im Bereich von 8000 bis 16000 gekennzeichnet ist.

4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das gamma-Inulin in Form einer stabilen reinen Suspension von Teilchen eines Durchmessers = 1 um vorliegt.

5. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Inulinderivat um β-D-[2-1]Polyfructose oder Inulin, bei dem die freien Hydroxylgruppen verethert oder verestert wurden, handelt.

6. Immuntherapeutische Zubereitung zur Aktivierung des alternativen Komplementwegs in vitro oder im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Antitumorbehandlung dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen nach 18 Tagen bei 37ºC in Wasser in durch den Brechungsindex nicht nachweisbarer Form löslich sind (als "gamma-polymorphe Form" bezeichnet), wobei das Präparat im wesentlichen von den α- und β-polymorphen Formen frei ist und wobei die aktive Komponente mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Träger und gegebenenfalls einem pharmazeutisch akzeptablen Konservierungsmittel kombiniert ist.

7. Präparat nach Anspruch 6, wobei die aktive Komponente Teilchen von gamma-Inulin eines Molekulargewichts über 8000 umfaßt.

8. Präparat nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Träger oder das Verdünnungsmittel aus einem sterilen wäßrigen Vehikel besteht.

9. Präparat nach Anspruch 8, wobei das wäßrige Vehikel aus einer isotonischen Lösung besteht.

10. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer injizierbaren Form vorliegt.

11. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer zur oralen, rektalen, vaginalen, topischen, nasalen oder okularen Verabreichung geeigneten Form vorliegt.

12. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 11, das zusätzlich eine zweite aus einem Immunmodulator bestehende aktive Komponente umfaßt.

13. Präparat nach Anspruch 12, wobei der Immunmodulator aus einem Impfantigen, einer antigenen Peptidsequenz oder einem Immunglobulin vom Antiidiotyp besteht.

14. Präparat nach Anspruch 12, wobei der Immunmodulator aus einem Interleukin oder einem Interferon oder einem Tumornekrosefaktor oder einem sonstigen Lymphokin oder einem Thymozytenstimulator oder einem sonstigen thymusstimulierenden Hormon, einem Muramylpeptid oder einer sonstigen mikrobiellen Komponente oder einer Vollmikrobe oder einem Endotoxin besteht.

15. Immuntherapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 14 zur Verwendung bei der Aktivierung des alternativen Komplementwegs in vitro oder im menschlichen oder tierischen Körpers oder zur Antitumorbehandlung im menschlichen oder tierischen Körper.

16. Immuntherapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 14 zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Behandlung aktueller oder möglicher präcanceröser Zustände in diesem.

17. Immuntherapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 14 zur Verwendung bei der Behandlung einer Infektion durch ein Bakterium, ein Mycoplasma, einen Pilz, ein Virus, ein Protozoon oder eine sonstige Mikrobe oder eines Befalls durch einen Wurm oder Parasiten im menschlichen oder tierischen Körper.

18. Immuntherapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 14 zur Verwendung bei der Behandlung allergischer Störungen oder primärer oder sekundärer Immundefekterkrankungen oder rheumatischer Erkrankungen oder neurologischer Störungen oder gastrointestinaler Störungen oder sonstiger zu Funktionsstörungen des Immunsystems in Bezug stehender Störungen im menschlichen oder tierischem Körper.

19. Immuntherapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 14 zur Verwendung als Immunantwortverstärker bei der Verabreichung eines Immunmodulators im menschlichen oder tierischen Körper.

20. Immuntherapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 14 zur Verwendung als Hilfsmittel bei der Verabreichung eines Impfantigens, einer antigenen Peptidsequenz oder eines Immunglobulins vom Antiidiotyp im menschlichen oder tierischen Körper.

21. Verfahren zur Herstellung von Teilchen von Inulin oder eines Inulinderivats, die nach 18 Tagen bei 37ºC in Wasser in einer durch den Brechungsindex nicht nachweisbaren Form löslich sind (als "gamma-polymorphe Form" bezeichnet) und praktisch keine α-und β-polymorphen Formen aus dem Rohinulin oder Inulinderivat enthalten, umfassen folgende Stufen:

(a) Umkristallisieren des Rohinulins oder -Inulinderivats aus Wasser bei einer Temperatur wesentlich unter 37ºC zur Gewinnung eines feinteiligen Teilchenmaterials in Suspension;

(b) 1- bis 4tägiges Erwärmen der Suspension auf eine Temperatur im Bereich von 25 bis 45ºC;

(c) weiteres 0,5 bis 1,5stündiges Erwärmen der Suspension auf eine Temperatur im Bereich von 40 bis 55ºC und

(d) Isolieren des hierbei gebildeten unlöslichen gamma-Inulins oder Inulinderivats aus der Suspension.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei Stufe (a) bei einer Temperatur von 5ºC, Stufe (b) bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 40ºC und Stufe (c) bei einer Temperatur im Bereich von 45 bis 50ºC durchgeführt werden.







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