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Ladungseffekte bei Immunassays - Dokument DE3049711C2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE3049711C2 05.05.1994
Titel Ladungseffekte bei Immunassays
Anmelder Syva Co., Palo Alto, Calif., US
Erfinder Gibbons, Ian, Menlo Park, Calif., US;
Rowley, Gerald L., Cupertino, Calif., US;
Ullman, Edwin F., Atherton, Calif., US
Vertreter Tauchner, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Heunemann, D., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Rauh, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte, 81675 München
DE-Anmeldedatum 23.04.1980
DE-Aktenzeichen 3049711
WO-Anmeldetag 23.04.1980
PCT-Aktenzeichen US8000455
WO-Veröffentlichungsnummer 8100261
WO-Veröffentlichungsdatum 05.02.1981
Date of publication of WO application in German translation 04.03.1982
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 05.05.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.05.1994
IPC-Hauptklasse G01N 33/536

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts, der Mitglied eines spezifisch bindenden Paares ist, wobei das gemessene Signal zur Menge des Analyts in Beziehung steht.

Proteinbindungsassays oder Immunassays waren Gegenstand ausführlicher Untersuchungen und haben Eingang in die Praxis gefunden. Die Möglichkeit der spezifischen Bestimmung eines Arzneistoffs oder einer anderen interessierenden Verbindung, insbesondere einer Verbindung von physiologischem Interesse, die in extrem niedriger Konzentration von gewöhnlich weniger als µg/ml vorliegt, hat neue Möglichkeiten in klinischen Laboratorien eröffnet. Die Möglichkeit der Überwachung der Verabfolgung von Arzneistoffen oder der Abhängigkeit von Arzneistoffen, der raschen und wirksamen Bestimmung von Krankheitszuständen sowie der Überwachung des Zustandes eines Patienten während Streßsituationen hat bedeutende Möglichkeiten für die Verbesserung der Patientenversorgung eröffnet.

Tests im klinischen Laboratorium erfordern häufig nicht nur eine hohe Empfindlichkeit sondern auch eine Genauigkeit über einen verhältnismäßig engen Bereich. Deshalb werden neue Methoden entwickelt, welche diese Anforderungen durch größere Empfindlichkeit, verminderte Antwort auf unspezifische Effekte und leichtere und einfachere Protokolle berücksichtigen. Zahlreiche Antigene können nur in unreiner Form oder mit erhöhten Kosten in reiner Form erhalten werden. Deshalb müssen Tests die Möglichkeit berücksichtigen, daß das Antigen in unreiner Form vorliegt. Parallel zu dieser Situation ist die Tatsache, daß die meisten Antikörper, die durch Verabfolgung eines Antigens erhalten werden, weniger als etwa 30 Gewichtsprozent oder häufig weniger als etwa 20 Gewichtsprozent des gesamten Proteins in Form des interessierenden Antikörpers enthalten. Bei der Herstellung von Reagenzien, bei denen Reaktionen mit dem Antikörperpräparat ablaufen, muß die Gegenwart großer Mengen an Verunreinigungen berücksichtigt werden. Weitere Überlegungen bei der Entwicklung eines Assays umfassen die Notwendigkeit für Inkubationen und die Anzahl der Inkubationen, die für die Inkubation erforderliche Zeit, die für die Messung erforderliche Zeit, die Empfindlichkeit der Messung gegenüber äußeren Faktoren, die Stabilität der Reagenzien und die Zusammensetzung der Reagenzien.

Diskussion des Standes der Technik

Aus der US-PS 3 996 345 ist die Verwendung eines Chromophorenpaares (fluoreszierende Substanz und Auslöscher) bekannt, wobei die Mitglieder bzw. Komponenten des Paares an verschiedene Mitglieder eines spezifisch bindenden Paares gebunden sind, so daß die Menge der fluoreszierenden Substanz und des Auslöschers (Quencher), die in einen Wechselwirkungen ermöglichenden Abstand kommen, von der enge des Analyts (Antigen; die zu analysierende Substanz) im Medium abhängt. In der US-PS 3 935 074 ist ein Immunassay beschrieben, der von der Unfähigkeit zweier Antikörper abhängt, sich gleichzeitig an ein Reagens zu binden, das mindestens zwei determinante Stellen aufweist. In der DE-OS 29 13 550 ist das Konzept bei Immunassays beschrieben, zwei Enzyme miteinander zusammenzubringen, deren Substrate oder Produkte in irgendeiner Weise zur Erzeugung eines erkennbaren Signals in Beziehung stehen, wobei die Nachbarschaft der Enzyme zur Menge des Analyts im Medium in Beziehung steht. In der DE-OS 28 30 862 ist ein Enzymimmunassay beschrieben, wobei der Ligand mit einem Enzym markiert ist und ein Enzyminhibitor daran gehindert wird, sich dem Enzym zu nähern, wenn ein Antikörper an den Ligand gebunden ist. In der US-PS 3 817 837 ist schließlich ein homogener Enzymimmunassay beschrieben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bestimmungsverfahren für einen Analyt zur Verfügung zu stellen, bei dem ein System verwendet wird, dessen Einsatz zu einem Signal führt, das in Beziehung zur Menge des Analyt steht.

Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.

Es wird ein Proteinbindungsassay geschaffen, der Mitglieder eines spezifisch bindenden Paares umfaßt. Diese Mitglieder sind ein Ligand und ein Receptor (Antiligand). Als erstes Reagens bei diesem Verfahren ist einer der Mitglieder durch eine Mehrzahl von ionisierbaren funktionellen Gruppen substituiert, die unter den Testbedingungen eine positive oder negative Ladung liefern. Ein zweites Mitglied, entweder das gleiche oder ein homologes Mitglied, ist mit einer Komponente eines ein Signal produzierenden Systems markiert. Dieses signalerzeugende System ist in der Lage, unter den Testbedingungen ein erkennbares Signal zu erzeugen.

Das von dem signalerzeugenden System gebildete Signal wird beeinflußt durch die Nachbarschaft zum elektrischen Feld, erzeugt vom geladenen ersten Mitglied. Durch entsprechende Wahl der Mitglieder in Beziehung zum Analyt kann die mittlere Nähe des ersten und zweiten Mitglieds im Testmedium in Beziehung gebracht werden zur Menge des Analyts im Testmedium. Auf diese Weise kann das beobachtete Signal in Beziehung gebracht werden zur Menge des Analyts im Testmedium. Bei Verwendung entsprechender Standards mit bekannten Mengen an Analyt ist es möglich, eine Beziehung zwischen der Konzentration des Analyts und dem Ausmaß des beobachteten Signals herzustellen.

Außerdem werden Reagenzien für den Test zur Verfügung gestellt. Ferner werden Kombinationen von Reagenzien zur Verfügung gestellt, welche die Empfindlichkeit des Tests oder das Ausmaß der Antwort des Tests auf Änderungen der Konzentration des Analyts optimieren.

Beschreibung spezieller Ausführungsformen

Die Erfindung betrifft einen Proteinbindungstest unter Verwendung eines spezifisch bindenden Paares, Ligand und Receptor. Die Grundlage der Erfindung ist darin zu erblicken, die Nähe von zwei Reagentien zur Menge des Analyts im Testmedium in Beziehung zu bringen. Das erste Reagens ist ein erstes Mitglied des spezifisch bindenden Paares, das durch eine Mehrzahl von ionisierten Ladungen modifiziert ist, so daß ein Ladungsfeld in wäßrigem Milieu bei einem bestimmten PH-Wert geschaffen wird. Ein zweites Mitglied ist mit einem Marker modifiziert, der eine Komponente eines aus einer einzigen oder aus mehreren Komponenten bestehenden Systems darstellt, das ein Signal erzeugt. Die Stärke des beobachteten Signals hängt von der Nachbarschaft des signalerzeugenden Systems zu dem von dem geladenen Mitglied erzeugten Feld ab. Das Feld beeinflußt das signalerzeugende System durch Verstärkung oder Verminderung der örtlichen Konzentration bestimmter Ionen im Testmedium. Diese Ionenkonzentration beeinflußt die Stärke des beobachteten Signals. Außer dem Analyt und dem ersten und zweiten Mitglied können noch andere Substanzen zugesetzt werden, je nach der Art des signalerzeugenden Systems.

Die Bindung homologer Mitglieder des spezifisch bindenden Paares hat die Bildung eines Komplexes zur Folge, bei dem mindestens zwei, gewöhnlich mindestens drei Mitglieder eine Rolle spielen. Im Hinblick auf die polyvalente Art der Antikörper und Antigene kann der Komplex erweitert werden und ein Netzwerk von Antikörper und Antigen schaffen, das eine Mehrzahl von Signalmarkern und ionisierten Ladungen in Nachbarschaft bringt, wobei Wechselwirkungen erfolgen können.

Bei der Beschreibung der Erfindung wird folgende Reihenfolge eingehalten. Zunächst wird das Testverfahren beschrieben. Sodann werden Definitionen verschiedener Ausdrücke im Hinblick auf die verwendeten Substanzen gegeben. Danach werden die Substanzen im Hinblick auf den Analyt, das signalerzeugende System und die geladenen Mitglieder erläutert. Schließlich folgen der experimentelle Teil und Angaben über die Anwendung des Verfahrens.

Testmethode

Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren werden der Analyt, ein Reagens mit einer Mehrzahl ionisierbarer Gruppen, die unter den Versuchsbedingungen ionisiert sind, ein markiertes Reagens, wobei der Marker ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems ist, und andere notwendige Komponenten in einem gepufferten wäßrigen Medium vereinigt. Das beobachtete Signal kann sodann abgelesen und mit einem Testmedium mit bekannter Menge an Analyt verglichen werden.

Der Analyt ist ein Mitglied eines spezifisch bindenden Paares, das aus einem Ligand und dessen homologen Receptor besteht. Entweder der Ligand oder der Receptor kann der Analyt sein. Das Testmedium ist normalerweise ein wäßriges Medium, das normalerweise auf einen mäßigen pH-Wert abgepuffert ist, der im allgemeinen nahe dem Wert ist, bei dem eine optimale Empfindlichkeit des Tests erreicht wird. Der Test wird ohne Abtrennung der Testkomponenten oder Produkte durchgeführt.

Das wäßrige Medium kann aus Wasser bestehen oder es kann bis zu 40 Volumenprozent eines weiteren Lösungsmittels, normalerweise ein polares Lösungsmittel, gewöhnlich ein sauerstoffhaltiges organisches Lösungsmittel mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, enthalten. Beispiele hierfür sind Alkohole und Äther.

Der pH-Wert des Mediums liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 4 bis 11, insbesondere im Bereich von etwa 5 bis 10 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Der pH-Wert wird so gewählt, daß ein signifikantes Ausmaß einer spezifischen Bindung durch den Receptor aufrechterhalten wird und gleichzeitig die Empfindlichkeit oder die Antwort des signalerzeugenden Systems auf Änderungen in der Analytkonzentration optimal ist.

Zur Einstellung des gewünschten pH-Wertes und zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Beispiele für derartige Puffer sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitursäure-Puffer. Der jeweils verwendete Puffer ist für die Erfindung nicht kritisch. Bei bestimmten Tests kann jedoch ein bestimmter Puffer bevorzugt sein.

Der Test wird normalerweise bei mäßigen Temperaturen und gewöhnlich bei konstanten Temperaturen, insbesondere bei Geschwindigkeitsbestimmungen durchgeführt. Die Inkubationstemperaturen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 45°C, gewöhnlich bei etwa 15 bis 40°C. Die Temperaturen während der Messungen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50°C, insbesondere bei etwa 15 bis 40°C.

Die Konzentration des zu bestimmenden Analyts liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 10-4 bis 10-15 M, insbesondere bei etwa 10-6 bis 10-13 M. Normalerweise hängt die Konzentration der anderen Reagenzien davon ab, ob der Test qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ ist. Ferner spielen die spezielle Nachweismethode und die Konzentration des Analyts eine Rolle.

Die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Testmedium werden im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Analyts bestimmt. Die Endkonzentration der Reagenzien wird normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Tests über den interessierenden Bereich zu optimieren. Eine signifikante Änderung der Analytkonzentration soll eine genau meßbare Signaldifferenz ergeben.

Die gesamten Bindungsstellen der Mitglieder des spezifisch bindenden Paares, die reziprok zum Analyt sind, können erheblich variieren, je nach der Art der Reagenzien, d. h. ob die Reagenzien gleich oder verschieden sind vom Analyt. Beispielsweise können beide Reagenzien Receptoren oder beide Reagenzien Liganden sein oder ein Reagens kann ein Ligand und das andere ein Receptor sein. Mindestens ein Reagens ist das reziproke Bindungsmittel des Analyts.

Das Verhältnis von markiertem Reagens zu Analyt gegeben durch die Bindungsstellen im Testmedium beträgt gewöhnlich etwa 0,5 bis etwa 100 Bindungsstellen des markierten Reagens pro Bindungsstelle des Analyts, vorzugsweise etwa 1 bis 50 und insbesondere etwa 1 bis 20 über den Bereich der Analytkonzentration. Diese Mitglieder beziehen sich auf die verfügbaren Stellen bei der Sättigung, da sämtliche Stellen nicht in gleicher Weise verfügbar sind.

Es ist ersichtlich, daß die vorstehenden Zahlenangaben lediglich zur Erläuterung der höchstwahrscheinlich interessierenden Verhältnisse gegeben werden. Das Verhältnis hängt ab von der Art der Messung, dem Gleichgewicht oder der Geschwindigkeit, der Bindungskonstante des markierten Reagens, der Analytkonzentration, der Empfindlichkeit des signalerzeugenden Systems gegenüber Ladungseffekten, der Art des Liganden und der Empfindlichkeit, mit der das Signal erkannt werden kann.

Das Molverhältnis des geladenen Mitglieds zum markierten Mitglied kann ebenfalls in verhältnismäßig weitem Umfang variieren, je nach der Art des Markers, der Empfindlichkeit des Markers gegenüber Ladungseffekten und der Art des Liganden. Gewöhnlich liegt das Molverhältnis des geladenen Mitglieds zum markierten Mitglied im Bereich von etwa 0,5 bis 100 : 1, insbesondere bei etwa 1 bis 20 : 1. Dieses Molverhältnis kann sehr stark variieren, je nach dem jeweiligen Protokoll, der Art der Zugabe, der Art des Markers, der relativen Bindungsaffinität und dergl.

Die Reihenfolge der Zugabe kann erheblich schwanken, jedoch werden häufig nicht sämtliche Komponenten eines aus mehreren Komponenten bestehenden signalerzeugenden Systems gleichzeitig zugesetzt. Gewöhnlich wird das mit einer Komponente des signalerzeugenden Systems markierte Mitglied dem Testmedium zugesetzt, bevor mindestens eine der anderen Komponenten des signalerzeugenden Systems zugegeben wird.

Dies ist insbesondere der Fall, wenn ein Enzym ein Marker ist und die anderen Komponenten Substrate und Cofaktoren sind.

Die beiden Reagensmitglieder können gleichzeitig oder nacheinander zum Analyt gegeben werden. Zweckmäßig wird der Marker mit dem signalerzeugenden System häufig vor dem geladenen Mitglied zugegeben. Die beiden Reagenzien können als einziges Gemisch oder in getrennter Form zur Verfügung gestellt werden, je nach der Art des Protokolls.

Zwei spezielle Protokolle können als Beispiel gegeben werden. Beim ersten Protokoll wird das mit dem signalerzeugenden System markierte Mitglied zum Analyt gegeben und eine ausreichende Zeit inkubiert, bis Gleichgewicht erreicht ist. Sodann wird das Gemisch mit dem geladenen Mitglied versetzt und gleichzeitig oder unmittelbar danach können irgendwelche weiteren Komponenten des signalerzeugenden Systems zugegeben werden.

Bei einem alternativen Protokoll, d. h. einer anderen Versuchsmethodik, werden das Mitglied, das mit dem signalerzeugenden System markiert ist, und das geladene Mitglied gleichzeitig zugegeben und gegebenenfalls inkubiert. Zweckmäßig kann man einen Signalinhibitor zusetzen, d. h. eine Substanz, die in Wechselwirkung tritt mit der signalerzeugenden Systemmarkierung, um die Bildung des Signals zu hemmen, wenn das Mitglied mit der signalerzeugenden Systemmarkierung nicht an sein homologes Mitglied gebunden ist.

Der Analyt kann so wirken, daß das geladene Mitglied und das signalmarkierte Mitglied zusammenkommen oder die Trennung des geladenen Mitglieds und des Signal markierten Mitglieds verstärken. Wenn beispielsweise der Analyt ein Antigen oder ein Poly(Ligand Analog) ist und die beiden Reagenzienmitglieder Antikörper sind, vermag der Analyt innerhalb eines begrenzten Konzentrationsbereiches durchschnittlich die beiden Reagenzienmitglieder in größere Nähe zu bringen, als wenn die Mitglieder frei in Lösung vorliegen. Wenn andererseits der Analyt ein Antigen und das signalmarkierte Mitglied ein Antigen ist, dann konkurrieren der Analyt und das signalmarkierte Mitglied um einen geladenen Antikörper.

Zur Herstellung des Testmediums können ein oder mehrere Inkubationsschritte erforderlich sein. Beispielsweise kann es erwünscht sein, einen Antigenanalyt mit einem markierten Receptor zu inkubieren. Außerdem kann es erwünscht sein, einen zweiten Inkubationsschritt durchzuführen, je nach der Art der anderen verwendeten Reagenzien. Die Verwendung einer Inkubationszeit und die Länge der Inkubationszeit hängt in erheblichem Ausmaß von der Art der Bestimmung (Verhältnis oder Gleichgewicht) und dem Anteil der Bindung des Receptors an den Liganden ab. Gewöhnlich beträgt die Zeit für die Inkubationsschritte etwa 0,5 Minuten bis 6 Stunden, insbesondere etwa 5 Minuten bis 1 Stunde. Die Inkubationstemperaturen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 4 bis 50°C, insbesondere von etwa 15 bis 37°C.

Nach Vereinigung der Reagenzien wird das Signal bestimmt. Dies erfolgt normalerweise durch Beobachtung einer elektromagnetischen Strahlung, insbesondere UV- und sichtbares Licht, vorzugsweise sichtbares Licht, entweder als Absorptions- oder Emissions-Bestimmung. Sofern eine Fluoreszenz eine Rolle spielt, soll das emittierte Licht eine Wellenlänge von mehr als 400 nm, besser mehr als 450 nm und vorzugsweise mehr als 500 nm aufweisen. Bei einer Absorptionsmessung liegt die Absorption normalerweise im Bereich von etwa 250 bis 900 nm, gewöhnlich bei etwa 325 bis 650 nm.

Die Temperatur, bei der das Signal beobachtet wird, liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50°C, insbesondere bei etwa 15 bis 40°C.

Es können Standard-Testmedien hergestellt werden, die bekannte Mengen des Analyts enthalten. Das beobachtete Signal für die Standard-Testmedien kann so aufgetragen werden, daß die Konzentration zum Signal in Beziehung steht. Sobald eine Eichkurve aufgestellt ist, kann ein Signal unmittelbar mit der Analytkonzentration in Beziehung gebracht werden.

Die Zeit zur Bestimmung des Signals hängt unter anderem davon ab, ob ein Verhältnis oder ein Gleichgewicht bestimmt wird, von der erforderlichen Empfindlichkeit und von der Art des signalerzeugenden Systems. Bei der Verhältnismethode schwanken die Zeitabstände zwischen den Ablesungen im allgemeinen von etwa 5 Sekunden bis 6 Stunden, gewöhnlich von etwa 10 Sekunden bis 1 Stunde. Für die Bestimmung des Gleichgewichts kann nach Einstellung des Gleichgewichtszustandes eine einzelne Ablesung ausreichen. Es können auch zwei Ablesungen über einen geeigneten Zeitabstand genügen.

Definitionen

Analyt: Die Verbindung oder das Präparat, das zu bestimmen ist. Es kann ein Ligand, eine einzige oder eine Mehrzahl von Verbindungen, die mindestens eine gemeinsame epitope oder determinante Stelle miteinander teilen, oder ein Receptor sein.

Spezifisch bindendes Paar: Zwei verschiedene Moleküle, wobei eines der Moleküle einen Bereich auf der Oberfläche oder in seinem Inneren aufweist, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche oder polare Organisation des anderen Moleküls bindet. Die Mitglieder des spezifisch bindenden Paares werden als Ligand und Receptor (Antiligand) bezeichnet.

Ligand: Jede organische Verbindung, für die es einen Receptor natürlicher Art gibt oder hergestellt werden kann.

Receptor (Antiligand): Jede Verbindung oder jedes Präparat, das eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls erkennt, d. h. eine determinante oder epitope Stelle. Beispiele für Receptoren sind natürlich vorkommende Receptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Fab-Fragmente, Enzyme und Lektine.

Ligand-Analog: Ein modifizierter Ligand, der mit dem analogen Ligand für einen Receptor in Konkurrenz treten kann. Die Modifikation stellt Mittel zur Verfügung, um den Ligand- Analog an andere Moleküle zu binden. Je nach den verfügbaren funktionellen Gruppen am Ligand kann der Ligand-Analog von dem Ligand durch mehr als ein Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung sich unterscheiden, welche den Ligand-Analog an ein Verbindungsstück oder einem Marker bindet.

Poly(Ligand-Analog): Eine Mehrzahl von Ligand-Analogen, die miteinander kovalent verbunden sind, häufig an einen Verbindungsstückkern. Der Verbindungsstückkern ist eine polyfunktionelle Substanz, normalerweise von polymerer Natur, die gewöhnlich eine Mehrzahl von funktionellen Gruppen aufweist, z. B. Hydroxyl-, Amino- oder Mercaptogruppen oder olefinisch ungesättigte Gruppen, die als Bindungsstellen dienen. Der Verbindungsstückkern kann in Wasser löslich oder unlöslich sein. Gewöhnlich ist er wasserlöslich und er hat normalerweise ein Molekulargewicht von mindestens etwa 10 000, gewöhnlich von mindestens etwa 35 000. Das Molekulargewicht kann 10 000 000 oder mehr sein, gewöhnlich liegt es jedoch unter 600 000 und insbesondere unter 300 000. Typische Beispiele für Verbindungsstückkerne sind Polysaccharide, Polypeptide (Proteine), Nucleinsäuren und Ionenaustauscherharze. Wasserunlösliche Verbindungsstückkerne sind beispielsweise Gläser, Additions- und Kondensationspolymerisate, die sowohl unvernetzt als auch vernetzt sind, natürlich vorkommende Partikel und dergl., die eine Mehrzahl funktioneller Gruppen aufweisen oder die zur Funktionalisierung befähigt sind.

Signalerzeugendes System: Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten enthalten. Eine Komponente ist an ein spezifisch bindendes Paarmitglied konjugiert. Das signalerzeugende System erzeugt ein meßbares Signal, das durch äußere Mittel erkennbar ist. Normalerweise wird die elektromagnetische Strahlung gemessen. Erfindungsgemäß hängt das Ausmaß des beobachteten Signals, das durch das signalerzeugende System erzeugt wird, von der Nähe des geladenen Mitglieds zum markierten Mitglied ab. Meistens umfaßt das signalerzeugende System Enzyme und Chromophore, wobei die Chromophoren Farbstoffe sind, die Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore, fluoreszierende oder chemilumineszierende Substanzen. Als Enzyme kommen normalerweise solche in Frage, welche entweder die Bildung oder den Abbau einer Substanz beschleunigen, welche Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbiert oder welche direkt oder indirekt die Bildung von emittiertem Licht durch Fluoreszenz oder Chemilumineszenz bewirken.

Marker: Jedes Molekül, das an ein anderes Molekül konjugiert ist, wobei das erstgenannte ein Mitglied des signalerzeugenden Systems ist. Erfindungsgemäß sind die Marker die Komponenten des signalerzeugenden Systems, die an ein Mitglied des spezifisch bindenden Paares gebunden sind. Sie werden als Signalmarker bezeichnet.

Markierter Ligand: Das Konjugat des Ligandenmitglieds (Liganden Analog) des spezifisch bindenden Paares mit einem Mitglied des signalerzeugenden Systems, entweder kovalent oder nicht kovalent gebunden. Bei kovalenter Bindung sind die Mitglieder entweder durch eine Bindung, eine Bindungsgruppe oder einen Verbindungsstückkern gebunden. Der markierte Ligand kann einen oder mehrere Liganden oder einen oder mehrere Marker oder eine Mehrzahl beider aufweisen. In diesem Fall wird er als Poly(Ligand-Analog)-Polymarker bezeichnet.

Markierter Receptor: Das Konjugat des Receptors mit einem Mitglied des Signalerzeugenden Systems, wobei die beiden entweder kovalent oder nicht kovalent, gewöhnlich kovalent durch eine Verbindungsgruppe, miteinander verbunden sind, wobei einer oder mehrere Receptoren an den Marker oder einer oder mehrere Marker an den Receptor gebunden sind.

Geladenes Mitglied: Ein lösliches Mitglied des spezifischen Bindungspaares, gewöhnlich der Receptor, speziell ein Antikörper, der polyionisch ist dadurch, daß er entweder kovalent oder nicht-kovalent substituiert ist durch eine Mehrzahl funktioneller Gruppen der gleichen Ladung, die entweder negativ oder positiv sind. Auf diese Weise wird eine verhältnismäßig hohe örtliche Ladungsdichte erzeugt. Es kann sich um ein einziges Mitglied oder eine Mehrzahl von Mitgliedern handeln, die miteinander verbunden sind.

Substanzen

Komponenten im erfindungsgemäßen Test sind der Analyt, der ein Mitglied des spezifisch bindenden Paares ist, das signalmarkierte Mitglied, weitere erforderliche Komponenten des signalerzeugenden Systems, das geladene Mitglied und gegebenenfalls ein Receptor oder Poly(Ligand-Analog).

Analyt

Die erfindungsgemäßen Liganden-Analyte sind entweder monoepitop oder polyepitop. Die polyepitopen Liganden- Analyte sind normalerweise Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und deren Kombinationen. Derartige Kombinationen von Substanzen sind Bakterien, Viren, Chromosome, Gene, Mitochondrien, Kerne und Zellmembranen.

In der Regel hat der erfindungsgemäß verwendete polyepitope Ligand-Analyt ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000, insbesondere von mindestens etwa 10 000. Bei den Polyaminosäuren liegt das Molekulargewicht im Bereich von etwa 5000 bis 5 000 000, insbesondere bei etwa 20 000 bis 1 000 000. Bei den Hormonen liegt das Molekulargewicht gewöhnlich im Bereich von etwa 5000 bis 60 000.

Als Proteine kommen die verschiedensten Proteine mit ähnlichen strukturellen Merkmalen- Proteine mit speziellen biologischen Funktionen, Proteine, die von speziellen Mikroorganismen stammen, insbesondere pathogenen Mikroorganismen in Betracht.

Nachstehend werden Beispiele für strukturell verwandte Proteine gegeben:

Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Scleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine, Glycoproteine, Proteoglycane, nicht klassifizierte Proteine, wie Somatotropin, Prolactin, Insulin und Pepsin.

Nachstehend wird eine Anzahl von Proteinen genannt, die in menschlichem Plasma vorliegen, und die von klinischer Bedeutung sind:

Prealbumin, Albumin, α1-Lipoprotein, α1-saures Glycoprotein, α1-Antitrypsin, α1-Glycoprotein, Transcortin, 4.6 S-Postalbumin, Tryptophan-armes α1-Glycoprotein, α1-Glycoprotein, Thyroxin-bindendes Globulin, Inter-α- Trypsin-Inhibitor, Gc-Globulin (Gc 1-1), (Gc 2-1), (Gc 2-2), Haptoglobin (Hp 1-1), (Hp 2-1), (Hp 2-2), Ceruloplasmin, Cholinesterase, α2-Lipoprotein(e), Myoglobin, C-reaktives Protein, α2-Macroglobulin, α2-HS-Glycoprotein, Zn-α2-Glycoprotein, α2-Neuramino-glycoprotein, Erythropoietin, β-Lipoprotein, Transferrin, Homopexin, Fibrinogen, Plasminogen, β2-Glycoprotein I, β2-Glycoprotein II,

Immunoglobulin G (IgG) oder γG-Globulin

Mol.-Formel: γ2K2 oder γ2λ2

Immunoglobulin A (IgA) oder γA-Globulin

Mol.-Formel: (α2K2)n oder (α2λ2)n

Immunoglobulin M (IgM) oder γM-Globulin

Mol.-Formel: (µ2K2)5 oder (µ2λ2)5

Immunoglobulin E(IgE) oder γE-Globulin (γE)

VII Proconvertin VIII Antihemophiles Globulin (AHG) IX Christmas-Factor, Plasma-Thromboplastin-Komponente (PTC) X Stuart-Prower-Factor, Autoprothrombin III XI Plasma-Thromboplastin-Antecedent (PTA) XII Hagemann-Factor XIII Fibrin-stabilisierender Factor


Beispiele für wichtige Proteinhormone sind Peptide und Proteinhormone, wie parathyreoides Hormon (Parathromon), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin (Melanocyten-stimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon), Thyrotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, Luteinisierungshormon (interstitielle Zellen stimulierendes Hormon), Luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin), Gonadotropin (Chorion-Gonadotropin),

Gewebehormone, wie Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin und humanes Placentalactogen, sowie Peptidhormone aus der Neurohypophysis, wie Oxytocin, Vasopressin, Releasing-Faktoren (RF), CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF.

Andere polymere Substanzen von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.

Spezielle Beispiele für antigene Polysaccharide, die sich von Mikroorganismen ableiten, sind folgende:

Mikroorganismus Hemosensitin gefunden im Streptococcus pyogenes Polysaccharid Diplococcus pneumoniae Polysaccharid Neisseria meningitidis Polysaccharid Neisseria gonorrheae Polysaccharid Corynebacterium diphtheriae Polysaccharid Actinobacillus mallei; Actinobacillus whitemori Rohextrakt Francisella tularensis Lipopolysaccharid, Polysaccharid Pasteurella pestis Pasteurella pestis Polysaccharid Pasteurella multocida Kapselantigen Brucella abortus Rohextrakt Haemophilus influenzae Polysaccharid Haemophilus pertussis roh Treponema reiteri Polysaccharid Veillonella Lipopolysaccharid Erysipelothrix Polysaccharid Listeria monocytogenes Polysaccharid Chromobacterium Lipopolysaccharid Mycobacterium tuberculosis Kochsalzextrakt von mit 90prozentigem Phenol extrahierten Mycobakterien und Polysaccharidfraktion aus den Zellen und Turberculin Klebsiella aerogenes Polysaccharid Klebsiella cloacae Polysaccharid Salmonella typhosa Lipopolysaccharid, Polysaccharid Salmonella typhi-murium; Salmonella derby Polysaccharid Salmonella pullorum Shigella dysenteriae Polysaccharid Shigella flexneri Shigella sonnei roh, Polysaccharid Rickettsiae Rohextrakt Candida albicans Polysaccharid Entamoeba histolytica Rohextrakt


Die zu untersuchenden Mikroorganismen können intakt, lysiert, gemahlen oder anderweitig fragmentiert sein. Es kann sich um die erhaltene Masse oder einen Teil davon handeln, der z. B. durch Extraktion erhalten wird. Spezielle Beispiele für interessierende Mikroorganismen sind:

Corynebacterium, wie Corynebacterium diphtheriae

Pneumococcen, wie Diplococcus pneumoniae,

Streptococcen, wie Streptococcus pyogenes und Streptococcus salivarus,

Staphylococcen, wie Staphylococcus aureus und Staphylococcus albus,









Ferner kommen in Frage Viren, z. B. Adenoviren, Herpesviren, wie Herpes simplex, Varicella (Chicken pox), Herpes Zoster (Shingles), Virus B und Cytomegalie, Pockenviren, wie Variola, Vaccinia, Poxvirus bovis, Paravaccinia, Nolluscum contagiosum, Picornaviren, wie Polio, Coxsackie, Echo und Rhino, Myxoviren, wie Influenza (A, B und C), Parainfluenza (1-4), Mumps, Newcastle Disease, Masern, Rinderpest, Hundestaupe, Respiratory Syncytial und Röteln, Arboviren, wie Eastern Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis, Sindbis, Chikugunya, Semliki Forest, Mayora, St. Louis Encephalitis, California Encephalitis, Colorado Tick Fever, Yellow Fever und Dengue, Reoviren, wie Reovirus Typ 1 bis 3, Hepatitis, wie Hepatitis A und Hepatitis B, und Tumorviren, wie Rauscher Leukaemie Virus, Gross Virus und Maloney Leukaemie Virus.

Die monoepitopen Ligandenanalyte haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000, insbesondere von 125 bis 1000. Speziell interessierende Analyte sind Arzneistoffe, Stoffwechselprodukte, Pestizide und verunreinigende Substanzen. Spezielle Beispiele für interessierende Arzneistoffe sind Alkaloide, z. B. Morphinalkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, ihre Derivate und Stoffwechselprodukte, Cocainalkaloide, wie Cocain- und Benzoylecgonin, ihre Derivate und Stoffwechselprodukte, Ergotalkaloide, wie Lysergsäurediäthylamid, Steroidalkaloide, Iminazoylalkaloide, Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide, Chinolinalkaloide, wie Chinin und Chinidin, und Diterpenalkaloide, ihre Derivate und Stoffwechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Steroide, wie Oestrogene, Gestagene und Androgene, Steroide der Nebennierenrinde, Gallensäuren, Herzglykoside und Aglycone, wie Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, ihre Derivate und Stoffwechselprodukte. Ferner gehören dazu steroidähnliche Substanzen, wie Diäthylstilböstrol.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit 5 bis 6 Ringgliedern, wie Barbiturate, z. B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidone, Ethosuximide und ihre Stoffwechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoalkylbenzole mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, wie Amphetamine, Catecholamine, z. B. Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin und ihre Stoffwechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind heterocyclische Verbindungen mit ankondensiertem Benzolring, wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, ihre Derivate und Stoffwechselprodukte. Als heterocyclische Ringe kommen Azepine, Diazepine und Phenothiazine in Frage.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Purine, wie Theophyllin, Coffein und ihre Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Verbindungen, die sich von Marihuana ableiten, wie Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Vitamine, wie Vitamin A, B, z. B. B12, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Prostaglandine, die sich durch das Ausmaß und die Stellung der Hydroxylierung und des Gehalts an ungesättigten Bindungen unterscheiden.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Antibiotika, wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, ihre Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Nucleoside und Nucleotide, wie ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren entsprechenden Zucker- und Phosphatresten.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind verschiedene einzelne Arzneistoffe, wie Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propanolol, Griseofulvin, Valproinsäure, Butyrophenone, Antihistaminika, anticholinerge Arzneistoffe, wie Atropin, ihre Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind Aminosäuren und kleine Peptide, wie Polyjodthyronine z. B. Thyroxin und Trijodthyronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin, Met- und Leu- Enkephalin, ihre Stoffwechselprodukte und Derivate.

Stoffwechselprodukte, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, sind Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoglykoside, wie Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.

Spezielle Beispiele für Pestizide sind polyhalogenierte Diphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, ihre Stoffwechselprodukte und Derivate.

Für Receptoranalyte liegt das Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich von 10 000 bis 2×106, insbesondere im Bereich von 10 000 bis 106. Für Immunoglobuline (IgA, IgG, IgE und IgM) liegt das Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich von etwa 160 000 bis etwa 106. Enzyme haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 6 000 000. Das Molekulargewicht natürlicher Receptoren kann in erheblichen Grenzen schwanken. Im allgemeinen beträgt es mindestens 25 000 und kann 106 oder höher sein. Beispiele für derartige Substanzen sind Avidin, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Prealbumin und Transcortin.

Ligand-Analog

Der Ligand-Analog unterscheidet sich vom Ligand entweder durch Substitution eines Wasserstoffatoms oder einer funktionellen Gruppe durch eine Bindung oder eine verbindende Gruppe, die eine Funktionalität zur Bildung einer kovalenten Bindung mit einem anderen Molekül mit einer aktiven Funktionalität aufweist, z. B. einer Hydroxyl-, Amino-, Aryl-, Thio- oder Olefingruppe. Die erhaltene Verbindung unterscheidet sich vom Ligand durch mehr als eine Substitution eines Wasserstoffatoms durch das Molekül, mit dem es konjugiert ist. Die verbindende Gruppe enthält normalerweise 1 bis 20 Atome (ausgenommen Wasserstoffatome), nämlich Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Stickstoff- und Halogenatome mit den Atomzahlen 17 bis 35. Beispiele für funktionelle Gruppen sind Carbonylgruppen (Oxo- oder Nichtoxo-) aktive Halogenatome, Diazogruppen, Mercaptogruppen, Äthylengruppen, insbesondere aktivierte Äthylengruppen und Aminogruppen. Die Zahl der Heteroatome liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0 bis 6, vorzugsweise bei etwa 1 bis 6 und insbesondere bei etwa 1 bis 4. Eine Beschreibung von verbindenden Gruppen findet sich in der US-PS 3 817 837, auf die hier Bezug genommen wird.

In der Regel sind die verbindenden Gruppen aliphatische Gruppen, jedoch kommen auch Diazogruppen und aromatische Gruppen in Frage. Im allgemeinen ist die verbindende Gruppe eine zweiwertige Kette mit etwa 1 bis 10, insbesondere etwa 1 bis 6 Atomen in der Kette. Sauerstoffatome liegen normalerweise in Form von Oxo- oder Oxygruppen vor, die an Kohlenstoff- und Wasserstoffatome gebunden sind. Vorzugsweise sind sie allein an Kohlenstoffatome gebunden. Stickstoffatome liegen im allgemeinen in Form von Aminogruppen vor, die an Kohlenstoffatome gebunden sind, oder in Form von Amidogruppen. Schwefelatome liegen in analoger Art vor wie die Sauerstoffatome.

Gemeinsame funktionelle Gruppen zur Bildung der kovalenten Bindung zwischen der verbindenden Gruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamine, Amide, Amidine, Thioamide, Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidine und Diazogruppen.

Verbindende Gruppen mit spezieller Anwendung bei der Konjugation an Polypeptide sind Carbonsäuren, die zusammen mit Diimiden verwendet werden können, oder in Form von gemischten Anhydriden mit Kohlensäuremonoestern oder aktive Carbonsäureester, beispielsweise von N-Hydroxysuccinimid oder p-Nitrophenylester. Stickstoffanaloge können als Imidoester verwendet werden. Aldehyde können so eingesetzt werden, daß sie unter reduktiven Aminierungsbedingungen Imine bilden, z. B. in Gegenwart von Borhydriden. Dabei entstehen Alkylamine. Andere verwendbare Nichtoxo-Carbonylgruppen sind Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen. Außerdem können aktive Halogenide verwendet werden, insbesondere Bromacetylgruppen.

In den meisten Fällen enthält der Ligand eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die als Stelle zur Bindung der verbindenden Gruppe verwendet werden können. Speziell Verwendung finden Hydroxyl-, Amino- und Arylgruppen, insbesondere aktivierte Arylgruppen. Auch können Oxime aus Oxo-Gruppen oder der als Stelle für die Verknüpfung der bindenden Gruppe, beispielsweise einer Carboxymethylgruppe, benutzte Hydroxylgruppen hergestellt werden.

Die Art der zu verbindenden Gruppe kann sehr stark variieren, je nach den Funktionalitäten, die in dem Liganden und in der Verbindung, mit der der Ligand konjugiert werden soll, vorliegen, und der Art und der Länge der gewünschten verbindenden Gruppe.

Signalerzeugendes System

Das signalerzeugende System enthält mindestens ein Mitglied und liefert ein erkennbares Signal im Testmedium. Dieses Signal wird durch die Nähe des stark geladenen Moleküls zu dem markierten Mitglied beeinflußt. Das signalerzeugende System reagiert nicht nur auf die Anwesenheit des stark geladenen Moleküls, sondern es ist erwünscht, daß das signalerzeugende System mehrere meßbare Ereignisse als Antwort auf die Bindung zwischen den Mitgliedern eines einzelnen spezifisch bindenden Paares (Verstärkung) liefert.

Die vor allem interessierenden signalerzeugenden Systeme sind diejenigen, die einen Katalysator, insbesondere einen Enzymkatalysator, oder ein Chromophor umfassen, das Licht absorbiert oder emittiert, insbesondere fluoreszierende oder chemilumineszierende Substanzen, sowie Kombinationen der beiden Systeme.

Der erste, nachstehend beschriebene Typ von System umfaßt Enzyme.

Enzyme

Bei der Wahl eines Enzyms für das Verfahren der Erfindung ist vor allem zu berücksichtigen, daß es durch die Nähe des stark geladenen Moleküls beeinflußt werden kann. Das stark geladene Molekül kann das Enzym auf mindestens einem von drei verschiedenen Wegen beeinflussen. Der erste Weg besteht in der Beeinflussung der örtlichen Konzentration von Protonen. Die örtliche Konzentration von Protonen (reziprok die Hydroxylkonzentration) beeinflußt die Enzymaktivität durch Beeinflussung der Konformation des Enzyms oder des Ionisierungsgrades spezieller funktioneller Gruppen des Enzyms oder des für die Reaktion wesentlichen Substrats, d. h. protoniert oder nicht protoniert. Deshalb läßt sich eine Erhöhung oder Verminderung des Anteils je nach dem pH-Wert der Lösung, der Natur der geladenen Species und der Enzymantwort auf die lokale Protonenkonzentration erzielen.

Ein zweiter Weg, wie der Enzymanteil beeinflußt werden kann, besteht in der Anziehung oder Abstoßung eines geladenen Substrats, insbesondere eines Substrats, das eine Mehrzahl von Substratmolekülen aufweist, die an ein Verbindungsstück gebunden sind. Das geladene Mitglied in Nachbarschaft zum Signalmarker, d. h. dem Enzym, kann das Substrat anziehen oder abstoßen und auf diese Weise die Umsatzzahl erhöhen oder vermindern.

Ein dritter Weg besteht in der Verwendung eines geladenen Substrats, das die lokale Konzentration einer Verbindung beeinflußt, die mit einem Enzymprodukt in Wechselwirkung tritt. Wenn beispielsweise ein Enzym eine chemilumineszierende Reaktion erzeugt, kann man einen geladenen Energieacceptor vorsehen, der durch das geladene Mitglied angezogen wird. Die Energie aus der chemilumineszierenden Substanz wird auf den Energieacceptor in Nachbarschaft zur chemilumineszierenden Substanz übertragen. Dies hat eine sensibilisierte Emission vom Acceptor zur Folge.

Bei der Auswahl eines Enzyms ist außer der Wirkung des geladenen Partikels auf die Enzymumsatzrate noch folgendes zu berücksichtigen, nämlich die Stabilität des Enzyms, die gewünschte hohe Umsatzrate, die Empfindlichkeit des Umsatzanteils gegenüber Änderungen in der physikalischen Umgebung, die Art der Substrate und Produkte, insbesondere die Fähigkeit zur genauen Bestimmung des Substrats oder Produkts, vorzugsweise des Produkts, die Verfügbarkeit des Enzyms, die Wirkung der Konjugation des Enzyms auf seine Eigenschaften, die Wirkung auf die Enzymaktivität von Substanzen, die in der Probelösung vorliegen können und das Molekulargewicht des Enzyms.

Nachstehend sind Kategorien von Enzymen gemäß der Klassifikation der Internationalen Union für Biochemie gegeben.

Tabelle I
  • 1. Oxidoreduktasen
    • 1.1 Einwirkung auf die CH-OH-Gruppe von Donoren
      • 1.1.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
      • 1.1.2 mit einem Cytochrom als Acceptor
      • 1.1.3 mit O2 als Acceptor
      • 1.1.99 mit anderen Acceptoren
    • 1.2 Wirkung auf die Aldehyd- oder Ketogruppe von Donoren
      • 1.2.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
      • 1.2.2 mit Cytochrom als Acceptor
      • 1.2.3 mit O2 als Acceptor
      • 1.2.4 mit Lipoat als Acceptor
      • 1.2.99 mit anderen Acceptoren
    • 1.3 Wirkung auf die CH-CH-Gruppe von Donoren
      • 1.3.1 mit NAD oder NADP als Acceptoren
      • 1.3.2 mit Cytochrom als Acceptor
      • 1.3.3 mit O2 als Acceptor
      • 1.3.99 mit anderen Acceptoren
    • 1.4 Wirkung auf die CH-NH2-Gruppe von Donoren
      • 1.4.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
      • 1.4.3 mit O2 als Acceptor
    • 1.5 Wirkung auf die C-NH-Gruppen von Donoren
      • 1.5.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
      • 1.5.2 mit O2 als Acceptor
    • 1.6 Wirkung auf reduziertes NAD oder NADP als Donor
      • 1.6.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
      • 1.6.2 mit einem Cytochrom als Acceptor
      • 1.6.4 mit einem Disulfid als Acceptor
      • 1.6.5 mit einem Chinon oder einer verwandten Verbindung als Acceptor
      • 1.6.6 mit einer stickstoffhaltigen Gruppe als Acceptor
      • 1.6.99 mit anderen Acceptoren
    • 1.7 Wirkung auf andere stickstoffhaltige Verbindunals Donoren
      • 1.7.3 mit O2 als Acceptor
      • 1.7.99 mit anderen Acceptoren
    • 1.8 Wirkung auf Schwefelgruppen von Donoren
      • 1.8.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
      • 1.8.3 mit O2 als Acceptor
      • 1.8.4 mit einem Disulfid als Acceptor
      • 1.8.5 mit einem Chinon oder einer verwandten Verbindung als Acceptor
      • 1.8.6 mit einer stickstoffhaltigen Gruppe als Acceptor
    • 1.9 Wirkung auf Hämgruppen von Donoren
      • 1.9.3 mit O2 als Acceptor
      • 1.9.6 mit einer stickstoffhaltigen Gruppe als Acceptor
    • 1.10 Wirkung auf Diphenole und verwandte Substanzen als Donoren
      • 1.10.3 mit O2 als Acceptor
    • 1.11 Wirkung auf H2O2 als Acceptor
    • 1.12 Wirkung auf Wasserstoff als Donor
    • 1.13 Wirkung auf einzelne Donoren mit Einbau von Sauerstoff (Oxygenasen)
    • 1.14 Wirkung auf gepaarte Donoren mit Einbau von Sauerstoff in einen Donor (Hydroxylasen)
      • 1.14.1 mit reduzierter NAD oder NADP als einem Donor
      • 1.14.2 mit Ascorbat als einem Donor
      • 1.14.3 mit reduziertem Pteridin als einem Donor
  • 2. Transferasen
    • 2.1 Übertragung von Gruppen mit einem Kohlenstoffatom
      • 2.1.1 Methyltransferasen
      • 2.1.2 Hydroxymethyl-, Formyl- und verwandte Transferasen
      • 2.1.3 Carboxyl- und Carbamoyltransferasen
      • 2.1.4 Amidinotransferasen
    • 2.2 Übertragung von Aldehyd- oder Ketongruppen
    • 2.3 Acyltransferasen
      • 2.3.1 Acyltransferasen
      • 2.3.2 Aminoacyltransferasen
    • 2.4 Glykosyltransferasen
      • 2.4.1 Hexosyltransferasen
      • 2.4.2 Pentosyltransferasen
    • 2.5 Übertragung von Alkylresten oder verwandten Gruppen
    • 2.6 Übertragung von stickstoffhaltigen Gruppen
      • 2.6.1 Aminotransferasen
      • 2.6.2 Oximinotransferasen
    • 2.7 Übertragung von phosphorhaltigen Gruppen
      • 2.7.1 Phosphotransferasen mit einer Alkoholgruppe als Acceptor
      • 2.7.2 Phosphotransferasen mit einer Carboxylgruppe als Acceptor
      • 2.7.3 Phosphotransferasen mit einer stickstoffhaltigen Gruppe als Acceptor
      • 2.7.4 Phosphotransferasen mit einer Phosphogruppe als Acceptor
      • 2.7.5 Phosphotransferasen, anscheinend Intramolekular
      • 2.7.6 Pyrophosphotransferasen
      • 2.7.7 Nucleotidyltransferasen
      • 2.7.8 Transferasen für andere substituierte Phosphogruppen
    • 2.8 Übertragung von schwefelhaltigen Gruppen
      • 2.8.1 Schwefeltransferasen
      • 2.8.2 Sulfotransferasen
      • 2.8.3 CoA-Transferasen
  • 3. Hydrolasen
    • 3.1 Wirkung auf Esterbindungen
      • 3.1.1 Carbonsäureesterhydrolasen
      • 3.1.2 Thiolesterhydrolasen
      • 3.1.3 Phosphorsäureestermonohydrolasen
      • 3.1.4 Phosphorsäurediesterhydrolasen
      • 3.1.5 Triphosphorsäuremonoesterhydrolasen
      • 3.1.6 Schwefelsäureesterhydrolasen
    • 3.2 Wirkung auf Glykosylverbindungen
      • 3.2.1 Glykosidhydrolasen
      • 3.2.2 Hydrolyse von N-Glykosylverbindungen
      • 3.2.3 Hydrolyse von S-Glykosylverbindungen
    • 3.3 Wirkung auf Ätherbindungen
      • 3.3.1 Thioätherhydrolasen
    • 3.4 Wirkung auf Peptidbindungen (Peptidhydrolasen)
      • 3.4.1 α-Aminoacylpeptidhydrolasen
      • 3.4.2 Peptidylaminosäurehydrolasen
      • 3.4.3 Dipeptidhydrolasen
      • 3.4.4 Peptidyl-Peptidhydrolasen
    • 3.5 Wirkung auf C-N-Bindungen anderer Art als Peptidbindungen
      • 3.5.1 bei linearen Amiden
      • 3.5.2 bei cyclischen Amiden
      • 3.5.3 bei linearen Amidinen
      • 3.5.4 bei cyclischen Amidinen
      • 3.5.5 bei Cyaniden
      • 3.5.99 bei anderen Verbindungen
    • 3.6 Wirkung auf Säureanhydridbindungen
      • 3.6.1 bei phosphorylhaltigen Anhydriden
    • 3.7 Wirkung auf C-C-Bindungen
      • 3.7.1 bei Ketonen
    • 3.8 Wirkung auf Halogenbindungen
      • 3.8.1 bei C-Halogen-Verbindungen
      • 3.8.2 bei P-Halogen-Verbindungen
    • 3.9 Wirkung auf P-N-Bindungen
  • 4. Lyasen
    • 4.1 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen
      • 4.1.1 Carboxy-Lyasen
      • 4.1.2 Aldehyd-Lyasen
      • 4.1.3 Ketosäure-Lyasen
    • 4.2 Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen
      • 4.2.1 Hydro-Lyasen
      • 4.2.99 andere Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen
    • 4.3 Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen
      • 4.3.1 Ammoniak-Lyasen
      • 4.3.2 Amidin-Lyasen
    • 4.4 Kohlenstoff-Schwefel-Lyasen
    • 4.5 Kohlenstoff-Halogen-Lyasen
    • 4.99 Andere Lyasen
  • 5. Isomerasen
    • 5.1 Racemasen und Epimerasen
      • 5.1.1 Wirkung auf Aminosäuren und Derivate
      • 5.1.2 Wirkung auf Hydroxysäuren und Derivate
      • 5.1.3 Wirkung auf Kohlenhydrate und Derivate
      • 5.1.99 Wirkung auf andere Verbindungen
    • 5.2 Cis-trans-Isomerasen
    • 5.3 intramolekulare Oxidoreduktasen
      • 5.3.1 Umwandlung von Aldosen und Ketosen
      • 5.3.2 Umwandlung von Keto- und Enolgruppen
      • 5.3.3 Transposition von C=C-Bindungen
    • 5.4 Intramolekulare Transferasen
      • 5.4.1 Übertragung von Acylgruppen
      • 5.4.2 Übertragung von Phosphorylgruppen
      • 5.4.99 Übertragung anderer Gruppen
    • 5.5 Intramolekulare Lyasen
    • 5.99 Andere Isomerasen
  • 6. Ligasen oder Synthetasen
    • 6.1 Bildung von C-O-Bindungen
      • 6.1.1 Aminosäure-RNA-Ligasen
    • 6.2 Bildung von C-S-Bindungen
      • 6.2.1 Säure-Thiol-Ligasen
    • 6.3 Bildung von C-N-Bindungen
      • 6.3.1 Säure-Ammoniak-Ligasen (Amid-Synthetasen)
      • 6.3.2 Säure-Aminosäure-Ligasen (Peptid-Synthetasen)
      • 6.3.3 Cylo-Ligasen
      • 6.3.4 Andere C-N-Ligasen
      • 6.3.5 C-N-Ligasen mit Glutamin als N-Donor
    • 6.4 Bildung von C-C-Bindungen.


Von besonderem Interesse sind die Enzyme der Klasse 1. Von Interesse in bestimmten Fällen sind auch die Oxidoreduktasen und die Hydrolasen der Klasse 3, jedoch auch Enzyme der Klasse 2, Transferasen, Lyasen der Klasse 4 und Isomerasen der Klasse 5.

In Tabelle II sind spezielle Unterklassen von Enzymen und spezielle Enzyme innerhalb der interessierenden Unterklasse angegeben. Von besonderem Interesse bei den Oxidoreduktasen sind NAD oder NADP, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid. Von den Hydrolasen sind diejenigen von Interesse, die Phosphat- und Glykosidbindungen spalten.

Tabelle II
  • 1. Oxidoreduktase
    • 1.1 Wirkung auf die CH-OH-Gruppen von Donoren
      • 1.1.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
        • 1. Alkoholdehydrogenase

          6. Glycerindehydrogenase

          27. Lactatdehydrogenase

          37. Malatdehydrogenase

          49. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
      • 1.1.3 mit O2 als Acceptor
        • 4. Glucose-Oxidase

          Galactose-Oxidase
    • 1.2 Wirkung auf die Aldehyd- oder Ketogruppe von Donoren
      • 1.2.1 mit NAD oder NADP als Acceptor
        • 12. Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
      • 1.2.3 mit O2 als Acceptor
        • 2. Xanthin-Oxidase

          Luciferase
    • 1.4 Wirkung auf die CH-NH2-Gruppe von Donoren
      • 1.4.3 mit O2 als Acceptor
        • 2. L-Aminosäure-Oxidase

          3. D-Aminosäure-Oxidase
    • 1.6 Wirkung auf reduziertes NAD oder NADP als Donor
      • 1.6.99 mit anderen Acceptoren
        • Diaphorase
    • 1.7 Wirkung auf andere stickstoffhaltige Verbindungen als Donoren
      • 1.7.3 mit O2 als Acceptor
        • 3. Uricase
    • 1.11 Wirkung auf H2O2 als Acceptor
      • 1.11.1
        • 6. Catalase

          7. Peroxidase
  • 2. Transferasen
    • 2.7 Übertragung von phosphorhaltigen Gruppen
      • 2.7.1 Phosphotransferasen mit CH-OH als Acceptor
        • 1. Hexokinase

          2. Glucokinase

          15. Ribokinase

          28. Triokinase

          40. Pyruvat-Kinase
      • 2.7.5 1. Phosphoglucomutase
  • 3. Hydrolasen
    • 3.1 Wirkung auf Esterbindungen
      • 3.1.1 Carbonsäureester-Hydrolasen
        • 7. Cholinesterase

          8. Pseudocholinesterase
      • 3.1.3 Phosphorsäuremonoester-Hydrolasen
        • 1. alkalische Phosphatase

          2. saure Phosphatase

          9. Glucose-6-phosphatase

          11. Fructose-Diphosphatase
      • 3.1.4 Phosphorsäurediester-Hydrolasen
        • 1. Phosphodiesterase

          3. Phospholipase C
    • 3.2 Wirkung auf Glykosylverbindungen
      • 3.2.1 Glykosid-Hydrolasen
        • 1. α-Amylase

          2. β-Amylase

          4. Cellulase

          17. Muramidase

          18. Neuraminidase

          21. β-Glucosidase

          23. β-Galactosidase

          31. β-Glucuronidase

          35. Hyaluronidase
      • 3.2.2 Hydrolyse von N-Glycosylverbindungen
        • 5. DPNase
  • 4. Lyasen
    • 4.1 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen
      • 4.1.2 Aldehyd-Lyasen
        • 13. Aldolyase
      • 4.2.1 Hydro-Lyasen
        • 1. Carboanhydrase
  • 5. Isomerase
    • 5.4 Intramolekulare Transferasen
      • 5.4.2 Übertragung von Phosphorylgruppen
        • Triosephosphat-Isomerase


Anstelle von Enzymmarkern können auch chromogene Substanzen als Marker verwendet werden, insbesondere Verbindungen, die im ultravioletten oder sichtbaren Bereich Licht absorbieren, fluoreszieren oder chemilumineszieren, insbesondere fluoreszieren. Die chromogene Verbindung muß ein Signal geben, das durch die Gegenwart des geladenen Mitglieds beeinflußt wird. Dies erfolgt normalerweise durch Verstärkung oder Verminderung einer geladenen Art, wenn die geladene Art eine verstärkte oder verminderte Signalfähigkeit hat. Wenn beispielsweise die negativ geladene Form einer fluoreszierenden Substanz für die Fluoreszenz erforderlich ist, ist es erwünscht, ein positiv geladenes Mitglied in Nachbarschaft zur fluoreszierenden Substanz zu haben, um die negativ geladene Form zu stabilisieren. Durch Abpufferung des Systems, so daß die ungeladene Form der fluoreszierenden Substanz begünstigt ist, wird die Konzentration der ionisierten Form der fluoreszierenden Substanz durch die erhöhte Nachbarschaft der fluoreszierenden Substanz zum positiv geladenen Mitglied verstärkt. Bei Verwendung von chromogenen Substanzen, die ein Proton in wäßrigen Medien bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 11 abgeben oder empfangen und wobei die chromophoren Eigenschaften der protonisierten Form verschieden sind von der nichtprotonisierten Form, kann die Gegenwart des geladenen Mitglieds zur Beeinflussung des beobachteten Signals verwendet werden.

Die fluoreszierenden Verbindungen von Interesse gehören in die verschiedensten Kategorien, die bestimmte primäre funktionelle Gruppen enthalten. Die aminosubstituierten fluoreszierenden Substanzen sind 1- und 2-Aminonaphthalin, p,p&min;-Diaminostilbene, 9-Aminoacridin, p,p&min;-Diaminobenzophenonimine, Bis-3-aminopyridiniumsalze und Indole. Zu den sauren, normalerweise phenolischen fluoreszierenden Substanzen gehören 7-Hydroxycumarin, 2,7-Dihydroxyxanthene, Sterophenol, Tetracycline und Salicylate.

Eine alternative Lichtquelle als feststellbares Signal ist eine chemilumineszierende Quelle. Die chemilumineszierende Quelle umfaßt eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und dann Licht emittieren kann, das als erkennbares Signal dient oder das Energie an einen Energieacceptor abgibt, der seinerseits fluoreszieren kann.

Zahlreiche Familien von Verbindungen ergeben Chemilumineszens unter den verschiedensten Bedingungen. Eine Familie von Verbindungen sind 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione, von denen Luminol am bekanntesten ist. Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind die 2,4,5-Triphenylimidazole.

Diese Verbindungen können allein verwendet werden, beeinflußt durch das geladene Mitglied, oder sie können in modifizierter Form als Enzymsubstrate verwendet werden, wenn das Enzym durch das geladene Mitglied beeinflußt wird, so daß der Umsatzanteil für die Transformation des chromophoren Substrats beeinflußt wird. Ein breiteres Spektrum von Chromophoren kann dann verwendet werden, je nach der Natur des Enzyms und der jeweils erforderlichen Verbindungsgruppe zur Modifikation durch das Enzym.

Beispielsweise können Hydrolasen mit Estern von Phenolen verwendet werden, die Chromogene enthalten, wenn die chromogenen Eigenschaften des Esters sich unterscheiden von den chromogenen Eigenschaften des Phenols. Die Geschwindigkeit der Bildung des hydrolysierten Chromogens kann durch die Nähe des geladenen Mitglieds beeinflußt werden. Beispiele für Verbindungen sind Fluoresceindiphosphat und Umbelliferylphosphat.

Signalmarkiertes Mitglied

Der Signalmarker kann entweder mit dem Liganden oder dem Receptor konjugiert werden. Wenn der Ligand ein Hapten oder ein kleines Molekül ist, wird normalerweise das Hapten mit einem Enzymmarker konjugiert, so daß das geladene Mitglied die Aktivität des Enzyms nach Bindung an das Hapten verstärken oder vermindern kann. Wenn der Ligand ein Hapten ist und der Signalmarker eine andere Substanz als ein Enzym ist, kann zwar ein einzelner Haptenligand an eine fluoreszierende Substanz oder eine chemilumineszierende Substanz gebunden sein, doch stellt man gewöhnlich einen Poly-(Ligand-Analog)- Marker her, um eine Mehrzahl von Bindungsstellen zu haben, die mindestens ein geladenes Mitglied in die Nachbarschaft mit diesen Markern bringen kann.

Für Antigene, die normalerweise polyepitop sind, ist die Situation, bei der der Signalmarker ein großes Molekül, wie ein Enzym ist, verschieden von dem Fall, wenn der Signalmarker ein kleines Molekül, z. B. eine fluoreszierende Substanz ist. Wenn der Signalmarker ein großes Molekül wie ein Enzym ist, und man es mit einem verhältnismäßig unreinen Gemisch zu tun hat, das entweder den Ligand oder den Receptor enthält, sorgt man normalerweise für eine Mehrzahl von Substituenten an dem Signalmarker, um einigermaßen sicherzustellen, daß der größte Teil des Signalmarkers an den interessierenden Liganden oder Receptor gebunden ist. Vorzugsweise ist mindestens die Hälfte, gewöhnlich mindestens drei Viertel und insbesondere etwa mindestens ein Mitglied des speziell bindenden Paares an den Signalmarker im Durchschnitt gebunden. Der Signalmarker kann polysubstituiert sein, doch ist er im allgemeinen mindestens durch ein Mitglied des spezifisch bindenden Paares monosubstituiert.

Diese Polysubstitution mit unreinen Gemischen aus einem Mitglied des spezifisch bindenden Paares dient dazu, Hintergrundseffekte auf ein Mindestmaß zu beschränken. Bei Verwendung eines unreinen Gemisches von beispielsweise einem Receptor, der an ein Enzym konjugiert wird, und wenn die Moleküle in dem unreinen Gemisch zu den Enzymmolekülen in einem Molverhältnis von 1 : 1 vorliegen würden, würde ein erheblicher Anteil des Enzyms nur an Verunreinigungen gebunden, und wenn es aktiv wäre, würde es einen erheblichen Hintergrund liefern. Um sicherzustellen, daß praktisch der gesamte Signalmarker in der Lage ist, sich an das homologe Paarmitglied zu binden, werden unreine Gemische eines Mitglieds des spezifisch bindenden Paares in derartiger Weise substituiert, daß praktisch sichergestellt ist, daß mindestens ein Mitglied des spezifisch bindenden Paares an das Enzym gebunden ist.

Wenn der Signalmarker klein ist, liegt eine andere Situation vor. In diesem Fall kann eine Mehrzahl der Mitglieder des spezifisch bindenden Paares nicht an einen Signalmarker gebunden werden. Wenn der Ligand oder der Receptor unrein ist, ist eine erhebliche Menge des Markers nur an Verunreinigungen gebunden. In diesem Fall ist es normalerweise erwünscht, daß unter den Versuchsbedingungen der an die Verunreinigungen gebundene Signalmarker ein Minimumsignal oder kein Signal ergibt oder daß eine Methode zur Verfügung gestellt wird, bei der der an die Verunreinigungen gebundene Signalmarker daran gehindert wird, ein Signal zu liefern.

Das Mengenverhältnis von Signalmarker zum Mitglied des spezifisch bindenden Paares kann erheblich schwanken, je nach dem Signalmarker, dem Mitglied des spezifisch bindenden Paares, der erforderlichen Empfindlichkeit des Tests, der Fähigkeit zur Unterdrückung von Hintergrund und der Wirkung des Signalmarkers auf die Eigenschaften des Mitglieds des spezifisch bindenden Paares.

Zur weiteren Verstärkung des Signalunterschieds zwischen dem Signalwert, wenn der Signalmarker in Nachbarschaft zum geladenen Mitglied steht, im Vergleich dazu, wenn sie weiter entfernt sind, kann das signalmarkierte Mitglied modifiziert werden, um Ladungen einzuführen, die entgegengesetzt sind den Ladungen des geladenen Mitglieds. Durchschnittlich liegen mindestens etwa 0,5 Ladungen pro Signalmarker, vorzugsweise mindestens etwa 1 und gewöhnlich nicht mehr als etwa 50, insbesondere nicht mehr als etwa 10 Ladungen pro Signalmarker vor. Das signalmarkierte Mitglied kann in gleicher Weise und mit der gleichen Art von ionisierbaren Substituenten modifiziert sein, wie das geladene Mitglied. Eine gewisse Verminderung des maximalen Signals kann durch die Gegenwart von Ladungen an dem signalmarkierten Mitglied herrühren. Es wurde festgestellt, daß eine größere Trennung zwischen den von dem Signalmarker in Gegenwart und Abwesenheit des geladenen Mitglieds beobachteten Signalen erfolgt.

Geladenes Mitglied

Das geladene Mitglied ist entweder ein Ligand oder ein Receptor, gewöhnlich ein Receptor und im allgemeinen eine proteinartige Substanz. Im Falle eines Receptors liegt das Molekulargewicht im Bereich von etwa 5000 bis 2 000 000 oder höher. Gewöhnlich handelt es sich um einen Antikörper mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 bis 800 000.

Die Zahl der funktionellen Gruppen, die eingeführt werden, und die eine elektrische Ladung liefern, entweder indem sie permanent geladen sind oder fähig sind, ein Proton aufzunehmen oder an das Lösungsmittelmedium abzugeben, ist im allgemeinen mindestens etwa 1 pro Molekulargewicht 20 000 und nicht mehr als etwa 1 pro Molekulargewicht 500, gewöhnlich etwa 1 bei einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000. Das heißt, das Äquivalentgewicht pro Ladung beträgt mindestens etwa 500, gewöhnlich 1000 bis 10 000 und nicht weniger als etwa 20 000.

Es können verschiedene funktionelle Gruppen verwendet werden, die in der Lage sind, im Testmedium eine stabile Ladung zu ergeben. Typische Beispiele für diese Gruppen sind basische Stickstoffatome enthaltende Gruppen, wie Amine, quartäre Ammoniumsalze, Phosphoniumsalze, Tetrazoliumsalze, Oniumsalze, Hydrazinsalze und Metallchelate. Negativ geladene funktionelle Gruppen sind Carboxylgruppen, Schwefelsäuregruppen, wie Sulfonate und Sulfate, Phosphorsäuren, wie Phosphonate und Phosphate, Oxide, wie Phenole, und Mercaptide.

Von besonderem Interesse sind ionisierbare Oxygruppen, d. h. funktionelle Gruppen mit einer ionisierbaren Hydroxylgruppe, wie bei den vorgenannten Oxysäuren.

Die funktionellen Gruppen sind durch beliebige zweckmäßige Verbindungsgruppen, im allgemeinen von etwa 1 bis 10 Kohlenstoffatomen mit entsprechender Funktionalität zur Ausbildung einer kovalenten Bindung, an das Mitglied des spezifisch bindenden Paares gebunden. Natürlich soll eine Gruppe nicht zerstört werden, die eine Ladung liefert, um eine andere Gruppe einzuführen, die die gleiche Ladung liefert, beispielsweise durch Substitution einer Aminogruppe durch eine Aminosäure unter Bildung des Aminoamids. Man kann jedoch ein Polyamin verwenden, um eine einzige Amingruppe zu substituieren, wie in dem Fall, wenn man das Maleinimid einer Aminogruppe herstellt und ein Polyaminomercaptan konjugiert, wobei eine einzelne Aminogruppe zu einer Mehrzahl von Aminogruppen führt. Die spezielle Art der Verbindung, die Wahl der Verbindungsgruppen und der funktionellen Gruppen und die jeweils verwendete funktionelle Gruppe zur Ausbildung einer Ladung ist für die Zwecke der Erfindung nicht kritisch. Es können die verschiedensten geladenen Mitglieder verwendet werden.

Speziell brauchbare anionisch geladene Mittel sind Antikörper, die durch zweibasische oder mehrbasische Säuren, insbesondere zweibasische Säuren mit etwa 4 bis 10 Kohlenstoffatomen substituiert sind. Die zweibasischen Säuren können aliphatischer, alicyclischer oder aromatischer Art sein. Typische Beispiele für zweibasische Säuren sind Bernsteinsäure, Glutarsäure, Maleinsäure, Phthalsäure und Hexahydrophthalsäure. Diese bilden bei der Umsetzung mit einem Antikörper die entsprechenden Säuren (amic acids).

Signalinhibitoren

Zur Beschränkung von Hintergrund auf ein Mindestmaß kann es erwünscht sein, dem System einen Signalinhibitor zuzusetzen, wobei der Inhibitor daran gehindert ist, mit dem Signalmarker in Wechselwirkung zu treten, wenn ein Immunkomplex durch Bindung der Mitglieder des spezifisch bindenden Paares erfolgt, der jedoch mit dem Signalmarker in Wechselwirkung tritt, welcher nicht in dem Immunkomplex vorliegt. Gewöhnlich sind diese Inhibitoren Makromoleküle, die infolge sterischer Hinderung sich dem Signalmarker nicht nähern können, wenn der Marker bei der Bindung von mindestens zwei Mitgliedern des spezifisch bindenden Paares mitwirkt. Typische Beispiele für Makromoleküle sind Antimarker, wie Antienzyme und Antifluorescer, wobei die Umsatzrate des Enzyms bzw. die Wirksamkeit der fluoreszierenden Substanz erheblich vermindert sind. Außerdem können chemische Enzyminhibitoren an Makromoleküle zur Hemmung des Enzyms gebunden werden, oder Antifluoreszer können durch Bindung von Unterdrückern an den Antifluoreszer, z. B. als Energieacceptoren oder schwere Atome modifiziert werden. Die Menge des zugesetzten Inhibitors soll ausreichen, um das von dem Hintergrund gebildete Signal erheblich zu vermindern.

Zusätzliche Komponenten

Je nach der Art des Signalmarkers können noch weitere Reagenzien zugegeben werden, beispielsweise Enzymsubstrate, Cofaktoren, Salze, Tenside, Stabilisatoren und Puffer. Zur Verstärkung der Ladungswechselwirkungen wird das Substrat an ein Makromolekül gebunden, um eine Mehrzahl von Ladungen zur Verfügung zu stellen, wobei es durch die Ladungen des geladenen Mitgliedes angezogen oder abgestoßen wird. Es können daher verschiedene Substrate verwendet werden, wobei der Verknüpfungskern eine Mehrzahl von Ladungen zur Verfügung stellt und das Substrat selbst geladen oder ungeladen ist.

Durch geeignete Wahl eines Verknüpfungskernes kann dieser die gewünschte Ladungsdichte zur Wechselwirkung mit dem geladenen Mitglied zur Verfügung stellen. Das Ionenäquivalentgewicht kann einen Wert von nur 100 haben; gewöhnlich ist der Wert nicht größer als 2000, insbesondere nicht größer als 10 000.

Beispiele für Monomere, die zur Herstellung von Polymeren verwendet werden können und welche Ionen im Testmedium zur Verfügung stellen, wobei diese Monomeren allein oder zusammen mit neutralen Monomeren verwendet werden können, sind Aziridin, N-(2&min;-Aminoäthyl)-acrylamid, Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäureanhydrid, Vinylsulfonat, Vinylphosphonat und Aminomethylstyrol. Gewöhnlich beträgt der Anteil des ionischen Monomers etwa 1 bis 50 Molprozent, insbesondere 1 bis 25 Molprozent des Copolymerisats.

Gemäß einer anderen Ausführungsform können ionische Kondensationspolymerisate verwendet werden, wie Carboxymethylcellulose, Polylysin, Polypeptide mit einer Mehrzahl von basischen Aminosäuren, wie Lysin, Arginin oder Histidin, oder sauren Aminosäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure.

Sofern der Verknüpfungskern neutral ist, können zusammen mit einem neutralen Substrat geladene Gruppen angebracht oder ein geladener Abstandsarm verwendet werden. Verschiedene Abstandsarme können verwendet werden, welche eine ionische Ladung liefern, z. B. Polyamine, insbesondere mit tertiären Aminogruppen in der Kette, wie Bis-2-aminoäthylmethylamin und Bis-N,N&min;-2-aminoäthylpiperazin, oder mehrwertige Carbonsäuren, wie 1,3,5-Pentantricarbonsäure oder 3,6-Dithia-1,2,7,8-octantetracarbonsäure.

Testkombinationen

Zur Erhöhung der Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Reagenzien in Kombination in einem gleichen Gefäß oder in getrennten Gefäßen zur Verfügung gestellt werden, so daß das Mengenverhältnis der Reagenzien eine signifikante Optimierung der Signalantwort auf Veränderungen in der Analytkonzentration erreicht wird. Beispiele für diese Reagenzien sind Hilfsstoffe, wie Puffer, Stabilisatoren und Tenside.

Verbindungen

Neue Verbindungen werden zur Verfügung gestellt, die die Körper darstellen, an welche eine Mehrzahl von funktionellen Gruppen gebunden ist, die unter den Testbedingungen Ladungen liefern, nämlich bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 11, vorzugsweise etwa 5 bis 10 und insbesondere etwa 6,5 bis 9,5. In der Regel haben diese Verbindungen folgende allgemeine Formel

Receptor - (RX)n

in der der Receptor ein spezieller Receptor für ein anderes Molekül ist. Gewöhnlich handelt es sich um eine proteinartige Substanz, beispielsweise einen Antikörper. R bedeutet eine Bindung oder eine Verbindungsgruppe, die normalerweise etwa 1 bis 10, insbesondere etwa 1 bis 6 Kohlenstoffatome und die 0 bis 6, vorzugsweise 0 bis 4 Heteroatome enthält. Bei diesen Heteroatomen handelt es sich um Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome. Die Sauerstoffatome liegen in Form von Oxy- oder Oxogruppen, die Stickstoffatome in Form von Amino- oder Amidogruppen und die Schwefelatome in Form von Thio- oder Thionogruppen enthalten, vor. X bedeutet eine funktionelle Gruppe, die eine Ladung bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 11, vorzugsweise 5 bis 10 und insbesondere 6,5 bis 9,5 trägt. Es kann sich um eine Amino- oder Oxysäure oder eine Carboxyl-, Sulfonat-, Sulfat-, Phosphonat-, Phosphat- oder Phenoxygruppe handeln. n hat einen Wert von mindestens 1. Normalerweise liegt der Wert im Bereich des Molekulargewichts des Receptors dividiert durch 20 000 bis zum Molekulargewicht des Receptors dividiert durch 500 und insbesondere im Bereich des Molekulargewichts des Receptors dividiert durch 10 000 bis zum Molekulargewicht des Receptors dividiert durch 1000.

Vorzugsweise ist der Receptor ein Antikörper, IgG, Reine 1-Oxoalkylengruppe, wobei die Oxogruppe eine Amidgruppe bildet; die Alkylengruppe enthält 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatome. X bedeutet eine Carboxylgruppe.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Versuchsteil

Sämtliche Temperaturangaben sind in Celsius angegeben. Teile und Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist. Bei Gemischen von Flüssigkeiten handelt es sich um Volumenteile. Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

PBS, N3, Mg: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung O,10 mM PO4, pH 7,0, 0,128 M NaCl, 5 mM Natriumazid, 1 mM Mg als Acetat;

DMF: N,N-Dimethylformamid;

NHS: N-Hydroxysuccinimid;

RSA: Kaninchenserumalbumin (1 mg/ml);

DEAE: Diäthylaminoäthyl;

RT: Raumtemperatur;

EDCI: Äthyl-dimethylaminopropylcarbodiimid;

ONPG: o-Nitrophenylgalactosid.

Beispiel 1 Konjugation von β-Galactosidase an Schaf-Anti (human IgG) (Schaf-AntiHIgG)
  • A) Die β-Galactosidase wird folgendermaßen hergestellt: Ein 10 ml Aliquot von β-Galactosidase (Boehringer 150797, 8,5 mg/ml) wird 10 Minuten zentrifugiert. Die erhaltene Fällung wird in 3 ml PBS, N3, Mg gelöst. Sodann wird das Gemisch mit 0,3 ml einer 100 millimolaren Lösung von Dithioerythrit versetzt und das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird an einer 2,6×75 cm Biogel A5M (200-400 mesh) Säule chromatographiert, die mit PBS, N3, Mg äquilibriert worden ist. Das Gesamtvolumen beträgt 390 ml. Die Lösung wird in einer Geschwindigkeit von 12 ml/Stunde eluiert. Es werden 80 Tropfen-Fraktionen (5 ml) aufgefangen. Die Röhrchen 39 bis 44 werden vereinigt zu einem Volumen von 28,9 ml. Die Lösung hat eine Konzentration von 1,47 mg/ml. Danach wird das Enzym bestimmt. Es hat eine Aktivität von 477 U/mg Protein.
  • B) Schaf-AntiHIgG-Serum wird mit einem gleichen Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgefällt. Die erhaltene Fällung wird in einem Endvolumen nach Dialyse von 154 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,5 gelöst. Die IgG-Fraktion wird weiter gereinigt durch Chromatographie an einer 5×60 cm-Säule (1178 ml) von DEAE-Sephadex A50, das mit dem gleichen Phosphatpuffer äquilibriert worden ist. Aufgrund der elektrophoretischen Muster und der Proteinausbeute wurde festgestellt, daß nicht das gesamte IgG eluiert worden ist. Deshalb wird die Säule mit Puffer weiter eluiert, dem 0,15 M NaCl zugesetzt worden sind. Die Eluierungsgeschwindigkeit beträgt etwa 150 ml/Stunde. Es werden 25 ml Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 133 bis 142 werden vereinigt und ergeben ein Volumen von 250 ml. Bezogen auf die Absorption bei 280 nm beträgt die Konzentration 9,96 mg/ml. Das Protein wird auf den gewünschten Antikörper untersucht. Er liegt in einer Konzentration von 1,78 mg/ml vor. Die spezifische Aktivität des Antikörpers, bezogen auf Gesamtprotein, beträgt etwa 18%. Das Protein wird durch ein gleiches Volumen Ammoniumsulfat ausgefällt und in PBS, N3, Mg gelöst. Es wird eine Lösung mit 35 mg/ml Protein erhalten.
  • C) 1,8 ml einer 35,3 mg/ml Lösung des AntiHIgG werden mit 60 µl (10 mg/ml DMF) m-Maleinimidobenzoesäure-NHS-ester versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden 0,18 ml einer 1 molaren Natriumacetatlösung vom pH-Wert 5 zugegeben. Das Gemisch wird danach 1 Stunde bei Raumtemperatur gegen zweimal 500 ml (entgaste) 20 mM Natriumacetatlösung vom pH-Wert 5 mit 0,15 M NaCl dialysiert. Eine Lösung von 5 ml β-Galactosidase (1,47 mg/ml) wird mit 0,2 ml 0,5 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 und danach mit 2 ml des vorstehend beschriebenen Reaktionsproduktes bei einer Konzentration von 31,1 mg/ml versetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 ml einer 10 mM Cystein-HCl- Lösung abgebrochen und 30 Minuten inkubiert. Es wird ein Endvolumen von 7,4 ml erhalten. Das Produkt wird an einer Biogel A5M-Säule (2,6×75 cm, 398 ml) chromatographiert, die mit PBS, N3, Mg äquilibriert worden ist. Eluiert wird mit dem gleichen Lösungsmittel in einer Geschwindigkeit von 12 ml/Stunde. Es werden 5 ml Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 24 bis 33 werden vereinigt und ergeben ein Volumen von 50 ml. Die optische Dichte bei 280 nm beträgt 0,540. Das Molverhältnis von Antikörper zu Enzym beträgt etwa 5 : 1. Die Konzentration der β-Galactosidase beträgt 121 µg/ml, die Konzentration des Schaf-IgG beträgt 213 µg/ml. Zur Bestimmung des Enzyms wird eine 10 µl-Fraktion verwendet, die in 0,5 ml PBS, N3, Mg, RSA zusammen mit 0,1 ml 20 mM ONPG in 0,4 ml Pufferlösung gelöst worden ist. Es wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei 37°C und bei 420 nm für den Zeitraum zwischen 10 bis 20 Sekunden nach Zugabe des Substrats bestimmt.
  • D) Das vorstehend beschriebene Verfahren wird folgendermaßen wiederholt: 1,8 µl Schafantiserum gegen HIgG (35,3 mg Protein/ml) werden mit 60 µl einer 32 mM Lösung von m-Maleinimidobenzoesäure-NHS-ester versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei RT gerührt. Nach Zugabe von 0,18 µl einer 1,0 M NaOAc Lösung vom pH-Wert 5,0 wird die Lösung gegen zweimal 500 µl (entgaste) 20 mM NaOAc-Lösung vom pH-Wert 5,0 mit 0,15 M NaCl innerhalb 1 Stunde bei RT dialysiert. 5 ml der β-Galactosidaselösung (1,47 mg/ml) werden mit 0,2 µl einer 0,5 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 und anschließend mit 3 µl der vorstehend beschriebenen Lösung (31,1 µg/ml) versetzt und das Gemisch wird 4 Stunden bei RT inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 0,2 µl einer 10 mM Cystein-HCl-Lösung abgebrochen und anschließend wird 30 Minuten inkubiert. Das Produkt wird an Biogel A5M (2,6×75 cm) chromatographiert, das mit PBS, N3, Mg äquilibriert worden ist. Eluiert wird mit dem gleichen Lösungsmittel in einer Geschwindigkeit von 12 ml/Stunde. Es werden 5 µl Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 24 bis 33 werden vereinigt. Die Aktivität des Konjugats im Vergleich zur Aktivität des Enzyms mit o-Nitrophenylgalactosid (ONPG) als Substrat beträgt 96%, während die Vergleichsaktivität mit ONPG, gebunden an DX 2000 (Dextran 2M Molekulargewicht), 38,6% beträgt. Die Tests werden bei 37°C durchgeführt. Abgelesen wird bei 420 nm. Es wird eine Testlösung von 10 µl des Konjugats, 0,9 ml PBS, N3, Mg, RSA und 0,1 ml Substrat (20 mM ONPG) verwendet.
Beispiel 2 Umsetzung von Schaf-Anti(human-IgG) mit Bernsteinsäureanhydrid

Nach Dialyse von 5 ml Schaf-Anti(human-IgG) (35,3 mg/ml) gegen dreimal 0,5 Liter einer 0,1 M Na2HPO4-Lösung bei Raumtemperatur und über Nacht werden die erhaltenen 5,3 ml (187,1 mg) mit 4 ml der Na2HPO4-Lösung verdünnt, und es werden 250 µl einer 1 M Lösung von 14C-Bernsteinsäureanhydrid unter Rühren zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 1 M Natronlauge auf einem Wert oberhalb 7,5 gehalten. Das Zugesetzte Gesamtvolumen beträgt 400 µl. Nach 30 Minuten wird 1 ml einer 1 M Hydroxylamin-HCl-Lösung (eingestellt mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 8) zugegeben, und das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor es fünfmal gegen 0,5 Liter PBS, N3 Mg bei Raumtemperatur über Nacht dialysiert wird. Das Endvolumen beträgt 10,7 ml, die Konzentration 17,4 mg/ml.

Beispiel 3 Markierung von Schaf-Anti(HIgG) mit Fluorrescein

Schafantiserum gegen humanes IgG (5 ml, 176,5 mg Schaf IgG) wird dreimal gegen 500 ml eines 0,1 M Na2CO3-Puffers vom pH-Wert 9,0 bei Raumtemperatur über Nacht dialysiert. Der Dialysepuffer (3,75 ml) wird zugegeben. Es wird ein Gesamtvolumen von 8,65 ml erhalten. 2,7 ml der Proteinlösung (54 mg, 0,33 µmol) werden mit 25 µl einer 50 mg/ml Fluorescein-isothiocyanat-DMF-Lösung (9,2 Fluorescein : Protein-Molverhältnis) versetzt. Das Gemisch wird bei RT und unter Lichtausschluß gerührt. Das Produkt wird der Gelfiltration an Sephadex G25M mit PBS vom pH-Wert 6,8, N3, Mg unterworfen. Es werden 7,3 ml markiertes Protein mit einem F : P-Verhältnis von 6,8 erhalten.

Beispiel 4 Dextran 40-ONPG A) 3-Hydroxy-4-nitrobenzoesäuremethylester (II)

1250 ml Methanol werden mit 25 ml Acetylchlorid sowie mit 100,3 g 95prozentig reiner (0,53 Mol) 3-Hydroxy-4-nitrobenzoesäure (I) versetzt. Der Feststoff löst sich innerhalb von 2 Tagen auf. Nach 6 Tagen wird die Lösung filtriert, um ungelöste Verunreinigungen abzutrennen. Durch Eindampfen der Lösung wird der rohe Ester erhalten. Es werden mehrere Kristallausbeuten erhalten. Die letzte aus einem 50 ml Volumen. Die Kristallausbeuten werden vereinigt und aus 150 ml Methanol umkristallisiert. Es werden zwei Kristallausbeuten des Esters (II) in Form von hellbraunen Kristallen vom F. 89 bis 91°C erhalten. Die Ausbeute beträgt 28,7 g (0,50 Mol).

B) 3-(2,3.4.6-Tetraacetyl-β-galactosyloxy)-4-nitrobenzoesäuremethylester (IV)

In 600 ml Acetonitril werden 100,1 g 95prozentig reine (0,23 Mol) Acetobromgalactose (III) sowie 45,5 g (0,23 Mol) 3-Hydroxy-4-nitrobenzoesäuremethylester (II) gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit 30 g (0,26 Äquiv.) Silberoxid versetzt. Die Farbe des schwarzen Feststoffes schlägt allmählich nach grau um. Nach 10 Minuten werden nochmals 20 g (0,17 Äquiv.) Silberoxid zugegeben. Das Gemisch wird weitere 20 Minuten gerührt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch durch ein Celite-Filterbett filtriert, um die Silbersalze abzutrennen. Das Filtrat wird eingedampft. Es werden 115 g einer rohen braunen Kristallmasse erhalten. Diese Masse wird aus 400 ml Äthanol umkristallisiert. Es werden zwei Kristallausbeuten von weißlichen Kristallen vom F. 150 bis 152°C erhalten. Die Ausbeute beträgt 99,6 g (0,19 Mol, 83% d.Th.).

C) 3-β-Galactosyloxy-4-nitrobenzoesäuremethylester (V)

1 Liter Methanol werden mit 119 g (0,226 Mol) des Tetraacetats (IV) versetzt. Das Gemisch wird auf 60°C erhitzt, bis der Feststoff gelöst ist. Danach werden 25 ml Triäthylamin zugegeben, und die Lösung wird weitere 2 Stunden auf 60°C erhitzt. Die Lösung wird eingedampft und das feste Rohprodukt in mehreren Ausbeuten erhalten. Die Endausbeute wird aus einem 20 ml Volumen entnommen. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt.

D) 3-β-Galactosyloxy-4-nitrobenzoesäure (VI)

1500 ml 1 n Natronlauge werden mit dem rohen Ester (V) versetzt, der aus 119 g des Tetraacetats (IV) hergestellt worden ist. Nach 15 Minuten ist der Ester in Lösung gegangen und verseift. Die erhaltene Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure neutralisiert. Es wird eine trübe, orangefarbene Lösung vom pH-Wert 7,5 erhalten. Die Lösung wird durch Filtration geklärt. Das Filtrat wird mit 250 ml 1 N Salzsäure angesäuert. Es wird eine hellgelbe Lösung vom pH-Wert 3 bis 3,5 erhalten. Die Säure (VI) fällt aus und wird abfiltriert. Das Produkt wird mit 20 ml Wasser gewaschen. Es werden 34,7 g seidenglänzende weiße Nadeln erhalten. Die wäßrigen Mutterlaugen werden auf 800 ml eingeengt und auf einen pH-Wert von 2 angesäuert. Es wird eine weitere Menge der rohen Säure erhalten, die aus 150 ml Methanol umkristallisiert wird. Es werden nochmals 7,7 g der Nadeln erhalten. Die Gesamtausbeute an gereinigter Säure (VI) beträgt 42,4 g (123 mM) vom F. 172 bis 174°C.

E) N-Hydroxysuccinimidester der 3-β-Galactosyloxy-4-nitrobenzoesäure (VII)

55,2 g (0,160 Mol) 3-β-Galactosyloxy-4-nitrobenzoesäure, 20 g (0,174 Mol) N-Hydroxysuccinimid und 35 g (0,183 Mol) EDCI werden in 200 ml DMF gelöst. Nach 2 Stunden ist die Umsetzung vollständig. Dies ergibt sich aus dem Dünnschichtchromatogramm (10 bis 20% CH3OH/CHCl3). Es zeigen sich neben der gewünschten Verbindung (VII) geringere Verunreinigungen. Die Lösung wird ohne weitere Behandlung in die nächste Stufe eingesetzt.

F) Carboxymethyliertes Dextran T40

101 g Dextran T40 (Molekulargewicht etwa 40 000) werden in 500 ml einer 1,2 M wäßrigen Lösung des Natriumsalzes der Chloressigsäure gelöst. Sodann werden 500 ml einer 2,5 M Lösung von Natronlauge zugegeben. Das Gemisch wird 3 Stunden auf 80 bis 85°C erhitzt. Danach wird das Reaktionsgemisch abgekühlt und unter Rühren langsam mit 1 Liter Äthanol versetzt. Nach Zugabe von 350 ml erfolgt die Ausfällung des Dextrans. Zur vollständigen Ausfällung werden nochmals 2 Liter Äthanol zugegeben.

Das Dextran scheidet sich zunächst als Schmiere ab. Der Überstand wird dekantiert und das Dextran durch drei weitere Ausfällungen wie folgt gereinigt: Die erhaltene Schmiere wird in 750 ml Wasser gelöst. Sodann werden 3 Liter Äthanol langsam zugegeben, bis die Lösung dauerhaft trüb bleibt. Danach wird der Äthanol rascher zugegeben. Über Nacht läßt man die schmierige Ausfällung des Dextrans absetzen. Das erhaltene Produkt enthält etwa 20% carboxymethylierte Glukoseeinheiten.

G) Amino-Dextran T40 (IX)

Das in Stufe (F) erhaltene carboxymethylierte Dextran T40 (als Schmiere, hergestellt aus 100 g Dextran T40) wird in 250 ml Wasser gelöst. Sodann wird eine Lösung von 400 g (2,00 Mol) N,N&min;-Bis-(3-aminopropyl)-piperazin in 680 g (8,52 mM/g, 5,80 Mol) Salzsäure zugegeben. Die erhaltene Lösung wird mit einer Lösung von 201 g (1,05 Mol) EDCI in 250 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wird 22 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden 3 Liter Äthanol zugegeben. Nach Zugabe von 1,5 Liter erfolgt die Ausfällung des Dextrans. Die Fällung wird über Nacht absetzen gelassen.

Das erhaltene Aminodextran wird durch zwei weitere Umfällungen gereinigt. Diese werden auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt. Bei der zweiten Ausfällung wird eine milchige Suspension erhalten, die nach Zugabe einer Lösung von 25 g Lithiumbromid in 250 ml Äthanol koaguliert und sich absetzt. Die erhaltene Schmiere wird auf 1 Liter verdünnt. Sie hat 1,04 mM an Aminogruppen.

H) ONPG-Dextran T40

Eine Lösung des Aminodextrans (IX) (1 Liter des Produkts 1,04 mM) wird mit 89 g (0,5 Mol) K2HPO4 versetzt. Es wird eine auf einen pH-Wert von 8 bis 8,1 gepufferte Lösung erhalten. Sodann wird eine DMF-Lösung des NHS-Esters (VII), hergestellt aus der Säure (VI), 160 mM, langsam zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Dextran wird durch Zugabe von 3 Liter Äthanol ausgefällt. Die Ausfällung setzt nach Zugabe von 350 ml des Äthanols ein. Die Fällung wird über Nacht absetzen gelassen.

Das erhaltene Dextran wird durch zwei weitere Umfällungen auf die vorstehend beschriebene Weise gereinigt. Die bei der zweiten Ausfällung erhaltene Schmiere wird in 1 Liter Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird zunächst durch eine Glasfilterfritte mittlerer Porosität und sodann durch ein 0,8 Mikron- Filter filtriert und geklärt. Das erhaltene Filtrat wird auf 2 Liter verdünnt. Eine Probe wird 1 : 121 verdünnt; sie hat eine Absorption bei 320 nm von 1,15. Bezogen auf einen Wert von E320 = 2700 ist die ONPG-Gruppenkonzentration 52 mM.

Die Lösung wird durch Zusatz von 0,65 g NaN3 konserviert. Etwa die Hälfte des Materials wird gefriergetrocknet. Der Rückstand läßt sich gut wieder in Wasser auflösen.

Zur Erläuterung der Erfindung werden folgende Tests durchgeführt:

Beim ersten Test wird als Puffer PBS, N31 Mg, RSA verwendet. Die verwendeten Lösungen sind die Enzymlösung (Beispiel 1C) bei einer Konzentration von 10 µg/ml in Pufferlösung, HumanIgG einer Konzentration von 0,2 mg/ml und der mit Bernsteinsäureanhydrid acylierte Antikörper in einer Konzentration von 17,4 mg/ml. Das Protein enthält durchschnittlich 48 Bernsteinsäuregruppen pro Molekül. Das Substrat war ein an Dextran gebundener o-Nitrophenylgalactosidyläther vom Molekulargewicht 40 000. Die Bindung des Äthers an das Dextran erfolgte über eine Di-(3-aminopropyl)-piperazin-Gruppe. Das Dextran war vorher mit dem Natriumsalz der Chloressigsäure modifiziert worden. Das Substrat wird in einer Konzentration von 4 mM ONPG in PBS, N3, Mg verwendet.

Bei dem Versuch werden 0,05 ml des Enzym-Antikörper-Konjugats und 0,10 ml Puffer mit 0,05 ml der entsprechenden Konzentration von humanem IgG und 0,10 ml Puffer vereinigt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wird das Gemisch mit 0,1 ml des succinylierten Antikörpers und 0,25 ml Puffer versetzt. 15 Sekunden später werden 0,10 ml der Substratlösung sowie 0,25 ml Puffer zugegeben. Die Messung erfolgt 10 Sekunden und 40 Sekunden nach der Zugabe des Substrats, und zwar bei 37°C und bei 420 nm.

In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse für verschiedene HIgG-Verdünnungen und succinylierte Antikörper Verdünnungen zusammengefaßt. Die succinylierte Antikörpern Verdünnung beträgt 1 Volumteil der Antikörperlösung zu einem Endvolumen im Puffer wie angegeben. Tabelle III



Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß bei zunehmenden Konzentrationen an succinyliertem Antikörper eine erhebliche Verstärkung der beobachteten Hydrolysegeschwindigkeit bei einer gegebenen Konzentration an humanem IgG erhalten wird, und daß die Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit der Änderung der Konzentration des humanen IgG folgt, wobei zunehmende Konzentrationen an humanem IgG zunehmende Reaktionsgeschwindigkeiten liefern.

Im nächsten Test wird als geladenes Mitglied Fluorescein als Quelle für die negative Ladung verwendet. Der Test wird folgendermaßen durchgeführt:

50 µl des Enzymkonjugats (Beispiel 1D) werden mit 50 µl HIgG in 0,2 ml Puffer (PBS, N3, Mg, RSA) vereinigt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wird das Gemisch mit 100 µl des Fluorescein-markierten Anti(HIgG) und 0,25 µl Puffer versetzt. Das Gemisch wird 15 Sekunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden 100 µl von 4 mM ONPG-konjugiertem Dextran (Molekulargewicht 40 000) in PBS, N, Mg + 0,25 µl Puffer zugegeben, und die Ablesung erfolgt bei 37°C und bei 420 nm. Die erste Ablesung erfolgt 10 Sekunden nach Zusatz des Substrats und wird subrahiert von dem Wert der Ablesung nach 40 Sekunden. In Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengefaßt. HIgG Verdünnung, 0,2 µg/ml Geschwindigkeit, min-1 0,398 4 096 0,418 1 024 0,448 256 0,502 64 0,582 16 0,624 4 0,726 1 0,828


Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß eine zweifache Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit über den verwendeten Konzentrationsbereich beobachtet wird. Das zwei negative Ladungen tragende Fluorescein ist in der Lage, die Reaktionsgeschwindigkeit zu modulieren, es verstärkt die beobachtete Umsatzgeschwindigkeit der β-Galactosidase, wenn es durch Bindung an das Antigen HIgG in Nachbarschaft zum Enzym gebracht wird.

Bei den nächsten beiden Tests wird ein Antienzym als Enzyminhibitor verwendet, das nicht an das Antigen gebunden wird. Es wird ein Gemisch aus 1,5 ml des vorstehend beschriebenen Enzym-Antikörper-Konjugats und 1,5 ml des succinylierten Antikörpers verdünnt 1 : 16 hergestellt. 0,05 ml der entsprechenden humanen IgG-Lösung werden mit 0,10 ml des vorstehend beschriebenen Gemisches versetzt. Sodann werden entweder (1) 0,05 ml Antienzym innerhalb weniger Minuten Zugegeben oder (2) das Gemisch wird inkubiert und sodann mit 0,05 ml des Antienzyms versetzt. In jedem Falle werden sodann die Gemische 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden 0,10 ml des 4 mM ONPG-Dextran 40- Konjugats + 0,7 ml Puffer zugegeben. Ablesungen erfolgen nach 10 Sekunden und 40 Sekunden bei 37°C und bei 420 nm. In Tabelle V sind die Ergebnisse zusammengefaßt. Das Antienzym wird in einer Pufferlösung bei einer Konzentration verwendet, so daß praktisch sämtliche Enzymbindungsstellen abgesättigt sind. Tabelle V



Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß über einen breiten Bereich der Änderung der Konzentration von humanem IgG eine signifikante Änderung der beobachteten Reaktionsgeschwindigkeit, bestimmt über einen sehr kurzen Zeitbereich, nämlich 30 Sekunden, erfolgt. Nach der Umsetzung zwischen den Antikörpern und dem Antigen läßt sich also das Antigen, humanes IgG, durch eine einfache und rasche spektrophotometrische Methode bestimmen.

Die Genauigkeit des Tests kann verbessert werden, wenn man den Hintergrund vom Enzym-Konjugat, das nicht bei der Bindung an das Antigen teilnimmt, eliminiert. Auf diese Weise sind die beobachteten Ergebnisse weniger empfindlich gegenüber unspezifischen Effekten und Variationen der Ergebnisse aufgrund des Enzyms, das an andere als den homologen Antikörper des Analyts konjugiert ist.

Die Erfindung liefert somit eine Methode, bei der unreiner Antikörper markiert und in einem empfindlichen Test zur Bestimmung extrem geringer Mengen Analyt verwendet wird. Das Verfahren umfaßt die Bindung einer Mehrzahl von Antikörpern, so daß ein größerer Anteil des Markers mit dem Antikörper an den interessierenden Ligand assoziiert ist. Das von einem Signalmarker in Nachbarschaft zum geladenen Mitglied erhaltene Signal ist signifikant verschieden von dem Signal, das von einem Signalmarker erhalten wird, der von dem geladenen Mitglied nicht beeinflußt ist. Somit liegt ein signifikanter Unterschied zwischen dem direkt oder indirekt an den interessierenden Antiligand gebundenen Marker und dem an andere in Antiseren vorliegende Proteine gebundenen Marker vor.

Erfindungsgemäß wird ein einfacher, empfindlicher und rascher Test zur Bestimmung der verschiedensten Analyte zur Verfügung gestellt. Das Verfahren gestattet die Verwendung der verschiedensten Marker, wobei der Marker durch die Gegenwart eines elektrischen Feldes in einem wäßrigen Medium beeinflußt werden kann. Das elektrische Feld wird durch Modifizierung eines Mitgliedes eines spezifisch bindenden Paares mit einer Mehrzahl von Substituenten zur Verfügung gestellt, die unter den Bedingungen des Testmediums ionisiert sind, und eine relativ konzentrierte Ladungsumgebung liefern.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde erläutert unter Verwendung von Antikörpern als Reagenzien, die gegen den interessierenden Analyt gerichtet sind. Es ist jedoch ersichtlich, daß man auch Antikörper gegen die Antikörper als universelle Reagenzien verwenden kann und den Anti-Antikörper zur Verfügungstellung von Ladungen oder Markern modifizieren kann. Auf diese Weise läßt sich die Zahl der Marker und Ladungen, die durch einen Analyt zusammengebracht werden, stark verstärken oder vermehren. Dieses Verfahren ist besonders wirksam, wenn verhältnismäßig reine Anti-Antikörper zur Verfügung stehen.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyts, der ein Mitglied eines spezifisch bindenden Paares aus einem Ligand und einem Antiligand ist, in einer zu analysierenden Probe, wobei ein feststellbares Signal erhalten wird, das in Beziehung steht zur Menge des Analyts, bei dem man ein markiertes Mitglied, dessen Marker Bestandteil eines signalerzeugenden Systems ist, und ein polyionisch geladenes Mitglied verwendet, wobei das feststellbare Signal in Beziehung steht zur durchschnittlichen Nähe des geladenen Mitglieds zu dem markierten Mitglied, und man in einem wäßrigen Testmedium
    1. (1) den Analyt in der zu analysierenden Probe,
    2. (2) das geladene Mitglied und
    3. (3) das signalmarkierte Mitglied zusammenbringt, wobei mindestens eine der Gruppen (1), (2) und (3) der Ligand ist und mindestens eine der verbleibenden Gruppen (1), (2) und (3) der Antiligand ist und die dritte verbleibende Gruppe am Ligand oder Antiligand bindet,
  2. und das feststellbare Signal, das durch das signalerzeugende System erzeugt wird, bestimmt im Vergleich zu dem Signal, das in einem Testmedium mit bekannter Analytmenge erzeugt wird.
  3. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Testmedium einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 11 aufweist und das geladene Mitglied eine Mehrzahl von negativ geladenen Sauerstoffatomen besitzt.
  4. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der negativen Ladungen Carboxylgruppen sind.
  5. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der negativen Ladungen phenolische Gruppen sind.
  6. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Enzym ist.
  7. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalerzeugende System ein makromolekulares geladenes Substrat einschließt.
  8. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker eine fluoreszierende Substanz ist.
  9. 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als weitere Komponenten Substrate und Cofaktoren für das Enzym einsetzt.
  10. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein makromolekulares geladenes Substrat ist.
  11. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das makromolekulare geladene Substrat die zum geladenen Mitglied entgegengesetzte Ladung aufweist.
  12. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Testmedium einen pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 aufweist.
  13. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das geladene Mitglied eine Mehrzahl von Carboxylgruppen aufweist.
  14. 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein antigenes Protein und der Antiligand ein Antikörper zu dem antigenen Protein ist und wobei das markierte Mitglied mit dem Antikörper konjugiert und das geladene Mitglied der Antikörper ist, der durch eine Mehrzahl von Carboxylgruppen substituiert ist.
  15. 14. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 10 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das geladene Mitglied durch eine Mehrzahl von phenolischen Gruppen substituiert ist.
  16. 15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym β-Galactosidase und das Substrat ein positiv geladenes makromolekulares Substrat mit einer Mehrzahl von o-Nitrophenylgalactosidgruppen ist.
  17. 16. Testreagens zur Durchfuhrung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, enthaltend modifizierte Mitglieder eines spezifisch bindenden Paares aus einem Ligand und Antiligand, wobei die modifizierten Mitglieder ein signalmarkiertes Mitglied einschließen, wobei der Signalmarker eine Komponente eines signalerzeugenden Systems ist, das durch die Nähe einer hohen Ladungskonzentration und eines geladenen Mitglieds beeinflußt wird, wobei das geladene Mitglied durch eine Mehrzahl von funktionellen Gruppen substituiert ist, die unter den Testbedingungen geladen sind, die relativen Mengen des geladenen Mitglieds und des signalmarkierten Mitglieds in Beziehung stehen zur Optimierung der Antwort des signalerzeugenden Systems auf die Änderung der Konzentration des zu bestimmenden Analyts.
  18. 17. Testreagens nach Anspruch 16, wobei das geladene Mitglied ein polycarboxylsubstituierter Antiligand und das signalmarkierte Mitglied ein durch β-Galactosidase substituierter Antiligand ist.
  19. 18. Testreagens nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an einem positiv geladenen makromolekularen Substrat für die β-Galactosidase mit einer Mehrzahl von o-Nitrophenylgalactosidgruppen.
  20. 19. Testreagens nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das geladene Mitglied ein polyphenolisch substituierter Antiligand und das signalmarkierte Mitglied ein β-Galactosidase-markierter Antiligand ist.
  21. 20. Testreagens nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an einem positiv geladenen makromolekularen Substrat mit einer Mehrzahl von o-Nitrophenylgalactosidgruppen.
  22. 21. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel

    Receptor - (RX)n

    wobei der Receptor ein Antikörper ist, R eine Bindung oder eine verbindende Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, X eine funktionelle Gruppe darstellt, die eine Ladung tragen kann, nämlich eine Amino- oder Oxysäure, und n einen durchschnittlichen Wert im Bereich des Molekulargewichts des Receptors dividiert durch 500 bis 10 000 hat, als geladenen Mitglied zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
  23. 22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Carboxylgruppe darstellt.
  24. 23. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Phenoxygruppe darstellt.
  25. 24. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß RX die Gruppe der Formel

    -CO-CH2CH2-COOH

    ist.






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