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Dokumentenidentifikation DE3382718T2 05.05.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0323861
Titel Peptide, die eine Immunogen-Lage des Poliovirus des Sabin-Stammes enthalten.
Anmelder Institut Pasteur, Paris, FR
Erfinder Girard, Marc, F-75015 Paris, FR;
van der Werf, Sylvie, F-75004 Paris, FR
Vertreter Frhr. von Pechmann, E., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Behrens, D., Dr.-Ing.; Brandes, J., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Goetz, R., Dipl.-Ing. Dipl.-Wirtsch.-Ing.; von Hellfeld, A., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte; Würtenberger, G., Rechtsanw., 81541 München
DE-Aktenzeichen 3382718
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 30.11.1983
EP-Aktenzeichen 891028888
EP-Offenlegungsdatum 12.07.1989
EP date of grant 06.10.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.05.1994
IPC-Hauptklasse C12N 15/43
IPC-Nebenklasse C12P 21/02   C07K 13/00   C07H 21/04   A61K 39/13   C12Q 1/68   G01N 33/53   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Peptide, die eine immunogene Passage des Poliovirus im Molekül umfassen. Die Erfindung betrifft auch DNA-Fragmente, die Nucleotidsequenzen enthalten, die für diese Peptide codieren. Die Erfindung betrifft auch immunisierende Aktivstoffe (Impfstoffe), die sich dieser Peptide bedienen, wobei diese Aktivstoffe in der Lage sind, im menschlichen oder tierischen Wirt die Produktion von Antikörpern, die nicht nur gegen sich selbst, sondern auch gegen ganze infektiöse Polioviren aktiv sind, zu induzieren.

Es wurden bereits in der französischen Patentanmeldung Nr. 82-02013 (eingereicht am 8. Februar 1982; FR-A 2,521,165) DNA-Fragmente beschrieben, die für ein Immunogen- Peptid codieren, das in vivo die Synthese von gegen das Poliovirus gerichteten (Antipoliovirus-)Antikörpern induzieren kann. Diese DNA-Fragmente weisen eine Lange auf, die nicht die Länge eines DNA-Fragments überschreitet, das größenordnungsmäßig 1,2 kb (Kilo- Basenpaare; 1.000 Basenpaare) umfaßt. Diese Fragmente sind noch genauer dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nucleotidsequenz enthalten, die für das Protein VP-1 codiert, von dem sich herausgestellt hat, daß es essentielle Antigen-Determinanten trägt, die auf der Stufe der Immunogenität des entsprechenden infektiösen Poliovirus eingreifen. Tatsächlich kann dieses Peptid Antigen-Antikörper-Komplexe mit monoklonalen oder polyklonalen neutralisierenden Seren bilden, die von Tieren erhalten wurden, denen man vollständigen Poliovirus (Serum der Spezifität D) injiziert hatte.

Die Sequenztypen von DNA, die für Immunogen-Peptide des oben angesprochenen Typs codieren, sind in der Folge der beigefügten Fig. 1 und 2 für eine von ihnen und in der Folge der Fig. 3 und 4, die ebenfalls beigefügt sind, für ein anderes DNA-Fragment, das die oben genannte Frequenz enthält, veranschaulicht. Die Orte bestimmter Restriktionsstellen, auf die nachfolgend Bezug genommen wird, sind gleichfalls in den Figuren angezeigt. Die Numerierungen der aufeinanderfolgenden Nucleotide, die in den Aufbau der DNA eingreifen, erfolgen ausgehend vom 5'-Ende. Was den Aufbau der klonierbaren DNA des Poliovirus betrifft, aus der die oben genannten DNA hervorgegangen sind, wird auf den Artikel von Sylvie van der Werf und anderer Autoren mit dem Titel "Molecular cloning of the genome of polioviris" in "Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, Nr. 10 (Oktober 1981), 59 bis 83, 59 bis 87" Bezug genommen.

Die Erfindung ergibt sich aus der Entdeckung, daß Peptide, die DNA-Sequenzen entsprechen, die in den vorstehend genannten DNA-Sequenzen enthalten sind, jedoch sehr viel kleiner sind als diese, dennoch Antigen-Determinanten tragen, die ihre Verwendung beim Aufbau immunisierender Aktivsubstanzen (Impfstoffe) erlauben, die gegen die entsprechenden Polioviren wirksam sind. Von den in Rede stehenden Peptiden kann man bestimmte isolieren, deren Größe ausreichend reduziert ist, daß sie unmittelbar durch chemische Synthese zugänglich sind.

Die Erfindung stellt außerdem die Verfahrensweise bereit, die die Bestimmung derartiger sehr viel kleinerer DNA-Sequenzen innerhalb von DNA relativ bedeutender Größe erlaubt, die Gegenstand der französischen Patentanmeldung Nr. 82-02013 sind, denen Peptide entsprechen, die Determinanten oder antigene Molekülstellen zeigen, die für den Einsatz bei der Herstellung von immunisierenden Aktivstoffen gegenüber entsprechenden vollständigen und infektiösen Polioviren geeignet machen.

In dieser Hinsicht besteht die längste DNA-Sequenz gemäß der Erfindung aus dem Fragment, das an seinen einander gegenüberliegenden Enden durch die XbaI-Schnittstellen begrenzt ist, die in den Bereichen liegen, die durch die Positionen 2546 und 2861 in Fig. 1 definiert sind.

Die Erfindung betrifft insbesondere diejenigen DNA-Sequenzen, die in der vorstehenden Sequenz enthalten sind und die ein Peptid codieren, das von monoklonalen Antikörpern erkannt werden kann, die zugleich gegen die "C"- und "D"-Teilchen, die von demselben Poliovirus stammen, und gegen das Strukturpolypeptid VP-1 des Capsids desselben Polio- Virus aktiv sind. Dies ist der Typ monoklonaler Antikörper, um den es sich in allen Fällen der folgenden Beschreibung handelt, solange er nicht in anderer Weise spezifiziert ist.

Derartige Antikörper werden ausgehend von Hybridomen erhalten. Diese werden ihrerseits erhalten bei Durchführung einer Fusion zwischen Milzzellen eines Tiers, das vorher mit einem Virus oder Virion immunisiert wurde, das eine Antigenität "C" zeigt (erhalten insbesondere durch Erwärmen von entsprechendem infektiösem Poliovirus einer Antigenität "D" für 1 h auf 56ºC) und geeigneten Myelomzellen. Dabei führt man bei der Kultivierung der erhaltenen Hybride oder Zellklone und bei der Selektion der Klone, von denen sich gezeigt hat, daß sie zugleich aktive monoklonale Antikörper gegen die Virionen mit einer Antigenität "C", gegen die homologen Virionen einer Antigenität "D" und gegen das entsprechende VP-1-Protein produzieren, eine an sich bekannte Verfahrensweise durch. Die in Frage kommenden Polioviren sind vorteilhafterweise vom Typ 1 (Mahony). Hinsichtlich dieser monoklonalen Antikörper (die nachfolgend mit "Antikörper CD-VP-1" (oder "C3") bezeichnet werden), sind die Zellhybride, die diese produzieren sowie ein Verfahren zu deren Herstellung bereits in der französischen Patentanmeldung Nr. 82-19338 (FR-A 2,536,414), eingereicht am 18. November 1982, beschrieben. Zwei der gebildeten Zellhybride wurden bei der Collection Nationale de Culture de Micro-Organismes des Insitut Pasteur in Paris (C.N.C.M.) unter den Hinterlegungsnummern I-208 bzw. I-209 hinterlegt.

Diese DNA-Sequenz gemäß der Erfindung hat die folgende Struktur:

Die Erfindung betrifft natürlich auch jede DNA-Sequenz, die für ein Peptid codiert, das immunogene Eigenschaften aufweist, die ähnlich denen des Peptids sind, das durch die vorstehend gezeigte Nucleotidsequenz codiert wird. Insbesondere kann jedes Triplett dieser Sequenz ersetzt werden, und zwar durch ein unterschiedliches Triplett, das für dieselbe Aminosäure codiert oder für eine unterschiedliche Aminosäure codiert, und zwar insoweit, als die Substitution vom zweiten zum ersten in dem codierten Peptid bei der in Rede stehenden DNA die immunogenen Eigenschaften des codierten Peptids bei der so modifizierten DNA-Sequenz nicht grundlegend verändert. Insbesondere betrifft die Erfindung jede DNA-Sequenz dieses Typs, die für ein Peptid codiert, das durch den oben genannten Antikörper C3 erkannt werden kann.

Die Erfindung betrifft auch jede Nucleotidsequenz kürzerer Lange, die in der vorstehend genannten Sequenz enthalten ist, sobald sie für ein Peptid codiert, das noch immer von dem Antikörper C3 erkannt werden kann.

Unter die DNA-Sequenzen, die im Bereich der Erfindung liegen, fallen diejenigen, die Nucleotidsequenzen enthalten, die für die Peptidsequenz His 65 - Phe 105 codieren, wie sie nachfolgend definiert ist, und insbesondere die Nucleotidsequenz 2671-2792 des Gens, das für das Strukturpeptid VP-1 des Poliovirus gemäß Fig. 1 codiert.

Andere bevorzugte DNA-Sequenzen, die im Bereich der Erfindung liegen, sind diejenigen, die für die Peptidsequenzen His 65 - Ile 110 codieren, die nachfolgend definiert sind, und insbesondere die Nucleotidsequenz Pro 95 - Ile 110 desselben Gens.

Die Erfindung betrifft natürlich die Polypeptide, die die Peptidsequenzen enthalten, für die die obengenannten DNA-Sequenzen codieren. Die Erfindung betrifft insbesondere die Sequenz der Formel

Die Erfindung betrifft in gleicher Weise jedes Peptid, das immunogene Eigenschaften aufweist, die bei den Bedingungen äquivalent sind, die bereits im Zusammenhang mit den Peptiden angegeben wurden, für die die vorstehend definierten DNA-Sequenzen codieren. Diesbezüglich betrifft die Erfindung insbesondere die folgende Sequenz, die nachfolgend als "Sequenz His - 65 Phe 105" bezeichnet wird:

oder die Sequenz, die nachfolgend als "Sequenz His 65 - Ile 110" bezeichnet wird:

Die Erfindung betrifft insbesondere die Peptide, die die folgende Peptidsequenz enthalten, die nachfolgend als "Sequenz Asp 93 - Leu 104" bezeichnet wird:

Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu.

Die Erfindung betrifft natürlich auch die Vektoren, insbesondere vom Typ Plasmide oder Phagen, die ein Insert enthalten, das durch eine der DNA-Sequenzen gebildet wird, die vorstehend definiert wurden. Diese modifizierten Vektoren können bei der Transformation cellulärer Organismen oder geeigneter Mikroorganismen verwendet werden, und zwar im Hinblick darauf, dadurch die Produktion eines Polypeptids, gegebenenfalls von Hybriden, zu induzieren, die eine Peptidsequenz enthalten, die von monoklonalen Antikörpern des Typs CD-PV1 oder C3 oder von anderen Antikörpern erkannt werden können, die den infektiösen Virus erkennen. Diese Polypeptide, gegebenenfalls auch Hybride, stellen in gleicher Weise einen Teil der Erfindung dar.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, das die Identifikation eines bestimmten Poliovirus innerhalb einer DNA-Sequenz, die normalerweise im Inneren der DNA enthalten ist, von kleineren Sequenzen aus der Gruppe derartiger Sequenzen, die für ein Immunogen- Peptid codieren können, oder bei der Herstellung einer immunogenen Aktivsubstanz verwendet werden können, die die Produktion von aktiven Antikörpern gegen den entsprechenden vollständigen Poliovirus erlaubt.

Dieses Verfahren ist im wesentlichen durch folgende Schritte gekennzeichnet: Ausgehend von einem Plasmid, das ein Insert enthält, das gebildet ist aus einer Anfangssequenz, von der bekannt ist, daß sie eine kleinere Sequenz enthalten muß, die für ein Immunogen-Peptid codieren kann oder in die Konstitution einer immunogenen Aktivsubstanz eintreten kann, linearisiert man das Plasmid in Bereich einer Restriktionsstelle außerhalb der kleineren Sequenz, zerschneidet das linearisierte Plasmid in kontrollierter Weise mit einem exonucleolytischen Enzym wie beispielsweise mit dem Enzym Bal31, zirkularisiert das Plasmid wieder mittels einer ADN-Ligase, transformiert einen geeigneten Mikroorganismus, der selbst durch den entsprechenden Vektor transformierbar ist und das in ihm enthaltene Insert exprimieren kann, und bestimmt unter den Expressionsprodukten dieses Mikroorganismus das eventuelle Vorhandensein eines Peptids, das die immunogene Stelle der in Frage stehenden Art tragen kann, indem man die Expressionsprodukte mit einem monoklonalen CD-PV1-Antikörper in Kontakt bringt. Dabei wird der Zyklus der soeben definierten Verfahrensschritte bis zum Verschwinden des Nachweises des Immunogenpeptids unter den Expressionsprodukten des durch das letztgenannte rezirkularisierte Plasmid transformierten Mikroorganismus wiederholt.

Es ist möglich, am Ende jedes der Zyklen des vorstehend definierten Verfahrens beispielsweise durch Vergleich der Restriktionskarten des Plasmids vor und nach dem oben genannten Verfahrensschritt des Zerschneidens die DNA-Sequenzen zu bestimmten, die zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schneideschritten eliminiert wurden, und folglich dann, wenn die Möglichkeit eines Nachweises eines Immunogen-Peptids unter den oben angegebenen Bedingungen endet, dieses Ergebnis mit einer der Sequenzen zu korrelieren, die im Verlauf des vorangehenden Verfahrensschritts des Zerschneidens abgebaut wurden, wobei diese abgebaute DNA-Sequenz für das genannte Immunogen-Peptid codiert. Die Struktur der abgebauten Sequenz (oder der abgebauten Sequenzen) kann sich natürlich aus Bestimmungen der Nucleotidsequenzen von den Enden her ergeben, die vor und nach dem in Betracht kommenden Schritt des Zerschneidens durchgeführt werden.

Ein derartiges Prinzip wird in einem der Durchführungsbeispiele der Erfindung veranschaulicht, dessen Beschreibung folgt. Es wird im folgenden in gleicher Weise auf die Zeichnungen Bezug genommen. - Die Fig. 1 bis 4 entsprechen Sequenzen, die bereits vorstehend definiert wurden. - Die Fig. 5a bis 5h zeigen schematisch eine Art der Herstellung einer Vorstufe, die ausgehend von den Klonen pPV1-846 und pPV1-120 erhalten wurden, die beschrieben sind in dem Artikel von Sylvie van der Werf und von anderen Autoren, der bereits vorstehend erwähnt wurde.

eines Plasmids wieder, das die hauptsächliche genetische Information der DNA- Sequenz enthält, wie sie sich aus den Fig. 1 und 2 ergibt.

- Fig. 7 ist eine schematische Wiedergabe der Herstellung des vorstehend genannten Plasmids und eines zusätzlichen Verfahrensschritts zur Durchführung in einem ersten Schritt gemäß der vorliegenden Erfindung, wie er sich aus der folgenden Beschreibung ergibt.

- Fig. 8 ist eine neue Wiedergabe der Sequenz, die für VP1 codiert, wobei ein Teil der Sequenz vorangeht, die für VP3 codiert und ein Teil der Sequenz folgt, die für NCVP3b codiert. Diese Sequenz unterscheidet sich nicht grundlegend von Teilen der entsprechenden Sequenzen, die in den Fig. 1 bis 4 dargestellt sind, außer durch die Numerierung der Nucleotide. Diese Numerierung stimmt überein mit der, die sich aus der "Übereinkunft" ergibt, auf die sich A. J. Dorner et al. in dem Artikel beziehen, der den Titel trägt: "Identification of the initiation site of poliovirus polyprotein synthesis" (Identification du site d'initiation de la synthèse de la polyproteine de poliovirus; Identifikation der Initiationsstelle der Synthese des Poliovirus-Polyproteins) (Journal of Virology 42 (Juni 1982), Nr. 3, Seiten 1017 bis 1028). Diese Veröffentlichung verweist auf das MOLGEN-Projekt des Systems SUMEX AIM der Universität Stanford, was die herzustellenden Verbindungen zwischen der Numerierung der vollständig veröffentlichten Sequenzen und der Numerierung betrifft, wie sie in Fig. 8 durchgeführt wurde.

- Fig. 9 ist eine schematische Wiedergabe des Plasmids pCW 119. Sie veranschaulicht die relativen Positionen der Streichungen, die bei anderen Plasmiden, die früher in Frage kamen, und bei Derivaten von pCW 119 eingeführt wurden.

- Fig. 10 veranschaulicht noch spezieller die Positionen dieser Streichungen gegenüber den Restriktionsstellen, die in dem Plasmid pCW 119 bestimmt wurden.

Die eingesetzten Verfahrensweisen des Aufbaus für die verschiedenen Plasmide sind klassischer Natur. Die DNA von Plasmiden wurden jedes Mal mit Restriktionsenzymen unter Bedingungen gespalten, die von den jeweiligen Herstellern vorgesehen waren. Die DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese in einem Agarosegel oder Polyacrylamidgel analysiert. Die überstehenden 3'-Enden wurden in stumpfe Enden transformiert durch Inkubation der DNA-Fragmente (0,1 mg/ml) mit 100 u/ml DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment) von E. coli während 1 h bei 37ºC in einem Medium aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), das 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 1 mM DTT enthielt, in Gegenwart von 0,2 mM der ersten Nucleotidpaare. Die Verdauung mit der Nuclease Ba 31 wurde in einem Medium von 20 mM CaCl&sub2; und 12 mM MgCl&sub2; bei Einhalten eines Verhältnisses Enzym/DNA von 0, 12 U pro ug durchgeführt. Nach Inkubation während 15 min bei 30ºC setzte man EDTA bis zum Erhalt einer Konzentration von 50 mM zu, und die DNA wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefallt. Die Ligationsreaktionen wurden in 20 ul eines Mediums aus 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP während 18 h bei 15ºC durchgeführt, wobei man 1 U T4-DNA-Ligase pro ug DNA verwendete. Die linearisierten Plasmide wurden gegebenenfalls vor einer Ligation mit den geeigneten Fragmenten während 30 min bei 68ºC mit einer bakteriellen alkalischen Phosphatase (0,02 U pro ug DNA) behandelt.

1. Hydrolyse der klonierten DNA mit Restriktionsenzymen

1.1 Die DNA des Plasmids pPVI-846 wurde vollständig mit EcoRI hydrolysiert. Die so erhaltene lineare Form der Plasmid-DNA (Fig. 5c) wurde durch partielle Verdauung mit Kpn I hydrolysiert. Die erhaltenen Fragmente (Fig. 5d) wurden durch Elektrophorese in Agarosegel bei 0,7% abgetrennt.

Das Fragment mit der Größe 6,6 kbp wurde selektioniert. Es stellt tatsächlich die Sequenz des Plasmids pBR322 von der EcoRI-Schnittstelle bis zur Pst I-Schnittstelle dar, verlängert um die DNA-Sequenz, die der Poliovirus-Sequenz entspricht, die sich vom Nucleotid 1 bis zum Nucleotid 3064 erstreckt (2e-Schnittstelle Kpn I).

1.2 Die DNA des Klons pPVI-120 wurde in einer vollständigen Verdauung mit AvaI und EcoRI hydrolysiert. So wurden zwei Fragmente unterschiedlicher Größe gebildet (Fig. 5e). Die DNA wurde danach partiell mit Kpn I hydrolysiert. Die so erhaltenen Fragmente (Fig. 5f) wurden durch Elektrophorese in Agarosegel bei 0,7% abgetrennt.

Das Fragment der Größe 3,55 kbp wurde selektioniert. Es stellt tatsächlich die Sequenz der cDNA des Poliovirus dar, die vom Nucleotid 3064 (2e-Schnittstelle Kpn I) bis zum Nucleotid (etwa) 5650 reicht, verlängert um die Sequenz der 752 Basenpaare des Segments Pst I-EcoRI des Plasmids pBR322.

2. Extraktion der DNA-Fragmente von den Gelen

2.1 Die Fragmente wurden in den Gelen durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Fragmente mit gewünschter Länge wurden aus den Oelen durch Elektroelution in einem Dialysebeutel extrahiert. 2.2 Das so erhaltene Material wurde gereinigt und konzentriert.

3. Wiederzusammenfügen der Fragmente (Rekombination)

Die beiden selektionierten Fragmente, die von den Klonen pPVI-846 und pPVI-120 stammten und oben beschrieben wurden, wurden vermischt und mit Hilfe der DNA-Ligase des Phagen-T4 wieder zusammengefügt. Zur Zusammenfügung vorgesehene Enden, die an den durch EcoRI und Kpn I hervorgerufenen Schnittpunkten gebildet waren und an jedem Ende der beiden Fragmente vorhanden waren, begünstigten das Zusammenfügen und stellten sicher, daß sich dieser Schritt nur im gewünschten Sinn vollziehen konnte (Fig. 5g und 5h).

Das Genom des Plasmids pBR322 wurde so ohne Modifikation oder Streichung zu dem rekombinanten Plasmid rekonstituiert. Insbesondere waren die Bereiche, die für dessen Replikation und die Expression der Resistenz gegen Tetracyclin erforderlich waren, nicht beeinträchtigt.

4. Transformation des Stamms E. coli 1106

Die an ihren Kpn I- und EcoRI-Schnittstellen wieder zusammengefügten Fragmente der Plasmide pPVI-846 und -120 wurden unter Transformationsbedingungen in Kontakt mit geeigneten Bakterien des Stamms E. coli 1106 gebracht. Die Bakterienkolonien wurden selektioniert, die gegen Tetracyclin resistent und gegen Ampicillin empfindlich waren.

5. Analyse der neuen Klone

5.1 Die Plasmid-DNA der gegen Tetracyclin resistenten Bakterien wurde gereinigt. Ihre Masse wurde durch Elektrophorese in Agarosegel bestimmt. Sie war gleich der Masse des Plasmids pBR322, erhöht um 5650 Basenpaare der viralen cDNA, die durch Rekombination gebildet worden war.

5.2 Die in vitro-Hybridisierung der so erhaltenen cDNA mit von den Klonen pPVI-846 und

pPVI-120 stammenden spezifischen Sonden erlaubt die Überprüfung der Gegenwart von genetischem Material von Poliovirus, das originär in den beiden Eltern-Klonen insertiert war, in einem einzigen rekombinanten Klon.

5.3 Die detaillierte Analyse der neuen Klone erfolgte durch Verfahrensweisen, die bereits früher zur Untersuchung von bereits charakterisierten Klonen herangezogen worden waren (physikalische Kartographie mit Restriktionsenzymen; Elektronenmikroskopie; Nucleotidsequenzierung; usw.).

5.4 Die cDNA, die von dem rekombinanten Plasmid (pPV1-X) oder pPV1-958 getragen wird, trägt die genetische Information, die für die Synthese des Proteins NCVP1a (oder P1) nötig ist, das Vorstufe folgender Capsid-Proteine ist: VP4 (Nucleotide 743 bis 950), VP2 (Nucleotide 951 bis 1766), VP3 (1767 bis 2479) und VP1 (2480 bis 3385), gefolgt von denen, die dem Protein NCVP3b (oder P2) entsprechen (Vorstufe insbesondere des Proteins NCVPX), und am Anfang des Proteins NCVPb (oder P3).

Der Gesamtkomplex umfaßt etwa 5650 der 7440 Basen des viralen Genoms.

Das Plasmid pPVI-846 wurde bei der C.N.C.M. am 19. Mal 1981 unter der Nummer I-155 hinterlegt, und das Plasmid pPVI-120 wurde am 19. Mai 1981 unter der Nummer I-156 hinterlegt.

Das erhaltene Plasmid pPV1-958 enthält in seinem Insert die Nucleotidsequenz, die für die folgenden Proteine codiert: VP0 (Nucleotide 743 bis 1766), VP3 (Nucleotide 1767 bis 2479) und VPI (Nucleotide 2480 bis 3385), gefolgt von der Sequenz, die für das Protein NCVP3b codiert (Nucleotide 3386 bis 5100 und einige weitere), und am Anfang davon für das Protein NCVP1b.

Ausgehend von dem Plasmid pPV1-958 kann man so ein cDNA-Fragment erhalten, das für VP1 codiert, in dem man wie folgt vorgeht:

Isolierung und Reklonierung eines Fragments der cDNA, die die Sequenz von VP1 umfaßt

Die Nucleotidsequenz, die für das Protein VP1 codiert, ist in das virale Genom eingebaut, und folglich auch in das von pPV1-958 getragene Insert der beiden PstI-Schnittstellen, die 237 Nucleotide strangaufwärts (Position 2243) bzw. 32 Nucleotide strangabwärts (Position 3417) gelben sind, gerechnet vom ersten bzw. vom letzten Nucleotid dieser Sequenz (vgl. auch die Restriktionskarte in der oben genannten Veröffentlichung sowie in Fig. 1 und 2).

Zerschneiden von pPV1-958 (Fig. 6 a) mit dem Restriktionsenzym PstI führt also zu einer Gruppe von Fragmenten, die Langen haben, die 4,36 kb (Körper des Plasmids) bzw. 1,8 kb, 0,43 kb, 1,17 kb bzw. etwa 2,23 kb entsprechen. Das 1,17 kb-Fragment trägt die Nucleotidsequenz, die für das Ende von VP3 und für das gesamte VP1 codiert. Dieses letztgenannte Fragmente beginnt mit der Nucleotidsequenz 5'-G T C C T C A T G T A und endet der Sequenz G T A C A C T G C A-3'. Man trennt die anderen PstI-Fragmente mittels Elektrophorese in Agarosegel ab. Man entnimmt die Gelbande, die die DNA enthält, und man unterwirft sie einer Elektroeiution, um die DNA daraus zu extrahieren. Der Elektroelution folgt eine Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung nach Anfarben des Gels mit Ethidiumbromid. Das so hergestellte Fragment entspricht den Nucleotiden 2243 bis 3417 des Poliovirus. Man insertiert die DNA durch Ligation mit der DNA-Ligase an der PstI- Schnittstelle des Plasmidvektors pBR322, den man vorher mit demselben Enzym linearisiert hatte. Die rekombinanten Plasmide, die man so gebildet hat, wurden in dem Stamm E. coli 1106 kloniert (Selektion der Kolonien, die gegenüber Tetracyclin resistent geworden waren, jedoch nach Transformation durch das Plasmid empfindlich gegenüber Ampicillin geblieben waren).

Die Analyse ihrer DNA durch Kartographie mit Restriktionsenzymen ermöglicht es, die rekombinanten Plasmide zu identifizieren und zu selektionieren, die das Fragment der cDNA des Poliovirus in der Richtung insertiert tragen, die gegenläufig zum Uhrzeigersinn ist, bezogen auf die Karte von pBR322, d. h. in derselben Transkriptionsrichtung wie das Gen der β-Lactamase (Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin). Es muß festgestellt werden, daß die Insertion des Fragments 2243 bis 3417 an der PstI-Schnittstelle von pBR322 die Kontinuität der Nucleotidsequenz unterbricht und so das β-Lactamase-Gen des Vektors inaktiviert. Indessen ermöglicht sie es jedoch nicht, die Expression von Proteinen des Poliovirus sicherzustellen, denn sie hat eine Änderung der Lesephase des Inserts zur Folge.

Man benannte das Plasmid mit diesen Eigenschaften pSW-11 (Fig. 6 b).

Eliminieren der Sequenzen, die für den Teil C am Ende von VP3 codieren: Herausschneiden von VP1

Das Plasmid pSW- 11, das vorstehend beschrieben wurde, enthielt in der Transkriptionsrichtung 5,→3' die Sequenz von VP1, also 237 Nucleotide der cDNA des Poliovirus, die zur Sequenz von VP3 gehören. Diese überschüssigen Nucleotide können auf wenigstens zwei verschiedene Arten abgespalten werden:

a) Durch schonende Behandlung des PstI-Fragments (das vorher von pSW-11 extrahiert worden war: (Fig. 6 c)) mit einer Größe von 1,17 kb mit dem Restriktionsenzym HaeII (partielle Verdauung zum Nucleotid 2467), anschließende Selektion des HaeII- PstI-Fragments von 0,95 kb (Fig. 6d) (Poliovirus-Nucleotide 2467 bis 3417) durch Elektrophorese und Reklonieren dieses Fragments in geeigneten Plasmiden. Man kann die Reklonierung erleichtern, indem man an die Enden des herausgeschnittenen Fragments in an sich bekannter Weise synthetische Adapter ("Linker") ankuppelt, also kurze Nucleotidsequenzen, die eine bestimmte Restriktionsstelle enthalten und durch Synthese erhalten werden, beispielsweise nach der Verfahrensweise, die von R. H. Scheller et al. in "Science 196 (1977), 177 bis 180" beschrieben ist. Der Typ des ausgewählten "Linkers" hängt im wesentlichen von der Schnittstelle des in dem Expressionsvektor verwendeten Restriktionsenzyms ab.

b) Durch Linearisierung des Plasmids pSW-11 durch vollständige Verdauung mit dem Enzym PvuI und eine anschließende exonucleolytische Behandlung mit dem Enzym Bal 31, gegebenenfalls anschließende Zugabe von Adaptoren ("Linker") des synthetischen Typs (Firma Biolabs, Collaborative Research) und Rezirkularisation des Plasmids durch die DNA-Ligase.

Man öffnet also die Moleküle. Man analysiert durch Wanderung in einem Agarosegel unter Elektrophorese ihre Größe, um die Moleküle zu identifizieren, die etwa 700 Basenpaare verloren haben (Verlust, der in Fig. 6e symbolisch durch einen Kreisbogen aus Pünktchen dargestellt ist), d. h. etwa 350 Basenpaare beiderseits der PvuI-Schnittstelle, nämlich das Fragment PvuI-PstI von pBR322 plus die Sequenz von VP3 bis zu VP1 einerseits und in einer ähnlichen Lange von pBR322, die von PvuI bis EcoRI reicht, andererseits.

Auf diese Weise kann man ein Fragment isolieren, dessen eines Ende mit dem Ende der DNA-Sequenz übereinstimmt, die für VP1 codiert oder in jedem Fall diesem Ende sehr nahe ist.

Tatsächlich findet sich in dem Plasmid pSW-11 die PvuI-Schnittstelle 126 Basenpaare (b) von der proximalen PstI-Schnittstelle der Sequenz des Fragments PstI von 1, 17 kb entfernt und 363 Basenpaare vom proximalen Ende des Fragments der cDNA entfernt, die für VP1 codiert.

Nach eventueller Fixierung von "Linkern", die beispielsweise eine BgIII-Schnittstelle enthalten, an den äußeren Enden des selektionierten Fragments mittels einer Ligase selektioniert man die Plasmide, deren Größe 4,8 bis 5 kb beträgt (Fig. 6f). Man bestimmt danach die Plasmide, die die gesamte Sequenz von VP1 erhalten haben, wobei sie die gesamte Sequenz oder quasi die gesamte Sequenz von VP3 verloren haben. Man überprüft dies in dem Fall, indem man einen BglII enthaltenden Linker insertiert hat, indem man die Nucleotidsequenz des Fragments BglII-PstI der selektionierten Plasmide bestimmt. Wenn man die Verfahrensweise von Sanger anwendet, insertiert man die zu sequenzierenden Fragmente in die replikative Form des Phagen M13 und klont die so aufgebauten rekombinanten Phagen. Man verwendet dann deren DNA zur Sequenzierung des insertierten Fragments nach der Verfahrensweise, die von Sanger beschrieben wurde. Man kann die Bestimmung der erhaltenen Nucleotidsequenz auch nach der Verfahrensweise durchführen, die von Maxam und Gilbert beschrieben wurde.

Das durch Zerschneiden des Plasmids pSW-11 erhaltene Plasmid, insbesondere nach der Variante (b) des vorstehend beschriebenen Verfahrens, jedoch ohne Einführung des Linkers BglII, wurde mit pSW-119 bezeichnet.

Die beobachteten Unterschiede zwischen den Plasmiden pSW-11 und pSW-119 (oder pCW- 119) ergeben sich aus dem Schema der Fig. 7. Insbesondere hat das Plasmid pSW-119 den größten Teil des Teils der Sequenz verloren, den das Plasmid pSW-11 noch enthielt und der für das Polypeptid der Struktur VP3 des Poliovirus codiert.

Wie in der französischen Patentanmeldung Nr. 82-02013 angegeben, kann das Plasmid pSW- t19 ein VP1-β-Lactamase-Fusionsprotein in den Stämmen E. coli 1106 oder GC 26 (neben anderen Mikroorganismen, wie sie in der früheren Patentanmeldung Nr. 82-02013 in Betracht gezogen wurden) exprimieren. Dieses Fusionsprotein, das ein Molekulargewicht von 49000 Dalton aufweist, wird spezifisch durch monoklonale Antikörper CD-VP1 (oder C3) immunopräzipitiert.

Ein Derivat von pSW-119, das Plasmid pFS 119 wurde hergestellt, indem man die Sequenzen zwischen den Schnittstellen für BamHI und PstI in pBR322 (Nucleotide 375 bis 3608) durch die entsprechenden Sequenzen von pBR 327 ersetzt. Nach Markierung der Proteine, die durch das Plasmid pFS 119 in GC 26-Bakterien exprimiert werden, mit (³&sup5;s)- Methionin, Immunopräzipitation und Elektrophorese-Analyse auf Polyacrylamidgel war es von neuem möglich, unter den Expressionsprodukten von GC 26 ein Fusionsprotein zu erkennen, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 49000 Dalton (p49) aufweist, das speziell durch C3 immunopräzipitiert wurde.

Man hat in gleicher Weise in Fig. 7 die schematische Struktur des Plasmids pFS-1019 wiedergegeben, das erhalten wurde durch - Verdauung des Plasmids pSW-119 oder pFS-119; - Abtrennung der erhaltenen Fragmente durch Elektrophorese in Agarosegel; - Selektion (nach der Größe der betreffenden Fragmente) der Fragmente, die von pSW-119 oder pCW-119 abgeleitet waren und eine Größe zeigen, die um etwa 315 Basenpaare verlängert ist; das kleine Fragment von 315 Basenpaaren XbaI-XbaI, das in gleicher Weise ausgehend von dem Verdauungsmedium unter denselben Bedingungen erhalten worden war, wurde ebenfalls erhalten; - das erste selektionierte Fragment wurde mittels einer Ligase unter Bildung des Plasmids pFS 1019 rezirkularisiert; nach Einbau dieses Plasmids in E. coli 1106 führte dieses zum Erhalt eines verstümmelten Fusionsproteins von 39000 Dalton, das nicht mehr durch den monoklonalen Antikörper CD-VP1 oder C3 erkannt wird.

Im Gegensatz dazu führt das kleine Endfragment XbaI von 315 Nucleotiden dann, wenn es in Phase in ein Gen wieder eingeführt wird, das von einem geeigneten Plasmid getragen wird, zu einem modifizierten Plasmid, das E. coli 1106 transformieren kann, um dieses in die Lage zu versetzen, ein Hybridprotein zu exprimieren, das von den monoklonalen Antikörpern C3 erkannt wird. Beispielsweise kann diese erneute Einführung in Phase in das β-Lactamase-Gen von pBR322 bewirkt werden.

Das Einsetzen in adäquater Phase kann dann, wenn es nötig ist, durch die Verfahrensweise bewirkt werden, die in der französischen Patentanmeldung Nr. 78-32041 (eingereicht am 13. November 1978) beschrieben ist.

Die Reinsertion des Fragments XbaI-XbaI, welches auch immer sein Ursprung ist, in das Plasmid pFS 1019 führt erneut zu einem Plasmid, dessen Expressionsprodukte ein Protein enthalten, das von C3 erkannt werden kann. Dies ist insbesondere so gewesen, was das Plasmid pCW 119 angeht, das erhalten wurde durch Reinsertion eines Fragments XbaI-XbaI derselben Größe und Nucleotidstruktur in die XbaI-Schnittstelle von pFS 1019. Das Fragment wurde ausgehend von pPVI-366 isoliert, das in gleicher Weise beschrieben ist in der Patentanmeldung Nr. 81 09 968. Die Nucleotidsequenz des Fragments XbaI-XbaI (315 Nucleotidpaare) wurde bereits oben angegeben. In gleicher Weise wurde oben angegeben die Peptidsequenz des Peptids Ser 23 - Ser 128.

In Fig. 9 ist ein Schema des Plasmids pCW 119 wiedergegeben, in dem die Sequenz, die für das Protein VP1 codiert, wiedergegeben ist durch eine schraffierte Zone, die durch zwei Kreisbogen begrenzt ist. Die hauptsächlichen Stellen, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung in Betracht kommen, sind in gleicher Weise in der Fig. 9 angegeben.

Die Bestimmung und der Erhalt der kleineren Peptidsequenzen, die die gesuchte immunogene Stelle (oder ein durch C3 erkanntes Epitop) tragen können, wurden in der folgenden Weise durchgeführt: Das Plasmid pCW 119 wurde einer Verdauung durch das Restriktionsenzym Kpn I unterworfen, das das Plasmid im Bereich der Restriktionsstelle 3064 öffnete (folglich außerhalb des oben angesprochenen Fragments XbaI). Die Durchführung des oben definierten Verfahrens unter Durchlaufen wiederholter Zyklen des Schneidens mit dem Enzym Bal 31 führte zum Verlust aufeinanderfolgender Fragmente an den Enden, die für die oben angegebenen Sequenzen His 65 - Phe 105 und Asp 93 - Leu 104 codieren. Die von den linearisierten Plasmiden ausgehende Streichung von Fragmenten, die die Sequenzen enthalten, die für die vorstehend erwähnten Peptidsequenzen codieren, tritt bei dem Plasmid im Anschluß an dessen Rezirkularisierung (mittels T4-ADN-Ligase) durch den Verlust seiner Fähigkeit zutage, die Produktion von Peptidsequenzen bei den Bakterien, die mit diesem Plasmid transformiert sind, zu induzieren, die durch monoklonale Antikörper CD-PVI oder C3 erkannt werden können.

Mit dem Ziel, mit noch mehr Präzision das durch C3 erkannte Epitop zu lokalisieren, wurde eine Reihe von Plasmiden hergestellt, die von pCW 119 abgeleitet sind und mehr oder weniger ausgedehnte Streichungen dieser Sequenz umfassen. Die relativen Positionen der gestrichenen Fragmente im Hinblick auf die XbaI-Schnittstellen (2546) und (2861) sind schematisch durch die Kreisbögen dargestellt, die in Fig. 9 gezeigt sind. Die Grenzen dieser Streichungen nach links wurden bestimmt durch Linearisierung der Plasmide (auf der Grundlage von 1 ug DNA) mit XbaI und durch Markierung mit dem Klenow-Enzym für die Zeit von 1 h bei 15ºC in Gegenwart von [α³²P]-dATP (10 uCi) und von dGTP, dCTP und dTTP (auf der Grundlage von 0,2 mM jedes dieser letztgenannten Komponenten). Die markierte DNA wurde danach mit den nachfolgend angegebenen Restriktionsenzymen digeriert (Bedingungen der partiellen Verdauung, wenn man auf AluI zurückgegriffen hat).

Die markierten Fragmente der Restriktion wurden dann auf einem Polyacrylamidgel bei 5% abgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Grenzen der Streichungen nach rechts wurden abgeleitet von der Größe der gestrichenen Fragmente. Dies wurde bestätigt durch die Gegenwart oder die Abwesenheit von Restriktionsstellen für die Enzyme, die im oberen Teil von Fig. 10 angegeben sind. Die in dieser Tabelle verwendeten Symbole hatten die folgende Bedeutung:

X = XbaI; H = HhaI; A = AluI; S = Sau3A; K = KpnI; P = PstI

Die angegebenen Zahlen entsprechen den Positionen der entsprechenden Nucleotide im Hinblick auf die Fig. 8.

Die von den Plasmiden pCW 217, pCW 213, pCW 215 und pCW 202 exprimierten verstümmelten Fusionsproteine reagieren noch mit dem neutralisierenden monoklonalen Antikörper C3. Dafür werden die von den Plasmiden pCW 216, pCW 203, pCW 218 und pCW 223 exprimierten verstümmelten Fusionsproteine nicht mehr von dem Antikörper C3 erkannt. Die Feinkartographie mit Restriktionsenzymen hat es ermöglicht, zu bestimmen, daß die größte Streichung, die nicht die Reaktivität des verstümmelten Proteins gegenüber C3 beeinträchtigt (pCW 215), sich genau bis zum Nucleotid 2792 (Leu&sub1;&sub0;&sub4;) erstreckt und daß die kleinste Streichung, die in einem Verlust der Reaktivität des Proteins zum Ausdruck kommt, sich genau bis zu den Nucleotiden 2771 bis 2782 (Thr&sub9;&sub8;-Lys&sub1;&sub0;&sub8;) erstreckt.

Folglich kann davon ausgegangen werden, daß das C-terminale Ende der Aminosäuresequenz, die das neutralisierende Epitop ausmacht, das von C3 erkannt wird, lokalisiert ist zwischen den Aminosäuren 95 und 110 und insbesondere zwischen den Aminosäuren 98 und 104 des Proteins VP1. Dieser Bereich entspricht außerdem einer hydrophilen Zone des Proteins.

Insertion der DNA-Sequenzen in einen Expressionsvektor

Die Sequenz XbaI-XbaI umfaßt weder ein Initiationscodon noch ein Terminalcodon. Sie umfaßt darüber hinaus auch weder einen Promotor für ihre Transkription noch ein Erkennungssignal für die Ribosomen (Sequenzen von Shine und Dalgarno; beschrieben in "Girard und Hirth", Virologie Moleculaire, Edition Doin 1980, Seiten 15 bis 46 und 263 bis 264). Um sie zu exprimieren, ist es also erforderlich, sie in Phase in der Mitte der Nucleotidsequenz (und jedenfalls hinter dem AUG-Initiationstriplett) eines klonierten Gens mit ihrem Promotor zu insertieren (alternativ bei einem Gen, dem man sequenzaufwärts einen fremden Promotor zugesetzt hat). Die Verwendung von "Linkern" - wie oben beschrieben - ermöglicht es, die Verwendung mehrerer Typen von verschiedenen Expressionsvektoren nach dem in Betracht kommenden Promotor in Betracht zu ziehen, beispielsweise vom Typ der Vektoren, die nachfolgend beispielhaft genannt werden.

(a) Bakterielle Promotoren

Dies ist insbesondere der Fall bei Plasmiden, die den Bereich Promotor-Operator des Lactose-Operons von E. coli enthalten (Lac-Operon). Dem folgt der 5'-Teil des Gens der β-Galactosidase. Diese Vektoren des Typs pPC (Charnay et al., Nucleic Acid Research 1978, Band V, Seiten 4479 bis 4494) erlauben die Insertion der Sequenz an der EcoRI- Schnittstelle, die 21 Nucleotide hinter dem AUG-Initiationstriplett der β-Galactosidase liegt. Das Protein, das daraus entsteht, umfaßt also für das N-terminale Ende sieben (oder acht) erste Aminosäuren der bakteriellen β-Galactosidase, gefolgt von den Aminosäuren, für die die Sequenz codiert.

(b) Phagenpromotoren

Dies ist insbesondere der Fall bei Plasmiden, die den Promotor-Operator-Bereich des Operons von links (PL) oder des Operons von rechts (PR) des Phagen λ enthält. Diese Vektoren des Typs pKC30 (Rosenberg, Nature 292 (1981), 128) bzw. des Typs pCL47 (Zabeau und Stanley, The EMBO Journal 1982, Band I, Seiten 1217 bis 1224), die von pLK5 (oder pRC5) bzw. von pLG 400 abgeleitet sind, wobei das letztgenannte Plasmid beschrieben ist in "Cell 20 (1980), Seiten 543 bis 553", ermöglichen, die Insertion der Sequenz innerhalb von Nucleotidsequenzen zu bewirken, die für das N-terminale Ende des Produkts des Gens N oder für das N-terminale Ende des Produkts des Gens cro codieren (das am 8. Februar 1982 bei der C.N.C.M. unter der Nummer I-184 hinterlegt wurde). Diese Vektorsysteme werden bei 30ºC in lysogenisierten Bakterien durch einen Phagen λ mit einem wärmeempfindlichen Repressor (cl 857) oder in Gegenwart von Plasmiden propagiert, die Träger desselben Gens (cl 857) sind und für einen wärmeempfindlichen Repressor codieren. Sie bleiben wegen der Gegenwart des Repressors inaktiv, solange die Kultur bei 30ºC gehalten wird. Der Überführung der Kultur auf 42ºC folgt die Aktivierung der Promotoren von λ (PL oder PR), die von dem rekombinanten Plasmid getragen werden, aufgrund der Inaktivierung des Repressors des Gens cl 857.

(c) Virale Promotoren

Dies ist insbesondere der Fall bei der Verwendung des Virus SV40 als Vektor. In diesem Fall verwendet man den reifen viralen Promotor, und man insertiert die Sequenz des Poliovirus ganz oder teilweise an der Stelle des Bereichs, die für die reifen Proteine von SV40 (VP1 oder VP2) codiert. Man stellt so substituierte DNA von SV40 her, in denen die Sequenzen, die für die Capsidproteine dieses Virus codieren durch die Sequenz ersetzt sind, die für das Immunogenpeptid codiert. So führt die Insertion der Sequenz - bei Bedarf über die Vermittlung von geeigneten "Linkern" an der Stelle des reifen Fragments HaeII-PstI von SV40 (Nucleotide von 767 bis 1923) oder eines Teils dieses Fragments - zur Bildung eines Chimären-Gens, das direkt strangabwärts zum N-terminalen Teilstück des Proteins VP2 von SV40 eine Sequenz aufweist, die für ein Immunogenpeptid codiert, das in vivo in Beziehung auf den Poliovirus aktive Antikörper induziert.

Man kann auch in der Weise vorgehen, daß man die Sequenz VP1 des Poliovirus anstelle der Sequenz SV40 zwischen der EcoRI-Schnittstelle (1718) und der BamH1-Schnittstelle (2469) substituiert.

(d) Promotoren von tierischen Viren die von bakteriellen Plasmiden getragen werden

Dies ist der Fall bei Plasmiden, die Promotoren des Gens der Thymidin-Kinase des Herpes- Virus (pAGO), des Gens des HBs-Antigens des Hepatitis B-Virus (pAC-2 oder pAC-14) oder frühreife oder spätreife Gene von Adenovirus 2 usw. tragen. Die Insertion einer Immunogensequenz gemäß der Erfindung nach dem AUG-Triplett des klonierten viralen Gens mit ihrem Promotor ermöglicht es, darin die Expression in der tierischen Zelle (nach Transfektion, Mikroinjektion oder Zell-Protoplasten-Fusion) sicherzustellen.

Die Peptidsequenzen oder "Sequenzen gemäß der Erfindung" sind durch chemische Synthese zugänglich, beispielsweise indem man zurückgreift auf eines der klassischen Verfahren, deren Bedingungen der Durchführung nachfolgend nochmals aufgeführt wird.

Die Synthese von Peptiden in homogener Lösung und in fester Phase ist wohlbekannt. Diesbezüglich kann man Bezug nehmen auf den in homogener Lösung ablaufenden Syntheseweg, der beschrieben ist von Houben-Weyl in dem Werk mit dem Titel "Methoden der Organischen Chemie", Herausgeber E. Wünsch, Band 15 I und II, Thieme-Veriag Stuttgart (1974).

Dieses Syntheseverfahren besteht darin, daß man sukzessive paarweise die aufeinanderfolgenden Aminoacylreste in der erforderlichen Reihenfolge kondensiert oder die Aminoacylreste und Fragmente, die vorher gebildet wurden und bereits mehrere Aminoacylreste in der passenden Reihenfolge enthalten, kondensiert oder daß man mehrere vorher bereits hergestellte Fragmente miteinander kondensiert, wobei es sich versteht, daß man Sorge dafür tragen muß, daß man vorab alle reaktiven Funktionen mit einer Schutzgruppe versieht, die von den Aminoacylresten oder Fragmenten getragen werden, mit Ausnahme der Aminfunktionen auf der einen und der Carboxylfunktionen auf der anderen Seite oder umgekehrt. Diese müssen normalerweise an der Bildung von Peptidbindungen nach Verfahrensweisen, die im Bereich der Synthese von Peptiden wohlbekannt sind, teilnehmen, insbesondere nach Aktivierung der Carboxylfunktion. In einer Variante kann man zurückgreifen auf Kupplungsreaktionen, bei denen klassische Kupplungsreagentien des Typs Carbodiimid eingesetzt werden, beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl-)carbodiimid. Wenn der eingesetzte Aminoacylrest eine zusätzliche Aminfunktion besitzt (z. B. im Fall von Lysin), oder eine weitere Säurefunktion besitzt (z. B. im Fall von Glutaminsäure), werden diese Funktionen mit einer Schutzgruppe versehen, beispielsweise mit Carbobenzoxygruppen oder t-Butyloxycarbonylgruppen, was die Aminfunktionen angeht, oder mit t- Butylestergruppen, was die Carboxylfunktionen angeht. Genauso wird zum Schutz anderer reaktiver Funktion vorgegangen. Beispielsweise kann man dann, wenn die in Betracht kommenden Aminoacylreste eine 5H-Funktion enthalten (z. B. bei Cystein), auf eine Acetamidomethyigruppe oder p-Methoxybenzylgruppe zurückgreifen.

Im Fall der von Aminosäure zu Aminosäure fortschreitenden Synthese beginnt die Synthese vorzugsweise durch Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die dem Aminoacylrest entspricht, der in der gewünschten Sequenz benachbart ist, und so fort von der einen zur nächsten Aminosäure bis zur N-terminaIen Aminosäure.

Nach einer anderen bevorzugten Verfahrensweise gemäß der Erfindung greift man zurück auf das Verfahren, das beschrieben wurde von R. D. Merrifield in dem Aufsatz mit dem Titel "Solid phase peptide synthesis (Festphasen-Peptidsynthese)" (J. Am. Chem. Soc. 45, 2149 bis 2154). Zur Herstellung einer Peptidkette nach dem Merrifield-Verfahren greift man zurück auf ein sehr poröses Polymerharz, auf dem man die erste, C-terminale Aminosäure der Kette fixiert. Diese Aminosäure wird auf dem Harz unter Vermittlung ihrer Carboxylgruppe fixiert, und ihre Aminofunktion wird geschützt, beispielsweise durch eine t- Butyloxycarbonylgruppe.

Wenn die erste, C-terminale Aminosäure so auf dem Harz fixiert ist, beseitigt man die Schutzgruppe von der Aminfunktion, indem man das Harz mit einer Säure wäscht. In dem Fall, in dem die Schutzgruppe der Aminfunktion die t-Butyloxycarbonylgruppe ist, kann diese durch Behandlung des Harzes mit Trifluoressigsäure eliminiert werden.

Man kuppelt dann die zweite Aminosäure, die den zweiten Aminoacylrest der gesuchten Sequenz bereitstellt, ausgehend von dem C-terminalen Aminoacylrest an der von der Schutzgruppe befreiten Aminfunktion der ersten, C-terminalen, auf der Kette befestigten Aminosäure. Vorzugsweise wird die Carboxylfunktion dieser zweiten Aminosäure aktiviert, beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, und die Aminfunktion wird geschützt, beispielsweise mit dem t-Butyloxycarbonylrest.

Man erhält so den ersten Teil der gesuchten Peptidkette, der zwei Aminosäurereste trägt und deren Amin-terminale Funktion geschützt ist. Wie vorstehend erwähnt, befreit man die Aminfunktion von der Schutzgruppe und kann dann mit der Fixierung des dritten Aminoacylrestes fortfahren. Dies geschieht unter Bedingungen, die analog zu denen sind, unter denen das Anhängen der zweiten C-terminalen Aminosäure erfolgte.

Man fixiert so - eine nach der anderen - die Aminosäuren, die die Peptidkette aufbauen sollen, an der jedes Mal vorab von der Schutzgruppe befreiten Aminogruppe des Teils der bereits gebildeten Peptidkette, die an dem Harz befestigt ist.

Wenn die gesamte gewünschte Peptidkette gebildet ist, entfernt man die Schutzgruppen von den verschiedenen Aminosäuren, die die Peptidkette aufbauen, und man entfernt das Peptid von dem Harz, beispielsweise mittels Fluorwasserstoffsäure.

Nachweis der Expression der Imminunogensequenzen gemäß der Erfindung

Die Expression von rekombinanten Plasmiden, die die genannten Immunogensequenzen tragen und sie exprimieren können, d. h. in der Lage sind, die Synthese eines Immunpeptids zu bewirken, wird mit Verfahrensweisen der Immunopräzipitation nachgewiesen, die selbst bekannt sind und vorzugsweise unter Verwendung von Asciten-Flüssigkeiten ablaufen, die monoklonale Antikörper C3 oder Anti-VP1-(α-VP1)-Hasenserum enthalten.

Was die Sequenzen betrifft, die eine kleinere Größe aufweisen und ein immunogenes Epitop oder eine immunogene Determinante tragen, und insbesondere die Sequenzen, die in realtiv leichter Weise durch chemische Synthese zugänglich sind, so ist es im Hinblick darauf, ihren immunogenen Charakter in vivo zu verdeutlichen, wünschenswert, diese kovalent an ein physiologisch annehmbares und nicht toxisches Trägermolekül zu koppeln oder es mit einem derartigen Molekül zu "konjugieren". Als Beispiele von als Träger geeigneten Molekülen oder makromolekularen Trägern, die in den Aufbau der Konjugate gemäß der Erfindung Eingang finden, kann man natürliche Proteine wie beispielsweise das Tetanus-Toxin, Ovalbumin, die Serumalbumine, die Hämocyanine usw. nennen. Als Beispiele synthetischer makromolekularer Träger kann man beispielsweise die Polylysine oder die Poly-(α-alanin-)poly-(L-lysin-)polymere nennen.

Die Literatur erwähnt auch andere Typen makromolekularer Träger, die verwendet werden können und die im allgemeinen ein Molekulargewicht oberhalb von 20000 aufweisen.

Zur Synthese der Konjugate gemäß der Erfindung kann man auf Verfahrensweisen zurückgreifen, die als solche bekannt sind, beispielsweise das Verfahren, das beschrieben wurde von Frantz und Robertson in "Infect. and Immunity 33 (1981), 193 bis 198" oder auf das Verfahren, das beschrieben wurde von P. E. Kauffman in "Applied and Environmental Microbiology 42, Nr. 4 (Oktober 1981), 611 bis 614", wobei man das Peptid und das geeignete Trägermolekül verwendet.

In der Praxis verwendet man vorteilhafterweise als Kupplungsmittel die folgenden Verbindungen, die genannt werden, ohne daß dies als Beschränkung herangezogen werden soll: Glutaraldehyd, Ethylchlorformiat, wasserlösliche Carbodiimide wie [N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyl-)carbodiimid·HCl], Diisocyanate, Bisdiazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine, Cyanogenbromid, Benzochinon sowie die Kupplungsmittel, die erwähnt sind in "Scand. J. Immunoi. 8 (1978), Seiten 7 bis 23 (Avrameas, Ternynck, Guesdon)".

Man kann auch auf jedes Kupplungsverfahren zurückgreifen, das dazu führt, daß einerseits eine oder mehrere reaktive Funktion(en) des Peptids an der Reaktion teilnehmen und andererseits ein oder mehrere reaktive Funktion(en) der Trägermoleküle teilnehmen.

Vorteilhafterweise handelt es sich um Carboxylfunktionen und Aminfunktionen, die zu einer Kupplungsreaktion in Gegenwart eines Kupplungsmittels des Typs führen, wie sie bei der Synthese von Proteinen verwendet werden, beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl-)carbodiimid, N-Hydroxybenzotriazol usw . . Man kann auch Bezug nehmen auf Glutaraldehyd, insbesondere dann, wenn es sich darum handelt, Aminogruppen miteinander zu verbinden, die von dem Peptid bzw. dem Trägermolekül getragen werden.

Nachfolgend wird als Beispiel die Kupplung des Peptids Asp 93 - Leu 104 an ein Trägermolekül, das aus Hämocyanin (KLH; entsprechend dem englischen Ausdruck "Keyhole limpet hemocyanin") aufgebaut ist, mittels Glutaraldehyd nach dem Verfahren erwähnt, das beschrieben wurde von P. Boquet und Koll. in "Molec. Immunol. 19 (1982), 1541 bis 1549". Die Kupplung wird ausgehend von Mengenverhältnissen von etwa 2 mg Peptid auf 2,25 mg Hämocyanin durchgeführt.

Das erhaltene Konjugat ist durch monoklonale Antikörper C3 immunopräzipitierbar. Diese Immunopräzipitation kann verfolgt werden nach Markieren des Konjugats mit ¹²&sup5;I unter

Verwendung von Chloramin T. Unter der Annahme, daß das Peptid keine Tyrosinreste enthält, erfolgt die Markierung nur auf der Ebene Protein-Träger, und zwar derart, daß die Antigeneigenschaften des Peptids nicht modifiziert werden können.

Die Immunogenität dieser Peptide kann in gleicher Weise verstärkt werden, indem man ihre Oligomerisation bewirkt, beispielsweise in Gegenwart von Glutaraldehyd oder in Gegenwart jedes Mittels, das die Durchführung einer Kupplung unterschiedlicher reaktiver Funktionen erlaubt, die an jedem der Peptidmonomere gebunden sind. Insbesondere betrifft die Erfindung so erhaltene wasserlösliche immunogene Oligomere, die insbesondere 2 bis 10 Monomerbausteine enthalten.

In allgemeiner Weise betrifft die Erfindung alle kleinen "Immunogenpeptide", die weniger als 20 Aminoacylreste enthalten, vorzugsweise weniger als 15 Aminoacylreste. Diese Immunogenpeptide enthalten vorzugsweise die Sequenz Asp 93 - Leu 104, wie sie oben angegeben wurde, oder jede Sequenz, die eine ähnliche Konformationsstruktur aufweist.

Die Erfindung ist natürlich nicht auf die besonderen Peptide beschränkt, die oben in Betracht gezogen wurden.

Wie es für Fachleute auf diesem Gebiet wohlbekannt ist, können bestimmte Aminoacylreste, die in den in Betracht kommenden Sequenzen enthalten sind, gegebenenfalls durch andere Aminoacylreste ersetzt werden, und zwar insoweit, als diese Reste nicht merklich die Konfigurationen der Oberfläche der gebildeten Peptide und ihre Fähigkeit modifizieren, insbesondere nach Kupplung mit dem makromolekularen Träger mit den gegen die Polioviren gerichteten Antikörpern zu reagieren. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise mögliche Substitutionen der Alanylgruppe durch die Glycylgruppe oder umgekehrt, die mögliche Substitution von Isoasparaginsäureresten durch Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste oder Isoglutaminsäurereste, die Substitution von Valingruppen durch Alaningruppen, Leucingruppen oder Glycingruppen, die Substitution von Lysingruppen durch Norleucingruppen oder auch Arginingruppen usw. erwähnen, unter der Maßgabe, daß jedes mal die Fähigkeit der modifizierten Peptide überprüft wird, Antikörper zu induzieren, die den gesamten Poliovirus neutralisieren können oder durch monoklonale Antikörper CD-VP1 erkannt werden können. Es versteht sich natürlich, daß alle diese möglichen Äquivalente in dem Bereich der nachfolgenden Ansprüche fallen.

Eigenschaften der Peptide gemäß der Erfindung

Die Peptide gemäß der Erfindung, und insbesondere die gebildeten konjugierten Peptide, können in vivo die Produktion von Antikörpern gemäß klassischen Verfahrensweisen induzieren. Man kann diese zur Reaktion mit den Antipoliovirus-Antikörpern bringen. Sie induzieren die Synthese von Antipoliovirus-Antikörpern, wenn sie in ein Tier inokuliert werden.

Außerdem kann man die Peptide als Reagentien für die Diagnostik und die Titration von Antipoliomyelitis-Antikörpern verwenden. Bei ihrer Verwendung als Reagentien für ein Diagnoseverfahren kann man auf klassische Verfahrensweisen zurückgreifen, beispielsweise auf die ELISA-Technik. Nachfolgend wird das Prinzip einer derartigen Verfahrensweise in Erinnerung gerufen. Es umfaßt beispielsweise die folgenden Schritte: - Einfüllen bestimmter Mengen des Peptids gemäß der Erfindung in die Vertiefungen einer Mikroplatte des Typs, wie er zur Durchführung des ELISA-Verfahrens verwendet wird; - Zugabe von zunehmenden Verdünnungen des Serums, das gegebenenfalls die nachzuweisenden Antikörper enthält, zur Dosierung in die Vertiefungen der Mikroplatte; - Inkubation und Unterbrechung der Reaktion, beispielsweise durch Zugabe einer Schwefelsäurelösung; - intensives Waschen der Mikroplatte mit einem geeigneten Puffer; - Zugabe von markierten Antikörpern, die gegen die ersten Antikörper gerichtet sind, wobei die Markierung mittels eines Enzyms erfolgt, das ein Substrat hydrolysieren kann, das unter den Substraten gewählt ist, für die sich diese Hydrolyse durch eine Veränderung der Absorption für eine Strahlung einer gegebenen Wellenlänge bemerkbar macht; - Messung der Veränderung der Absorption; und - Nachweis - vorzugsweise gegenüber ähnlichen Meßergebnissen, die an einer Vergleichsprobe durchgeführt wurden - des Gehalts an Antikörpern im untersuchten Serum.

Die DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung können selbst als Sonden der Hybridisierung verwendet werden, die den Nachweis der Präsenz von viraler RNA oder entsprechender cDNA in einer biologischen Probe erlaubt. Dieses Verfahren schließt folglich die vorangehende Extruktion der RNA oder DNA der biologischen Probe und ihr In-Kontakt- Bringen unter Bedingungen ein, die die Hybridisierung mit der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung erlauben, die mit einem radioaktiven Tracer oder mit einem Enzym markiert ist, insbesondere vom Typ der Verbindungen, die geeignet sind, ein Substrat des oben angegebenen Typs zu hydrolysieren.

Die Erfindung betrifft natürlich alle äquivalenten DNA-Sequenzen, die zu Expressionsprodukten führen, die mit äquivalenten immunologischen Eigenschaften insofern ausgestattet sind, als die durch die Antikörper, die durch die Expressionsprodukte dieser äquivalenten Sequenzen induziert werden, selbst mit den Expressionsprodukten der DNA-Fragmente reagieren können, die ganz speziell beschrieben wurden, und umgekehrt. Insbesondere erstreckt sich die Erfindung auf DNA-Sequenzen, die sich von denen unterscheiden können, die bereits oben ganz besonders beschrieben wurden, und zwar durch Streichungen, Zusätze oder Substitutionen von Nukleinsäuren, insoweit, als die immunologischen Eigenschaften dieser Expressionsprodukte äquivalent sind.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erhalt eines Immunogenpeptids, wie es oben definiert wurde, das die Schritte umfaßt, die in einer Insertion einer DNA-Sequenz gemäß der Erfindung in einen geeigneten Vektor, in der Transformation eines durch den so modifizierten Vektor transformierbaren Mikroorganismus, der in der Lage ist, die oben genannte Insertionssequenz zu exprimieren, das Zerschneiden der synthetisierten Proteine und die Isolierung der Peptidfraktion, die das Peptid gemäß der Erfindung enthält, bestehen, wobei dieses nachgewiesen werden kann - gegebenenfalls nach Fraktionierung gemäß den Molekulargewichten - durch die Antikörper, die gleichzeitig gegen die "C"-Teilchen und "D"-Teilchen eines selben Poliovirus und gegen das Strukturpolypeptid VP-1 des Capsids dieses Poliovirus aktiv sind.

Die Erfindung betrifft natürlich in gleicher Weise jeden Vektor, der eine Insertionsequenz gemäß der Erfindung enthält, unter Kontrolle eines Promotors, der die Expression dieses Inserts in einem Mikroorganismus ermöglicht, der durch diesen Vektor transformierbar ist.

Letztlich betrifft die Erfindung durch einen derartigen Vektor transformierte Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein Protein zu produzieren, das von den Antikörpern erkannt wird, die gleichzeitig gegen die "C"-Teilchen und "D"-Teilchen desselben Poliovirus und gegen das Strukturpolypeptid VP-1 des Capsids dieses Poliovirus aktiv sind.

Es versteht sich von selbst und ergibt sich darüber hinaus auch aus dem Vorstehenden, daß die Erfindung in keiner Weise auf die Anwendungsarten und Durchführungsarten beschränkt ist, die ganz speziell angesprochen wurden. Sie umfaßt im Gegenteil alle Varianten, insbesondere diejenigen, die in entsprechenden Peptidsequenzen bestehen, die von anderen Stämmen des Poliovirus stammen als dies die Stämme des Typs 1 oder auch die Stämme der Typen 2 oder 3 sind. Beispielsweise sind entsprechende Sequenzen (oder Äquivalente) von DNA zu nennen, die für das Protein VP-1 des Stamms Sabin codieren. Die Peptidsequenz des Stamms Sabin, die der Sequenz His 65 - Ala 106 von VP-1 in dem Stamm Mahoney entspricht, unterscheidet sich von dieser durch unterschiedliche Aminoacylreste in den Positionen, die durch die nachfolgend angegebenen Ziffern wiedergegeben sind:

88 (Ala), 90 (Ile), 95 (Ser), 98 (Lys) und 106 (Thr anstelle von Ala).

Es versteht sich, daß die Peptide, die die verschiedenen Substitutionen von Aminosäuren umfassen, die oben angesprochen wurden, Äquivalente der Peptide darstellen, die spezieller in den Patentansprüchen definiert sind. Diese Peptide sind jedoch als solche gleichfalls durch die Ansprüche geschützt.


Anspruch[de]

1. DNA-Fragment, gekennzeichnet durch eine Nucleotidsequenz, die vollständig oder zum Teil die Peptidsequenz His 65-Phe 105:

codiert, mit der Maßgabe, daß diese auf jeden Fall die Aminosäuresequenz Asp Asn Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu enthält.

2. Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz Asp Asn Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu codiert.

3. Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Formel:

ganz oder teilweise enthält, wobei dieses Polypeptid auf jeden Fall die Sequenz Asp Asn Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu enthält.

4. Polypeptid nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz der Formel Asp Asn Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu.

5. Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 20 Aminosäurereste enthält.

6. Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 15 Azainosäurereste enthält.

7. Immunogenes Konjugat, das aus der kovalenten Kupplung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 3 bis 6 resultiert.

8. Vektor, der ein Insert enthält, das aus einer RNA-Sequenz besteht, die unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der die Expression dieses Inserts in einem durch diesen Vektor transformierbaren Mikroorganismus gestattet, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz dieses Nucleotidinserts mit derjenigen des Fragmentes nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 übereinstimmt.

9. Wasserlosliches Oligomeres, das insbesondere 2 bis 10 Monomereinheiten enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomereinheit aus einem Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 3 bis 6 definiert, besteht.

10. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wie in einem der Ansprüche 3 bis 6 definiert, welches die Transformation eines Mikroorganismus, der durch den Vektor nach Anspruch 8 transformierbar ist und in welchem das oben genannte Insert unter Kontrolle des entsprechenden Promotors exprimiert werden kann, die Gewinnung der synthetisierten Proteine und die Isolierung der das genannte Peptid enthaltenden Peptidfraktion umfaßt.

11. Reagens für die Diagnose der Anwesenheit von Antipoliomyelitis-Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit, wie einem Serum, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Antigen besteht, das mit diesen Antikörpern reagieren kann, wobei dieses Antigen aus einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 bis 6 oder aus einem Immunogenkonjugat nach Anspruch 7 oder aus einem Immunogenoligomeren nach Anspruch 9 besteht.

12. Sonde für den Nachweis der RNA des Poliomyelitis-Virus, Mutante des Stammes Sabin, oder der entsprechenden cDNA, enthaltend eine Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, sich mit der genannten RNA oder cDNA zu hybridisieren, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sonde ein DNA-Fragment nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 enthält.

13. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 3 bis 6, eines Konjugats nach Anspruch 7 oder eines Oligomeren nach Anspruch 9 zur Herstellung von Impfstoffen gegen die Polioviren.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
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