PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE3886211T2 26.05.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0354978
Titel Gereinigter Guajakolharz und Verfahren zu seiner Herstellung.
Anmelder Dai Nippon Insatsu K.K., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Watanabe, Masanao, Tokyo-To, JP;
Kuroda, Kohji, Chofu-Shi, Tokyo-To, JP;
Fujita, Yoshiko, Benten-Machi, Shinjuku-ku, Tokyo-To, JP
Vertreter Zimmermann, H., Dipl.-Ing.; Graf von Wengersky, A., Dipl.-Ing.; Kraus, J., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Busch, T., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 80331 München
DE-Aktenzeichen 3886211
Vertragsstaaten BE, DE, FR, IT, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 08.09.1988
EP-Aktenzeichen 883082836
EP-Offenlegungsdatum 21.02.1990
EP date of grant 08.12.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.05.1994
IPC-Hauptklasse C09F 1/02

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes Guajakharz, das zur Verwendung als auf Oxidation ansprechender (oxidierbarer) Farbindikator eines Diagnosemittel zum Nachweis von Glukose und okkultem Blut in Körperfluids geeignet ist, und auch ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Um Diabetes in einem frühen Stadium festzustellen, zu diagnostizieren und zu kontrollieren, ist wesentlich, eine Glukosemenge in einem Körperfluid, wie Harn, Blut oder Lymphe, rasch und einfach nachzuweisen.

Die übliche Praxis zum Nachweis von Glukose in Körperflüssigkeiten, und insbesondere Harn, nach dem Stand der Technik besteht darin, einen Teststreifen zu verwenden, bei dem Filterpapier mit einem Glukosenachweisreagens imprägniert wird, um einen Grad an Farbentwicklung eines oxidierbaren Farbindikators zu beurteilen oder einen Testkörper, bei dem die Reagenszusammensetzung auf ein Substrat aufgetragen wird. Diese Teststreifen oder -körper sind vom Standpunkt der Anwendung betrachtet insofern vorteilhaft, als der Testvorgang einfach ist und die Beurteilung innerhalb kurzer Zeit erfolgen kann. In der US-PS-2,981,606 wird die Verwendung von o-Tolidin, Guajakharz und o-Phenylendiamin als oxidierbarer Farbindikator von Diagnosemitteln beschrieben, die verwendet werden, um Glukose und okkultes Blut in Körperfluids nachzuweisen. Da Benzidinverbindungen hohe Nachweisempfindlichkeit aufweisen, ist bisher vorwiegend o-Tolidin verwendet worden. Obwohl o-Tolidin hohe Empfindlichkeit aufweist, neigt es dazu, sich während der Lagerung zu verfärben oder weniger empfindlich zu werden, und eine durch die Farbreaktion gebildete blaue Substanz ist instabil, so daß die Zeit zur genauen Ablesung kurz wird, was präzise Beurteilung bei praktischen Anwendungen unmöglich macht. Daher besteht der Wunsch, diesen Nachteil zu überwinden. Das üblicherweise als weiterer oxidierbarer Farbindikator verwendete Guajak- oder Guajakumharz ist ein natürliches Produkt und wird aus dem Kernholz des Guajakbaumes, einer tropischen Pflanze, gewonnen. Demgemäß enthält das Guajak neben den für Färbung oder Farbentwicklung wirksamen Bestandteilen eine Vielzahl von Verunreinigungen, z. B. alpha-Guajakonsäure, beta-Guajakonsäure, Guajaretinsäure, Guajaksäure, Resen, Gummiharze und ätherische Öle und ähnliches, wie nach dem Stand der Technik bekannt. Außerdem sind die Zusammensetzungen aus den Wirkbestandteilen und den Verunreinigungen nicht immer konstant, was schwierig macht, stabile Eigenschaften wie Empfindlichkeit und Gleichmäßigkeit bei der Farbreaktion zu gewährleisten. Es sind mehrere Verfahren zur Reinigung des Guajakharzes vorgeschlagen worden. Beispielsweise ist ein Verfahren bekannt, bei dem, wenn das Guajak der Lösungsmittelextraktion der Reihe nach mit Petroläther, einem Äther und einem Alkohol unterworfen wird, in der ätherextrahierten Fraktion ein Bestandteil vorhanden ist, der fähig ist, in Gegenwart einer Peroxidase und von Wasserstoffperoxid eine Blaufärbung zu entwickeln; und durch Isolieren der Fraktion durch Dünnschichtchromatographie werden drei Hauptbestandteile analytisch erhalten [(H.Auterhoff et al., "Arch.Pharmaz." 299, S.618-626 (1966) und 302, S. 545-554 (1969)]. Die US-PS-4,297,271 sagt, daß einer der obigen Bestandteile bei der Dünnschichtchromatographie (Toluol/Dioxan/Eisessig 90 : 25 : 10) einen Rf-Wert von 0,45 aufweist und durch Säulenchromatographie unter Verwendung von neutralem Silikagel und einer Mischung aus n-Heptan/Essigsäureester in industriellem Maßstab erhalten werden kann. Dies wird beschrieben, um eine Technik nach dem Stand der Technik zu verdeutlichen. Wie in der Patentveröffentlichung beschrieben, handelt es sich bei dem durch die Technik erhaltenen Guajakbestandteil nicht um eine Einzelsubstanz, sondern er wird als eine Mischzusammensetzung erhalten, die nicht-farbentwickelnde Substanzen enthält. Daher wird angenommen, daß das Patent aufgrund der Instabilität der Guajakharzbestandteilzusammensetzung auf die Anwendbarkeit der Zusammensetzung bei einer Bestimmung von okkultem Blut in Fäzes hinweist, bei dem eine einfache Entscheidung getroffen wird, das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von okkultem Blut qualitativ zu ermitteln. Zur Verwendung der Guajakbestandteile als Hochleistungsuntersuchungsmittel für Glukose und okkultes Blut in Körperfluids, die halbquantitative Ermittlung erfordert, sollten die Bestandteile eine hohe Empfindlichkeit aufweisen, die zur Farbentwicklung bei geringen Konzentrationen ausreicht, sowie die Fähigkeit, eine entwickelte Farbdichte schrittweise über einen Bereich von geringer zu hoher Konzentration zu variieren. Anders als im Fall von okkultem Blut in Fäzes muß bei flüssigen Proben wie Körperfluids eine ein Untersuchungsmittel enthaltende Reagensschicht gleichmäßig mit der Probe benetzt werden. Beim in der US-PS-4,297,271 beschriebenen Verfahren ist nicht möglich, Substanzen vom Guajakharz zu entfernen, welche die Benetzungseigenschaften beeinträchtigen, begleitet von wesentlichen Nachteilen bei der Farbschattierung und Instabilität der schlußendlichen Farbdichte, verursacht durch die ungleichmäßige Ablagerung der Probe auf der oder Infiltration in die Reagensschicht.

Darüber hinaus enthält das Guajakharz Bestandteilgruppen, die zur Entwicklung einer Farbe fähig sind, aber bei der Dünnschichtchromatographie Rf-Werte aufweisen, die vom Rf-Wert 0,45 abweichen. Zu diesen Gruppen gehören Bestandteile, die unterschiedliche Farbdichteregionen aufweisen. Um zu bewirken, daß sich quantitativ unterschiedliche Farbdichten über einen großen Konzentrationsbereich entwickeln, ist es notwendig, daß diese Bestandteile enthalten sind. In diesem Zusammenhang sind jedoch gemäß dem im obigen Patent beschriebenen Verfahren Verunreinigungen in großen Mengen enthalten, da Bestandteile mit einem großen Bereich von Rf-Werten von 0,2 bis 0,6 enthalten sind. Daher wird Reinigung im wesentlichen nicht durchgeführt. Zumindest auf industriellem Gebiet ist kein Verfahren zur Gewinnung einer Bestandteilgruppe bekannt, die als oxidierbarer Farbindikator wirksam ist.

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Lösung der obigen Probleme, die im Zusammenhang mit den obigen Farbindikatoren bestehen, und soll ein gereinigtes Guajakharz schaffen, das als oxidierbarer Farbindikator eines Diagnosemittels zum Nachweis von Glukose und okkultem Blut in Körperfluids geeignet ist, da die die Farbentwicklung hemmenden Substanzen daraus entfernt worden sind und es im wesentlichen wirksame Bestandteile enthält. Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung des gereinigten Guajakharzes.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes Guajakharz, das durch Isolierung aus einem natürlichen Guajakharz durch Chromatographie unter Verwendung eines Gels für Umkehrphasenchromatographie als stationäre Phase und eines polaren Lösungsmittels als mobile Phase erhalten wird. Das gereinigte Guajakharz enthält im wesentlichen keine die Farbentwicklung hemmenden Substanzen, welche das Abstoßen einer Probe bewirken, oder Bestandteile, die instabile Farbentwicklung aufweisen, wenn es zur Verwendung als ein Körperfluiduntersuchungsmittel in Filterpapier imprägniert oder auf ein Substrat und der Farbreaktion in Gegenwart einer Peroxidase und von Wasserstoffperoxid unterworfen wird. Außerdem enthält das gereinigte Guajakharz eine Vielzahl von farbentwickelnden Bestandteilen, die fähig sind, über einen weiten Konzentrationsbereich eine Farbe zu entwickeln.

In den Figuren:

ist Fig. 1 eine Ansicht, die ein Eluierungsmuster eines durch Säulenchromatographie getrennten rohen Guajakharzes zeigt; und

ist Fig. 2 eine Ansicht, die ein Eluierungsmuster eines rohen Guajakharzes zeigt, das durch die Verwendung eines Chromatographen mit automatischer Sammlung erhalten wird.

Das gereinigte Guajakharz gemäß vorliegender Erfindung wird erhalten, indem ein natürliches Guajakharz Umkehrphasenchromatographie unterworfen wird, wobei ein Gel-Festbett und ein anfängliches Entwicklungslösungsmittel mit einer höheren Polarität als ein Lösungsmittel aus Wasser und Methanol in einem Volumsmischungsverhältnis von 1 : 9 verwendet wird, um eine nicht-farbentwickelnde Bestandteilgruppe, die wasserabstoßende Bestandteile enthält, und eine instabile farbentwickelnde Bestandteilgruppe zu entwickeln und aus dem Guajakharz zu eliminieren, die resultierende Lösung aus einer hydrophilen farbentwickelnden Bestandteilgruppe gesammelt wird und das Lösungsmittel aus der Lösung entfernt wird.

Wenn das natürliche Guajakharz nach dem obigen Verfahren isoliert wird, werden vier Bestandteilgruppen isoliert. Die erste Bestandteilgruppe enthält eine kleine Menge an Farbentwicklungsbestandteilen, die so klein sind, daß sie bei praktischen Anwendungen nicht verwendet werden, und enthält auch wasserabstoßende Bestandteile. Obwohl es seltsam erscheinen mag, daß die erste Bestandteilgruppe wasserabstoßende Substanzen enthält, ist das folgendermaßen zu sehen: für die Herstellung eines Teststreifens bzw. -körpers adsorbieren die Substanzen so auf dem polarem Träger der Testkörper, daß die hydrophoben Gruppen so orientiert sind, daß sie nach außen gerichtet sind.

Die zweite Bestandteilgruppe enthält rötlich purpurfarbene Farbentwicklungsbestandteile, die instabil sind und entfernt werden sollten.

Die dritte Bestandteilgruppe umfaßt eine Vielzahl wirksamer Bestandteile, die zur Entwicklung einer tiefblauen Farbe fähig sind, und ist hydrophil.

Die vierte Bestandteilgruppe umfaßt eine Mischung aus Bestandteilen, die fähig sind, eine Farbe über einen großen Konzentrationsbereich zu entwickeln, und Farbentwicklungsbestandteile mit hoher Empfindlichkeit, wenn auch nicht in relativ hoher Konzentration, enthalten. Diese Gruppe ist hydrophil.

Das gereinigte Guajakharz gemäß vorliegender Erfindung besteht aus der dritten und der vierten Bestandteilgruppe der obigen vier Gruppen. Die vorliegende Erfindung wird detaillierter beschrieben. Bei der Herstellung des gereinigten Guajakharzes wird zuerst ein natürliches Guajakharz in Aceton aufgelöst, dann wird Toluol hinzugefügt, um einen gebildeten Niederschlag zu entfernen. Das resultierende Filtrat wird zur Trockene verdampft, und der Rückstand wird in einem polaren Lösungsmittel aufgelöst, um ein grob gereinigtes Guajakharz zu erhalten. Beispiele für das Gel für den Umkehrphasenchromatographen sind ein alkyliertes Silikagel, das durch die Umsetzung von Silanolgruppen an der Oberfläche von zerteiltem oder kugelförmigem Silikagel mit einem Alkyl- oder Arylchlorsilan erhalten wurde, ein chemisch kombiniertes Silikagel, alkylierte harte Gels auf Polymerbasis und ähnliches. Im spezielleren werden alkylierte Silikagels, wie mit C&sub1;&sub8;, C&sub8;, C&sub2;, C&sub1; und ähnliche erwähnt, chemisch kombinierte Silikagels mit Endgruppen wie -NH&sub2;, -CN, Phenyl und ähnlichem, und alkylierte harte Gels auf Polymerbasis, wie von polymeren C&sub1;&sub8;-Verbindungen. Obwohl die Eluierungszeit je nach der Gelart mehr oder weniger variiert, kommt es kaum zu Unterschieden in der Eluierungsreihenfolge der Bestandteilgruppen, was wirksame Isolierung der Gruppen gewährleistet.

Die gemäß vorliegender Erfindung nützlichen polaren Lösungsmittel werden aus geeigneten Kombinationen aus Äthanol, Methanol, Äthanolamin, Äthylenglykol, Formamid, Wasser, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, 1,3-Dicyanopropan, Diäthyläther, Propylchlorid, Äthylacetat, Proypylamin, Äthylbromid, CHCl&sub3;, Tetryhydrofuran, Methylacetat, Aceton, CH&sub2;Cl&sub2;, 1,2-Dichloräthan, Natriumoktansulfonat, Dioxan, Pyridin, Benzonitril, Nitromethan, Nitrobenzol und ähnlichem ausgewählt.

In manchen Fällen können dem polaren Lösungsmittel bis zu 50% an unpolaren Lösungsmitteln zugegeben werden. Um den pH-Wert zu regulieren, können Essigsäure, Trifluoressigsäure, Natriumoktansulfonat und ähnliches verwendet werden, aber da sie nach dem Eluieren abgetrennt werden sollten, gibt es wenig Gelegenheit, solche Materialien zuzugeben, außer in Fällen, in denen sie koexistierend verwendet werden können.

In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden die stationären und mobilen Phasen, wie zuvor beschrieben, verwendet, um durch Eluieren mit einem anfänglichen Entwicklungslösungsmittel die erste und zweite Bestandteilgruppe abzutrennen, die farbhemmende Bestandteile sind. In der Folge werden hydrophile farbentwickelnde Bestandteilgruppen eluiert, die zur Färbung nützlich sind. Bei dem zur Trennung der Hemmungsbestandteile verwendeten anfänglichen Entwicklungslösungsmittels handelt es sich vorzugsweise um eines, das eine etwas höhere Polarität als Methanol aufweist. Beispiele für eine solches Lösungsmittel sind gemischte Lösungsmittel aus Methanol und Wasser, Natriumoctansulfonat, Essigsäure, Trifluoressigsäure und ähnliche. Das gesamte gemischte Lösungsmittel sollte vorzugsweise eine Polarität aufweisen, die höher als jene einer Lösung aus Methanol und Wasser in einem Volumsmischungsverhältnis von 9 : 1 ist. Das zum Sammeln der dritten und vierten Bestandteilgruppe, die farbentwickelnde Bestandteilgruppen sind, verwendete Entwicklungslösungsmittel ist ein Lösungsmittel, das dem anfänglichen Entwicklungslösungsmittel ähnlich ist. Die dritte Bestandteilgruppe kann durch das anfängliche Entwicklungslösungsmittel als ein Bestandteil mit einer längeren Retentionszeit gesammelt werden. In der Praxis können die dritte und die vierte Bestandteilgruppe durch Verwendung eines Lösungsmittels eluiert werden, dessen Polarität geringer als die des anfänglichen Entwicklungslösungsmittels ist. Die Eluierung mit Methanol alleine oder Äthanol ist wirksam.

Das gemäß vorliegender Erfindung erhaltene gereinigte Guajakharz ist als Farbindikator eines Testpapiers zum Zweck des Nachweises von Glukose oder okkultem Blut in Körperfluids geeignet. Es ist festgestellt worden, daß das für diesen Zweck verwendete Guajakharz nicht nur die dritte und die vierte Bestandteilgruppe enthalten kann, sondern auch Bestandteile mit einer längeren Retentionszeit als eine Fraktion, die ohne jegliche Behinderung eluiert wird, um den obigen Zweck zu erreichen.

Der Körperfluidteststreifen oder -körper kann nach jedem bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise wird eine herkömmliche Glukosenachweiszusammensetzung, die durch das Formulieren eines Farbindikators, einer Glukoseoxidase, einer Peroxidase, eines pH-Puffers, eines wasserlöslichen Bindemittels wie Polyvinylpyrrolidon und, wenn notwendig, eines Befeuchtungsmittels, eines Empfindlichkeitsregulators und eines Stabilisators erhalten wird, in Wasser oder einer Wasser-Alkohol-Mischung aufgelöst, gefolgt vom Imprägnieren eines Filterpapiers mit der Lösung und Trocknen, um ein Testpapier zu erhalten. Wenn das erfindungsgemäße gereinigte Guajakharz auf das Testpapier aufgetragenem wird, wird die Gleichmäßigkeit der Farbentwicklung verbessert.

Alternativ dazu wird eine Glukosenachweisfarbstoffzusammensetzung in einem nichtwässerigen Lösungsmittel, das oben vorgeschlagen wurden hergestellt, indem ein Farbindikator, Glukoseoxidase, eine Peroxidase, ein pH-Puffer, ein Bindemittel und ein wasserabsorbierendes Pulver in einem nichtwässerigen Lösungsmittel aufgelöst oder dispergiert werden. Nach dem Zugeben eines Befeuchtungsmittels, eines Empfindlichkeitsregulators und eines Stabilisators zur Lösung, wenn notwendig, wird die Zusammensetzung auf ein Substrat aufgebracht und getrocknet, um einen Testkörper zum Glukosenachweis zu erhalten. Dieser Körper weist eine bessere Empfindlichkeit und Stabilität als das Testpapier des Typs auf, der durch Imprägnieren von Filterpapier erhalten wird. Jedoch besteht, wenn die erste Bestandteilgruppe in das als Farbindikator verwendete Guajakharz aufgenommen ist, die Tendenz zum Auftreten von Wasserabstoßung, wobei die Möglichkeit zu Ungleichmäßigkeit besteht. Dazu gibt es folgende Überlegungen: wenn das nichtwässerige Lösungsmittel verdampft wird, um im Verlauf der Herstellung den Testkörper zu trocknen, sammelt sich die erste Bestandteilgruppe lokal in der Oberflächenschicht, um Wasserabstoßung zu verleihen. Wenn das erfindungsgemäße gereinigte Guajakharz verwendet wird, das aus der dritten und der vierten Bestandteilgruppe besteht, werden die charakteristischen Merkmale des Guajakharze, wie hohe Empfindlichkeit und gute Farbstabilität, betont. Das Guajakharz ist besonders wirksam als der Körperfluidtestkörper auf nichtwässeriger Lösungsmittelbasis.

Beim Glukosetestpapier reagiert die Glukose in einem Körperfluid mit Sauerstoff in der Luft durch Einwirkung eines Glukoseoxidationsenzyms wie Glukoseoxidase und wird schließlich zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das resultierende Wasserstoffperoxid erzeugt durch die Einwirkung der Peroxidase naszierenden Sauerstoff. Dieser Sauerstoff reagiert sofort mit dem Guajakharz und bewirkt Farbentwicklung des Indikators. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein und die Menge der Glukose im Körperfluid kann in Anbetracht des Ausmaßes der Farbentwicklung halbquantitätiv ermittelt werden. Demgemäß ist es notwendig, daß das Körperfluid es ermöglicht, daß der Testkörper gleichmäßig benetzt wird, so daß eine Farbdichte über einen großen Bereich von geringen bis zu hohen Konzentrationen beurteilt werden kann und daß der Farbton nach der Farbentwicklung stabil gehalten wird. In dieser Hinsicht weist das gereinigte Guajakharz gemäß vorliegender Erfindung gute Empfindlichkeit, einen großen Farbdichtebereich und gute Farbstabilität auf. Das erfindungsgemäße Guajakharz ist nicht nur für den obigen Zweck wirksam, sondern auch zum Nachweis von Wasserstoffperoxid und Substanzen, die fähig sind, aktiven Sauerstoff zu erzeugen. Das Guajakharz kann auf den Gebieten von Testmitteln vielfältig eingesetzt werden, wie beim Nachweis von Reaktionen oder der halbquantiativen Ermittlung in der Koexistenz von Glukoseoxidase für Glukose, Urease für Harnstoff-Stickstoff, Cholesterinoxidase für Cholesterin, Hämoglobin mit der Pseudoperoxidasewirkung für okkultes Blut und ähnliches.

[Beispiele]

Die vorliegende Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, die nicht als die Erfindung einschränkend interpretiert werden sollten.

Beispiel 1

Isolierung von gereinigtem Guajakharz (1):

100 g natürliches Guajakharz wurden in 150 ml Aceton aufgelöst, dann wurde unter Rühren 1,5 l Toluol zugegeben, um den resultierenden Niederschlag (etwa 20 g) durch Filtration durch Absaugen zu entfernen. Das resultierende Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet, um bei dieser Vorbehandlung etwa 70g einer trockenen Substanz zu erhalten. Ein Teil der getrockneten Substanz wurde in einer Mischlösung aus Methanol/Wasser (65 : 35) aufgelöst, was eine Lösung mit 0,5g/l ergab. 20 ul dieser Lösung wurde auf eine Säule gegossen, und dann wurde eine Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (65 : 35) mit einer Rate von 0,5 ml/min bei 40ºC in die Säule mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Höhe von 15 cm gegossen, die mit Octadecylsilan behandeltes Silikagel (C&sub1;&sub8;) enthielt, das zuvor mit einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (65 : 35) äquilibriert worden war. Nach der Bestätigung des Eluierens der ersten und der zweiten Bestandteilgruppe wurde eine Fraktion, die aus einer dritten Bestandteilgruppe bestand, nach einer Retentionszeit von 16 Minuten gesammelt. Nach 32 Minuten wurde die Eluierung erleichtert, indem das Fließbett in Methanol geändert wurde, um eine vierte Bestandteilgruppe bis zu 60 Minuten lang zur Sammlung zu eluieren. Ein Detektor setzte einen UV-Strahl mit 280 nm ein.

Fig. 1 zeigt das Eluierungsmuster eines rohen Guajakharzes, das unter den obigen Bedingungen durch Säulenchromatographie getrennt wurde. Die Ordinate gibt eine Absorption des UV-Strahls bei 280 nm an, und die Abszisse gibt eine Retentionszeit an. In Fig. 1 werden die erste, die zweite, die dritte und die vierte Bestandteilgruppe als voneinander getrennt dargestellt. Nach dem Eluiern der dritten Bestandteilgruppe wurde die mobile Phase in Methanol geändert, und das resultierende Eluat war die vierte Bestandteilgruppe.

Herstellung von gereinigtem Guajakharz (1):

Ebenso wie bei der Isolierung (1) wurde natürliches Guajakharz vorbehandelt, und 2 Liter einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) wurde zu etwa 70 g der resultierenden trockenen Substanz zugegeben.

80 ml der Lösung wurden bei Raumtemperatur in eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einer Höhe von 50 cm gegossen, die mit Octadecylsilan behandeltes Silikagel (C&sub1;&sub8;) enthielt, das mit einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) äquilibriert worden war, gefolgt vom Hindurchschicken einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) mit 100 ml/min. Nach 180 Minuten, als die erste und die zweite Bestandteilgruppe eluiert worden war, wurde Methanol durchfließen gelassen, um eine Fraktion zu eluieren und zu sammeln, bis keine Absorption eines UV-Strahls bei 280 nm von einem Detektor beobachtet wurde. Das Eluierungsmuster wird in Fig. 2 gezeigt. Das resultierende gereinigte Guajakharz wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei der Isolierung (1) entwickelt, woraufhin bestätigt wurde, daß die erste und die zweite Bestandteilgruppe nicht nachgewiesen wurde, sondern das Harz aus der dritten und der vierten Bestandteilgruppe bestand. Die Menge an gesammeltem Harz betrug etwa 0,6 g.

Herstellung von gereinigtem Guajakharz (2):

Natürliches Guajakharz wurde auf die gleiche Art wie bei der Herstellung von gereinigtem Guajakharz (1) vorbehandelt. 2 l einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (11 : 9) wurden zu etwa 70 g der resultierenden trockenen Substanz zugegeben. Diese Lösung wurde zur Sammlung vorbereitend in einen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen gegeben, und 100 ml der Lösung wurden einmal bei Raumtemperatur in eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einer Höhe von 50 cm gegossen, die mit Butyl chemisch kombiniertes Silikagel (C&sub4;) enthielt, das mit einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (11 : 9) äquilibriert worden war, gefolgt vom Hindurchschicken einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (11 : 9) mit 100 ml/Minute zum Abtrennen von Verunreinigungen durch Eluieren. Daraufhin wurden die in der Säule enthaltenden Bestandteile mit Äthanol eluiert. Zum Ermitteln wurde ein UV-Strahl mit 280 nm verwendet. Die mit Äthanol eluierte Fraktion wurde in einem Verdampfer zur Trockene verdampft, um etwa 0,5 g gereinigtes Guajakharz (2) zu erhalten.

Herstellung von gereinigtem-Guajakharz (3):

Natürliches Guajakharz wurde auf die gleiche Art wie bei der Herstellung von gereinigtem Guajakharz (1) vorbehandelt. 2,0 l einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) wurde zu etwa 70 g der resultierenden getrockneten Substanz zugegeben. 100 ml der Lösung wurde einmal bei Raumtemperatur in eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einer Höhe von 50 cm gegossen, die mit Octadecylsilan behandeltes Silikagel (C&sub1;&sub8;) enthielt, das vorbereitend mit einer Mischlösung aus 1,2 mM wässeriger Natriumoctansulfonatlösung/H&sub2;O (6 : 4) äquilibriert worden war, gefolgt

vom Hindurchschicken einer Mischlösung aus 1,2 mM wässeriger Natriumoktansulfonatlösung/H&sub2;O (6 : 4) mit 100 ml/Minute, um Verunreinigung durch Eluieren abzutrennen. Daraufhin wurden in der Säule enthaltende Bestandteile mit Methanol eluiert. Zum Ermitteln wurde ein UV-Strahl mit 289 nm verwendet. Die mit dem Methanol eluierte Fraktion wurde in einem Verdampfer zur Trockene verdampft, um etwa 0,5 g gereinigtes Guajakharz (3) zu erhalten.

Herstellung von gereinigtem Guajakharz (4):

Natürliches Guajakharz wurde auf die gleiche Art wie bei der Herstellung von gereinigtem Guajakharz (1) vorbehandelt. 2,0 l einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) wurde zu etwa 70 g der resultierenden getrockneten Substanz zugegeben. Diese Lösung wurde zum Sammeln in einen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen gegeben, und 100 ml der Lösung wurden einmal bei Raumtemperatur in eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einer Höhe von 50 cm gegossen, die mit Butyl chemisch kombiniertes Silikagel (C&sub1;&sub8;) enthielt, das vorbereitend mit einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) äquilibriert worden war, gefolgt vom Hindurchschicken einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) mit 100 ml/Minute, um Verunreinigungen durch Eluieren abzutrennen. Daraufhin wurden in der Säule enthaltene Bestandteile mit Acetonitril/H&sub2;0 (6 : 4) eluiert. Zum Ermitteln wurde ein UV-Strahl mit 280 nm verwendet. Die mit Acetonitril/H&sub2;O eluierte Fraktion wurde in einem Verdampfer zur Trockene eluiert, um etwa 0,5 g gereinigtes Guajakharz (4) zu erhalten.

Bestätigung von gereinigtem Guajakharz:

Der erste und der zweite Bestandteil und der nach dem Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Guajakharz (1) gesammelte dritte und vierte Bestandteil wurden auf folgende Weise getestet. Die die jeweiligen Bestandteile enthaltenden Gruppen wurden jeweils auf einer aus Silikagel gebildeten Platte (F-254) mit einer Mischlösung aus Toluol/Dioxan/Eisessig (90/25/10) entwickelt, über die eine wässerige Lösung aus Peroxidase-H&sub2;O&sub2; gesprüht wurde. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß von einer Vielzahl von Farbbändern des rohen Guajakharzes in der zweiten Bestandteilgruppe eine Gruppe von Substanzen vorlag, die eine rötlich purpurne Farbe annähmen und sich innerhalb einer kurzen Zeit nach der Färbung entfärbten. Weiters gehörte eine Gruppe von Substanzen, die eine blaue Farbe annähmen und nach der Färbung stabil waren, zur dritten Bestandteilgruppe. Eine Gruppe von Substanzen mit einer etwas geringeren Farbdichte, die aber fähig waren, in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen eine Farbe zu entwickeln, gehörte zur vierten Bestandteilgruppe. Es wurde bestätigt, daß die erste Bestandteilgruppe nur geringe Mengen an farbentwickelnden Substanzen enthielt. Was die dritte und die vierte Bestandteilgruppe betraf, waren die unter dem UV-Licht beobachteten Bänder im wesentlichen mit Farbbändern deckungsgleich.

Destilliertes Wasser wurde mit 2 ml einer 10%igen wäßrigen H&sub2;O&sub2;-Lösung, 4 ml Äthanol und 50 mg Meerrettichperoxidase beaufschlagt, um 9,9 ml einer Lösung herzustellen. Der Lösung wurde 0,1 ml einer Lösung aus 2 mg des gereinigten Guajakharzes (1) in 20 ml Äthanol zugegeben. 30 Sekunden nach dem raschen Mischen der Lösungen wurde die gemischte Lösung der Messung des Lichtdurchlaßgrades bei 600 nm in einer 1 cm-Küvette unterworfen, um eine spezifische Absorption E1%1cm von 300 zu erhalten.

Bezugsbeispiel 1 Herstellung von durch herkömmliche Phase gereinigtem Guajakharz:

100 g natürliches Guajakharz wurden in 150 ml Aceton aufgelöst, dann wurden 1,5 l Toluol unter Rührung zugegeben, um den resultierenden Niederschlag (etwa 20 g) durch Saugen abzufiltrieren. Das resultierende Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet, um bei dieser Vorbehandlung etwa 70 g einer getrockneten Substanz zu erhalten.

500 ml einer Mischlösung aus n-Heptan/Essigsäureester (2 : 5) wurde unter Erwärmung der getrockneten Substanz zugegeben. 100 ml der Lösung wurde einer Silikagelsäule (Durchmesser 8 cm, Höhe 70 cm) zugegeben, die mit einer Mischlösung aus n-Heptan/Essigsäureester (2 : 5) vorbereitend äquilibriert worden war, gefolgt von Trennung durch Eluieren mit einer Mischlösung aus n-Heptan/Essigsäureester (2 : 5). 100 ml der Lösung wurde für jede Eluierung verwendet. Die jeweiligen Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie überprüft, um gewünschte Fraktionen zu sammeln, gefolgt von Einengung auf 100 ml. Das Konzentrat wurde zur Umkristallisation mit 2 ml n-Hexan gemischt, um etwa 3,5 g gereinigtes Guajakharz zu erhalten.

Bestätigung von durch normale Phase gereinigtem Guajakharz:

Das so erhaltene gereinigte Guajakharz wurde auf einer aus Silikagel gebildeten Platte mit einer Mischlösung aus Toluol/Dioxan/Eisessig (90 : 25 : 10) entwickelt, woraufhin eine wässerige Lösung aus Peroxidase-H&sub2;O&sub2; aufgesprüht wurde, um das Entwickeln einer blauen Farbe zu bewirken, wobei ein Rf-Wert von 0,45 erhalten wurde.

Isolierung eines ersten Bestandteils in gereinigtem Guajakharz:

3 g durch normale Phase gereinigtes Guajakharz wurden zu 100 ml einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) zugegeben und darin aufgelöst. Die Lösung wurde zur Sammlung in einen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen gegeben und bei Raumtemperatur in eine mit Octadexylsilan behandelte Silikagel(C&sub1;&sub8;)-Säule gegossen, die mit einer Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) äquilibriert worden war und einen Durchmesser von 5 cm und eine Höhe von 50 cm aufwies. Daraufhin wurde eine Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/Minute hindurchgeschickt, um Verunreinigungen durch Eluieren abzutrennen, gefolgt von Eluieren eines Bestandteils, der in der Säule festgehalten wurde, mit Methanol. Als Detektor wurde ein UV-Strahl mit 280 nm verwendet.

Die mit der Mischlösung aus Methanol/H&sub2;O (6 : 4) eluierte Fraktion mit einer kurzen Retentionszeit (0-80 Minuten) wurde in einem Verdampfer zur Trockene verdampft, um etwa 1,0 g des ersten Bestandteils in einem durch normale Phase gereinigten Guajakharz zu erhalten. Es wurde bestätigt, daß, wenn das durch normale Phase gereinigte Guajakharz nach dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren isoliert wurde, die zweite Bestandteilgruppe (Retentionszeit: 80-160 Minuten) aus dem mit Methanol eluierten gereinigten Guajakharz entfernt wurde.

Beispiel 2 Herstellung und Bewertung der Leistung von Testkörpern zum Nachweis von Glukose (1):

Das in Beispiel 1 erhaltene durch Umkehrphase gereinigte Guajakharz und das in Bezugsbeispiel 1 erhaltene durch Normalphase gereinigte Guajakharz und die in Bezugsbeispiel 1 erhaltene erste Bestandteilgruppe davon alleine wurden mit einem Farbstoff in nachstehend angegebenen Mengen gemischt, wodurch ein Testkörper zum Nachweis von Glukose hergestellt wurde. Es ist festzustellen, daß die gereinigten Guajakharze von Beispiel 1, was die Leistung betrifft, geringe Unterschiede aufweisen, und lediglich als durch Umkehrphase gereinigtes Guajakharz bezeichnet werden.

Tabelle 1 Mischungsverhältnis

Erfindungsgemäßes durch Umkehrphase gereinigtes 4,8 Gew.-Teile

Produkt Guajakharz (1)

Kontrolle A rohes Guajakharz 4,8 Gew.-Teile

Kontrole B durch Normalphase gereinigtes Guajakharz 4,8 Gew.-Teile

Kontrolle C durch Umkehrphase gereinigtes 4,8 Gew.-Teile Guajakharz und erste Bestandteilgruppe 4,8 Gew.-Teile

Die in Tabelle 1 angegebenen Guajakharze wurden verwendet, und eine Farbstoffzusammensetzung der folgenden Formulierung zum Nachweis von Glukose wurde mit einem Homomischer fein dispergiert, gefolgt von Drucken auf einer 300 um dicken weißen Polystyrolbahn durch Siebdruck in Form eines Quadrats mit einer Seitenlänge von jeweils 5 mm. Die verwendete Siebplatte hatte eine Gesamtdicke von 80 Mesh Resist und ein Siebgewebe mit 130 um.

Farbstoffzusammensetzung zum Nachweis von Glukose:

Glukoseoxidase (Qualität II, erhältlich von Toyobo) 3,6 Gew.-Teile

Peroxidase (Qualität III, erhältlich von Toyobo) 2,4 Gew.-Teile

Guajakharz vorherbestimmte Mengen (in Tabelle 1 angeführt)

Sorbitanmonolaurat (Span 20, erhältlich von Kao Co., Ltd.) 7,2 Gew.-Teile

L-Ascorbylstearat 0,48 Gew.-Teile

Zitronensäure 2,8 Gew.-Teile

Natriumzitrat 11,0 Gew.-Teile

Polyvinylpyrrolidon (Kolidon 90, von BASF) 12,6 Gew.-Teile

Polyvinylbutyral (Eslek BX-1, von Sekisui Chem. Co., Ltd.) 2,25 Gew.-Teile

Feinzellulosepulver (Avicel TG-D, von Asahi Chem.Co.,Ltd.) 171 Gew.-Teile

n-Amylalkohol 228 Gew.-Teile

Butylzellosolveacetat 33,5 Gew.-Teile

Der resultierende Druck wurde 40 Minuten lang bei 60ºC getrocknet, danach wurde in der Form eines Stabs geschnitten, um einen Testkörper zum Nachweis von Glukose zu erhalten.

Leistungstest (1):

Die Testkörper, bei denen das erfindungsgemäße Produkt und die Kontrollen A, B, C und D verwendet wurden, wurden in Proben aus normalem Harn und aus normalem Harn getaucht, in dem 25 mg/dl, 50 mg/dl, 100 mg/dl, 250 mg/dl und 500 mg/dl beta-D-Glukose gelöst waren, und sofort aus den Proben entfernt. Für jeden Körper wurden die zur Färbung erforderliche Zeit und ein Farbton am Untersuchungsabschnitt geprüft. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2
Glukosekonzentration Normaler Harn Erfindungsgemäßes Produkt sec. Kontrolle (Farbdichte +n/Zeit vor der Färbung)

Der Farbton in der Tabelle wurde durch Vergleich mit einer Farbtabelle unter einer Normlichtquelle ermittelt. Das erfindungsgemäße Guajakharz hat eine bessere Empfindlichkeit und Färbungsgeschwindigkeit als das rohe Guajakharz und die nach dem bekannten Verfahren gereinigten Guajakharze.

Es wurde festgestellt, daß die erste Bestandteilgruppe, die nach dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren entfernt werden konnte, die Empfindlichkeit des Testkörpers in einem beträchtlichen Ausmaß verringerte.

Nachdem die Testkörper in einem Glasbehälter abgedichtet und 12 Monate lang bei 40ºC gelagert worden waren, wurden sie auf die gleiche Art wie oben beschrieben getestet. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der erfindungsgemäße Gegenstand und die Kontrollen B, C und D ähnlichen jenen vor der Lagerung gleichmäßig, klar und stabil waren und Glukose in Proben auf die gleiche Art wie vor der Lagerung ermitteln konnten. Jedoch wurde, wenn die Kontrolle A auf ähnliche Art getestet wurde, die Gleichmäßigkeit und Klarheit der Färbung im Testreagensabschnitt um Vergleich mit jener vor der Lagerung schlechter. Es war schwierig, eine Glukosekonzentration in Proben zu ermitteln. Dadurch wurde bestätigt, daß die zweite Bestandteilgruppe ein instabiler Bestandteil war.

Leistungstest (2):

Die Testkörper zum Nachweis von Glukose, bei denen das erfindungsgemäße Produkt und die Kontrollen A, B, C und D verwendet wurde, wurden jeweils in eine wässerige Lösung getaucht, in der 500 mg/dl beta-D-Glukose gelöst waren, und sofort herausgezogen, gefolgt von Stehenlassen für eine Minute, um das Auftreten einer Farbschattierung in einem solchen Ausmaß von nicht weniger als 10% des untersuchten Abschnitts zu prüfen. 100 Stäbe wurden der Messung einer Rate des Auftretens der Farbschattierung unterworfen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 3 gezeigt werden.

Tabelle 3
Erfindungsgemäßes Produkt Kontrolle Häufigkeit des Auftretens von Farbschattierung

Davon ausgehend, wurde festgestellt, daß das Entfernen der ersten Bestandteilgruppe und das Sammeln der Farbbestandteile gute gleichmäßige Merkmale gewährleistete.

Beispiel 3 Herstellung und Bewertung der Leistung von Testkörpern zum Nachweis von Glukose:

Testkörper des Filterimprägnierungstyps, welche das in Beispiel 1 erhaltene durch Umkehrphase gereinigte Guajakharz enthielten, wurden auf folgende Art hergestellt.

Ein Filterpapier (Nr. 526, von Toyo Filter Paper Co., Ltd.) wurde mit einer Lösung der folgenden Formulierung imprägniert und bei 60ºC getrocknet:

Glukoseoxidase (Qualität II, erhältlich von Toyobo Ltd.) 0,72 Gew.-Teile

Peroxidase (Qualität III, von Toyobo Ltd.) 0,48 Gew.-Teile

durch Umkehrphase gereinigtes Guajakharz 0,96 Gew.-Teile

Sorbitanmonlaurat (Span 20,von Kao Co., Ltd.) 1,44 Gew.-Teile

L-Ascorbylstearat 0,10 Gew.-Teile

Zitronensäure 0,56 Gew.-Teile

Natriumzitrat 2,20 Gew.-Teile

Polyvinylpyrrolidon (Kolidon 90, von BASF) 1,26 Gew.-Teile

Äthanol 30,0 Gew.-Teile

Wasser 70,0 Gew.-Teile

Der getrocknete Filter wurde in Stücke mit 5 mm im Quadrat geschnitten und mit einem doppelseitig beschichteten Klebeband an eine 300 um dicke weiße Polystyrolbahn gebunden, gefolgt vom Schneiden in einen Stab, um einen Testkörper zum Bestimmen von Glukose zu erhalten. Normaler Harn und normaler Harn, in dem beta-D-Glukose in Konzentrationen von 50 mg/dl, 100 mg/dl, 250 mg/dl, 500 mg/dl und 2.000 mg/dl aufgelöst war, wurden als Proben verwendet, in welche die Stäbe eingetaucht, sofort herausgezogen und 1 Minute lang stehengelassen wurden, um einen Farbton des Testreagensabschnitts zu beobachten. Die Farbe des Testreagensabschnitts war gleichmäßig und klar, und die Farbdichte nahm mit der Zunahme der Glukosekonzentration in der Probe stufenweise zu. So konnte die Glukosekonzentration in der Probe innerhalb des obigen Bereichs klar beurteilt werden. Der gefärbte Testkörper wurde 3 Minuten stehengelassen, ohne daß eine Änderung des Farbtons festgestellt wurde.

Das durch Umkehrphase gereinigte Guajakharz in der Zusammensetzung wurde auf folgende Art variiert, mit dem Ergebnis, daß der Farbton des Untersuchungsabschnitts und die zur Färbung erforderliche Zeit folgende waren:

Tabelle 4
Glukosekonzentration Normal Erfindungsgemäßes Produkt: durch Umkehrphase gereinigtes Guajakharz Kontrolle E: durch Normalphase gereinigtes Guajakharz rohes Guajakharz erste Bestandteilgruppe

Es gab keinen Unterschied in der Empfindlichkeit zwischen den Testkörpern der Kontrollen E und G und jenem des erfindungsgemäßen Produktes. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Empfindlichkeit des Testkörpers der Kontrolle H, der eine große Menge der ersten Bestandteilgruppe enthielt, verringert war. Das erfindungsgemäße Produkt ist im wesentlichen besser, was die Empfindlichkeit der Untersuchung betrifft, als die Kontrollen H und G, weil das erfindungsgemäße Produkt eine bessere Färbungsgeschwindigkeit aufweist als die Kontrollen E und G.

Beispiel 4 Herstellung von Testkörpern zum Bestimmen von okkultem Blut:

Unter den Bestandteilen der folgenden Zusammensetzung zum Bestimmen von okkultem -Blut wurden Cumolhydroperoxid und 6-Methoxychinolin, die als Sensibilisierungsmittel verwendet wurden, unter Verwendung von Gummi arabikum in Mikrokapseln eingeschlossen, und es wurden andere Bestandteile zugegeben, um so eine Zusammensetzung für okkultes Blut zu erhalten. In der Folge wurde die Zusammensetzung durch einen Homomischer gleichmäßig dispergiert und durch Siebdrucken auf eine 300 um dicke weiße Polystyrolbahn gedruckt, um einen Testreagensabschnitt in der Form eines Quadrates mit einer Seitenlänge von 5 mm zu bilden. Nach dem Bedrucken wurde sie bei 60ºC 40 Minuten lang getrocknet. Die Siebdimension einer zum Drucken verwendeten Platte war 80 Mesh, und die Gesamtdicke eines Resists und eines Siebgewebes betrug 130 um. Nach dem Trocknen wurde die Bahn zur Untersuchung in Stabstücke geschnitten.

Zusammensetzung für okkultes Blut:

Cumolhydroperoxid 3,6 Gew.-Teile

6-Methoxychinolin 1,0 Gew.-Teile

(diese beiden verkapselt)

Gummi arabikum 9,4 Gew.-Teile

gereinigtes Guajakharz (Beispiel 1-(1)) 1,5 Gew.-Teile

Zitronensäure 0,56 Gew.-Teile

Natriumzitrat 2,2 Gew.-Teile

Laurylsulfattriäthanolamin 1,62 Gew.-Teile

Polyäthylenglykol 2,52 Gew.-Teile

Polyvinylbutyral (Eslek BX-1, von Sekisui Chem.Co., Ltd.) 3,6 Gew.-Teile

Zellulosefeinpulver Avicel TG-D, von Asahi Chem.Co., Ltd.) 22,4 Gew.-Teile

n-Amylalkohol 39,7 Gew.-Teile

Butylzellosolveacetat 13,0 Gew.-Teile

Es wurden die folgenden vier Proben verwendet:

(1) Normaler Harn

(2) Harn, der 0,06 mg/dl menschliches Hämoglobin (Sigma Co., Ltd.) enthielt

(3) Harn, der 0,15 mg/dl menschliches Hämoglobin (Sigma Co., Ltd.) enthielt

(4) Harn, der 0,75 mg/dl menschliches Hämoglobin (Sigma Co., Ltd.) enthielt

Die Testkörper wurden in die obigen Proben (1) bis (4) eingetaucht und sofort herausgezogen, gefolgt von Stehenlassen für 1 Minute, um die Farbe des Testreagensabschnitts zu prüfen.

Die Farben der Testreagensabschnitte waren gleichmäßig und klar, und die Farbdichte nahm mit einer Zunahme der Konzentration an menschlichem Hämoglobin in den Proben schrittweise zu. Die Konzentration des okkulten Blutes in der Probe konnte innerhalb des obigen Bereichs recht gut beurteilt werden. Die gefärbten Testkörper wurden 5 Minuten lang stehengelassen, woraufhin keine Änderung der Farbe festzustellen war.

Die Testkörper für die Untersuchung wurden in einem Glasbehälter dicht abgeschlossen und 12 Monate lang bei 40ºC konserviert, gefolgt von Testen auf die gleiche Art wie oben beschrieben. Die Farbe des Testreagensabschnitts war gleichmäßig, klar und stabil wie zuvor, und die Konzentration an menschlichem Hämoglobin in den Proben konnten klar beurteilt werden.

Beispiel 5 Herstellung von Testkörpern zum Nachweis von Harnstoff-Stickstoff:

Zum Nachweis von Harnstoff-Stickstoff in Serum wurden Testkörper auf die gleiche Art wie in Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die folgende Farbstoffzusammensetzung zum Nachweis von Harnstoff-Stickstoff anstelle der Farbstoffzusammensetzung zum Nachweis von Glukose verwendet wurde.

Farbstoffzusammensetzung zum Nachweis von Harnstoff-Stickstoff:

Urease (Qualität II, von Toyobo Ltd.) 3,6 Gew.-Teile

Peroxidase (Qualität III; von Toyobo Ltd.) 2,4 Gew.-Teile

Gereinigtes Guajakharz (Beispiel 1-(1)) 4,8 Gew.-Teile

Sorbitanmonolaurat (Span 20,von Kao Co.,Ltd.) 7,2 Gew.-Teile

Zitronensäure 2,0 Gew.-Teile

Natriumzitrat 11,0 Gew.-Teile

Polyvinylpyrrolidon (Kolidon, von BASF) 12,6 Gew.-Teile

Polyvinylbutyral (Eslek BX-1, von Sekisui Chem.Co.Ltd.) 2,25 Gew.-Teile

Zellulosefeinpulver (Avicel, von Asahi Che. Co., Ltd.) 171 Gew.-Teile

n-Amylalkohol 228 Gew.-Teile

Butylzellosolveacetat 33,5 Gew.-Teile

Der resultierende Testkörper wurde in ein Serum eingetaucht, das durch Zentrifugaltrennung von menschlichem Blut erhalten wurde, unmittelbar nach dem Eintauchen herausgezogen und zum Prüfen etwa 1 Minute lang stehengelassen, woraufhin festgestellt wurde, daß die Reagensschicht eine blaue Farbe annahm. Beim Vergleich mit einer Standardfarbvergleichstabelle wurde festgestellt, daß etwa 10 mg/dl Harnstoff-Stickstoff enthalten waren.

Beispiel 6 Herstellung eines Testkörpers zur Gesamtcholesterinbestimmung:

Zur Gesamtcholesterinbestimmung in einem Serum wurde das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Farbstoffzusammensetzung zur Gesamtcholesterinbestimmung anstelle der Farbstoffzusammensetzung zum Nachweis von Glukose verwendet wurde, wodurch ein Testkörper erhalten wurde.

Farbstoffzusammensetzung zur Gesamtcholesterinbestimmung:

Cholesterinesterase (Qualität III, von Toyobo Ltd.) 1,6 Gew.-Teile

Cholesterinoxidase (Qualität III, von Toyobo Ltd.) 1,6 Gew.-Teile

Peroxidase (Qualität III, von Toyobo Ltd.) 2,4 Gew.-Teile

Gereinigtes Guajakharz (Beispiel 1-(1)) 4,8 Gew.-Teile

Sorbitanmonolaurat (Span 20, von Kao Co., Ltd.) 7,2 Gew.-Teile

Mononatriumphosphat 6,0 Gew.-Teile

Dinatriumphosphat 9,0 Gew.-Teile

Polyvinylpyrrolidon (Kolidon 90, von BASF) 12,6 Gew.-Teile

Polyvinylbutyral (Eslek BX-1,von Sekisui Chem. Co. Ltd.) 2,25 Gew.-Teile

Zellulosefeinpulver (Avice), (von Asahi Chem.Co.Ltd.) 171 Gew.-Teile

n-Amylalkohol 228 Gew.-Teile

Butylzellosolveacetat 33,5 Gew.-Teile

Der erhaltene Testkörper wurde in ein Serum getaucht, das durch Zentrifugaltrennung eines beliebigen menschlichen Blutes erhalten worden war, unmittelbar nach dem Eintauchen herausgezogen und etwa 2 Minuten längstehengelassen. Es wurde festgestellt, daß die Reagensschicht eine blaue Färbung annahm, und der Vergleich mit einer Normfarbvergleichstabelle zeigte, daß das Serum einen Gesamtcholesteringehalt von etwa 200 mg/dl enthielt.

Gemäß der Erfindung ermöglicht das Hindurchschicken durch eine Säule, die mit einem Gel zur Umkehrphasenchromatographie bepackt ist, das Isolieren und Eluieren von Verunreinigungen, welche die Farbentwicklung behindern und in natürlichem Guajakharz enthalten sind. Durch das Isolieren und Eluieren von Bestandteilgruppen, die für die Farbentwicklung eines Testkörpers wirksam sind, der zum Nachweis von Glukose oder okkultem Blut in Körperfluids verwendet wird, kann ein gereinigtes Guajakharz erhalten werden, das Bestandteile oder Ingredienzien enthält, die zur Farbentwicklung in einem weiten Bereich von Konzentrationen fähig sind. In der Praxis der Erfindung ist die Trennbarkeit sehr gut, und die Wiederverwendbarkeit der Säule ist mit guter Wirtschaftlichkeit möglich. Testkörper, bei denen das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene gereinigte Guajakharz verwendet wird, um Glukose und okkultes Blut in Körperfluids nachzuweisen, sind im wesentlichen frei von jeglichen Verunreinigungen, welche die Farbentwicklung beeinträchtigen. Somit ist die Färbung im Verlauf der Diagnose klar. Darüber hinaus entwickelt sich, da eine Vielzahl von farbentwickelnden Bestandteilen enthalten ist, die Farbe mit hoher Empfindlichkeit und schrittweise bis zu einer hohen Konzentration. Der Testkörper weist hohe Lagerstabilität auf. Insbesondere wenn ein Testkörper durch Auftragen einer nichtwässerigen Zusammensetzung auf ein Substrat erhalten wird, gewährleistet er gleichmäßige Farbentwicklung und hohe Empfindlichkeit.


Anspruch[de]

1. Gereinigtes Guajakharz, das eine hydrophile farbentwickelnde Bestandteilgruppe enthält, das durch das Vorsehen eines Gels für Umkehrphasenchromatographie als Festbett und Unterwerfen eines natürlichen Guajakharzes der Entwicklung mit einem Lösungsmittel gesammelt wird, das höhere Polarität als ein Lösungsmittel aus Wasser und Methanol in einem Volumsmischungsverhältnis von 1 : 9 aufweist, um anfänglich eluierte nicht-farbentwickelnde Bestandteilgruppe und instabile farbentwickelnde Bestandteilgruppe aus dem genannten natürlichen Guajakharz zu eliminieren.

2. Gereinigtes Guajakharz nach Anspruch 1, worin das genannte gereinigte Guajakharz nach der Umsetzung mit Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase ein spezifisches Absorptionsvermögen E1%1cm, von etwa 300 bei 600 nm aufweist.

3. Körperfluiduntersuchungsgegenstand, der eine auf einem Substrat ausgebildete Untersuchungsreagensschicht umfaßt, wobei die genannte Schicht einen Farbindikator enthält, der aus einem gereinigten Guajakharz besteht, das eine hydrophile farbentwickelnde Bestandteilgruppe umfaßt, das durch das Vorsehen eines Gels für Umkehrphasenchromatographie als Festbett und Unterwerfen eines natürlichen Guajakharzes der Entwicklung mit einem Lösungsmittel gesammelt wird, das höhere Polarität als ein Lösungsmittel aus Wasser und Methanol in einem Volumsmischungsverhältnis von 1 : 9 aufweist, um anfänglich eluierte nicht-farbentwickelnde Bestandteilgruppe und instabile farbentwickelnde Bestandteilgruppe aus dem genannten natürlichen Guajakharz zu eliminieren.

4. Körperfluiduntersuchungsgegenstand nach Anspruch 3, worin die genannte Untersuchungsreagensschicht eine Schicht zur Glukoseuntersuchung ist, die durch das Auflösen oder Dispergieren des genannten Farbindikators, einer Glukoseoxidase, einer Peroxidase, eines pH-Puffers, eines Bindemittels und eines wasserabsorbierenden bzw. -aufnehmenden Pulvers in einem nicht-wässerigen Lösungsmittel erhalten wurde.

5. Körperfluiduntersuchungsgegenstand nach Anspruch 3, worin die genannte Untersuchungsreagensschicht eine Schicht zur Glukoseuntersuchung ist, die durch das Auflösen des genannten Farbindikators, einer Glukoseoxidase, einer Peroxidase, eines pH-Puffers und eines wasserlöslichen Bindemittels in Wasser oder einer Wasser-Alkohol-Lösung, Imprägnieren der resultierenden Lösung in ein Filterpapier und Trocknen des imprägnierten Filterpapiers gebildet ist.

6. Körperfluiduntersuchungsgegenstand nach Anspruch 3, worin die genannte Untersuchungsreagensschicht eine Schicht zur Untersuchung von okkultem Blut ist, die durch das Auflösen oder Dispergieren des genannten Farbindikators, eines organischen Hydroperoxids, eines Sensibilisators, eines pH-Puffers, eines Bindemittels und eines wasserabsorbierenden bzw. -aufnehmenden Pulvers in einem nicht-wässerigen Lösungsmittel erhalten wurde.

7. Körperfluiduntersuchungsgegenstand nach Anspruch 3, worin die genannte Untersuchungsreagensschicht eine Schicht zur Harnstoff-Stickstoff-Untersuchung ist, die durch das Auflösen oder Dispergieren des genannten Farbindikators, einer Urease, einer Peroxidase, eines pH-Puffers, eines Bindemittels und eines wasserabsorbierenden bzw. -aufnehmenden Pulvers in einem nicht-wässerigen Lösungsmittel erhalten wurde.

8. Körperfluiduntersuchungsgegenstand nach Anspruch 3, worin die genannte Untersuchungsreagensschicht eine Schicht zur Gesamtcholesterinuntersuchung ist, die durch das Auflosen oder Dispergieren des genannten Farbindikators, einer Cholesterinoxidase, einer Peroxidase, eines pH-Puffers, eines Bindemittels und eines wasserabsorbierenden bzw. -aufnehmenden Pulvers in einem nicht-wässerigen Lösungsmittel erhalten wurde.

9. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Guajakharzes, welches das Schaffen eines durch Vorbehandlung eines natürlichen Guajakharzes erhaltenen grob gereinigten Guajakharzes, das Unterwerfen des grob gereinigten Guajakharzes der Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer Gel-Festphase zur Entwicklung mit einem anfänglichen Entwicklungslösungsmittel mit höherer Polarität als ein Lösungsmittel aus Wasser und Methanol mit einem Volumsmischungsverhältnis von 1 : 9, um anfänglich eluierte nicht-farbentwickelnde Bestandteilgruppe und instabile farbentwickelnde Bestandteilgruppe aus dem Guajakharz zu entfernen, das Sammeln einer Lösung, die eine hydrophile farbentwickelnde Bestandteilgruppe enthält, und das Entfernen des Lösungsmittels aus der genannten Lösung umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluieren der hydrophilen farbentwickelnden Bestandteilgruppe unter Verwendung eines Lösungsmittels bewirkt wird, das eine geringere Polarität als das anfängliche Entwicklungslösungsmittel aufweist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Eluieren der hydrophilen farbentwickelnden Bestandteilgruppe durch die Verwendung von Methanol bewirkt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Eluieren der hydrophilen farbentwickelnden Bestandteilgruppe durch die Verwendung von Äthanol bewirkt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Eluieren der hydrophilen farbentwickelnden Bestandteilgruppe durch die Verwendung eines Lösungsmittels aus Wasser und Acetonitril in einem Volumsmischungsverhältnis von 4 : 6 bewirkt ward.

14. Gereinigtes Guajakharz, das im wesentlichen keine die Farbentwicklung hemmenden Substanzen enthält, die eine Probe abstoßen würden, oder Bestandteile, die instabile Farbentwicklung zeigen, wenn das gereinigte Harz auf ein Substrat aufgetragen und einer Farbreaktion in Gegenwart von einer Peroxidase und Wasserstoffperoxid unterworfen wird.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com