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Dokumentenidentifikation DE3650152T2 01.06.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0214853
Titel Viskoelastische Kollagenlösung für augenheilkundige Verwendung und Verfahren zur Herstellung.
Anmelder Minnesota Mining and Mfg. Co., Saint Paul, Minn., US
Erfinder DeVore, Dale P., Chelmsford Massachusetts 01824, US;
Scherrer, Robert A. c/o MINNESOTA MINING AND, P.O. Box 33427 St. Paul Minnesota 55133, US;
Scholz, Matthew T. c/o MINNESOTA MINING AND, P.O. Box 33427 St. Paul Minnesota 55133, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 3650152
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 05.09.1986
EP-Aktenzeichen 863068805
EP-Offenlegungsdatum 18.03.1987
EP date of grant 30.11.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.06.1995
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse A61L 27/00   A61L 15/00   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemisch gebundene Kollagenverbindung, die beim Auflösen in einem physiologischen Puffer bei einer Vielzahl von medizinischen Anwendungen, insbesondere in der Augenchirurgie, therapeutisch eingesetzt wird. Insbesondere sind die Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung bei den folgenden Prozeduren verwendbar: a) als ein Anteriorsegment- Implantat zur Erhaltung der vorderen Augenkammertiefe und zum Schutz des Hornhautendothels während der intra- und extrakapsulären Staroperation sowie bei intraokularer Linsenimplantation; b) als ein chirurgischer Zusatz bei Hornhauttransplantationen zum Schutz des Hornhautendothels vor dem Berühren von anderem okularen Gewebe und zum Verhindern von postoperativer Transplantatdislokation; c) als ein Posteriorsegment-Implantat bei intraokularer Linsenimplantation und als ein Zusatz in der Chirurgie der Netzhautablösung; sowie d) als ein Glaskörperersatz. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung der Kollagenverbindung durch entweder sequentiellem oder gleichzeitigen Umsetzen von gereinigtem, nativem mit Pepsin behandeltem Kollagen mit einem amin-reaktiven Kupplungsmittel und einem monofuktionalen amin-reaktiven Modifikationsmittel entweder sequentiell oder gleichzeitig, und zwar in kontrolliert er Weise, um den Kupplungsgrad zu begrenzen.

Ausgangssituation

Natriumhyaluronat-, Kollagengele und Chondroitinsulfatlösungen wurden in der vorderen Augenkammer verwendet, um das Hornhautendothel vor einem intraokularen Linsentrauma zu schützen und die vordere Augenkammertiefe zu bewahren. Zusätzlich wurden Hyaluronat- und Kollagengele als Glaskörperersatz verwenden. Bei derartigen Anwendungen hat sich keines dieser Materialien als ideal erwiesen.

Stenzel et al. ("Collagen Gels: Design for a Vitreous Replacement" (Kollagengele: Aufbau für ein Glaskörperersatz"), Science 164: 1282-1283 (1969)), Dunn et al. ("Collagen-Derived Membrane: Corneal Implantation" (Kollagenderivat-Membran: Hornhaut-Implantation"), Science, 157: 1329-1330 (1967)) und Rubin et al. ("Collagen as a Vehicle for Drug Delivery" ("Kollagen als Träger für die Zuführung von Medikamenten"), J. Clinical Pharmacology, August-September, S. 309-312 (1973)) haben die Verwendung von stabilisierten Kollagenmembranen und Gelen zum Zuführen von Medikamenten, als Glaskörperersatz-Gele und Hornhauttransplantate beschrieben. Die Einführung der Vernetzungen wurde Wärme, ultraviolette Strahlung oder Glutaraldehydreaktion erzielt.

Die US-P-4 409 332 offenbart Membranen und Gele, die sich aus Komplexen von rekonstituiertem Kollagen mit alkalischer Phosphatase zusammensetzten, vernetzt mit Glutaraldehyd, durch UV-Strahlung oder Gammastrahlung. Diese Komplexe sollen als Glaskörperersatz für ophthalmologische Therapie verwendbar sein.

Die US-P-4 164 559 beschreibt eine chemisch modifizierte Kollagenmembran, die als ein Träger für ophthalmische Medikation verwendbar ist. Die offenbarten Kollagenverbindungen sind einzelne Kollageneinheiten, die acyliert oder verestert wurden.

Die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlichte WO-A-85/04413 bezieht sich auf ein Kollagen, das wahllos gekuppelt ist und zu einem Produkt führt, bei dem es sich um ein unlösliches stark vernetztes Kollagen handelt, das in Körperflüssigkeiten nicht löslich wäre, wobei insbesondere keine amin-modifizierende Gruppe offenbart wird, die mit einer nichtgekuppelten Lysinepsilon-Aminogruppe verknüpft ist.

Kollagen wird als ein Ersatz der vorderen Augenkammer von Kawakami ("Operation for Aftercataract with the Injection of Collagen Gel into the Anterior Chamber" ("Operation des Sekundärkatarakts durch Injektion von Kollagengel in die vordere Augenkammer"), Excerpta Medica International Congress Series, 13d. 2 (450), S. 1432-1434 (1975)) beschrieben. Diese Untersuchung beschreibt die Injektion von durch UV vernetztes Kollagengel in die vordere Augenkammer vor der Extraktion des Sekundärkatarakts.

Die nachfolgend beschriebenen Kollagengele verfügen über höhere Viskositäten und geben den Augengeweben dadurch mehr Protein und Halt, als das bei Chondroitinsulfat der Fall ist. Allerdings sind die bekannten Kollagengele nicht pseudoplastisch und zerfallen, wenn sie durch eine Spritze injiziert werden, zu kleinen Stücken. Außerdem sind Kollagengele im allgemeinen trübe Materialien und bewirken bekanntermaßen Entzündungsreaktionen in der Augenvorkammer und dem Glaskörper (Advances in Vitreous Surgery, S. 601- 623, Irvine and O'Malley, 1976)

Die EP-A-089 145 bezieht sich auf ein viskoses Fluid, umfassend mit einem Aldehyd vernetztes Kollagen. Die Vernetzungsreaktion wird durch Zusatz einer Aminosäure abgeschreckt. Die vernetzende Gruppe verfügt über keine mit den Lysin-Aminogruppen der Kollagenmoleküle gebundene Carbonyl- oder Sulfonylgruppen, wie das in den Patentansprüchen des Anmelders gefordert wird. Darüber hinaus ist das von der zitierten Stelle erzeugte vernetzte Produkt in physiologischer Pufferlösung suspendierbar, jedoch nicht löslich.

Darüber hinaus können in die vordere Augenkammer injizierte Kollagengele eine Erhöhung des interokularen Drucks bewirken (Kawakami, E., "Operation for Aftercataract with the Injection of Collagen Gel into the Anterior Chamber" ("Operation des Sekundärkatarakts durch Injektion von Kollagengel in die vordere Augenkammer"), wie oben).

Weder die in der Augenchirurgie verwendeten Chondroitinsulfatlösungen noch die Kollagengele sind viskoelastische Materialien. Viskoelastische ophthalmische Materialien werden aus mehreren Gründen bevorzugt. Während des operativen Eingriffs schützen viskoelastische Materialien Zell- und Gewebeoberflächen vor einem mechanischen Trauma; schaffen Abstand durch Separieren zweier angrenzender, jedoch nicht adhärierender Gewebeoberflächen oder durch Abreißen normaler oder pathologischer Gewebeadhäsionen; bewahren Abstand und ermöglichen sichere operative Manipulationen oder erlauben das Einsetzen von Implantaten ohne Dislokation oder Berührung empfindlicher Gewebe; enthalten Hämorrhagien; und wirken außerdem als ein "weiches Instrument" oder "chirurgisches Instrument", um Gewebe zu bewegen, zu manipulieren oder zu verschieben.

Nach dem chirurgischen Eingriff können viskochirurgische Materialien verwendet werden, um für eine gewünschte Zeitdauer einen Raum zu bewahren, postoperative Entzündung auf ein Minimum zu halten und Blutung zu begrenzen, Fibrinkoagulation einzuschränken, entzündliche Zellen zurückzuhalten und Gewebeoberflächen gleitend zu halten, die sich relativ zueinander bewegen, und dadurch einen Adhäsivprozeß zu vermeiden.

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemisch modifizierte Kollagenverbindung, welche mindestens zwei native Kollagenmoleküle umfaßt, die an mindestens einer an jedem der Kollagenmoleküle vorhandenen Lysin-epsilon- Aminogruppe über eine Kupplungsgruppe gekuppelt sind, welche Kupplungsgruppe mindestens zwei Teile aufweist, die mit den Lysin-Aminogruppen direkt verknüpft sind, welche Teile ausgewählt werden aus Carbonyl- und Sulfonylgruppen und welche Carbonyl- und Sulfonylgruppen über gesättigte oder ungesättigte Alkylen-, Arylen- oder gemischte Alkylen- Arylen-Kupplungsketten miteinander verknüpft sind, welche Kupplungsketten weniger als zwanzig Kohlenstoffatome aufweisen und wahlweise Heteroatome enthalten, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, wobei das Kuppeln in einem so begrenzten Umfang erfolgt, daß die chemisch modifizierte Kollagenverbindung ungekuppelte, reaktionsfähige basische Stellen aufweist und in physiologischen Pufferlösungen ausreichend löslich ist, um eine viskoelastische Lösung zu schaffen.

Insbesondere hat die Kupplungsgruppe die allgemeine Formel

-B-A-B-

worin sind:

B unabhängig CO, SO&sub2; oder Kombinationen davon; und

A, ausgewählt aus

(1) einer aromatischen Gruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen;

darin sind

Ar unabhängig ein aromatischer Ring mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein heteroaromatischer Ring mit Atomen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S, und mit etwa 5 bis 10 Atomen oder Kombinationen davon;

J Wasserstoff oder -(L)b-B, worin L ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Phenylen, einem Alkylen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und einem Oxyalkylen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,

b Null oder 1 und

B wie vorstehend beschrieben, unter der Voraussetzung, daß lediglich eines der J in der Kette -(L)b-B sein kann, in welchem Fall alle anderen J Wasserstoff sind;

n Null oder 1;

a eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und 4; und

D unabhängig O, CO, S, SO, SO&sub2;,

-NH-CO-NH-, worin m etwa 1 bis 3 ist, R ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Phenyl und einer geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkyl- oder Acylgruppe mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; und

J wie vorstehend festgelegt und eingeschränkt ist;

(3) einer aromatischen Gruppe mit etwa 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die aromatische Gruppe in verfügbaren Positionen substituiert sein kann durch J, worin J wie vorstehend festgelegt und eingeschränkt ist;

(4) einer heteroaromatischen Gruppe mit Atomen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S, und mit etwa 5 bis 14 Ringatomen, wobei die heteroaromatische Gruppe in verfügbaren Positionen substituiert sein kann durch J, worin J wie vorstehend festgelegt und eingeschränkt ist;

(5) einer aliphatischen oder arylaliphatischen Kette, die eine oder zwei Olefin- oder Acetylengruppen enthält und die etwa 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, wobei die Kette in verfügbaren Positionen substituiert sein kann durch J, worin J wie vorstehend festgelegt ist und eingeschränkt wurde;

(6) eines alicyclischen Ringes, der teilweise ungesättigt sein kann, etwa 3 bis 15 Kohlenstoffatome hat, wobei der alicyclische Ring in verfügbaren Positionen substituiert sein kann durch J, worin J wie vorstehend festgelegt ist und eingeschränkt wurde;

(7) eines heterocyclischen Ringes, der gesättigt oder ungesättigt sein kann und der Atome enthält, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S, und der etwa 5 bis 12 Ringatome hat, wobei der heterocyclische Ring in verfügbaren Positionen substituiert sein kann durch J, worin J wie vorstehend festgelegt ist und eingeschränkt wurde;

worin sind:

t etwa 1 bis 8;

E unabhängig O, NRJ, S, SO, SO&sub2;, CO,

CONH, SO&sub2;NH oder NHCONH, worin R wie vorstehend festgelegt ist und m etwa 1 bis 3 ist;

J wie vorstehend festgelegt und eingeschränkt;

s etwa 2 bis 8;

p etwa Null bis 4;

q etwa Null oder 1; und

r etwa Null bis 8 unter der Voraussetzung, daß, wenn q gleich 1 ist, r größer ist als Null; und

worin sind

G unabhängig ein aromatischer Ring mit etwa 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein heteroaromatischer Ring mit etwa 5 bis 10 Atomen oder ein heterocyclischer Ring mit etwa 5 bis 10 Atomen, wobei die heteroaromatischen und heterocyclischen Ringe Atome enthalten, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S;

J wie vorstehend festgelegt und eingeschränkt;

w etwa 1 bis 8;

E und q wie vorstehend festgelegt;

y etwa 1 oder 2; und

v zwischen etwa Null und 4 unter der

Voraussetzung, daß, wenn g gleich 1 ist, v nicht Null ist.

Aromatische oder heteroaromatische Abschnitte von A können in verfügbaren Positionen durch Carboxylgruppen, geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylgruppen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkoxygruppen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen und anderen nichtreaktionsfähigen Teilen substituiert sein. Aliphatische, alicyclische und heterocyclische Abschnitte von A können in verfügbaren Positionen durch Carboxylgruppen und geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert sein.

Die vorliegende Erfindung schafft ebenfalls eine chemisch modifizierte Kollagenverbindung, welche mindestens 2 native Kollagenmoleküle umfaßt, die an mindestens einer an jedem der Kollagenmoleküle vorhandenen Lysin-epsilon- Aminogruppe über eine Kupplungsgruppe gekuppelt sind, welche Kupplungsgruppe mindestens 2 Teile aufweist, die mit den Lysin-Aminogruppen direkt verknüpft sind, welche Teile ausgewählt werden aus Carbonyl- und Sulfonylgruppen und welche Carbonyl- und Sulfonylgruppen über gesättigte oder ungesättigte Alkylen-, Arylen- oder gemischte Alkylen- Arylen-Kupplungsketten miteinander verknüpft sind, welche Kupplungsketten weniger als 20 Kohlenstoffatome aufweisen und wahlweise Heteroatome enthalten, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, wobei das gekuppelte Kollagen einen Abschnitt von Lysin-epsilon-Aminogruppen hat, die mit den Kupplungsgruppen nicht verknüpft sind, von denen mindestens 60 % zu Gruppen modifiziert sind, ausgewählt aus gesättigten oder ungesättigten Alkansulfonamid- und Carboxamidgruppen, Arensulfonamid- und Carboxamidgruppen und gemischten gesättigten oder ungesättigten Alkan-Arensulfonamid- und Carboxamidgruppen, welche modifizierten Gruppen 2 bis 20 Kohlenstoffatome haben, wobei jede modifizierte Gruppe wahlweise bis zu 5 Heteroatome enthält, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, und wahlweise in verfügbaren aromatischen und aliphatischen Positionen substituiert sind durch Carboxylgruppen, Alkyl- und Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Halogenatomen.

Das bedeutet, daß mindestens ein Abschnitt der an dem gekuppelten Kollagenprodukt vorhandenen nichtgekuppelten Lysin-epsilon-Aminogruppen mit amin-modifizierenden Gruppen verknüpft sind, welche amin-modifizierenden Gruppen gesättigtes oder ungesättigtes Alkan, Aren oder gemischte Alkan-Aren-Sulfonamid- oder carboxamidgruppen mit zwischen etwa 2 und 20 Kohlenstoffatomen sind, die durch einen oder zwei Carbon- oder Sulfonsäureteile terminiert sind.Die aminmodifizierenden Gruppen können auch bis zu fünf Heteroatome anthalten, z.B. O, S und N, und können an verfügbaren aromatischen und aliphatischen Positionen substituiert sein durch Carbonsäuregruppen, Alkyl- oder Alkoxygruppen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenen und anderen nicht- reaktiven Teilen. Speziell haben die amin-modifizierenden Grupppen die allgemeine Formel:

-B-A-(B-K)z

worin z Null bis 2, vorzugsweise 1 oder 2 ist, B und A wie vorstehend festgelegt sind unter der Voraussetzung, daß J Wasserstoff ist und K OH ist.

Die chemisch modifizierte Kollagenverbindung der vorliegenden Erfindung wird hergestellt, indem gereinigtes, mit Pepsin behandeltes Kollagen in einem begrenzten Umfang gekuppelt wird, begleitet von der Modifikation von ungekuppelten basischen Stickstoffen (hauptsächlich Aminogruppen), und zwar mit Hilfe eines Modifikationsmittels, welches diese Stellen in nichtbasische überführt, d.h. mit einem pKa von kleiner als 4.

Die Erfinder haben festgestellt, daß der Grad des Kuppelns bei der Herstellung von Kollagenlösungen mit viskoelastischen, pseudoplastischen Eigenschaften besonders wichtig ist, die ihr in der Augenchirurgie die erfolgreiche Anwendung als ein wäßriger oder glasartiger Ersatz ermöglichen. Es wurde festgestellt, daß das erzeugte Produkt, wenn das Kuppeln zu weit geht, keine viskoelastische Lösung sondern anstelle dessen ein Kollagengel ist.

Die Schwierigkeiten mit derartigen Gelen wurden vorstehend detailliert beschrieben. Es wurde ebenfalls entdeckt, daß, wenn das Kuppeln nicht weit genug geht, die Lösung nicht so viskoelastisch ist, wie angestrebt wird, und die Lösung nicht die Gleiteigenschaften besitzt, die für ein Hilfsmittel der Augenchirurgie benötigt werden. Die Erfinder haben ebenfalls festgestellt, daß die meisten der ungekuppelt verbleibenden basischen, an den gekuppelten Kollagenmolekülen vorhandenen Stellen nicht-basisch gemacht werden müssen, und zwar vorzugsweise gleichzeitig mit dem Einführen einer negativ geladenen Gruppe, damit das Kollagenprodukt der Fibrillogenese widersteht.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kollagenlösungen haben sich in der Augenchirurgie aus den folgenden Gründen als besonders verwendbar erwiesen:

1) sie sind viskoelastisch und besitzen Gleiteigenschaften, die dem Hornhautendothel, der Iris und der Netzhaut einen gewissen Schutz bieten;

2) sie sind pseudoplastisch und lassen sich damit leicht durch eine Spritze injizieren und haben dennoch die Fähigkeit, ihre ursprüngliche statische Viskosität wieder anzunehmen;

3) sie sind gegenüber spontaner Fibrillogenese beständig und bewahren damit ihre klare transparente Beschaff enheit nach dem Einsetzen in das Auge;

4) sie haften an hydrophoben polymeren Oberflächen, wie beispielsweise intraokularen Linsen aus Polymethylmethacrylat oder Polypropylen und lassen sich damit zum Beschichten derartiger Linsen verwenden, um das Einsetzen in die vordere oder hintere Augenkammer zu erleichtern;

5) wenn sie in die Gewebe injiziert werden, verringern sie ihre Viskosität und werden in der Gewebeflüssigkeit verdünnt und verlassen den ((Injektions)) Ort;

6) sie führen zu keiner nachteiligen Erhöhung des intraokularen Druckes;

7) sie verfügen über niedrige Osmolaritäten zwischen etwa 200 und 400 mOsm; und

8) bevorzugte Ausführungsformen rufen keine Entzündung hervor und sind biologisch kompatibel.

Darüber hinaus ist natives Kollagen aus einer großen Vielzahl von Quellen verfügbar, z.B. Knochen, Sehnen, Haut, usw. Dementsprechend ist Kollagen reichlicher vorhanden und weniger kostspielig zu erhalten, als von Hyaluronsäure abgeleitetes Gewebe.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das Verfahren, nach dem die chemisch modifizierte Kollagenverbindung hergestellt wird, umfaßt 4 Hauptschritte. Diese Schritte sind (nicht notwendigerweise in dieser Reihenfolge):

I. Beschaffung von Kollagen-Ausgangsmaterial;

II. Kontrolliertes Kuppeln von Kollagen-Ausgangsmaterial;

III. Modifikation von verbleibenden nichtgekuppelten basischen Stellen und

IV Aufnahme, Reinigung und Rekonstitution von modifiziertem Kollagen.

I. Beschaffung von Kollagen-Ausgangsmaterial

Das Verfahren, um Kollagen aus dem Kollagen-Rohprodukt, z.B. Sehnen, Haut, usw., zu erhalten, ist normalerweise nicht entscheidend, wobei eine gewisse Flexibilität bei der Auswahl des speziellen Gewebes und des dafür eingesetzten Verfahrens praktiziert werden kann. Die Erfinder bevorzugen die Extraktion von Kollagen aus einem Bindegewebe, wie beispielsweise Rinderhaut. Wenn das Kollagen für ophthalmische Anwendungen eingesetzt werden soll, wird bevorzugt, wenn es aus dem Corium der Rinderhaut, auch bekannt als "Spaltleder", erhalten wird. Spaltleder ist kommerziell verfügbar bei der Andre Manufacturing Co., Newark, New Jersey.

Das Kollagen kann nach jedem beliebigen Standard- Extraktionsverfahren löslich gemacht werden, z.B. saure Extraktion oder Salzextraktion, Enzymaufschluß oder eine Kombination davon. Vorzugsweise wird enthaarte und gereinigte Haut mit einem proteolytischen Enzym (beispielsweise Pepsin) löslich gemacht und löslich gemachtes Kollagen bei pH 7 nach Inaktivierung und Entfernung des Enzyms durch Zusatz von NaCl bis auf etwa 2,5M ausgefällt. Mit Pepsin behandeltes Kollagen fällt aus, indem es die aufgeschlossenen nicht-helikalen terminalen Peptide des Kollagenmoleküls und andere nicht-kollagenartige Verunreinigungsstoffe, z.B. Saccharide, Mucopolysaccharide, usw., in Lösung zurückläßt (die zu verwerfen sind). lnaktivierte Enzyme werden durch Filtration und Zentrifugieren bei 4 ºC entfernt. Das mit Pepsin behandelte Kollagen wird sodann durch wiederholtes Auflösen in saurem Wasser (pH 2...4) und wiederholtes Ausfällen durch Salzbehandlung, z.B. durch den Zusatz von 0,8M Natriumchloridlösung bei pH 3, weiter gereinigt.

Das gereinigte Kollagen wird vorzugsweise unter Anwendung eines beispielsweise bei der Amicon, Danvers, Mass. kommerziell verfügbaren Filtrationssystems "Amicon DC-30" einer Diafiltration unterzogen. Vorzugsweise wird ein 0,1 pm-Membranfilter eingesetzt, um Salze, Proteine und andere Moleküle mit einer relativen Molekülmasse von weniger als 300.000 Dalton abzufiltrieren. Die Erfinder haben festgestellt, daß die Diafiltration die Transparenz des Kollagenprodukts erhöht und das Auftreten von wäßrigem Flackern herabsetzen kann. Ferner muß das Kollagen, wenn es bei chirurgischen Anwendungen eingesetzt werden soll, sterilisiert werden, vorzugsweise mit Hilfe der Methoden der Filtersterilisation.

II. Kontrolliertes Kuppeln

Die solubilisierten gereinigten Kollagenmoleküle werden unter Anwendung von Kupplungsmitteln gekuppelt, die zwei oder drei Gruppen aufweisen, welche mit Aminen reagieren, nicht jedoch mit Carboxylgruppen reagieren. Derartige Kupplungsmittel umfassen Di- und Tricarbonsäurehalogenide, Di- und Trisulfonylhalogenide, Di- und Trianhydride, di- und tri-reaktionsfähige aktive Ester und Kupplungsmittel, die mindestens zwei Gruppen vom Typ des Carbonsäurehalogenids, Sulfonylhalogenids, Anhydrids oder aktiven Esters enthalten. Bevorzugte aromatische und aliphatische Di- und Tricarbonsäurehalogenide umfassen: D-Kampher-Diacidchlorid; 4-[p- (o-Chlorcarbonylbenzoyl)phenyl]butyrylchlorid; Furan-3,5- dicarbonsäurechlorid; Fumarylchlorid; Glutarylchlorid; Succinylchlorid; Sebacoylchlorid; Isophthaloylchlorid; Terephthaloylchlorid; 4-Bromisophthaloylchlorid; Diglykolsäure-diacidchlorid; 1,1-Cyclohexandiacetylchlorid; 2,2- Dimethylglutarylchlorid; Thioglykolsäuredichlorid; Nitrilotriessigsäurechlorid; Beta-methylcarballylsäuretrichlorid; Hexadecandionsäuredichlorid;Malonsäuredichlorid; Acetondicarbonsäuredichlorid; Oxydiacetylchlorid; Benzol-1,3,5- tricarbonylchlorid; 4-Chlorcarbonylphenoxyacetylchlorid; Homophthaloylchlorid; 4,4'-Diphenyletherdicarbonsäuredichlorid; 4,4'-Diphenylthioetherdicarbonsäuredichlorid; 4,4'- Diphenylsulfondicarbonsäuredichlorid; Acetylendicarbonsäuredichlorid; Cyclohexan-1,4-dicarbon-säuredichlorid; trans-3,6- Endomethylen-1,2,3,6-tetra-hydrophthaloylchlorid; 4,4'-Dithiodibutyrylchlorid; Diphenylmethan-4,4'-bis(oxyacetyl)chlorid; N-(4-Chlorcarbonylphenyl)anthranyloylchlorid; 1,3- Benzol-bis-oxyacetylchlorid; Pyridin-3,5-dicarbonsäuredichlorid; Pyridin-2,5-dicarbonsäuredichlorid; Pyridin-2,4- dicarbonsäuredichlorid; Pyrazin-2,3-dicarbonsäuredichlorid und Pyridin-2,6-dicarbonsäuredichlorid; Ethylenglykol-bis- (4-chlorcarbonylphenyl)ether; Diethylenglykol-bis-(4-chlorcarbonylphenyl)ether; Bis-(4-chlorcarbonyl-2-tolyl)thioether und N-Chlorcarbonylmethyl-N-methylglutaminsäurechlorid.

Bevorzugte aromatische und aliphatische Di- oder Trisulfonylhalogenide umfassen p-Fluorsulfonylbenzolsulfonylchlorid, 1,3,5-Benzoltrisulfonylchlorid, 2,6-Naphthalendisulfonylchlorid; 4,4'-Biphenyldisulfonylchlorid; 1,10- Decandisulfonylchlorid und 4,4'-trans-Stilbendisulfonylchlorid.

Bevorzugte Di- und Trianhydrid-Kupplungsmittel umfassen 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid; 3,4,9,10-Perylentetracarbonsäuredianhydrid; 3,3',4,4'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid; 1,2,7,8-Naphthalentetracarbonsäuredianhydrid; Pyromellithsäuredianhydrid; 2,3,4,5-Tetrahydrofurantetracarbonsäuredianhydrid; Mellithsäuretrianhydrid; 1,2,3,4,-Cyclobutantetracarbonsäuredianhydrid; Bicyclo- [2,2,2]-oct-7-en-2,3,5,6-tetracarbonsäuredianhydrid; Cyclopentantetracarbonsäuredianhydrid; Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid und Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid.

Aktive Ester wurden von Greenstein und Winitz in "Chemistry of the Amino Acids", Bd. 2, John Wiley and Sons, Inc. (1961) beschrieben. Bevorzugte di-reaktive aktive Ester-Kupplungsmittel umfassen Diphenylsuccinat; Bis-(p- nitrophenyl) succinat; Bis-(cyanoethyl)glutarat und Di-S- phenyldithiosuccinat.

Bevorzugte Kupplungsmittel, die Kombinationen von aminreaktiven Gruppen umfassen 5-Chlorsulfonylorthoanissäurechlorid; 2-Chlor-5-fluorsulfonylbenzoylchlorid; 4- Chlorsulfonylphenoxyacetylchlorid; m-Fluorsulfonylbenzoylchlorid und Trimellithsäureanhydrid-saures Chlorid.

Das Kupplungsmittel wird zu einer wäßrigen Lösung des mit Pepsin behandelten Kollagens zugesetzt und mit dieser gründlich gemischt. Um den Kupplungsgrad zu begrenzen enthält das Reaktionsgemisch vorzugsweise gereinigtes Kollagen in einer Konzentration von 0,05 bis 0,3 Gewichtsprozent und mehr bevorzugt 0,15 bis 0,3 Gewichtsprozent.

Die Konzentration des Kupplungsmittels hängt von zahlreichen Faktoren ab, einschließend das Reaktionsvermögen des Kupplungsmittels. Normalerweise beträgt die Menge des Kupplungsmittels jedoch etwa 1 bis 600 Mole Kupplungsmittel pro Mol Kollagen, vorzugsweise etwa 50 bis 500 Mole Kupplungsmittel pro Mol Kollagen und mehr bevorzugt etwa 100 bis 200 Mole Kupplungsmittel pro Mol Kollagen.

Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird vorzugsweise während der gesamten Kupplungsreaktion bei etwa 8 bis 11, vorzugsweise bei etwa 8,5 bis 9,5 und am meisten bevorzugt bei etwa 9,0, durch Zusatz einer verdünnten Base gehalten, wie beispielsweise In Natriumhydroxid. Auf diese Weise werden nahezu alle an den Kollagenmolekülen vorhandene Lysin-epsilon-Aminogruppen von ihrer protonierten Form befreit und werden in die Lage versetzt, entweder mit dem Kupplungsmittel oder dem Modifikationsmittel zu reagieren.

Die Kupplungsreaktion wird solange fortgesetzt, bis im wesentlichen alles, d.h. mindestens 90 %, des Kupplungsmittels entweder mit dem Kollagen umgesetzt ist oder hydrolysiert wurde, - normalerweise etwa 30 Minuten.

Der Grad und die Gleichförmigkeit der Kupplungsreaktion hängt von der Temperatur ab und wird dadurch von ihr geregelt, von dem zum Auflösen des Kupplungsmittels verwendeten Lösemittel, von der Geschwindigkeit des Zusatzes des Kupplungsmittels, von der Identität und Form des Kupplungsmittels, von der Konzentration der Reaktanten und den pH-Wertänderungen des Reaktionsgemisches.

Beispielsweise werden einige Kupplungsmittel bevorzugt zur Kollagenlösung als ein Feststoff zugesetzt. Die Erfinder haben festgestellt, daß durch den Zusatz des Kupplungsmittels zum Kollagen als ein Feststoff der Kupplungsgrad kontrolliert werden kann. Obgleich jedoch der Zusatz bestimmter Kupplungsmittel in fester Form bevorzugt wird, kann das Kupplungsmittel in einem geeigneten Lösemittel vor dem Zusatz zum mit Pepsin behandelten Kollagen aufgelöst sein. Geeignete Lösemittel sind vorzugsweise mit Wasser mischbar und umfassen N-Methylpyrrolidon, N,N-Dimethylformamid, Aceton, Ethylenglykoldimethylether und Acetonitril. Die besonders bevorzugten Lösemittel haben relativ hohe Dielektrizitätskonstanten, d.h. größer als 25 und vorzugsweise größer als 30 bei Messung bei 25ºC. Derartige besonders bevorzugte Lösemittel umfassen N- Methylpyrrolidon und N,N-Dimethylformamid. Lösemittel mit hohen Dielektrizitätskonstanten bieten eine weitere Möglichkeit zum Kontrollieren des Kuppelns, da sie dazu neigen, den Kupplungsgrad durch Unterstützung der Hydrolyse des Kupplungsmittels zu begrenzen. Andererseits können mit Wasser relativ nichtmischbare Lösemittel verwendet werden, die ein 2-phasiges Reaktionsgemisch ergeben. Die Verwendung eines 2-phasigen Gemischs begrenzt den Kupplungsgrad, indem die Zahl der Reaktionsstellen auf die Oberfläche des Lösemittels begrenzt wird. Ein mit Wasser relativ nichtmischbares Lösemittel ist beispielsweise Ethylacetat. Wenn eine Lösung des Kupplungsmittels in irgendeinem Lösemittel verwendet wird, wird eine solche Menge des Lösemittels bevorzugt, das es mit etwa 0,5...10 ml des Lösemittels pro 100 ml der wäßrigen Kollagenlösung und am meisten bevorzugt etwa 1 ml des Lösemittels pro 100 ml Kollagenlösung vorliegt.

Obgleich die Kupplungsreaktion bei einer Temperatur zwischen etwa 0 ºC und 35 ºC durchgeführt werden kann, haben die Erfinder festgestellt, daß, wenn man die Kupplungsreaktion bei einer Temperatur unterhalb von etwa 20 ºC, vorzugsweise etwa 4 ºC, ablaufen läßt, die Reaktion des Kupplungsmittels mit den am Kollagen vorhandenen Lysinepsiolon-Aminogruppen unterstützt werden kann.

Die besonders bevorzugten Kupplungsmittel umfassen: Succinylchlorid; Glutarylchlorid; Terephthaloylchlorid; Bicyclo-(2,2,2)-oct-7-en-2,3,5,6-tetracarbonsäure-2,3,5,6- dianhydrid; 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid; p- Fluorsulfonylbenzolsulfonylchlorid und 1,3,5-Benzoltrisulfonylchlorid, Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid.

Die Erfinder haben festgestellt, daß bei bestimmten hoch reaktionsfähigen Kupplungsmitteln, wie beispielsweise Terephthaloylchlorid; Bicyclo-(2,2,2)-oct-7-en-2,3,5,6- tetracarbonsäure-2,3,5,6-dianhydrid; 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid und p-Fluorsulfonylbenzolsulfonylchlorid oder bei Lösemittelsystemen mit hoher Dielektrizitätskonstante und/oder relativ großer Mischbarkeit mit Wasser, wie beispielsweise N,N-Dimethylformamid und N- Methylpyrrolidon, die Kupplungsreaktion vorzugsweise durch Vormischen der Reaktionsteilnehmer bei einem sauren pH-Wert von etwa 3 bis 5,5, vor dem Erhöhen des pH-Werts auf 8 bis 11 begonnen wird, um die Reaktion der Kollagen-Aminogruppen mit dem Kupplungsmittel zu beeinflussen. Indem der pH-Wert auf diese Weise verändert wird, wird die Kupplungsreaktion kontrolliert, um das angestrebte viskoelastische Produkt zu erzielen.

Es wird insbesondere bei Kupplungsmitteln mit geringerem Reaktionsvermögen bevorzugt, daß der pH-Wert des Reaktionsgemischs auf mindestens 11,5 bei Beendigung der Kupplungsreaktion erhöht wird, um alle nichtumgesetzten Teile des Kupplungsmittels zu hydrolysieren.

III: Modifikation der verbleibenden basischen Stellen

Das gekuppelte Kollagenprodukt enthält reaktive basische Stellen, hauptsächlich Amingruppen, das zur Erzeugung einer klaren und transparenten Lösung für die Augenchirurgie chemisch modifiziert werden muß, um eine neutrale Nettoladung oder vorzugsweise negative Ladung zu gewähren. Eine solche Modifikation dieser reaktionsfähigen basischen Stellen ermöglicht dem Kollagenprodukt bei Verwendung in der Augenchirurgie der Fibrillenbildung zu widerstehen. Hierfür wird das gekuppelte Kollagen mit einem monoreaktiven Amin-modifizierenden Mittel umgesetzt, das auch als ein Monoacylierungsmittel oder Sulfonierungsmittel bekannt ist. Das Modifikationsmittel ist vorzugsweise eine Verbindung oder Kombination von Verbindungen, die eine saure Gruppe, Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppe enthalten oder im Verlaufe der Reaktion eine saure Gruppe, Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen erzeugen. Vorzugsweise hat die saure Form des Modifikationsmittels einen ähnlichen pKa wie den des hydrolysierten Kupplungsmittels, um optimale Ausfällung des chemisch modifizierten Kollagenprodukts zu gewährleisten. Verwendbare Modifikationsmittel umfassen Anhydride, Säurehalogenide, Sulfonylhalogenide und aktive Ester. Bevorzugte Anhydride umfassen cyclische Anhydride, wie beispielsweise Glutarsäureanhydrid; 3-Ethyl-3-methylglutarsäureanhydrid; alpha-2-Carboxyethylglutarsäureanhydrid; 3-Methylglutarsäureanhydrid; 2-Phenylglutarsäureanhydrid; Dimethylglutarsäureanhydrid; 1,8-Naphthalsäureanhydrid; 4-Chlor-1,8- naphthalsäureanhydrid, 3,6-Dinitro-1,8-naphthalsäure- anhydrid; 3-Nitro-1,8-naphthalsäureanhydrid; Maleinsäureanhydrid; Brommaleinsäureanhydrid; Dichlormaleinsäureanhydrid; Succinsäureanhydrid; S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid; 2,2,3,3-Tetramethylsuccinsäureanhydrid; 2-Dodecen- 1-yl-succinsäureanhydrid; Methylsuccinsäureanhydrid; Citraconsäureanhydrid; Itaconsäureanhydrid; 2,3-Chinoxalindicarbonsäureanhydrid; 1,2-Cyclobutandicarbonsäureanhydrid; Diphensäureanhydrid; Cyclohexan-1,2-Dicarbonsäureanhydrid; Phthalsäureanhydrid; Hexahydro-4-methylphthalsäureanhydrid; Homophthalsäureanhydrid; Tetrahydrophthalsäureanhydrid; Tetrachlorphthalsäureanhydrid; Tetrabromphthalsäureanhydrid; 1,4,5,6,7,7-Hexachlor-5-norboren-2,3-dicarbonsäureanhydrid; 3,6-Endoxo-1,2,3,6 -Tetrahydrophthasäureanhydrid; 5-Chlorisatosäureanhydrid; 3,4-Pyridindicarbonsäureanhydrid; Carbobenzyloxy-L-glutaminsäureanhydrid; 1,2,4-Benzoltricarbonsäureanhydrid; o-Sulfobenzoesäureanhydrid; Thiodiglykolsäureanhydrid; 2,3-pyridindicarbonsäureanhydrid; 3-Ketoglutarsäureanhydrid-(1,3-acetondicarbonsäureanhydrid); Diglykolsäureanhydrid; 4-Amino-1,8-naphthalsäureanhydrid und Kampfersäureanhydrid. Bevorzugte Sulfonylchloride umfassen Chlorsulfonylbenzolsulfonsäure. Bevorzugte Säurechloride umfassen Sulfoacetylchlorid, die einbasigen Chloride der Terephthalsäure und Fumarsäure und Monomethylsuccinsaurechlorid. Bevorzugte aktive Ester umfassen Phenolate, wie beispielsweise Monophenylterephthalat, und Cyanomethylester, wie beispielsweise Mono(cyanomethylsuccinat). Zusätzlich können Acylierungsmittel verwendet werden, wie beispielsweise Benzoylchlorid, Benzolsulfonylchlorid und Butyrylchlorid, die keine negativ geladenen Produkte erzeugen, die vorzugsweise jedoch in Kombination mit den vorgenannten Modifikationsmitteln verwendet werden.

Die Modifikationsreaktion führt man in einem wäßrigen Medium aus, so daß gleichzeitig konkurrierende Reaktionen der Acylierung der Kollagenamine und Hydrolyse des Modifikationsmittels auftreten. Wie bei der Kupplungsreaktion hängt der Umfang der jeweiligen Reaktion vom pH- Wert, dem prozentualen Anteil der am gekuppelten Kollagen verbleibenden basischen Stellen, der Temperatur und von der Beschaffenheit und der Form des Modifikationsmittels ab.

Das Modifikationsmittel kann zu einer wäßrigen Lösung des gekuppelten Kollagens entweder rein oder in einem Lösemittel zugesetzt werden. Geeignete Lösemittel sind solche, die zum Auflösen des Kupplungsmittels verwendet werden. Vorzugsweise wird das Modifikationsmittel als ein Feststoff oder in einem mit Wasser mischbaren Lösemittel mit einer Dielektrizitätskonstante von weniger als etwa 25 zugesetzt. Wenn eine Lösung des Modifikationsmittels in einem Lösemittel verwendet wird, wird eine solche Menge des Lösemittels bevorzugt, daß es mit etwa 0,5 bis 10,0 ml Lösemittel pro 100 ml wäßriger gekuppelter Kollagenlösung vorliegt und am meisten bevorzugt etwa 1,0 ml Lösemittel pro 100 ml Kollagenlösung.

Vorzugsweise wird ein großer stöchiometrischer Überschuß des Modifikationsmittels zum Kollagen zugesetzt, und zwar aufgrund der unter den Reaktionsbedingungen auftretenden parallel ablaufenden Hydrolyse des Modifikationsmittels. Die Menge des verwendeten Modif ikationsmittels muß mindestens ausreichend sein, um mit 60 bis 100 % der nichtumgesetzten Lysin-epsilon-Aminogruppen zu reagieren, und vorzugsweise ausreichend, um mit etwa 80 % der nicht umgesetzten Lysin-epsilon-Aminogruppen zu reagieren. Insofern die Hydrolyse des Modifikationsmittels mit abnehmendem prozentualen Anteil der Lysin-Aminogruppen zunehmend dominiert, ist es weder praktisch noch erforderlich, eine Umsetzung von 100 % zu erreichen. Die Menge des Modifikationsmittels, die zum Umsetzen von mindestens 80 % der Aminogruppen erforderlich ist, hängt vom Reaktionsvermögen des Modifikationsmittels und des etwaigen speziellen Lösemittels ab. Beispielsweise begünstigen Sulfonylchloride die Reaktion mit Aminen gegenüber der Hydrolyse. Daher sind für die Modifikationsreaktion weniger Sulfonylchloride erforderlich, als von anderen Modifikationsmitteln benötigt werden würden. Normalerweise werden jedoch mindestens 100 Mole Modifikationsmittel pro Mol des gereinigten Ausgangs-Kollagens, vorzugsweise mindestens 500 Mole des Modifikationsmittels pro Mol Kollagen und am meisten bevorzugt mindestens 750 Mole Modifikationsmittel pro Mol Kollagen, benötigt.

Das Reaktionsgemisch wird während der gesamten Reaktion bei einem pH-Wert von vorzugsweise etwa 8 bis 11, mehr bevorzugt etwa 8,5 bis 9,5 und am meisten bevorzugt etwa 9,0, durch Zusatz einer verdünnten Base gehalten, z.B. In Natriumhydroxid. Die Modifikationsreaktion wird vorzugsweise für mindestens 30 Minuten fortgesetzt, um alles nichtumgesetztes Modifikationsmittel zu hydrolysieren. Wie bei der Kupplungsreaktion, wird die Modifikationsreaktion, obgleich sie bei einer Temperatur zwischen etwa 0 ºC und 35 ºC durchgeführt werden kann, vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb von etwa 20 ºC, vorzugsweise etwa 4 ºC, durchgeführt, da die Reaktion mit Amingruppen gegenüber der Hydrolyse bei niedrigeren Temperaturen begünstigt wird.

In den meisten Fällen wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei Beendigung der Modifikationsreaktion auf mindestens 11,5 erhöht, um alles nichtumgesetztes Modifikationsmittel zu hydrolysieren.

Während es sich bei der bisherigen Beschreibung um eine zweistufige Synthese handelt (zunächst Kuppeln des Kollagens, gefolgt von einer Modifikation der verbleibenden nicht-reagierten basischen Stellen), besteht eine Variation dieses Ablaufs in der gleichzeitigen Durchführung sowohl der Kupplungs- als auch der Modifikationsreaktion. Tatsächlich wird bei den stärker reaktionsfähigen Kupplungsmitteln, die Dianhydride einschließen, wie beispielsweise 1,2,4,5- Benzoltetracarbonsäuredianhydrid und Bicyclo-(2,2,2)-oct-7- en-2,3,5,6-tetracarbonsäure-2,3,5,6-dianhydrid, sowie Diacidhalogenide wie beispielsweise Succinylchlorid und 5-Chlorsulfonyl-o-anissäurechlorid, sowie Sulfonylhalogenide, wie beispielsweise Benzoltrisulfonylchlorid und p-Fluorsulfonylbenzolsulfonylchlorid, das gleichzeitige Umsetzen des Kollagens mit dem Kupplungsmittel und dem Modifikationsmittel bevorzugt, um einen unzulässig hohen Kupplungsgrad in dem resultierenden Kollagenprodukt zu vermeiden. Bei gleichzeitiger Durchführung der Kupplungs- und Modifikationsreaktion wird die Hälfte des Modifikationsmittels (d.h. mindestens 50 Mole pro Mol gereinigtes Ausgangskollagen) dem Reaktionsgemisch zugesetzt, wobei die andere Hälfte des Modifikationsmittels verwendet wird, um das gekuppelte Kollagenprodukt nach dem Kuppeln zu behandeln. Eine weitere Variation zur Anwendung bei stärker reaktionsfähigen Kupplungsmitteln besteht darin, daß das gereinigte Kollagen mit näherungsweise einem Viertel des Modifikationsmittels (d.h. mindestens etwa 25 Mol pro Mol gereinigtes Ausgangskollagen) vor dem Kuppeln vorreagiert wird. Das restliche Modifikationsmittel wird zur Behandlung des Kollagenprodukts nach dem Kuppeln verwendet.

IV. Aufnahme, Reinigung und Rekonstitution von modifiziertem Kollagen

Das modifizierte Kollagen wird durch Einstellung des pH-Werts in bezug auf den isoelektrischen Punkt ausgefällt. Der Niederschlag wird vorzugsweise durch Zentrifugieren aufgenommen und mit sterilem pyrogenfreiem Wasser zur Entfernung etwaiger überschüssiger Reagenzien gewaschen. Das gereinigte chemisch modifizierte Kollagen wird zur Verwendung durch Rekonstitution mit ausreichend physiologischem Puffer und In NaOH vorbereitet, um eine Lösung von 0,1...7,5 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,5...5,0 Gewichtsprozent, von modifiziertem Kollagen bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5, vorzugsweise 7,0 bis 7,4, zu erhalten. Geeignete physiologische Puffer enthalten NaCl und wahlweise ausreichend andere Salze, wie beispielsweise KCl, CaCl&sub2;, MgCl&sub2;, CH&sub3;COONa, NaH&sub2;PO&sub4;, Na&sub2;HPO&sub4; sowie Natriumcitrat, um dem Puffer eine Osmolarität zwischen etwa 200 und 400 mOsm, vorzugsweise etwa 320 mOsm, zu verleihen. Ein bevorzugter physiologischer Puffer enthält 0,64 Gewichtsprozent NaCl, 0,075 Gewichtsprozent KCl, 0,048 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,030 Gewichtsprozent MgCl&sub2;, 0,39 Gewichtsprozent CH&sub3;COONa und 0,17 Gewichtsprozent C&sub6;H&sub5;O&sub7;Na&sub3; und ist kommerziell verfügbar als BSS bei der Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Texas. Bei ophthalmischen Anwendungen sollte der Puffer vorzugsweise auch Phosphatsalze enthalten, z.B. Na&sub2;HPO&sub4; und NaH&sub2;PO&sub4;. Eine mehr bevorzugte Phosphat-Pufferlösung enthält 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Ein abschließender bevorzugter Schritt besteht darin, das rekonstituierte Kollagen durch ein Filter mit etwa 10 Mikrometer zu filtrieren, um etwaige Feststoffteilchen zu entfernen, die sich während der Bearbeitung angesammelt haben können. Das filtrierte Kollagen wird sodann bevorzugt unter einem Stickstoff-Überdruck bei einer Temperatur von etwa 4 ºC zur Vermeidung von Kontamination gelagert. Wenn die erfindunggemäßen bevorzugten, chemisch modifizierten Kollagenfraktionen in ausreichend physiologischem Puffer aufgelöst werden, um eine Lösung mit 1 %...5 Gewichtsprozent Kollagen zu ergeben, so sind sie

(a) transparent und farblos mit einer Durchlässigkeit von etwa 100 % bei 400...700 nm und einem Brechungsindex von näherungsweise gleich dem des Wassers oder der wäßrigen Körperflüssigkeit, d.h. 1,33...1,40;

(b) stabil und frei von Kollagenfasern;

(c) viskoelastisch, d.h. sie zeigen den Weissenberg- Effekt ("Introduction to Colloid and Surface Chemistry" ("Einführung in die Kolloid- und Oberflächenchemie"), London Butterworths, 1966);

(d) pseudoplastisch mit niedrigeren Viskositäten bei höheren Scherraten;

(e) thixotropisch, d.h. Viskosität wird nach Scherung im Ruhezustand wieder hergestellt;

(f) sie rufen keine Entzündungen hervor und sind biokompatibel mit einer Fähigkeit, bei Injektion in physiologisches Gewebe von Gewebeflüssigkeit absorbiert zu werden;

(g) sie besitzen eine Schmelztemperatur von etwa 32 ºC bis etwa 48 ºC und

(h) sie besitzen eine Osmolarität von etwa 260...340 mOsm, bevorzugt etwa 280.. .320 mOsm.

Alle die Eigenschaften (a) bis (h) der Kollagenlösung stehen im Zusammenhang mit ihrer therapeutischen Wirksamkeit bei ophthalmischer Anwendung.

(a) Transparenz

Dadurch, daß die bevorzugten Kollagenlösungen für ophthalmische Anwendung, d.h. bis zu 5 Gewichtsprozent chemisch modifiziertes Kollagen aufgelöst in physiologischem Puffer, transparent und farblos sind und Brechungsindices von näherungsweise gleich denen der wäßrigen Körperflüssigkeit haben, sind sie besonders geeignet als wäßrige oder glasartige Ersatzmittel bei intrakapsulärer und extrakapsulärer Staroperation, intraokularer Linsenimplantation, Hornhauttransplantation und Behebung von Netzhautablösung. Die Transparenz gewährleistet dem Chirurgen eine freie Handhabung und volle Kontrolle des operativen Vorganges mit vollständiger und klarer Sichtbarkeit bei Gegenwart jeder beliebigen Menge der viskoelastischen Kollagenlösung.

(b) Stabilität

Physiologische Stabilität wird als der Widerstand gegenüber spontaner Fibrillogenese bei pH 7,2 und einer Temperatur von 32 ºC...42 ºC festgelegt. Fibrillogenese wird als die Selbstorganisation von Kollagenmolekülen zu unlöslichen Aggregaten festgelegt. Kollagen, das nicht chemisch modifiziert worden ist, so daß es nach der Lehre der vorliegenden Erfindung im wesentlichen mit allen freien Amingruppen reagieren kann, unterliegt spontaner Fibrillogenese, beispielsweise wenn es in einer physiologischen Pufferlösung aufgelöst und auf 37 ºC erwärmt wird und als nicht chemisch modifiziertes Kollagen spontan ein weißes lichtundurchlässiges faseriges Netzwerk bildet. Widerstand gegenüber Fibrillogenese bedeutet, daß die Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung nach dem Einsetzen in das Auge ihre klare transparente Beschaffenheit bewahren.

(c) Viskoelastizität

Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung zeigen den bekannten Weissenberg-Effekt, was darauf hinweist, daß sie viskoelastisch sind. Der Weissenberg-Effekt beschreibt die Neigung zum Auftreten von Fließen in viskoelastischen Lösungen in rechten Winkeln zu einer aufgebrachten Kraft. Wenn ein rotierender Stab in eine Newtonsche Flüssigkeit (nicht viskoelastisch) getaucht wird, wird die Flüssigkeit in Rotation versetzt und wird sich nach außen bewegen und rund um den Stab eine Vertiefung hinterlassen. Wenn der rotierende Stab in eine viskoelastische Flüssigkeit getaucht wird, kann die Flüssigkeit augenblicklich an dem Stab aufsteigen. Die Rotation des Stabes bewirkt, daß die Flüssigkeit zirkular geschert wird und wirkt aufgrund ihrer elastischen Natur als ein gestrecktes Gummiband, das versucht, die Flüssigkeit zum Zentrum des Gefäßes zu drücken und damit am Stab hochzusteigen.

Die Kollagenlösungen haben aufgrund ihrer viskoelastischen Eigenschaft Gleitmitteleigenschaften, durch die sie als Schutzbeschichtungen auf Instrumenten und Implantaten besonders verwendbar sind, die in der Nähe von sensitiven Zell- und Gewebeoberflächen verwendet werden. Bei Verwendung in der Augenvorkammer bewahren die erfindungsgemäßen viskoelastischen Materialien Augenkammertiefe und schützen das Hornhautendothel während der intrakapsulären und extrakapsulären Staroperation sowie während intraokularer Linsenimplantation. Viskoelastizität ist auch in der Glaskörperchirurgie wichtig, damit die Lösung in der Lage ist, die Netzhaut in ihre normale Position zurückzudrücken und nicht durch die Öffnung hinter der Netzhaut zufließen. Darüber hinaus gewähren viskoelastische Lösungen der Netzhaut bis zu ihrem Heilen eine langandauernde Stützung und bewahren die rheologischen Eigenschaften des Glaskörpers.

(d) Pseudoplastizität

Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Kollagenlösungen zeigen deutliche Viskositätsabnahmen, wenn sie zunehmenden Scherraten ausgesetzt werden. Die stationäre Viskosität von Lösungen mit 2 Gewichtsprozent chemisch modifiziertem Kollagen in physiologischem Puffer wurde unter Verwendung eines Platte-Kegel-Viskosimeters (kommerziell verfügbar als ein "Model 605 Mechanical Spectrometer" bei der Rheometrics Co., Piscataway, New Jersey) bei einer Temperatur zwischen etwa 19 ºC und 24 ºC und bei einer Feuchtigkeit von etwa 50 % gemessen. Die stationäre Viskosität wurde über eine Dauer von etwa 1,5 Minuten gemessen. Die Viskosität der Kollagenlösungen lag zwischen etwa 0,15 x 10&sup6; und 4,0 x 10&sup6; cP ((1 cP = 0,001 Pa s)) bei einer Scherrate von 0,10 s&supmin;¹; zwischen etwa 0,20 x 10&sup5; und 7,5 x 10&sup5; cP bei einer Scherrate von 1,0 s&supmin;¹; zwischen etwa 0,3 x 10&sup4; und 1,0 x 10&sup5; bei einer Scherrate von 10,0 s&supmin;¹ sowie zwischen etwa 0,45 x 10³ und 2,0 x 10&sup4; cP bei einer Scherrate von 100,0 s&supmin;¹.

Bei ophthalmischen Anwendungen ist ein pseudoplastisches Material ideal. Bei hohen Scherspannungen, d.h. während der Operation, wenn die Augengewebe, Instrumente und/oder Implantate im Inneren des Auges manipuliert werden, nimmt die Viskosität des Materials ab und reduziert dadurch die Widerstandskraft an den benachbarten Geweben, während die Viskosität bei geringen Scherspannungen, wenn sich das Material im Ruhezustand befindet, hoch ist und das Material als ein wirksames Gleitmittel für Implantate und/oder für Gewebeoberflächen wirkt, die sich relativ zueinander bewegen.

Außerdem ermöglicht Pseudoplastizität dem Chirurgen, die Kollagenlösung relativ mühelos durch kleine Nadelöffnungen in kleine Geweberäume einzubringen.

(e) Thixotropie

Eine thixotrope Flüssigkeit kann als ein pseudoplastisches Material definiert werden, das in der Lage ist, seine Viskosität zurückzugewinnen, wenn man es für eine längere Zeitdauer ruhen läßt, nachdem es spannungsbelastet war. Normalerweise sind chemisch modifizierte Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung in der Lage, ihre stationäre Viskosität wieder zu gewinnen, nachdem sie durch eine Spritze injiziert worden sind. Insbesondere gewinnen Kollagenlösungen 50 bis 95 %, vorzugsweise 65 bis 95 %, ihrer stationären Viskosität innerhalb von etwa 7 Minuten nach der Scherbelastung wieder zurück.

(f) Keine Entzündung hervorrufend und biologisch kompatibel

Bevorzugte viskoelastische Lösungen des chemisch modifizierten Kollagens wurden in physiologischem Puffer (etwa 1 % bis 3 Gewichtsprozent) als Implantate für die vordere Augenkammer bei mehreren Tierarten bewertet, umfassend Kaninchen, Hund, Schwein, Gans und Makak. Die chemisch modifizierten Kollagenlösungen wurden in das eine Auge und Konstrollsubstanzen wie beispielsweise Luft, Mineralsalzmedium, z.B. BSS oder Healon , kommerziell verfügbar bei Pharmacia Co., in das kontralaterale Auge injiziert. Sowohl das behandelte als auch das Kontrollauge wurden nach nicht mehr als 24 Stunden nach der Implantation und nochmals in 24 Stunden Abständen bis zu 2 Wochen mit einer Spaltlampe untersucht. Zur Auswertung der Augen wurde ein modifiziertes McDonald-Shadduck-Bewertungssystem angewandt (McDonald, T.O. und Shadduck, LT.A. (1977); "Eye Irritation" in: Advances in Modern Toxicology, Bd. 4, Dermatotoxicology and Pharmacology, S. 162.. .166; New York: John Wiley & Sons, Inc.). Dieses System umfaßt die Auswertung und Bewertung von: konjuntivaler Congestion, Schwellung und Laufen, wäßriges Flackern, Entzündung der Iris, Hornhauttrübung und Ödem, Pannus-Bildung und Aussehen der vorderen Kapsel. Darüber hinaus wurden Auswertungen des vorhandenen Materials und des Umfanges der Bedeckung in der vorderen Augenkammer vorgenommen. Derartige Auswertungen zeigten die Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des chemisch modifizierten Kollagens zu Luft, BSS und Healon .

Dementsprechend wurden die bevorzugten Kollagenlösungen bestimmt als "keine Entzündung hervorrufend" und biologisch kompatibel.

(g) Schmelztemperatur

Die Schmelztemperatur ist diejenige Temperatur, bei der die viskoelastische Kollagenlösung einen drastischen Verlust der Viskosität zeigt, d.h. die Viskosität auf über das 100- bis 1.000-fache in Centipoise bei Messung bei einer Scherrate von 1 s&supmin;¹ abfällt. Normalerweise liegt die Schmelztemperatur der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Kollagenlösungen (bei Messung unter Verwendung eines Differentialscanningkalorimeters) zwischen etwa 32 ºC und 48 ºC.

Die Schmelztemperatur kann durch Kontrolle des Kupplungsgrads reguliert werden; ein größerer Kupplungsgrad erzeugt ein Material mit einer höheren Schmelztemperatur. Kollagenlösungen, die eine Schmelztemperatur zwischen etwa 34 ºC und 38 ºC haben, sind als lmplantate für die vordere Augenkammer zur Verwendung in der Staroperation, IOL- Chirurgie und Hornhauttransplantationen sowie als viskoelastische chirurgische Hilfsmittel für Hornhauttransplantate am besten geeignet. Materialien mit niedrigerer Schmelztemperatur werden bei diesen Anwendungen bevorzugt, so daß das Material vor dem Auge relativ rasch klar wird, d.h. innerhalb von etwa 24 Stunden, und dadurch die Möglichkeit einer vorübergehenden Zunahme des intraokularen Drucks herabgesetzt wird. Materialien mit einer höheren Schmelztemperatur zwischen etwa 39 ºC und 45 ºC werden bei Anwendungen bevorzugt, bei denen ein thermisch stabileres Material benötigt wird, z.B. als Glaskörperersatz, als Gelenkflüssigkeitsersatz und als ein viskoelastisches chirurgisches Hilfsmittel bei Hornnauttransplantation.

(h) Osmolarität

Die Osmolarität der Kollagenlösung darf nicht so groß oder so klein sein, daß bei Zellen ein osmotisches Trauma erzeugt wird, die mit der Lösung in Kontakt gelangen. Normalerweise sind die Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung isotonisch und weisen Osmolaritäten zwischen etwa 200 und 400 mOsm auf, bevorzugt zwischen etwa 260 und 340 mOsm und am meisten bevorzugt zwischen etwa 280 und 320 mOsm.

Die bevorzugten Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung haben besondere Anwendbarkeit in der Augenchirurgie als ein wäßriges oder glasartiges Ersatzmittel ((auch bezeichnet als Glaskörperersatz)). Die wäßrige Körperflüssigkeit kann durch die Kollagenlösung nach verschiedenen intraokularen oder extraokularen operativen Maßnahmen ersetzt werden, um eine Zellinvasion der vorderen Augenkammer zu verhindern, durch die die Regeneration und Funktion der Iris, der Ziliarkörper und des Hornhautendothels gefährdet wären. Die bevorzugte Kollagenlösung kann auch als eine Prothese in der vorderen Augenkammer nach einer Staroperation verwendet werden, um den vorgefallenen Glaskörper zurückzudrücken und eine Trennung zwischen Glaskörper und Hornhaut zu gewähren. Ferner könnte die Kollagenlösung in der vorderen Augenkammer nach einer Hornhautplastik verwendet werden, um eine Adhäsionsbildung zwischen der Hornhautwunde und der Iris zu vermeiden.

Die bevorzugte Kollagenlösung kann nach einem umfangreichen intravitrialen Eingriff (Entfernung von Blutungen, Trübungen, usw.) in den Glaskörper implantiert werden, um eine übermäßige Zellreaktion und Entwicklung von Fasciae und präretinalen Gewebemembranen zu vermeiden.

Darüber hinaus sind die bevorzugten Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung in der Chirurgie der Netzhautablösung verwendbar, um ein viskoelastisches Mittel bei der Manipulation zum Wiederanheften der Netzhaut zu schaffen und das Heilen der intraokularen Wunde zu erleichtern, indem eine übermäßige Bildung von fibrösem Gewebe und Entwicklung von intravitrealem Narbengewebe vermieden wird.

Die bevorzugten viskoelastischen Lösungen der vorliegenden Erfindung haften an hydrophoben polymeren Oberflächen, wie beispielsweise intraokularen Linsen aus Polymethylmethacrylat oder Polypropylen. Somit können intraokuläre Linsen leicht mit der Kollagenlösung beschichtet werden, wodurch während des Einsetzens in die vordere oder hintere Augenkammer des Auges nicht so leicht Trauma und Gefährdungen hervorgerufen werden. Das chemisch modifizierte Kollagen könnte ebenfalls als ein Netzmittel in Lösungen für Kontaktlinsen verwendet werden. Eine derartige benetzende Lösung würde auf den Linsen für eine längere Zeit verweilen als bisherige bekannte Netzmittellösungen, wodurch die Annehmlichkeit, die dem Träger der Linsen geboten wird, verlängert wird.

Die Kollagenlösungen könnten als ein Träger zur Medikation bei ophthalmischen oder orthopädischen Anwendungen zur Verlängerung der Wirksamkeit des Medikaments verwendet werden.

In anderen therapeutischen Anwendungen sind bestimmte nichtimmunogene Kollagenlösungen verwendbar, um die Bildung von fibrösem Gewebe und die sich daraus entwickelnden Adhäsion und Narben zu vermeiden. Beispielsweise geht man in Fällen von traumatischer Arthritis, Osteoarthritis und Bursitis davon aus, daß nichtimmunogene Kollagenlösungen als Ersatz für synoviales Fluid in einem synovialen Raum verwendet werden können, um die Entwicklung von intraartikulärem fibrösen Gewebe (Pannus, Ankylosis, Adhäsionen) zu hindern und den Heilungsprozeß von Knorpelgeweben und synovialem Gewebe zu unterstützen. Der hierin verwendete Begriff "synovialer Raum" soll denjenigen Raum bezeichnen, der Gelenke, Sehnen und/oder Beutel trennt. In der Anthroplastik, Osteotomie und allen Arten der intraartikulären Chirurgie, wie beispielsweise Arthroskopie, könnten bestimmte Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung zum Schutz der artikulären Knorpeloberflächen gegen postoperative Verletzung und den möglichen schädlichen Einfluß von Protesenoberflächen verwendet werden, um die übermäßige Bildung von vibrösem Gewebe zu vermeiden und die normale Heilung der weichen Gewebe und Knorpel zu unterstützen.

Es wird ferner angenommen, daß bestimmte Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung zwischen Sehnen und ihren Scheiden implantiert werden könnten, um die Adhäsionsbildung nach einem etwaigen operativen Eingriff oder um periphere Nerven und Nervenwurzeln nach Verletzung oder chirurgischem Eingriff auf ein Minimum herabzusetzen, wenn die Beschädigung des Bindegewebes um den Nerv umfangreich ist und eine übermäßige Narbenbildung zu erwarten ist. Implantation der Kollagenlösungen um den heilenden (sich regenerierenden) Nerv kann ihn vor Invasion durch Bindegewebszellen schützen.

Um Adhäsionsbildung zwischen zwei Endothel- oder Bindegewebsmembranen zu vermeiden, könnten bestimmte Kollagenlösungen zwischen mesothelialen, perikardialen und pleuralen Schichten implantiert werden.

Das chemisch modifizierte Kollagen der vorliegenden Erfindung ist in Form einer trockenen Membran auch als ein Wundverband verwendbar. Das Kollagen kann bei Verwendung zum Abdecken von Hautwunden als eine Barriere für Wasser und Mikroorganismen wirken.

Bestimmte Kollagenlösungen könnten zum Separieren von Gewebeoberflächen verwendet werden. Die viskoelastischen Eigenschaften der Lösung würden das Gewebe während des operativen Eingriffs und postoperativ schützen. Die Kollagenlösungen sind günstig zum Verbessern der Gleitfunktion von Muskelscheiden und Sehnenscheiden bei traumatischen Verletzungen.

In der orthopädischen oder kardiovaskulären Chirurgie sind bestimmte Kollagenlösungen zum Gleitendmachen und Beschichten von implantaten verwendbar. Ferner könnte die Lösung verwendet werden, um Gefäßimplantate daran zu hindern, Körperflüssigkeiten zu berühren, und könnte ebenfalls als eine Komponente künstlicher Gefäße verwendet werden.

Die Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung sind ferner als Befeuchtungsmittel und Gleitmittel in kosmetischen Crems und Lotions verwendbar.

Lyophilierte gekuppelte Kollagen- und gekuppelte und mit Amin modifizierte Kollagenlösungen der vorliegenden Erfindung sind als hämostatische Mittel verwendbar.

Unlösliches gekuppelt es Kollagen mit einem pH von 7 und gekuppelte und mit Amin modifizierte Kollagenmaterialien der vorliegenden Erfindung können zum Aufbau von weichem Gewebe verwendet werden.

Weitere Anwendungen der chemisch gekuppelten und/oder mit Amin modifizierten Kollagenverbindungen und viskoelastischen Lösungen der vorliegenden Erfindung sind dem Fachmann zweifelsfrei ersichtlich, so daß die vorstehende Beschreibung die möglichen Anwendungen nicht beschränkt.

Um das Wesen der vorliegenden Erfindung klarer zu offenbaren, werden nun die folgenden Beispiele beschrieben, welche die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Methoden zur Verwendung solcher Zusammensetzungen veranschaulichen. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß dieses ausschließlich als Beispiel dient und weder zur Begrenzung des Umfanges der Erfindung noch zur Einschränkung des Schutzumfanges der beigefügten Ansprüche dient.

Beispiel 1

Isolation und Reinigung von Kollagen Typ I wurden durch die folgende Methode erzielt. Es wurde gereinigte, enthaarte Rinderhaut (200 g) einer Kryomahlung unterzogen und zu 15 l 0,5m Essigsäurelösung bei 4 ºC zugesetzt. Das Kollagen ließ man für 1 Stunde solubilisieren. Die terminalen nicht- helikalen Abschnitte der Telopeptid-Kollagenmoleküle wurden von den helikalen Abschnitten des Moleküls durch Zusatz von Pepsin (5,86 g) zu der Kollagenlösung und Rühren dieser Mischung bei 4 ºC für 16 Stunden abgespalten. Der pH-Wert der Lösung wurde sodann durch Zusatz von Ion Natriumhydroxid auf 7,0 erhöht. Nach 2-stündigem Mischen (unter Beibehaltung der Temperatur von 4 ºC) wurde das denaturierte Pepsin durch Filtration aus der Lösung entfernt. Die Kollagenlösung wurde sodann durch allmählichen Zusatz von festem Salz auf 2,5m Natriumchlorid eingestellt. Der resultierende Kollagenniederschlag wurde auf genommen und in 0,5m Essigsäure rekonstituiert. Das Kollagen wurde wiederum durch Zusatz von Natriumchlorid auf 0,8m ausgefällt. Der Niederschlag wurde aufgenommen und in 0,5m Essigsäure rekonstituiert. Das Ausfällen des Kollagens durch Zusatz von Natriumchlorid auf 0,8m wurde wiederholt. Der aufgenommene Niederschlag wurde in 0,1m Essigsäure rekonstituiert, um eine Lösung von Kollagen Typ I mit 0,3 Gewichtsprozent einer hohen Reinheit mit einem pH-Wert von etwa 3 zu schaffen.

Das Filter-sterilisierte gereinigte Kollagen wurde in der folgenden Weise chemisch modifiziert. Alle Reaktionen wurden unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung steriler Lösungen und Reagenzien durchgeführt. Die Kollagenlösung (3.000 ml) wurde mit 5n Natriumhydroxid bei 4 ºC behandelt, um den pH-Wert auf 9,0 zu erhöhen. Succinsäureanhydrid-Pulver in feiner Verteilung (1,60 g) wurde zu dieser Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde heftig gerührt und der pH-Wert durch allmähliche Zugabe von 1n Natriumhydroxid bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Nach etwa 2 Minuten wurde Succinylchlorid (0,60 g) zugesetzt. Das Rühren wurde für 30 Minuten fortgesetzt und der pH-Wert durch Zusatz von 1n Natriumnydroxid bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Das resultierende gekuppelte Kollagenprodukt wurde durch Zusatz von Succinsäureanhydrid in feiner Verteilung (1,60 g) weiterbehandelt (bei 24 ºC). Wie zuvor, wurde der pH-Wert durch allmählichen Zusatz von In Natriumhydroxid bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Die Lösung wurde für weitere 60 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 6n HCl auf 4,1 gesenkt, um das chemisch modifizierte Kollagenprodukt auszufällen. Das Produkt wurde durch Zentrifugieren aufgenommen und nacheinander mit 4 Volumina sterilem Wasser gewaschen. Der Kollagenniederschlag wurde in einer Phosphat-gepufferten Lösung¹ aufgelöst, um eine modifizierte Kollagenlösung von 2 Gewichtsprozent zu schaffen, wobei der pH-Wert mit 1n Natriumhydroxid auf 7,2 eingestellt wurde.

Die Kollagenlösung war sowohl bei visueller Betrachtung als auch in der Lichtmikroskopie bei 40-fach farblos und transparent.

Die chemisch modifizierte Kollagenlösung wurde in Neuseeland an weißen Kaninchen, reinzüchtigen Beagle, Weißen Hausgänsen, Yorkshire-Schweinen und Makaken als ein lmplantat der vorderen Augenkammer ausgewertet. Die lmplantation wurde folgendermaßen ausgeführt. Das Tier wurde intramuskulär mit Ketoamin anästhesiert. Nach der Sedierung wurden die orbitalen Bereiche rasiert und das Tier in die Chirurgie gefahren und unter Verwendung von Halothan und Dinitrogenoxid anästhesiert. Die Augen wurden mit Chloromycetin beschichtet und auf die umgebenden Bereiche gegeben. Die Augen wurden mit BSS gespült. Die orbitalen Bereiche ließ man trocknen, und es wurde ein Spekulum in das Auge eingesetzt. Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Anwendung der Augenmikrochirurgie durchgeführt.

Unter Verwendung einer "Supersharp Beaver Blade-Klinge" wurde am Limbus ein Einschnitt in die vordere Augenkammer mit näherungsweise 1 mm ausgeführt. Wäßriges Fluid wurde abgelassen und die wäßrige Kammer mit BSS oder BSS - enthaltendes Heparin (1 ml von 5.000 Einheiten/ml in 500 ml) ¹ Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

und Epinephrin (1 ml von 1:1000 in 500 ml) gespült. Die vordere Kammer wurde aspiriert und vollständig entleert. Sodann wurde die Kammer unter Verwendung einer 27er Kanüle mit dem chemisch modifizierten Kollagen (eine Lösung mit 2 Gewichtsprozent in Phosphat-gepufferter Lösung²) gefüllt.

Das kontralaterale Kontrollauge wurde mit BSS , Luft oder einer Lösung von viskoelastischem Natrium-Hyaluronat, kommerziell verfügbar als Healon bei Pharmacia Co., gefüllt. Die Menge des in die vordere Augenkammer injizierten Materials hing von dem wäßrigen Volumen und dem eigenen inneren Augendruck ab. Das Material wurde soweit injiziert, bis der Gegendruck es an der Injektionsstelle austreten ließ.

Sowohl das behandelte als auch das Kontrollauge wurde mit Hilfe eines Spaltlampen-Mikroskopes unter Anwendung des McDonald-Shadduck-Systems nicht mehr als 24 Stunden nach 0der Behandlung und wiederum in Abständen von 24 Stunden bis zu 96 Stunden untersucht. Dieses System umfaßt Bewertung und Auswertung der konjunktivaler Congestion, Schwellung und Laufen, wäßriges Flackern, Entzündung der Iris, Hornhauttrübung und Ödem, Pannus-Bildung und Aussehen der vorderen Kapsel. Eine derartige Auswertung zeigt die Gesamtüberlegenheit des nach dem vorliegenden Beispiel der Erfindung hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens gegenüber Luft, BSS und Healon .

Chemisch modifiziertes Kollagen (eine Lösung von 2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung²), das nach dem vorliegenden Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde während der intraokularen Linsenimplantation bei einem weißen Kaninchen "Neuseeland" als ein Anteriorzusatz bewertet. Es wurde festgestellt, daß die Kollagenlösung die vordere Augenkammer für mindestens 30 Minuten inflatiert ² Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

hielt und eine für die Extraktion der Starlinse und Implantation einer intraokularen Linse (IOL) geeignete hervorragende Kammertiefe gewährte. Der IOL-Einsatz wurde erleichtert, während eine traumatische Beschädigung, wie sie beim IOL-Einsatz ohne Verwendung einer viskoelastischen Substanz beobachtet wurde, reduziert wurde. Das Kollagenmaterial überzog die chirurgischen Instrumente und die Oberflächen der IOL.

Um die Biokompatibilität der modifizierten Kollagenlösung zu prüfen, wurde der nachfolgende Test durchgeführt. Es wurden primäre Human-Endothelzellkulturen auf Multititerplatten gehalten, die mit 1 % Gelatine in normaler Salzlösung (0,9 % NaCl) beschichtet waren. Nachdem der Zusammenfluß erreicht war, wurden die Zellen mit Kochsalzlösung gewaschen und mit der chemisch modifizierten Kollagenlösung geflutet (2 Gewichtsprozent in Phosphatgepufferter Lösung³). Nach einer Stunde bei 35,5 ºC wurde die Kollagenlösung aspiriert und die Zellen mit serumfreiem Mittel gespült. Die Zellen wurden in dem Medium für weitere 24 Stunden inkubiert. Die Zellkulturen wurden mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie vor der Aufbringung der Kollagenlösung, 3 Minuten nach der Aufbringung der Kollagenlösung, eine Stunde nach Aufbringung des Kollagens und 24 Stunden nach Entfernung der Kollagenlösung untersucht. Die behandelten Zellen waren genauso gesund (d.h. sie waren nicht abgestorben und unterlagen keinen morphologischen Veränderungen) wie die unbehandelten, was darauf hinweist, daß die Kollagenlösung keine toxischen Einflüsse ausübt. ³ Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in Phosphatgepufferter Lösung³) erwies sich unter Anwendung des folgenden Tests als viskoelastisch, d.h. sie zeigte den Weissenberg-Effekt. Ein mit Motor angetriebener Rührstab mit einem Flügeldurchmesser von einem halben Zoll, der mit Polytetrafluorethylen beschichtet war, wurde in ein 50 ml- Becherglas getaucht, das etwa 30 ml der Kollagenlösung enthielt, und mit etwa 40 Umdrehungen pro Minute rotiert. Die Kollagenlösung strömte im rechten Winkel zur aufgebrachten Kraft und bewegte sich an dem Rührstab um mindestens 0,5 cm nach oben.

Die Viskosität der Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in Phosphat-gepufferter Lösung³) wurde rheometrisch folgendermaßen untersucht. Es wurden bei Raumtemperatur (22 ºC...24 ºC) mit einem mechanischen Spektrometer (kommerziell verfügbar als ein "Model 605 Mechanical Spectrometer" bei der Rheometrics Co., Piscataway, New Jersey) unter Anwendung der Platte-Kegel-Methode gemessen. Der Kegelwinkel wurde bei 0,1 Radiant gehalten und die Probe für 30 Sekunden geschert, um eine Gleichgewichtseinstellung zu ermöglichen, bevor die Kraft über eine Dauer von 1,5 Minuten gemessen und die Viskosität bestimmt wurde. Die Viskositäten wurden auf diese Weise für mehrere Scherraten bestimmt und in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I
Scherraten (in s&supmin;¹) Viskosität (in Centipoise)

Die Viskosität der Kollagenlösung nahm mit zunehmenden Scherraten ab, was darauf hinweist, daß die Lösung pseudoplastisch war.

Die Thixotropie der Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in Phosphat-gepufferter Lösung&sup4;) wurde folgendermaßen nachgewiesen: Es wurden unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Platte-Kegel-Methode Viskositätsmessungen bei einer Scherrate von 0,1 s&supmin;¹ ausgeführt. Nach Scherverdünnung bei 500 s&supmin;¹ für 30 Sekunden wurde die Scherkraft entfernt und die Probe für 7 Minuten erholen gelassen. Die Probe wurde wiederum bei einer Scherrate von 0,1 s&supmin;¹ geschert und nochmals die Viskosität aufgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II
Anfangsviskosität bei s&supmin;¹ (in Centipoise) Viskosität nach 7 Minuten bei s&supmin;¹ ( in Centipoise) prozentuale Erholung

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) wurde ebenfalls auf Wirksamkeit als Ersatz für die vordere Augenkammer unter Verwendung des folgenden Tests, nachfolgend bezeichnet als "Spritzentest", geprüft. Es wurde eine 250-Mikroliter-Glasspritze ("Model 1725RN", verfügbar bei Hamilton Co., Reno, Nevada) mit einem Kolben der "Model 1725N-Spritze", ebenfalls verfügbar bei Hamilton Co., ausgestattet. Auf die Vorderseite des Kolbens wurde ein Messinggewicht aufgeschraubt, um eine konstante Kraft von 64 g auszuüben. Die Teflon-Spitze des Kolbens wurde leicht mit einem 30 Mikrometer feinen Schleifpapier angeschliffen, bis sich der Kolben leicht bewegen ließ. Der Zylinder war mit einer auswechselbaren 22er 2-Inch-Nadel ausgestattet. Die Kollagenlösung wurde blasenfrei in den Zylinder unter Verwendung einer nadellosen 1 mm-Kunnststoff-Tuberkulinspritze &sup4;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

eingeführt. Die Zeit zum Ausspritzen von 0,05 ml Lösung, d.h. die Zeit für die Abwärtsbewegung des Kolbens von 0,5 Inch in dem Zylinder, wurde in Tabelle III aufgezeichnet.

Tabelle III
Probe Kollagenkonzentration (Gewichtsprozent) Ausspritzzeit (Sekunden)

Die Erfinder haben festgestellt, daß, um die vordere Augenkammer angemessen zu halten, eine Ausspritzzeit von mehr als etwa 20 Sekunden benötigt wird. Zusätzlich wird eine Ausspritzzeit von weniger als etwa 120 Sekunden benötigt, damit die Lösung aus dem Auge austreten kann. Vorzugsweise liegt die Ausspritzzeit zwischen etwa 20 und 40 Sekunden.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wird mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie bei etwa 35 ºC...36 ºC bestimmt.

Beispiel 2

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehen wurde gereinigtes Kollagen vom Typ I mit der Ausnahme hergestellt, daß der gereinigte Kollagenniederschlag in 1.700 ml 0,05m Essigsäure rekonstituiert wurde, um eine Kollagenlösung von 0,15 Gewichtsprozent zu schaffen. Diese Lösung wurde bei 4 ºC gehalten und mit Ion Natriumhydroxid zur Erhöhung des pH- Werts auf 5 versetzt. Zu dieser heftig gerührten Lösung wurde Terephthaloylchlorid (0,1036 g) in 17 ml N,N'- Dimethylformamid mit einem Mal zugesetzt. Der pH-Wert der gerührten Mischung wurde mit 5n Natriumhydroxid rasch auf 9,0 ± 0,25 gebracht. Ein Überschießen wurde durch Rückmischen mit 6n HCl korrigiert. Das Rühren wurde für 6 Minuten fortgesetzt, während der pH-Wert bei 9,0 gehalten wurde. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von Sn NaOH bzw. 6n HCl für 2 Minuten auf 11,5 erhöht und sodann wieder auf 9,0 zurückgebracht, um das nichtumgesetzte Terephthaloylchlorid zu hydrolysieren und dadurch das gekuppelte Kollagenprodukt zu erzeugen.

Zu dem bei 4 ºC gehaltenen gekuppelten Kollagenprodukt wurde Glutarsäureanhydrid (0,1455 g) in 17 ml Aceton tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 1n Natriumhydroxid bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Die Lösung wurde für weitere 14 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit 1n Natriumhydroxid für 2 Minuten auf 11,8 gebracht und sodann mit 6n HCl für 15 Minuten auf 9,0 zurückgeführt. Der pH-Wert der Lösung wurde sodann durch Zusatz von 6n HCl auf 4,1 abgesenkt, um das chemisch modifizierte Kollagenprodukt auszufällen. Das Produkt wurde durch Zentrifugieren aufgenommen und wie in Beispiel 1 gewaschen. Der modifizierte Kollagenniederschlag wurde in BSS aufgelöst, um eine modifizierte Kollagenlösung mit 2 Gewichtsprozent zu schaffen, wobei der pH-Wert mit 1n Natriumhydroxid auf 7,15 eingestellt wurde.

Diese Lösung war nach Bestimmung sowohl durch visuelle Betrachtung als auch durch 40-fache Lichtmikroskopie farblos und transparent.

Die Viskosität wurde als Funktion der Scherrate entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur mit den folgenden Ergebnissen gemessen.

Tabelle IV
Scherrate (1 s&supmin;¹) Viskosität (in Centipoise)

Die Viskosität nahm mit zunehmender Scherrate ab, was darauf hinweist, daß die 2-gewichtsprozentige Kollagenlösung pseudoplastisch war.

Das chemisch modifizierte Kollagen (eine 2- gewichtsprozentige Lösung in BSS ) wurde als ein Implantat für die vordere Augenkammer bei Weißen Kaninchen "Neuseeländer" ausgewertet. Die Lösung hielt die vordere Augenkammer mindestens für 30 Minuten inflatiert und gewährte eine für die Extraktion der Starlinse und Implantation einer intraokularen Linse (IOL) geeignete hervorragende Kammertiefe. Die Kollagenlösung überzog die chirurgischen Instrumente und intraolulären Linsen.

Die Kollagenlösung (2-gewichtsprozentig in einer Phosphat-gepufferten Lösung&sup5;) wurde als ein Implantat für die vordere Augenkammer in "Neuseeländer"-weißen Kaninchen unter Anwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des chemisch modifizierten Kollagens dieses Beispiels in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Biokompatibilität der Kollagenlösung wurde folgendermaßen getestet. Es wurden dekontaminierte Human-Hornhäute mit weniger als 5 % abgestorbene Zellen für 4 Tage bei 34 ºC in BSS , Kollagenlösung (2-gewichtsprozentig in BSS ) 25 Volumenprozent in BSS oder Kollagenlösung (2- gewichtsprozentig in BSSTM) 50 Volumenprozent in BSS inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Hornhäute mit Trypanblau oder Atya-Alyzarinrot angefärbt und auf Zellmorphologie und -dichte untersucht. Die mit Kollagenlösungen behandelten Hornhäute zeigten keinen signifikanten Unterschied zu den mit BSS behandelten Hornhäuten. &sup5;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte den Weissenberg-Effekt bei Prüfung entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen Prozeduren.

Die Thixotropie des 2%igen Kollagenlösung wurde entsprechend der Beschreibung von Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V
Anfangsviskosität bei 0,1 s&supmin;¹ (in Centipoise) Viskosität nach 7 Minuten Erholung bei 0,1 s&supmin;¹ ( in Centipoise) prozentuale Erholung

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie bestimmt und betrug etwa 39 ºC...40 ºC.

Beispiel 3

Es wurde nach der Prozedur von Beispiel 2 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß 1,2,4-Benzoltricarbonsäureanhydrid (0,425 g) anstelle des Glutarsäureanhydrid als Amin-Modifikationsmittel Verwendet wurde. Nach dem Ausfällen und Waschen wurde das Kollagen in BSS aufgelöst, um eine 2-gewichtsprozentige Kollagenlösung zu schaffen. Der pH-Wert der Lösung wurde mit In Natriumhydroxid auf 7,2 eingestellt.

Die Kollagenlösung war sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40facher Lichtmikroskopie farblos und transparent.

Die Kollagenlösung wurde in einem Implantat der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen-"Neuseeländer" ausgewertet. Die Kollagenlösung hielt die vordere Augenkammer für mindestens 30 Minuten inflatiert und gewährte eine für die Extraktion der Starlinsen und Implantation einer intraokularen Linse (IOL) geeignet hervorragende Kammertiefe.

Die Kollagenlösung (2-gewichtsprozentig in BSS ) wurde als ein Implantat für die vordere Augenkammer bei erwachsenen Katzen entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Die Augen wurden 24 Stunden und 48 Stunden postoperativ durch Spekularmikroskopie zur Auswertung der allgemeinen Morphologie und Dichte von Endothelzellen untersucht. Es wurden keine nachteiligen Einflüsse auf das Hornhautendothel festgestellt.

Die Kollagenlösung (2-gewichtsprozentig in Phosphatgepufferter Lösung&sup6;) wurde als ein Implantat in der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen -"Neuseeländer" unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des chemisch modifizierten Kollagens dieses Beispiels in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung entsprechend der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch, erholt sich auf etwa 75 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten der Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie bei etwa 35 ºC...36 ºC. bestimmt. &sup6;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Beispiel 4

Es wurde nach der Prozedur von Beispiel 2 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß Cyclopentantetracarbonsäuredianhydrid (0,1786 g) in 17 ml N- Methylpyrrolidon anstelle des Terephthaloylchlorids als Kupplungsmittel und 1,2,4-Benzoltricarbonsäureanhydrid (0,5667 g) in 17 ml Aceton anstelle von Glutarsäureanhydrid an Amin-Modifikationsmittel verwendet wurden.

Die Kollagenlösung war sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40-facher Lichtmikroskopie transparent und farblos.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung&sup7;) wurde als ein Implantat in der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen- "Neuseeländer" unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigt eine Gesamtäauivalenz des entsprechend des vorliegenden Beispiels hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens gegenüber Luft, BSS und Healon . Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung entsprechend der Prozedur nach Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropische und erholt sich zu etwa 65...95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten der Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt. &sup7;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Beispiel 5

Es wurde nach der Prozedur von Beispiel 2 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß Sebacinsäurechlorid (0,2033 g) in 17 ml N-Methylpyrrolidon anstelle von Terephthaloylchlorid als Kupplungsmittel und Succinsäureanhydrid (0,1063 g) in 17 ml N-Methylpyrrolidon anstelle von Glutarsäureanhydrid als Amin-Modifikationsmittel verwendet wurden.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung&sup8;) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen -"Neuseeländer" unter Anwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens gegenüber Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung entsprechend der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholt sich zu etwa 73 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten bei einer Scherung von 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt. &sup8;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Beispiel 6

Es wurde entsprechend der Prozedur von Beispiel 2 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß 4-[p-(o-Chlorcarbonylbenzoyl)phenyl]butyrylchlorid (0,2652 g) in 17 ml Aceton anstelle von Terephthaloylchlorid als Kupplungsmittel und Succinsäureanhydrid (0,3933 g) in 17 ml Aceton anstelle von Glutarsäureanhydrid als Amin-Modifikationsmittel verwendet wurden.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung&sup9;) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen "Neuseeländer" unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch, zeigte bei Prüfung nach der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropische und erholt sich zu etwa 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differantialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt. &sup9;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Beispiel 7

Es wurde nach Prozedur von Beispiel 2 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß Diglykolsäurediacidchlorid (0,1442 g) in 17 ml Aceton anstelle von Terephthaloylchlorid als Kupplungsmittel und Diglykolsäureanhydrid (0,1973 g) in 17 ml Aceton anstelle von Glutarsäureanhydrid als Amin-Modifikationsmittel verwendet wurden.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung&sup9;) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen "Neuseeländer" unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung nach der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholt sich auf etwa 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten Scherung bei 0,1 s&supmin;¹

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt.

Beispiel 8

Es wurde wie in Beispiel 2 (1.700 ml einer 0,15- gewichtsprozentigen Kollagenlösung in 0,05m Essigsäure) hergestelltes gereinigtes Kollagen vom Typ I bei 4 ºC mit 10n Natriumhydroxid versetzt, um den pH-Wert auf 5,0 zu erhöhen. Eine Lösung von Bicyclo-(2,2,2)-oct-7-en-2,3,5,6- tetracarbonsäure-2,3,5,6-dianhydrid (0,0810 g) und 1,2,4- Benzoltricarbonsäureanhydrid (0,0660 g) in 17 ml N,N- Dimethylformamid wurde mit einem Mal dem gereinigten Kollagen vom Typ I unter Rühren zugesetzt. Der pH-Wert wurde sofort unter Verwendung von 10n Natriumhydroxid auf 9,4 erhöht und die Lösung für 10 Minuten unter Einhaltung des pHs bei 9,4 durch allmählichen Zusatz von 1n Natriumhydroxid gerührt. Nach 10 Minuten wurde der pH-Wert durch Zusatz von 10n Natriumhydroxid auf 12,1 erhöht und der pH-Wert für 2 Minuten bei 12,1 gehalten. Sodann wurde der pH-Wert durch Zusatz von 6n HCl auf 9,0 herabgesetzt und bei diesem Wert für 10 Minuten gehalten, während die Temperatur der Lösung von 4 ºC auf 32 ºC erhöht wurde.

Zu diesem gekuppelten Kollagenprodukt wurde 1,2,4- Benzoltricarbonsäureanhydrid (0,2472 g) in 17 ml Aceton tropfenweise zusammen mit 1n Natriumhydroxid zugesetzt, um den pH-Wert bei 9,0 ± 0,25 zu halten. Nach beendeter Zugabe wurde die Lösung für 10 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 10n NaOH bzw. 6n HCl für 3 Minuten auf 12,5 erhöht und auf 9,0 gesenkt. Nach 10 Minuten Rühren bei pH 9,0 wurde der pH-Wert auf 3,2 gesenkt und das chemisch modifizierte Kollagenprodukt ausgefällt. Die Lösung wurde für 15 Minuten leicht gerührt, um ein vollständiges Ausfällen zu gewährleisten. Das Material wurde durch Zentrifugieren aufgenommen und der aufgenommene Niederschlag viermal nacheinander mit sterilem Wasser bei einer Verdünnung von 10 Teilen Wasser zu 1 Teil feuchtem Niederschlag gewaschen.

Sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40-facher Lichtmikroskopie war eine 2-gewichtsprozentige Lösung des Kollagens in BSS farblos und transparent.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in BSS ) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei Weißen Kaninchen - "Neuseeländer" unter Verwendung des McDonald- Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch, zeigte bei Prüfung nach der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholt sich auf 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt.

Beispiel 9

Es wurde nach der Prozedur von Beispiel 8 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß 1,3,5-Benzoltrisulfonsäurechlorid (0,0727 g) in 17 ml NMethylpyrrolidon anstelle von Bicyclo-(2,2,2)-oct-7-en- 2,3,5,6-tetracarbonsäure-2,3,5,6-dianhydrid als Kupplungsmittel und o-Sulfobenzoesäure-cyclisches Anhydrid (0,0718 g) in 17 ml Aceton anstelle von 1,2,4-Benzoltricarbonsäureanhydrid als Amin-Modifikationsmittel verwendet wurden.

Eine 2-gewichstsprozentige Lösung des Kollagens in BSS war sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40- facher Lichtmikroskopie farblos und transparent.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung¹&sup0;) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei "Neuseeländer"-weißen Kaninchen unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte Gesamtäquivalenz des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon . ¹&sup0;) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch, zeigte bei Prüfung entsprechend der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholte sich auf etwa 75 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten bei Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 35 ºC...42 ºC bestimmt.

Beispiel 10

Es wurde nach der Methode von Beispiel 8 chemisch modifiziertes Kollagen mit der Ausnahme hergestellt, daß 3,3',4,4'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid (0,10 g) anstelle von Bicyclo-(2,2,2)-oct-7 en-2,2,5,6-tetracarbonsäuredianhydrid als Kupplungsmittel verwendet wurde.

Eine 2-gewichtsprozentige Lösung des Kollagens in BSS war sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40-facher Lichtmikroskopie farblos und transparent.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung¹¹) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei "Neuseeländer"-weißen Kaninchen unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon . ¹¹) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch, zeigte bei Prüfung entsprechend der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholte sich auf etwa 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten bei einer Scherung von 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt.

Beispiel 11

Es wurde wie in Beispiel 1 gereinigtes Kollagen vom Typ I in ausreichend 0,1m Essigsäure aufgelöst, um eine 0,15- gewichtsprozentige Lösung zu schaffen. Die Kollagenlösung (300 ml) wurde auf 4 ºC abgekühlt und der pH-Wert mit 10n NaOH auf 9,0 eingestellt. Unter heftigem Rühren wurde dem Kollagen 1,3-Benzoldisulfonylchlorid (0,07 g), aufgelöst in 3 ml Ethylenglykoldimethylether, zugesetzt. Der pH-Wert wurde für 15 Minuten durch allmählichen Zusatz von 1n NaOH bei 9,0 ± 0,25 gehalten.

Nach 15 Minuten wurde eine Lösung, die 1,2,4- Benzoltricarbonsäureanhydrid (0,05 g) aufgelöst in 3 ml Ethylenglykoldimethylether enthielt, zu der Kollagenlösung mit einem Mal zugesetzt. Der pH-Wert wurde für eine Dauer von 45 Minuten bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Der PH-Wert wurde durch Zusatz von 10n NaOH für 3 Minuten auf 12,0 erhöht. Der pH-Wert wurde sodann unter Verwendung von 6n HCl auf 3,3 herabgesetzt, um das chemisch modifizierte Kollagenprodukt auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration aufgenommen und unter Verwendung von deionisiertem Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in einer Phosphatgepufferten Lösung¹² rekonstituiert, um eine 2-gewichtsprozentige Lösung zu schaffen.

Die Kollagenlösung war sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40-facher Lichtmikroskopie farblos und transparent.

Die Kollagenlösung wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei "Neuseeländer"-weißen Kaninchen unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung nach der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholt sich auf etwa 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt.

Beispiel 12

Es wurde nach Beispiel 2 hergestelltes gereinigtes Kollagen vom Typ 1 (750 ml) bei 4 ºC mit 10n NaOH versetzt, um den pH-Wert auf 5,0 zu erhöhen. Es wurden p- Fluorsulfonylbenzolsulfonylchlorid (0,0251 g) und 0,0124 g Glutarsäureanhydrid in 7,5 ml Aceton unter heftigem Rühren in einer Portion der Kollagenlösung zugesetzt. Der pH-Wert ¹²) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

wurde sofort unter Zusatz von 10n NaOH bzw. 6n HCl auf 11,7 erhöht bzw. danach auf 9,2 herabgesetzt. Die Lösung wurde für 15 Minuten gerührt, um das gekuppelte Kollagenprodukt zu erzeugen.

Die gekuppelte Kollagenlösung wurde bei 4 ºC durch tropf enweisen Zusatz von Glutarsäureanhydrid (0,0642 g) in 7,5 ml Aceton behandelt und der pH-Wert durch Zusatz von In NaOH bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Nach beendeter Zugabe wurde die Lösung für 10 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 6n HCl auf 4,0 herabgesetzt und die Lösung für weitere 10 Minuten gerührt. Der modifizierte Kollagenniederschlag wurde durch Zentrifugieren aufgenommen und viermal mit sterilem Wasser bei einer Verdünnung von 10 Teilen Wasser zu 1 Teil feuchtem Niederschlag gewaschen.

Eine 2-gewichtsprozentige Lösung des Kollagens in BSS war sowohl bei visueller Betrachtung als auch bei 40-facher Lichtmikroskopie farblos und transparent.

Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in BSS ) wurde als ein Implantat der vorderen Augenkammer bei "Neuseeland"- weißen Kaninchen unter Verwendung des McDonald-Shadduck- Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz oder Überlegenheit des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung nach der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholt sich auf etwa 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt.

Beispiel 13

Es wurde wie in Beispiel 1 hergestelltes gereinigtes Kollagen vom Typ I in 300 ml einer 0,1m Essigsäurelösung rekonstituiert, um eine 0,20-gewichtsprozentige Lösung zu schaffen. Die Kollagenlösung (300 ml) wurde auf 4 ºC abgekühlt und der pH-Wert mit 10n NaOH auf 8,0 eingestellt. Zu der Kollagenlösung wurde unter Rühren allmählich 5- Chlorsulfonyl-o-anissäurechlorid (0,030 g), aufgelöst in 3 ml Aceton, zugesetzt und der pH-Wert durch Zusatz von In NaOH bei 8,0 gehalten. Es wurde ein pH-Wert der Reaktion von 8,0 verwendet, um die Konzentration von verfügbaren freien Aminen zu reduzieren, wodurch der Kupplungsgrad kontrolliert wird. Nach 6 Minuten der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zusatz von sn NaOH auf 13 erhöht, um jegliches restliches Kupplungsmittel zu hydrolysieren und die Reaktion anzuhalten. Der pH-Wert wurde für 2 Minuten bei 13 gehalten und sodann unter Verwendung von 6n HCl auf 9,0 herabgesetzt.

Es wurde eine Lösung, die Glutarsäureanhydrid (0,034 g) aufgelöst in 3 ml Aceton enthielt, zu der Kollagenlösung mit einer Portion zugesetzt. Der pH-Wert wurde durch allmählichen Zusatz von 1n NaOH für eine Dauer von 30 Minuten bei 9,0 ± 0,25 gehalten. Der pH-Wert wurde sodann unter Verwendung von 6n HCl auf 4,0 herabgesetzt, um das chemisch modifizierte Kollagenprodukt auszufällen. Der Niederschlag wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode aufgenommen und gewaschen. Der Kollagenniederschlag wurde in Mineralsalzmedium (BSSTM) aufgelöst, um eine 2- gewichtsprozentige Lösung zu schaffen. Der pH-Wert wurde sodann unter Verwendung von 1n NaOH auf 7,1 eingestellt. Die Kollagenlösung (2 Gewichtsprozent in einer Phosphat-gepufferten Lösung¹³) wurde als ein Implantat der ¹³) Die Phosphat-gepufferte Lösung enthielt 0,84 Gewichtsprozent NaCl, 0,054 Gewichtsprozent KCl, 0,017 Gewichtsprozent CaCl&sub2;, 0,028 Gewichtsprozent Na&sub2;HPO&sub4; und 0,004 Gewichtsprozent NaH&sub2;PO&sub4;.

vorderen Augenkammer bei "Neuseeländer"-weißen Kaninchen unter Verwendung des McDonald-Shadduck-Systems entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgewertet. Eine solche Auswertung zeigte eine Gesamtäquivalenz des nach diesem Beispiel hergestellten, chemisch modifizierten Kollagens in bezug auf Luft, BSS und Healon .

Die Kollagenlösung (etwa 2 Gewichtsprozent in BSS ) zeigte bei Prüfung entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur den Weissenberg-Effekt. Die Kollagenlösung ist pseudoplastisch und zeigte bei Prüfung entsprechend der Prozedur von Beispiel 1 abnehmende Viskositäten bei zunehmenden Scherraten. Die Kollagenlösung ist thixotropisch und erholt sich auf 65 bis 95 % ihrer Anfangsviskosität innerhalb von 7 Minuten der Scherung bei 0,1 s&supmin;¹.

Die Schmelztemperatur der 2%igen Kollagenlösung wurde mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie mit etwa 34 ºC...37 ºC bestimmt.


Anspruch[de]

1. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung, welche mindestens zwei native Kollagenmoleküle umfaßt, die an mindestens einer an jedem der Kollagenmoleküle vorhandenen Lysin-epsilon-Aminogruppe über eine Kupplungsgruppe gekuppelt sind, welche Kupplungsgruppe mindestens zwei Teile aufweist, die mit den Lysin-Aminogruppen direkt verknüpft sind, welche Teile ausgewählt werden aus Carbonyl- und Sulfonylgruppen und welche Carbonyl- und Sulf onylgruppen über gesättigte oder ungesättigte Alkylen-, Arylen- oder gemischte Alkylen-Arylen-Kupplungsketten miteinander verknüpft sind, welche Kupplungsketten weniger als zwanzig Kohlenstoffatome aufweisen und wahlweise Heteroatome enthalten, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, wobei das Kuppeln in einem so begrenzten Umfang erfolgt, daß die chemisch modifizierte Kollagenverbindung ungekuppelte, reaktionsfähige basische Stellen aufweist und in physiologischen Pufferlösungen ausreichend löslich ist, um eine viskoelastische Lösung zu schaffen.

2. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung nach Anspruch 1, bei welcher die Alkylen- und/oder Arylen-Kupplungsketten in verfügbaren aromatischen Positionen substituiert sind durch Carboxylgruppen, gerade oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, gerade oder verzweigtkettige Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder Halogenatomen und/oder in verfügbaren aliphatischen Positionen substituiert sind durch Carboxylgruppen oder Alkyl- oder Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

3. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung nach Anspruch 1, bei welcher die kuppelnde Gruppe die allgemeine Formel hat:

hat:

-B-A-B-

worin sind:

B unabhängig CO, SO&sub2; oder Kombinationen davon; und

A, ausgewählt aus

(I) einer aromatischen Gruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen;

darin sind:

Ar unabhängig ausgewählt aus einem aromatischen Ring mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, einem heteroaromatischen Ring mit Atomen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S, und mit 5 bis 10 Atomen oder Kombinationen davon;

J ist Wasserstoff oder -(L)b-B, worin L ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Phenylen, einem Alkylen mit etwa 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und einem Oxyalkylen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, b ist Null oder 1 und B wie vorstehend festgelegt, unter der Voraussetzung, daß lediglich eines der J in der Kette

-(L)b-B sein kann und alle anderen J Wasserstoff sind;

n ist Null oder 1;

a ist Null oder eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 und 4; und

D ausgewählt aus O, CO, S, SO, SO&sub2;,

-NH-CO-NH-, worin m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist,

R ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Phenyl und einer geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkyl- oder Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; und

J wie vorstehend festgelegt ist;

(3) einer aromatischen Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die aromatische Gruppe wahlweise in verfügbaren Positionen substituiert sein kann durch J, worin J wie vorstehend festgelegt ist;

(4) einer heteroaromatischen Gruppe mit Atomen, die ausgewählt werden aus C, N, O und S, und die 5 bis 14 Ringatomen haben, wobei die heteroaromatische Gruppe wahlweise in verfügbaren Positionen durch J substituiert ist, worin J wie vorstehend festgelegt ist;

(5) einer aliphatischen oder arylaliphatischen Kette, die eine oder zwei olefinische oder acetylenische Gruppen enthält und die 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, wobei die Kette wahlweise in verfügbaren Positionen durch J substituiert ist, worin J wie vorstehend festgelegt ist;

(6) einem alicyclischen Ring, der wahlweise partiell ungesättigt ist, 3 bis 15 Kohlenstoffatome hat, wobei der alicyclische Ring wahlweise in verfügbaren Positionen durch J substituiert ist, worin J wie vorstehend festgelegt ist;

(7) einem heterocyclischen Ring (außer einer heteroaromatischen Gruppe 4), der gesättigt oder ungesättigt ist und der Atome enthält, ausgewählt aus C, N, O und S, und der etwa 5 bis 12 Ringatome hat, wobei der heterocyclische Ring wahlweise in verfügbaren Positionen substituiert ist durch J, worin J wie vorstehend festgelegt ist;

worin sind:

t eine ganze Zahl zwischen 1 und 8;

B ausgewählt aus O, - , S, SO, SO&sub2;, CO,

CONH, SO&sub2;NH und NHCONH, worin R wie vorstehend festgelegt ist und m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist;

J wie vorstehend festgelegt und eingeschränkt;

s eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 8;

p Null oder eine ganze Zahl mit einem Wert vom 1 bis 4;

q Null oder 1; und

r Null oder eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 unter der Voraussetzung, daß, wenn q gleich 1 ist, r größer ist als Null; und

worin sind:

G ausgewählt aus einem aromatischen Ring mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, einem heteroaromatischen Ring mit 5 bis 10 Atomen, einem heterocyclischen Ring mit 5 bis 10 Atomen, wobei die heteroaromatischen und heterocyclischen Ringe Atome enthalten, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S;

J wie vorstehend festgelegt;

w eine ganze Zahl mit einem Wert zwischen 1 und 8;

B und q wie vorstehend festgelegt;

y 1 oder 2 und

v Null oder eine ganzen Zahl mit einem Wert zwischen 1 und 4 unter der Voraussetzung, daß, wenn q gleich 1 ist, v nicht Null ist.

4. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung, welche mindestens zwei native Kollagenmoleküle umfaßt, die an mindestens einer an jedem der Kollagenmoleküle vorhandenen Lysin-epsilon-Aminogruppe über eine Kupplungsgruppe gekuppelt sind, welche Kupplungsgruppe mindestens zwei Teile aufweist, die mit den Lysin-Aminogruppen direkt verknüpft sind, welche Teile ausgewählt werden aus Carbonyl- und Sulfonylgruppen und welche Carbonyl- und Sulf onylgruppen über gesättigte oder ungesättigte Alkylen-, Arylen- oder gemischte Alkylen-Arylen-Kupplungsketten miteinander verknüpft sind, welche Kupplungsketten weniger als zwanzig Kohlenstoffatome aufweisen, und die wahlweise Heteroatome enthalten, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, wobei das gekuppelte Lysin einen Abschnitt von Lysinepsilon-Aminogruppen haben, die nicht mit den Kupplungsgruppen verknüpft sind, von denen mindestens 60 Prozent modifizierte Gruppen sind, ausgewählt aus gesättigten oder ungesättigten Alkansulfonamid- und -carboxamidgruppen, Arensulfonamid- und -carboxamidgruppen sowie gemischten gesättigten oder ungesättigten Alkan-Arensulfonamid und -carboxamidgruppen, welche modifizierte Gruppen 2 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen und durch einen oder zwei Carbonsäure- oder Sulfonsäureteile terminiert sind, wobei jede modifizierte Gruppe wahlweise bis zu 5 Heteroatome enthält, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, und wahlweise in verfügbaren aromatischen und aliphatischen Positionen durch Carboxylgruppen, Alkyl- und Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Halogenen substituiert ist.

5. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung nach Anspruch 4, bei welcher die amin-modifizierende Gruppe die allgemeine Formel hat:

-B-A(B-K)z

worin sind:

B unabhängig CO, SO&sub2; oder Kombinationen davon; und

A, ausgewählt aus

(1) einer aromatischen Gruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen;

darin sind:

Ar unabhängig ausgewählt aus einem aromatischen Ring mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, einem heteroaromatischen Ring mit Atomen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S, und mit 5 bis 10 Atomen oder Kombinationen davon;

n ist Null oder 1;

a ist Null oder eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 und 4; und

D ausgewählt aus O, CO, S, SO, SO&sub2;,

-NH-CO-NH-, worin m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist,

R ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phenyl und einer geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkyl- oder Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen;

(3) einer aromatischen Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die aromatische Gruppe wahlweise in verfügbaren Positionen substituiert ist durch Wasserstoff;

(4) einer heteroaromatischen Gruppe mit Atomen, die ausgewählt werden aus C, N, O und S, und die 5 bis 14 Ringatome haben, wobei die heteroaromatische Gruppe wahlweise in verfügbaren Positionen durch Wasserstoff substituiert ist;

(5) einer aliphatischen oder arylaliphatischen Kette, die eine oder zwei olefinische oder acetylenische Gruppen enthält und die 2 bis 20 Kohlenstoffatome hat, wobei die Kette wahlweise in verfügbaren Positionen durch Wasserstoff substituiert ist;

(6) einem alicyclischen Ring, der wahlweise partiell ungesättigt ist, 3 bis 15 Kohlenstoffatome hat, wobei der alicyclische Ring wahlweise in verfügbaren Positionen durch Wasserstoff substituiert ist;

(7) einem heterocyclischen Ring (außer einer heteroaromatischen Gruppe 4), der gesättigt oder ungesättigt ist und der Atome enthält, ausgewählt aus C, N, O und S, und der etwa 5 bis 12 Ringatome hat, wobei der heterocyclische Ring wahlweise in verfügbaren Positionen durch Wasserstoff substituiert ist;

worin sind:

t eine ganze Zahl zwischen 1 und 8;

E ausgewählt aus O, - , S, SO, SO&sub2;, CO,

CONH, SO&sub2;NH oder NHCONH, worin R wie vorstehend festgelegt ist und m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist;

s eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 8;

p Null oder eine ganze Zahl mit einem Wert vom 1 bis 4;

q Null oder 1; und

r Null oder eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 unter der Voraussetzung, daß, wenn g gleich 1 ist, r größer ist als Null; und

worin sind:

G ausgewählt aus einem aromatischen Ring mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen. einem heteroaromatischen Ring mit 5 bis 10 Atomen und einem heterocyclischen Ring mit 5 bis 10 Atomen, wobei die heteroaromatischen und heterocyclischen Ringe Atome enthalten, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C, N, O und S;

w eine ganze Zahl mit einem Wert zwischen 1 und 8;

E und q wie vorstehend festgelegt;

y 1 oder 2 und

v Null oder eine ganzen Zahl mit einem Wert zwischen 1 und 4 unter der Voraussetzung, daß, wenn q gleich 1 ist, v nicht Null ist;

und worin z Null, 1 oder 2 ist unter der Voraussetzung, daß, wenn z Null ist, A in verfügbaren Positionen durch Wasserstoff substituiert ist; und K OH ist.

6. Verfahren zum Herstellen einer chemisch modifizierten Kollagenverbindung nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

(a) Zusetzen eines Kupplungsmittels zu einer wässrigen Lösung von mindestens 0,05 Gewichtsprozent nativem Kollagen in einer Menge von 1 bis 600 Molen Kupplungsmittel pro Mol natives Kollagen, welches Kupplungsmittel ausgewählt wird aus Di- und Tricarbonsäurehalogeniden, Di- und Trisulfonsäurehalogeniden, Di- und Trianhydriden, di- und trireaktiven aktiven Estern und Verbindungen mit mindestens zwei Teilen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carbonsäurehalogenid, Sulfonsäurehalogenid, Anhydrid und aktivem Ester; sowie

(b) Umsetzen des nativen Kollagens und des Kupplungsmittel s bei einem pH-Wert von oberhalb 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine Dauer, die ausreichend ist, um mindestens 90 Prozent des Kupplungsmittels mit dem Kollagen entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem das Kupplungsmittel ausgewählt wird aus Terephthaloylchlorid, Bicyclo- (2,2,2)-oct-7-en-2,3,5,6-tetracarbonsäure-2,3,5,6-dianhydrid; 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid; p-Fluorsulfonylbenzolsulfonylchlorid und wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches anfangs bei 3 ... 5,5 gehalten wird, bevor er auf oberhalb von 8 erhöht wird.

8. Verfahren zum Herstellen einer chemisch modifizierten Kollagenverbindung nach Anspruch 4, umfassend die Schritte von Anspruch 6 und den zusätzlichen Schritt:

(c) Zusetzen eines monoreaktiven amin-modifizierenden Mittels zu dem genannten Reaktionsgemisch, wobei das amin-modifizierende Mittel ausgewählt wird aus Anhydriden, Säurehalogeniden, Sulfonsäurehalogeniden und aktiven Estern, und zwar in einer Menge von mindestens 100 Molen amin-modifizierendes Mitttel pro Mol natives Kollagen; und

(d) Durchführen der Reaktion der Aminmodifikation bei einem pH-Wert oberhalb von 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine ausreichende Dauer, um im wesentlichen das gesamte amin-modifizierende Mittel entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren.

9. Viskoelastische Kollagenlösung, umfassend 0,5 bis 5,0 Gewichtsprozent einer Kollagenverbindung nach Anspruch 4 oder nach Anspruch 5, aufgelöst in einer physiologischen Pufferlösung.

10. Verfahren zum Herstellen einer chemisch modifizierten Kollagenlösung nach Anspruch 4, umfassend die Schritte:

(a) Zusetzen eines Kupplungsmittels zu einer wässrigen Lösung von mindestens 0,05 Gewichtsprozent nativem Kollagen in einer Menge von 1 bis 600 Molen Kupplungsmittel pro Mol natives Kollagen und eines monoreaktives amin-modifizierenden Mittels in einer Menge von mindestens 50 Molen amin-modifizierendes Mittel pro Mol natives Kollagen; welches Kupplungsmittel ausgewählt wird aus Di- und Tricarbonsäurehalogeniden, Di- und Trisulfonsäurehalogeniden, Di- und Trianhydriden, di- und trireaktiven aktiven Estern und Verbindungen mit mindestens zwei Teilen, ausgewählt aus Carbonsäurehalogenid, Sulfonsäurehalogenid, Anhydrid und aktivem Ester und worin das amin-modifizierende Mittel ausgewählt wird aus Anhydriden, Säurehalogeniden, Sulfonsäurehalogeniden und aktiven Estern;

(b) Reagierenlassen des Raktionsgemisches bei einem pH-Wert von oberhalb 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine Dauer, die ausreichend ist, um im wesentlichen das gesamte Kupplungsmittel und das aminmodifizierende Mittel entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren;

(c) Zusetzen von zusätzlichem monoreaktiven aminmodifizierenden Mittel zu dem Reaktionsgemisch von Schritt (b) in einer Menge von mindestens 50 Molen des modifizierenden Mittels pro Mol natives Kollagen; und

(d) Reagierenlassen des Raktionsgemisches von Schritt (c) bei einem pH-Wert von oberhalb 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine Dauer, die ausreichend ist, um im wesentlichen das gesamte modifizierende Mittel entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren.

11. Verfahren zum Herstellen einer chemisch modifizierten Kollagenverbindung nach Anspruch 4, umfassend die Schritte:

(a) Zusetzen eines monoreaktiven amin-modifizierenden Mittels zu einer wässrigen Lösung von mindestens 0,05 Gewichtsprozent nativem Kollagen in einer Menge von mindestens 25 Molen des amin-modifiziernden Mittels pro Mol natives Kollagen, welches amin-modifizierende Mittel ausgewählt wird aus Anhydriden, Säurehalogeniden, Sulfonsäurehalogeniden und aktiven Estern;

(b) Reagierenlassen des Reaktionsgemisches von Schritt (a) bei einem pH-Wert von oberhalb 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine Dauer, die ausreichend ist, um im wesentlichen das gesamte aminmodif izierende Mittel entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren;

(c) Zusetzen eines in Schritt (b) hergestellten Gemisches eines Kupplungsmittels in einer Menge von 1 bis 600 Molen Kupplungsmittel pro Mol natives Kollagen, welches Kupplungsmittel ausgewählt wird aus Di- und Tricarbonsäurehalogeniden, Di- und Trisulfonsäurehalogeniden, Di- und Trianhydriden, di- und trireaktiven aktiven Estern und Verbindungen mit mindestens zwei Teilen, ausgewählt aus Carbonsäurehalogenid, Sulfonsäurehalogenid, Anhydrid und aktivem Ester; und

(d) Reagierenlassen des Raktionsgemisches von Schritt (c) bei einem pH-Wert von oberhalb 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine Dauer, die ausreichend ist, um im wesentlichen das gesamte Kupplungsmittel entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren;

(e) Zusetzen von zusätzlichem monoreaktiven aminmodifizierenden Mittel zu dem Reaktionsgemisch von Schritt (d) in einer Konzentration von mindestens 75 Molen des modifizierenden Mittels pro Mol natives Kollagen; und

(f) Reagierenlassen des Raktionsgemisches von Schritt (d) bei einem pH-Wert von oberhalb 8 und bei einer Temperatur von 0º ... 35 ºC für eine Dauer, die ausreichend ist, um im wesentlichen das gesamte aminmodifizierende Mittel entweder umzusetzen oder zu hydrolysieren.

12. Viskoelastische physiologische Pufferlösung einer chemisch modifizierten Kollagenverbindung nach Anspruch 1 bis 5.

13. Viskoelastische Kollagenlösung nach Anspruch 9 und 12 zum Ersetzen von mindestens einem Teil der wässrigen oder glasartigen Körperflüssigkeit in einem Auge eines Menschen oder Tieres.

14. Viskoelastische Kollagenlösung nach Anspruch 9 und 12 zum Verhindern der Bildung von fibrösem Gewebe und daraus folgender Entwicklung von Adhäsion und Narben, die in heilendem Gewebe im Verlaufe des normalen Heilungsprozesses auftreten können.

15. Viskoelastische Kollagenlösung nach Anspruch 9 und 12 zum Gleitendmachen eines Gelenks oder Sehne eines Menschen oder Tieres.

16. Viskoelastische Kollagenlösung nach Anspruch 9 und 12 zum Separieren von heilenden Geweben und Beibehalten dieser Separation während des normalen Heilungsprozesses nach der Operation.

17. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung nach Anspruch 1 oder 4 zum Erzielen von Haemostase.

18. Chemisch modifizierte Kollagenverbindung nach Anspruch 1 oder 4 zum Vermehren von weichem Gewebe.







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