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Dokumentenidentifikation DE69019164T2 07.09.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0504202
Titel VERBESSERTES MENINGOKOKKALE POLYSACCHARIDKONJUGATVAKZIN.
Anmelder National Research Council of Canada, Ottawa, Ontario, CA
Erfinder JENNINGS, Harold, J., Gloucester, ON, K1J 6G6, CA;
MICHON, Francis, Ottawa, ON, K1M 1T5, CA
Vertreter Rechts- und Patentanwälte Lorenz Seidler Gossel, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69019164
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 13.12.1990
EP-Aktenzeichen 919001420
WO-Anmeldetag 13.12.1990
PCT-Aktenzeichen CA9000437
WO-Veröffentlichungsnummer 9108772
WO-Veröffentlichungsdatum 27.06.1991
EP-Offenlegungsdatum 23.09.1992
EP date of grant 03.05.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.09.1995
IPC-Hauptklasse A61K 39/095
IPC-Nebenklasse A61K 39/108   A61K 39/385   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft chemisch modifizierte Polysaccharide der Gruppe B von Neisseria meningitidis. Die Erfindung stellt ebenso Impfstoffe zur Verfügung, in denen die jeweiligen modifizierten Polysaccharide mit einem Protein-Träger konjugiert sind.

Hintergrund der Erfindung

Meningitis, verursacht durch N meningitidis der Gruppe B und E. coli K1, stellt ein großes Problem der Weltgesundheit dar. Gruppe-B-Meningitis tritt sowohl in endemischen als auch in epidemischen Situationen auf und ist für ungefähr die Hälfte aller berichteten Fälle meningokokkaler Meningitis verantwortlich, während K1 positive E. coli die Hauptursache für Meningitis in Neugeborenen darstellen. Im Augenblick ist kein Impfstoff gegen die durch Meningokokken der Gruppe B und E. coli K1 verursachte Erkrankung kommerziell verfügbar. Dies ist hauptsächlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß das Meningokokken-Polysaccharid der Gruppe B (GBMP) in Menschen nur geringfügig immunogen wirkt. Es gibt einige kürzlich beschriebene, auf Komplexen des GBMP mit Proteinen der äußeren Membran basierende Impfstoff-Kandidaten, jedoch gibt es bis jetzt keinen klaren Beweis ihrer Wirksamkeit im Menschen.

Vor kurzem wurde ein neues Konzept eines Impfstoffes entwickelt, das auf einem synthetischen, chemisch modifizierten (N-propionylierten) Gruppe-B-Polysaccharid-Protein (N-Pr-GBMP-Protein)-Konjugat beruht. Der Impfstoff induziert in Mäusen hohe Titer von IgG-Antikörpern, die nicht nur schützen, sondern auch mit unmodifizertem GBMP (d.h. N- Acetyl-GBMP) kreuzreagieren. Dieses Konzept wird beschrieben und als Patent beansprucht im U.S. Patent Nr. 4 727 136, erteilt am 23. Februar 1988 am Harold J. Jennings et al.

Es wurde gefolgert, daß ein Impfstoff der zu kreuzreaktiven Antikörpern führt, so wie der im U.S. Patent 4 727 136 beschriebene, nur auf Kosten Abschwächung (breaking) der Immuntoleranz erfolgreich sein kann. Diese Hypothese wird durch die Identifikation eines gemeinsamen Epitops legitimiert, das aus einer Kette von α-(2-8)-verknüpften Sialinsäureresten (bei einer Mindestanzahl von zehn Resten) besteht, sowohl bei nativem N- Ac-GBMP als auch in humanem und tierischem Gewebe. (Jennings, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, Band 10, 15165). Diese Polysialosyl-Ketten wirken als Entwicklungsantigene und wurden zum größten Teil mit dem fötalen Zustand bei der embryonalen, neuralen Zell-Adhäsion in Zusammenhang gebracht (Finne et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, 112, 482). Während der postnatalen Reifung wird dieses Antigen herunterreguliert (Friedlander et al., J. Cell Biol., 1985, 101, 412) wird aber im erwachsenen Menschen während der Regeneration erkrankter Muskeln exprimiert (Cashman et al., Ann. Neuron., 1987, 21, 481) sowie in Tumorzellen (Roth et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85, 299) und in natürlichen Killerzellen (NK) und CD3&spplus; T-Zellen (Husmann et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19, 1761). Obwohl die Folgen einer Abschwächung der Immuntoleranz gegenüber diesen fötalen Antigenen noch nicht bestimmt wurden, nimmt man generell an, daß aufgrund dieser Kreuzreaktion das N-Pr-GBMP-Protein Konjugat von Zulassungsbehörden äußerst sorgfältig untersucht werden würde, was zu beträchtlichen Ausgaben und Verzögerungen führen würde, verursacht durch die komplexe Versuchsdurchführung, die nötig ist, um die Gefahrlosigkeit des Impfstoffes vor der Genehmigung zu kommerziellem Vertrieb zu beweisen.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff zu entwickeln, der immunogene Eigenschaften aufweist, die im Vergleich zu denen des N-Pr-GBMP-Proteins erhöht sind. Es ist des weiteren ein Ziel der Erfindung, einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der beträchtlich verminderte Kreuzreaktivität mit einem humanen und tierischen neuralen Zell-Adhäsions-Antigen (fötalem N-CAM) aufweist.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein modifizertes B-Polysaccharid von Neisseria meningitidis zur Verfügung gestellt, dessen Sialinsäurerest-N-Acetyl (C&sub2;)-Gruppen durch eine C&sub4;-C&sub8; Acylgruppe ersetzt sind, wobei das modifizierte Polysaccharid ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 10 000 und 50 000 Dalton hat.

Gemäß einem anderen Aspekt wird ein antigenes Konjugat zur Verfügung gestellt, das das N- C&sub4;-C&sub8;-Acyl-Polysaccharid konjugiert mit einem immunologisch geeigneten Protein enthält, worin das modifizierte Polysaccharid von Neisseria meningitidis ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 10 000 und 50 000 Dalton aufweist, bei erhöhter Immunogenizität und beträchtlich verminderter Induktion kreuzreaktiver Antikörper.

Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Impfstoff zur Verfügung gestellt, der das N-C&sub4;-C&sub8;- Acyl-Polysaccharid-Protein-Konjugat in Verbindung mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmedium enthält. Die Impfstoffe der Erfindung können ebenfalls eine therapeutisch wirksame Menge eines für die Anwendung beim Menschen geeigneten Adjuvans wie z.B. Aluminiumphosphat oder Muminiumhydroxid enthalten.

Gemäß noch einem weiteren Aspekt wird ein modiziertes E. coli-K1-Kapsel-Polysaccharid zur Verfügung gestellt, worin die Sialinsäurerest-N-Acetyl-Gruppen des nativen Polysaccharides durch eine C&sub4;-C&sub8;-Acyl-Gruppe ersetzt sind, wobei das modifizierte Polysaccharid ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 10 000 und 50 000 Dalton hat.

Gemäß noch einem weiteren Aspekt wird eine gamma-Globulinfraktion zur Verfügung gestellt, die zum passiven Schutz gegen durch N. meningitidis der Gruppe B und E. coli K1 verursachte Meningitis befähigt ist, wobei diese gamma-Globulinfraktion durch Immunisierung eines Säugetiers mit dem Impfstoff und der Gewinnung von gamma-Globulin von dem Säugetier hergestellt wird. Die Fraktion wird durch die Immunisierung eines Säugetieres mit einem Impfstoff der Erfindung hergestellt.

Die Fraktion wird daraulhin einem Individuum verabreicht, um einem Schutz vor oder eine Behandlung von einer voranschreitenden, durch oben genannte Organismen verursachte Infektion zu gewährleisten. Daher wird es angesichts ihrer günstigen Immunogenizität bei minimaler Induktion von kreuzreaktiven Antikörpern mit dem humanen und tierischen neuralen Zell-Adhäsions-Antigen, fötalem N-CAM, geschätzt werden, daß die immunogenen Impfstoff- Konjugate der Erfindung eine Quelle therapeutischen Antiserurns zur Verfügung stellen. Die Konjugate der Erfindung werden ebenso nützlich sein, um monoklonale Antikörper zu erzeugen und, möglicherweise, antiidiotypische Antikörper.

In unseren letzten Experimenten wurde gefunden, daß die meisten der durch das N-Pr-GBMP- Protein-Konjugat, beschrieben in dem oben genannten an Jennings et al. erteilten U.S. Patent 4 727 136, induzierten bakteriziden und protektiven Antikörper nicht mit den mit fötalem NCAM kreuzreagierenden Antikörpern in Zusammenhang stehen. Tatsächlich ist die meiste protektive Aktivität in einer N-Pr-GBMP-spezifischen Antikörperpopulation enthalten, die nicht mit fötalem N-CAM kreuzreagiert. Angesichts dieser Tatsache glaubt man, daß das N- Pr-GBMP ein einmaliges bakterielles Epitop auf der Oberfläche von Meningokokken der Gruppe B nachahmt.

Die vorliegende Erfindung gründet auf der Entdeckung, daß es möglich ist, chemisch modifizierte GBMPs zu synthetisieren, die das bakterizide Epitop nachahmen und die, in ihrer konjugierten Form, nicht nur erhöhte Immunogenizität zeigen, sondern ebenso in beträchtlichem Maße die Induktion von Antikörpern, die mit fötalem N-CAM kreuzreagieren, verhindern.

Um bei der vorliegenden Erfindung anzukommen, wurden eine Anzahl verschiedener, chemisch modifizierter GBMPs synthetisiert und jeweils einzeln mit Protein konjugiert, gefolgt von der Injektion der Konjugate in Mäuse und dem Vergleich der Effekte mit den durch das N-Pr- GBMP-Konjugat hervorgerufenen. Überraschenderweise wurde gefünden, daß die N-C&sub4;-C&sub8;- Acyl-GBMP-Protein-Konjugate, z.B. das n-Butanoyl-, iso-Butanoyl-, n-Pentanoyl-, iso- Pentanoyl-, neo-Pentanoyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl- und Octanoyl- und besonders das N- Butanoyl (N-Bu)-GMBP-Protein-Konjugat, dem bakteriziden Epitop stark ähneln, bei gleichzeitiger, beträchtlicher Verminderung der Induktion kreuzreaktiver Antikörper.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das meningokokkale Polysaccharid der Gruppe B wird von N meningitidis mit Hilfe von Methoden isoliert, die im Fachgebiet bekannt sind. Gemäß einer solchen Methode werden Meningokokken der Gruppe B (Stamm 981B) bei 37ºC in einem Fermenter unter Verwendung von 30g getrocknetem Todd Hewitt Medium (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) pro Liter destillierten Wassers gezüchtet. Vor dem Wachstum im Fermenter wurde der lyophilisierte Stamm zu Anfang in einem Reagenzglas (candle jar) bei 37ºC auf 5% (v/v) Schafsblutagarplatten (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) gezüchtet. Die Bakterien wurden dann in 1,0 Liter Todd Hewitt Medium (wie oben angegeben) in einen Erlenmeyerkolben transferiert, der bei 37ºC 7 Stunden lang bei 190 U/min geschüttelt wurde. Dieses Inoculum wurde dann in den Fermenter transferiert. Nach dem Wachstum im Fermenter (16 Stunden) wurden die Bakterien durch Zugabe von Formalin bis zu einer Endkonzentration von 0,75% getötet. Die Bakterien wurden durch kontinuierliche Zentritugation entfernt, und das Meningokokken-Polysaccharid der Gruppe B wurde aus dem Überstand isoliert und gereinigt, im wesentlichen wie von Bundle et al., J. Biol Chem, 249, 4797-4801 (1974) beschrieben, mit dem Unterschied, daß das Protein durch Rühren einer Lösung des rohen Polysaccharides mit kaltem (4ºC) 90%igem Phenol statt heißem (50-60ºC) extrahiert wurde. Dieses zuletzt angegebene Verfahren gewährleistet, daß eine Form des GBMP mit hohem Molekulargewicht gewonnen wird.

E. coli (018:K1:H7) (NRCC 4283) wurden bei 37ºC in einem Fermenter in destilliertem Wasser, das entwässerte 'Brain Heart Infüsion' (BHI, 37g/l) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) enthielt, gezüchtet. Vor dem Wachstum im Fermenter wurde der lyophilisierte Stamm in 50 ml BHl-Lösung (wie oben angegeben) in einem Erlenmeyerkolben, der bei 37ºC 7 Stunden lang bei 200 U/min geschüttelt wurde, gezüchtet. Diese Kultur wurde dann in 1,5 Liter BHI (siehe oben) transferiert und unter denselben Bedingungen, wie oben beschrieben, 7 Stunden lang gezüchtet. Das Inoculum wurde dann in den Fermenter transferiert.

Die für die Isolation und Reinigung des Kapsel-Polysaccharides von E. coli K1 angewandten Verfahrensweisen waren identisch mit den oben für die Isolation des Meningokokken- Polysaccharides der Gruppe B beschriebenen.

Es wird geschätzt werden, daß die oben beschriebenen Isolations- und Reinigungsverfahren nicht die einzigen sind, die angewandt werden können, und daß andere Verfahrensweisen verfügbar sind, z.B. die von Watson et al., J. Immunol., 81, 331 (1958) und die im obengenannten U.S. Patent 4 727 136 beschriebenen.

Das native Polysaccharid wird N-deacetyliert, um eine reaktive Amingruppe im Bereich der Sialinsäurereste des Moleküls zur Verfügung zu stellen. Die N-Deacetylierung kann mittels jeder bekannten Methode durchgeführt werden, z.B. in einem basischen, wäßrigen Medium unter erhöhten Temperaturen, z.B. bei ungefähr 90ºC bis 110ºC, und einem pH von ungefähr 13 bis 14. Das basische, wäßrige Medium ist geeigneterweise eine wäßrige Alkalimetallhydroxidlösung, z.B. Natriumhydroxid von ungefähr 2M Konzentration. Alternativ kann Hydrazin in wäßriger Lösung angewandt werden. Der Grad der N-Deacetylierung kann von ungefähr 30% bis 100% variieren, in Abhängigkeit von den Bedingungen. Es wird vorgezogen ungefähr 90% bis 100% N-Deacetylierung zu erreichen. N-deacetyliertes Produkt kann zum Beispiel durch Abkühlen, Neutralisieren und Aufreinigen, falls gewünscht, und Lyophilisieren gewonnen werden.

Vor dem N-Deacetylierungsverfahren hat das native Polysaccharid ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 500 000 bis 800 000 Dalton. Als Ergebnis der N- Deacetylierung werden Fragmente des Polysaccharides erzeugt, die ein durchschnittliches Molekulargewicht haben, das sich von ungefähr 10 000 bis 50 000 Dalton erstreckt.

Die N-deacetylierten Polysaccharidfragmente werden dann N-acyliert um das entsprechende N-acylierte Produkt zu erzeugen. Die N-Acylierung kann durch Lösen des N-deacetylierten Polysaccharides in einem wäßrigen Medium mit einem pH von ungefähr 7,5 bis 9,0 durchgeführt werden, gefolgt von der Zugabe des geeigneten Acylanhydrids, wahlweise mit einem Alkohol, um die Löslichkeit zu erhöhen, und Kühlen auf unter 10ºC bis zum vollständigen Ende der Reaktion. Das Reaktionsmedium kann, falls gewünscht, gereinigt werden, zum Beispiel durch Dialyse, und das N-acylierte Produkt kann dann gewonnen werden, typischerweise durch Lyophilisierung. Die Reaktion ist im wesentlichen innerhalb von 10 bis 20 Stunden beendet. Der Grad der N-Acylierung, wie durch analytische Techniken bestimmt, üblicherweise ¹H-NMR, beträgt mindestens 90% und wahrscheinlich annähernd 100%. Die N-Acylierungsreaktion führt nicht zu einer signifikanten Verringerung des Molekulargewichtes der Fragmente.

Es wird gemäß der vorliegenden Erfindung vorgezogen, zum Zweck der Konjugation, das N- acylierte Material so auszuwählen, daß es ein durchschnittliches Molekulargewicht aufweist, das ungefähr 30 bis 200 Sialinsäureresten entspricht. Dies wird im allgemeinen mittels Gelftltration des N-acylierten GBMP erreicht, unter Verwendung einer Ultragel (Warenzeichen) AcA 44 (Körnungsdurchmesser 60-140 um)-Säule, unter Verwendung von PBS als Elutionsmittel. Alternativ kann eine Membran passender Größe verwendet werden.

N-acyliertes Material eines durchschnittlichen Molekulargewichtes von 10 000 bis 50 000 Dalton, zum Beispiel 10 000 bis 15 000 Dalton, wird in der Erfindung verwendet. Dieses wird durch das Sammeln von Fraktionen des Eluates der Säule erhalten, die N-acyliertes GBMP- Material enthalten, das das durchschnittliche Molekulargewicht dieses Bereichs aufweist. N- acyliertes Material höheren durchschnittlichen Molekulargewichtes, zum Beispiel im Bereich von 30 000 bis 40 000 Dalton, hat sich als, gemäß der Erfindung, ebenfalls nützlich erwiesen.

Die Impfstoffe der Erfindung werden durch Konjugation des N-acylierten Polysaccharides mit einem immunologisch geeigneten Träger-Protein hergestellt. Bevorzugterweise ist das Trägerprotein selbst ein Immunogen. Beispiele geeigneter Träger-Proteine sind Tetanus- Toxoid, Diphterie-Toxoid, kreuzreagierende Materialien (CRMs), bevorzugterweise CRM&sub1;&sub9;&sub7;, erhalten von Sclavo Ltd., Siena, Italien und bakterielle Protein-Träger, zum Beispiel äußeres Membranprotein von Meningokokken.

Jede Form von Konjugation kann eingesetzt werden, um die modifizierten Polysaccharidfragmente mit dem Träger-Protein zu konjugieren. Eine bevorzugte Methode ist die im U.S. Patent 4 356 170 beschriebene, d.h. durch Einhren terminaler Aldehydgruppen (via Oxidation cis-benachbarter Hydroxylgruppen) in das N-acylierte Polysaccharid und das Koppeln der Aldehydgruppen an die Aminogruppen des Proteins durch reduktive Aminierung. Die Polysaccharide und das Protein werden dadurch mittels einer -CH-NH-Protein-Bindung verknüpft.

Es muß jedoch verstanden werden, daß die Konjugatimpfstoffe der Erfindung nicht auf die mittels reduktiver Aminierung hergestellten beschränkt sind. Daher können die Impfstoffe auch mittels Konjugation des N-acylierten Polysaccharides mit dem Träger-Protein unter Gebrauch eines Adipinsäuredihydrazin-Spacers hergestellt werden, wie von Schneerson, K, et al. "Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influezae type b Polysaccharide-Protein Conjugates", J. Exp. Med., 1952, 361-476 (1980), und im U.S. Patent 4 644 059 von Lance K Gordon beschrieben. Alternativ kann die von Merck entwickelte binäre Spacer-Technologie, benutzt werden, wie von Marburg, S., et al., "Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membrane Protein", J. Am. Chem. Soc., 108, 5282-5287 (1986) beschrieben, oder möglicherweise die Verfahrensweise mit reduzierenden Enden, worauf von Anderson im U.S. Patent 4 673 574 Bezug genommen wird.

Die erhaltenen N-acylierten Polysaccharid-Protein-Konjugate weisen keine signifikanten Quervernetzungen auf und sind in wäßrigen Lösungen löslich. Dies macht die Konjugate der Erfindung zu guten Kandidaten für den Gebrauch als Impfstoff.

Die erhaltenen N-acylierten Polysaccharid-Protein Konjugate der Erfindung wurden in in-vitro- Tests in Mäusen getestet, wobei sie generell nachweislich verbesserte immunogene Eigenschaften, verglichen mit dem N-propionylierten Polysaccharid, aufwiesen. Darüber hinaus wird eine beträchtlich verminderte Bildung kreuzreaktiver Antikörper beobachtet. Angesichts dieser Tatsache wird angenommen, daß die Impfstoffe der Erfindung gegen durch Gruppe B- N. meningitidis- oder E. coli K1-Organismen verursachte Meningitis nützlich sein werden. Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, um Kinder zu schützen, die in höchster Weise für bakterielle Meningitis anfällig sind.

Die Impfstoffe der Erfindung werden typischerweise durch das Dispergieren des Konjugats in irgendeinem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie physiologischer Kochsalzlösung oder anderen injizierbaren Flüssigkeiten, hergestellt. Der Impfstoff wird parenteral verabreicht, zum Beispiel subkütan, intraperitoneal oder intramuskulär. In Impfstoffen gebräuchliche Zusatzstoffe können ebenfalls enthalten sein, wie zum Beispiel Stabilisatoren wie Lactose oder Sorbitol und Adjuvansien wie Aluminiumphosphat, -hydroxid oder -sulfat.

Eine geeignete Dosis des Impfstoffes in Kindern liegt generell im Bereich von ungefähr 5 bis 25 ug oder ungefähr 1 bis 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht.

Beispiele

Die Erfindung wird anhand der folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert. Das N- Acetyl-, N-Propionyl-, N-Butanoyl-, N-iso-Butanoyl-, N-Pentanoyl- und N-Hexanoyl-GBMP- Protein-Konjugat wurden zum Zweck der Beurteilung hergestellt, und die Ergebnisse werden in den Beispielen erörtert.

Materialien und Methoden für die Herstellung der Konjugate (a) Materialien

Propionsäure-, Butansäure-, Isobutansäure-, Pentansäure- und Hexansäureanhydride wurden zusammen mit Sialsäure von Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO. bezogen. Da Sialsäure strutuurell mit dem Meningokokken-Polysaccharid (GBMP) der Gruppe B identisch ist, wird sie im weiteren als GBMP bezeichnet. Tetanus-Toxoid (TT) wurde vom Institut Armand Frappier, Laval, Quebec bezogen, und seine monomere Form, die in allen Konjugationen benutzt wurde, wurde mittels einer Passage der oben angegebenen Präparation über eine Bio-Gel (Warenzeichen) A 0,5 (200-400 Mesh)-Säule (1,6 x 90 cm) (Bio-Rad, Richmond, Ca.) gewonnen, äquilibriert und eluiert mit 0,01 M phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) (pH 7,4).

(b) N-Deacylierung des GBMP

Das GBMP (Na&spplus;-Salz) (1,0g) wurde in 5 ml 2M NaOH gelöst, und nach der Zufügung von NaBH&sub4; (150 mg) wurde die Lösung bei 110ºC 6 Stunden lang in einem Teflon (Warenzeichen)-Behälter mit Schraubdeckel (60 ml) erhitzt. Diese Verfahrensweise ist im wesentlichen wie in J. Immunol., 134, 2651 (1985) und im U.S. Patent 4 727 136 beschrieben, beide lautend auf Harold J. Jennings et al. Die abgekühlte, verdünnte Lösung wurde dann bei 4ºC völlig gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophllisiert. Die Tatsache, daß N- deacetyliertes GBMP erhalten worden war, wurde durch die Abwesenheit des Methyl- acetamido-Signals (Singulett bei delta 2,07) im ¹H-NMR-Spektrum des N-deacetylierten GBMP bestimmt.

(c) N-Acylierungen des GBMP

N-deacyliertes GBMP (1,0g) wurde in 50 ml wäßrigem 5%igem NaHCO&sub3; gelöst. Zu fünf einzelnen Aliquots (10 ml der oben angegebenen Lösung) wurden entweder Propionsäure-, Butansäure-, Isobutansäure-, Pentansäure- oder Hexansäureanhydrid gegeben. Diese Reagenzien wurden in 3 x 0,5 ml Aliquots während eines Zeitraumes von 3 Stunden bei Raumtemperatur zugefügt, während die Lösung mittels 0,5 N NaOH bei einem pH von 8,0 gehalten wurde. Methanol (0,5 ml) wurde jeweils gemeinsam mit jedem Zufügen von Anhydrid zugegeben, um ihre Löslichkeit zu vergrößern. Zuletzt wurden die Lösungen 16 Stunden lang bei 4ºC gerhhrt, völlig gegen destilliertes Wasser bei 4ºC dialysiert und lyophilisiert. Das einzelne N-propionylierte, N-butanoylierte, N-isobutanoylierte, N-pentanoylierte und N- hexanoylierte GBMP wurde jeweils in Ausbeuten von über 90% erhalten. In jedem Fall wurde im wesentlichen eine vollständige N-Acylierung durch das Verschwinden in dem jeweiligen ¹H-NMR-Spektrum des N-deacetylierten GBMP bestätigt.

(d) Sortierung der Fragmente der unterschiedlichen N-acylierten GBMP

Gelfiltration mittels einer Ultragel (Warenzeichen) AcA 44 (Kömungsdurchmessser 60-140 u m)-Säule (IBF Biotechnics, Savage, MD.) mit PBS als E1utionsmittel wurde angewendet, um das gewünschte durchschnittliche Molekulargewicht des N-acylierten GBMP-Materials zu erhalten. Fraktionen, die aus der Säule bei KD 0,5 bis KD 0,7 eluierten, wie mittels FLPC (siehe unten) gemessen, wurden gesammelt, dialysiert und lyophilisiert. Dieser Bereich von KD-Werten entspricht N-acyliertem GBMP von ungefähr 30- 50 Sialinsäureresten (10 000 bis 15000 Dalton, typischerweise 12 000 Dalton, durchschnittliches Molekulargewicht). Fraktionen im Bereich von KD 0,2 bis 0,4, Fragmenten entsprechend mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht im Bereich von 30 000 bis 40 000 Dalton, wurden ebenfalls gesammelt und konjugiert. Folglich ist N-acyliertes Material im KD-Bereich von 0,2 bis 0,7 von besonderem Interesse.

(e) Polysaccharid Konjugate

Terminale Aldehydgruppen wurden in das N-acylierte GBMP durch Periodatoxidation (siehe U.S. Patent Nr. 4 356 170) eingeführt. Die oben genannten N-acylierten GBMP-Fragmente wurden in 0, 1 M wäßrigem NaIO&sub4; (Natriummetaperiodat) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln oxidiert. Überschüssiges Periodat wurde im Anschluß durch Zugabe von 1 ml Ethylenglykol zerstört, und die Lösung wurde dann bei 4ºC vollständig dialysiert und lyophllisiert. Der Gebrauch von NaBH&sub4; beim N-Deacylierungsverfahren (außer für das GBMP) führt zur Umwandlung der terminalen reduzierenden Sialinsäurereste von jedem der N-acylierten GBMP in offenkettige Polyolreste. Dieser Typ von Rest ist periodatsensitiv (siehe J. Immunol., 127, 1011 (1981) und U.S. Patent 4 356 170 Harold J. Jennings et al.) was zur Einführung von Aldehydgruppen in die N-acylierten GBMP Fragmente an beiden Termini führt.

Die oxidierten Fragmente (100mg) wurden in 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 8,1)-Puffer (2 ml) gelöst, und TT (20 mg) wurde der Lösung zugegeben. Im Anschluß schließlich auf die Zugabe von Natriumcyanoborohydrid (NaCNBH&sub3;) (40 mg) wurde die Lösung bei Raumtemperatur leicht geruhrt. Der Verlauf der Konjugation wurde durch FPLC verfolgt mittels einer Geliiltrationssäule, Superose (Warenzeichen) 12 HR10/30 enthaltend (Pharmacia), die isokratisch (isocractically) bei 1 ml/min in PBS-Puffer bei pH 7,2 laufen gelassen wurde, wobei sowohl das Protein als auch die N-acylierten GBMP-Fragmente bei 214 um kontrolliert wurden. Die Fragmente hatten den KD-Wert 0,6, TT hatte den KD-Wert 0,39, und die Konjugate hatten den KD-Wert 0,23. Die Konjugation war abgescMossen, als das gesamte TT verbraucht war, was durch den Verlust der Spitze im FPLC-Chromatogramm, die der Komponente bei KD 0,39 entsprach, bestimmt wurde. In den meisten Fällen war die Konjugation innerhalb von 2 Tagen abgeschlossen, wurde jedoch für eine Gesamtreaktionszeit von 4 Tagen durchgeführt. Die Aldehydgruppen, die möglicherweise nicht reagiert hatten, wurden schließlich vor der Gelfiltration mit Natriumborhydrid (20 mg) reduziert.

Die Polysaccharid-TT-Konjugate wurden von den Polysaccharid-Fragmenten mittels Gelftltration unter Gebrauch einer Bio Gel A-Säule mit PBS als Elutionsmittel abgetrennt. Das das Konjugat enthaltende Elutionsmittel wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die N-acylierten GBMP-TT-Konjugate enthielten 12-30%, typischerweise 12- 20%, Sialinsäure, wie mittels der Resorcinol-Methode, beschrieben von Svennerholm, L., "Quantitative Estimation of Sialic Acids, 11A Colorimetric Resorcinol-Hydrochloric Acid Method", Biochim. Biophys. Acta 24, 604 (1957), bestimmt wurde. Dies zeigt an, daß die Konjugate ein molares Verhältnis von Polysaccharid zu TT von jeweils 2-3:1 aufwiesen.

Immunisierung und Immuntests (a) Immunisierungsverfahren

Zwanzig weibliche, weiße CFI-Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intraperitoneal mit jedem einzelnen N-acylierten GBMP-TT-Konjugat in Freud's Complete Adjuvans (FCA) (Difco, Detroit, MI.) immunisiert (3 mal im Abstand von 3 Wochen). Jede Immunisierung enthielt genügend Konjugat (10-12 ug), um 2ug Sialinsäure zu enthalten. Elf Tage nach der dritten Injektion wurden die Mäuse ausgeblutet. Die folgenden Tests wurden mit dem Serum durchgeführt.

(b) Radioaktiver Antigen-Bindungstest

Dieser Test wurde mittels einer Modifikation der Farr-Techriik durchgeführt unter Verwendung extrinsisch [³H]-markierten GBMP (Jennings H. J., et al., "Determinant Specificities of the Groups B and C Polysaccharides of Neisseria meningitidis", J. Immunol., 134, 2651 (1985)), oder [³H]-markierten N-Pr-GBMP (Jennings, H. J., et al., "Unique Intramolecular Bactericidal Epitope mvolving the Homo Sialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface of Group B Neisseria meningitidis and E. coli K1, J. Immunol., 142, 3585-3591 (1989)). Durch die Mischung von 20ul der vereinten Antisera von Gruppen von 20 mit jedem einzelnen N-acylierten GBMP-TT-Konjugat immunisierten Mäusen, verdünnt auf 100 ul mit PBS mit [³H]-marklertem GBMP und [³H]-markiertem N-Pr-GBMP in 50 ul PBS in einem Eppendorf-Micro-Test-Reaktionsgefäß aus Polypropylen wurde die Reaktionsmischung für den radioaktiven Antigenbindungstest erhalten. Nach einer 16 Stunden langen Inkubation bei 4ºC wurden 150 ul gesättigtes (bei 4ºC) Ammoniumsumit (pH 7,0) in die Reaktionsgefäße zugegeben und weitere 30 Minuten bei 4ºC stehen gelassen. Die Reaktionsgefaße wurden bei 15 000 U/min 10 min zentrifügiert, und zwei Aliquots von 130 ul wurden von den Gefäßen entnommen. Die Aliquots wurden mit 2 ml Wasser und ein Szintillationsflüssigkeit enthaltendes Xylol (wäßriges ACS Szintillant) gemischt, und die Flüssigkeiten wurden in einem Flüssig-Szintillations-Meßgerät gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1 Bindung von [³H]-marklertem N-Ac-GBMP mit unterschiedlichen Maus-Anti-N-Acyl-GBMP- TT-Konjugat-Seren.
Antiserum % Bindunga a Die vier Bindungstests wurden mit vereinigten Antiseren von 20 immunisierten Mäusen durchgeführt. Abkürzungen, die in Tabelle 1 und anderen Tabellen benutzt werden: N-Ac-, N-Pr-, N-Bu-, N-IsoBu-, N-Pen-, N-Hex- stehen für N-Acetyl-, N-Propionyl-, N- Butanoyl-, N-Isobutanoyl-, N-Pentanoyl- und N-Hexanoyl-.

Die Ziffern 1,2,3 und 4 sind Ergebnisse von vier wiederholten Experimenten. Tabelle 1 zeigt schlüssig, daß das N-Ac-GBMP (das dasselbe Epitop trägt wie fötales N-CAM) weniger an das durch das N-Bu-GBMP, N-IsoBu-GBMP, N-Pen-GBMP und N-Hex-GBMP induzierte Antiserum bindet, als an das durch N-Pr-GBMP induzierte. Daher kann von Tabelle 1 abgeleitet werden, daß die N-Bu-, N-IsoBu-, N-Pen- und N-Hex-Polysaccharid-Konjugate weniger kreuzreaktive Antikörper hervorrufen als das N-Pr-Konjugat.

(c) Quantitative Präzipitationsanalyse

Diese Experimente wurden mit der Methode von Kabat und Meyer, Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, S. 22 (1961), durchgeführt. Aliquots (100ul) von Anti-N-Acyl-GBMP-TT-Seren (Sfach verdünnt in PBS) wurden in Reaktionsgefäßen mit steigenden Konzentrationen der N-Acetyl- (Sialsäure), N-Propionyl-, N- Butanoyl-, N-Iso-butanoyl-, N-Pentanoyl und N-Hexanoyl-GBMP in einem Gesamtvolumen von 200 ul (eingestellt mit PBS) zur Reaktion gebracht. Die Fraktionen höheren Molekulargewichts dieser Derivate wurden in diesen Experimenten eingesetzt. Sie wurden aus dem Eluat der Ultragel AcA 44-Säule erhalten, die zuvor zur Sortierung nach Größe der N- acylierten GBMP eingesetzt worden war (KD-Wert 0,4, wie mittels FPLC gemessen). Die Reaktionsgefäße wurden 4 Tage bei 4ºC unter täglichem Mischen inkubiert, zentrifiigiert, und die Menge des Antikörperproteins wurde nach der von Lowry et al., "Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent", J. Biol. Chem., 1933, 265 (1951), beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2 Präzipitationa von Maus-Anti-N-Acyl-GBMP- Seren unter Gebrauch unterschiedlicher N-Acyl- GBMP als präzipitierendem Agens.
N-Acyl-GBMP-Antigen Antiserum N-Acetyl-N-PropionylN-ButanoylN-PentanoylN-Hexanoyla Maximalbetrag des präzipitierten Antikörpers, angegeben in mg/ml des Antiserums.

Was die Kreuzreaktivität betrifft, 50 zeigt die erste Spalte von Tabelle 2, daß im Vergleich zum N-Pr-Konjugat von den N-Bu- und N-Hex-Konjugaten sehr wenig kreuzreaktive Antikörper erzeugt werden. Es zeigt sich des weiteren, daß das N-Pen-Konjugat weniger kreuzreaktive Antikörper erzeugt als das N-Pr-Konjugat.

Bezüglich der Immunogenizität zeigt sich im Sinne der homologen Antwort in Tabelle 2 daß die N-Bu- (2,60), N-Pen- (6,35) und N-Hex- (4,40) GBMP-TT-Konjugate stärker immunogen wirken als das N-Pr-GBMP-Analog (0,40).

(d) ELISA

Die Vertiefüngen von EIA-Mikrotitrationsplatten (Flow Labs, Mississauga, Ontario, Canada) wurden mit einer 10 ug/ml Lösung von jeweils entweder GBMP- N-Pr-GBMP- oder N-Bu- GBMP-BSA-Konjugaten in PBS (100 ul/Vertieftmg) beschichtet. Die Platten wurden 18 Stunden bei 4ºC stehen gelassen und nach der Beschichtung mit 1% Rinderserumalbumin in PBS 10 min bei Raumtemperatur gewaschen (Blockierungsschritt). Die Vertiefüngen wurden daraufhin mit 100 ul von seriellen 10 fach-Verdünnungen in PBS von Anti-Maus-N-Acyl- GBMP-TT-Konjugat gefüllt, und die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit SBT wurden die Platten mit 50 ul der geeigneten Verdüunung von peroxidasemarkierten Ziege-Anti-Maus-Immunoglobulin-Konjugaten (Kirkegard and Perry Laboratories) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde der Inhalt der Vertiefüngen abgesaugt und die Platten fünfmal mit SBT gewaschen. Schließlich wurden 50 ul Tetramethylenblau-Peroxidase Substrat (TMB) (Kirkegard and Perry Laboratories) in jede Vertiefung gegeben. Nach 10 min wurde die Absorption bei 450 um mit einem Multiscan Spektrometer (Flow Laboratories, Mississauga, Ont.) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3 ELISA-Titrationen vereinigter Mäuse-anti-N-Acyl-GBMP-TT-Konjugat-Seren gegen N-Acyl- GBMP-BSA-Konjugate.
Titera der Antiseren Beschichtendes Antigen a Titer (GM) = Kehrwert der Verdünnung bei 50% der maximalen Absorption bei 450 nm. b N-Acyl-spezifische Antiseren, in Mäusen durch homologe N-Acyl-GBMP-TF-Konjugate erzeugt.

In Bezug auf die Kreuzreaktivität zeigt sich in Tabelle 3, daß das N-Bu-GBMP-Konjugatbezogen auf N-Ac-GBMP weniger kreuzreaktive Antikörper erzeugt (1 000) als das N-Pr- GBMP-TT-Konjugat (7 800). Die Ursache hierfür ist, daß das GBMP weniger an die durch das N-PR-GBMP-TT-Konjugat erzeugten Antikörper bindet als an die vom N-Bu-GBMP-TT- Konjugat erzeugten. Gleiches gilt bezüglich des N-IsoBu-GBMP-TT-Konjugats.

Was die Immunogenizität anbelangt, so ist das N-Bu-Konjugat stärker immunogen als das N- Pr-Analog, wie sich in den homologen Bindungstitern von 52 000 (N-Bu) und 40 000 (N-Pr) zeigt.

(e) Radioaktiver Bindungsinhibitionstest

Steigende Konzentrationen des N-Acyl-GBMP lnhibitors mit größerem Molekulargewicht in PBS (80 ul) wurden zu 20ul Maus-anti-N-Pr-GBMP-TT-Konjugat-Antiserum gegeben, eine Menge, die hlnreicht, um 50% des [³H]-markierten N-Pr-GBMP in der Abwesenheit des Inhibitors zu binden. Die Reaktionsgefäße wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und 50 ul des [³H]-markierten N-Pr-GBMP in PBS wurden zugefügt. Nach vorsichtigem Mischen wurden die Reaktionsgefäße 16 Stunden bei 4ºC inkubiert, und die Tests wurden exakt, wie oben für den radioaktiven Antigen-Bindungstest beschrieben, durchgeführt. Die % Inhibition wurden nach folgender Formel berechnet:

Prozent Inhibition = 100 x [(cpm mit Inhibitor minus cpm ohne Inhibitor)/(cpm ohne Antikörper minus cpm ohne Inhibitor)]

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4 Inhibition der Bindung von [³H]-markiertem N-Pr-GBMP an Maus-anti-N-Pr-GBMP-TT- Konjugat induzierte IgG2a-, IgG2b(A)a- und IgG&sub1;(B)a-Antikörper.
Inhibitorb a Bei diesen handelte es sich um Fraktionen von polyklonalem Maus-Anti-N-Pr-GBMP-TT- Serum, beschrieben in Jennings et al., J.Immunol., 142, 3585-3591 (1989). b Mikrogramm Inhibitor, um 50% Inhibition zu erhalten.

Bakterizide Tests

Diese Tests wurden nach der Methode ausgeführt, die in Jennings et al., J. Exp. Med., 165, 1207-1211 (1987) beschrieben wurde.

In diesen Tests wurde Neisseria meningitidis Stamm B (M 986) eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5 Bindung von [³R]-markiertem N-Pr-GBMP an verschiedene Maus-Anti-N-Acyl-GBMP-TT- Konjugat-Seren und die bakteriziden Titer der jeweiligen Antiseren.
Antiserum ul des Antiserumsa Bakterizider Titerb a für 50% Bindung nötige Anzahl ul des Antiserurns (5fach verdünnt mit PBS) b Verdünnungsexperiment: ein Verdünnungsunterschied, z.B. 128 im Vergleich zu 64, liegt innerhalb des experimentellen Fehlers.

Die Tabelle 4 zeigt, daß N-Bu-GBMP als Inhibitor genauso gut ist wie das N-Pr-GBMP bei der Bindung von letztgenanntem an die eigenen homologen Antikörper. Daher führt der Gebrauch von N-Bu-GBMP anstelle von N-Pr-GBMP nicht zu irgendeinem signifikanten Verlust der von N-Pr-GBMP gezeigten Eigenschaften. Die Tabelle 5 zeigt, daß das N-Bu- GBMP genauso gut wie das N-Pr-GBMP an die durch das N-Pr-GBMP-TT-Konjugat induzierten Antikörper bindet. Beide Antiseren, sowohl das vom N-Bu-GBMP-TT-Konjugat als auch das vom N-Pr-GBMP-TT-Konjugat induzierte, ergaben ähnliche bakterizide Titer. Diese Tatsache zeigt die Äqulvalenz von N-Bu-, N-IsoBu- und N-Pen-GBMP zum N-Pr- GBMP in ihrer Fähigkeit das bakterielle Epitop auf der Oberfläche der Meningokokken der Gruppe B nachzuahmen.


Anspruch[de]

1. Modifiziertes Polysaccharid der Gruppe B von Neisseria meningitidis, worin die N- Acetylgruppen des Sialinsäurerestes des nativen Polysaccharids durch C&sub4;-C&sub8;- Acylgruppen ersetzt sind, wobei das modifizierte Polysaccharid ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 50 000 Dalton hat.

2. Modifiziertes E.coli-K1-Kapselpolysaccharid, worin die N-Acetylgruppen des Sialinsäurerestes des nativen Polysaccharids durch eine C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe ersetzt sind, wobei das modifizierte Polysaccharid ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 50 000 Dalton hat.

3. Modifiziertes Polysaccharid nach Anspruch 1, wobei die C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe aus der aus n-Butanoyl, iso-Butanoyl, n-Pentanoyl, iso-Pentanoyl, neo-Pentanoyl, Hexanoyl, Heptanoyl und Octanoyl bestehenden Gruppe gewählt ist.

4. Modifiziertes Polysaccharid nach Anspruch 3, wobei die Acylgruppe aus der aus n- Butanoyl, iso-Butanoyl, n-Pentanoyl und Hexanoyl bestehenden Gruppe gewählt ist.

5. Modifiziertes Polysaccharid nach Anspruch 2, wobei die C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe aus der aus n-Butanoyl, iso-Butanoyl, n-Pentanoyl, iso-Pentanoyl, neo-Pentanoyl, Hexanoyl, Meptanoyl und Octanoyl bestehenden Gruppe gewählt ist.

6. Modifiziertes Polysaccharid nach Anspruch 5, wobei die aus der aus n-Butanoyl, iso-Butanoyl, n-Pentanoyl und Hexanoyl bestehenden Gruppe gewählt ist.

7. Polysaccharid nach Anspruch 1, worin etwa 27 % bis 100 % der N-Acetylgruppen des Sialinsäurerestes durch C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe ersetzt sind.

8. Polysaccharid nach Anspruch 2, worin etwa 27 % bis 100 % der N-Acetylgruppen des Sialinsäurerestes durch C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe ersetzt sind.

9. Antigenes Konjugat, umfassend ein modifiziertes Polysaccharid der Gruppe B von Neisseria meningitidis, bei dem die N-Acetylgruppen des Sialinsäurerestes durch eine N-C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe ersetzt ist, konjugiert mit einem immunologisch geeignetem Protein, wobei das modifizierte Polysaccharid ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 50 000 Dalton besitzt.

10. Konjugat nach Anspruch 9, wobei die Acylgruppe aus der aus n-Butanoyl, iso- Butanoyl, n-Pentanoyl, iso-Pentanoyl, neo-Pentanoyl, Mexanoyl, Heptanoyl und Octanoyl bestehenden Gruppe gewählt ist.

11. Konjugat nach Anspruch 10, wobei die Acylgruppe aus der aus n-Butanoyl, iso- Butanoyl, n-Pentanoyl, und Hexanoyl bestehenden Gruppe gewählt ist.

12. Konjugat nach Anspruch 9, wobei das Protein aus der aus Tetanus-Toxoid, Diphterie-Toxoid, einem kreuzreagierenden Material (CRM) und einem bakteriellen Proteinträger bestehenden Gruppe gewählt ist.

13. Konjugat nach Anspruch 9, wobei das Protein und das Polysaccharid durch eine -CH&sub2;-NH-Proteinbindung kovalent verknüpft sind.

14. Konjugat nach Anspruch 12, bei dem das CRM CRM&sub1;&sub9;&sub7; ist.

15. Impfstoff, der ein Konjugat nach Anspruch 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren injizierbaren Träger umfaßt.

16. Impfstoff nach Anspruch 15, der ferner ein physiologisch annehmbares Adjuvans umfaßt.

17. Impfstoff nach Anspruch 16, bei dem das Adjuvans aus der aus Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumsulfat bestehenden Gruppe gewählt wird.

18. Gamma-Globulinfraktion, die zum passiven Schutz gegen durch N. meningitidis der Gruppe B und E.coli K1 verursachte Meningitis in der Lage ist, wobei die gamma- Globulinfraktion hergestellt wird, indem ein Säugetier mit einem Impfstoff nach Anspruch 17 immunisiert und das gamma-Globulin aus dem Säugetier gewonnen wird.

19. Modifiziertes Polysaccharid nach Anspruch 1, worin etwa 90 % bis 100 % der N- Acetylgruppen des Sialinsäurerestes durch C&sub4;-C2-Acylgruppe ersetzt sind.

20. Polysaccharid nach Anspruch 2, worin etwa 90 % bis etwa 100 % der N-Acetylgruppen des Sialinsäurerestes durch C&sub4;-C&sub8;-Acylgruppe ersetzt sind.







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