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Dokumentenidentifikation DE69107855T2 07.09.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0552192
Titel VERBESSERTES VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR TANGENTIELLEN FILTRIERUNG.
Anmelder Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., US
Erfinder VAN REIS, Robert, D., Redwood City, CA 94062, US
Vertreter Leinweber & Zimmermann, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69107855
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 11.09.1991
EP-Aktenzeichen 919172916
WO-Anmeldetag 11.09.1991
PCT-Aktenzeichen US9106553
WO-Veröffentlichungsnummer 9204970
WO-Veröffentlichungsdatum 02.04.1992
EP-Offenlegungsdatum 28.07.1993
EP date of grant 01.03.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.09.1995
IPC-Hauptklasse B01D 61/14

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Reinigung und Abtrennung von Spezien, besonders jenen von biologischem Interesse, aus diese enthaltenden Gemischen unter Anwendung von verbesserten Tangentialfluß-Filtrationsverfahren und -vorrichtungen.

Beschreibung von verwandten Veröffentlichungen

Zurzeit sind mehrere Verfahren zur Abtrennung von biologisch interessierenden Molekülen, wie z.B. Proteinen, aus Gemischen davon verfügbar. Eine wichtige derartige Vorgangsweise ist Affinitätschromatografie, die auf der Basis von spezifischer und selektiver Bindung der gewünschten Moleküle an eine Affinitätsmatrix oder -gel auftrennt. Affinitätsgele bestehen typischerweise aus einer auf einem Gelträger immobilisierten, liganden-bindenden Spezies. Beispielsweise wendet GB-A-2.178.742 Affinitätschromatografie an, um Hämoglobin und dessen chemisch modifizierte Derivate basierend auf der Tatsache, daß natives (Oxy)Hämoglobin spezifisch an polyanionische Spezien gewisser Affinitätsgele bindet, zu reinigen. In diesem Verfahren wird nicht-modifiziertes Hämoglobin durch das Affinitätsgel zurückgehalten, während modifiziertes Hämoglobin eluiert wird, das sich nicht an das Gel binden kann, da seine Polyanion-Bindungsstelle durch den Modifikator kovalent besetzt ist. Affinitätschromatografie-Säulen sind hochspezifisch und liefern daher sehr reine Produkte; Affinitätschromatografie ist jedoch ein relativ teures Verfahren.

Ein anderes bekanntes Trennverfahren ist Membranfiltration, die gelöste und suspendierte Stoffe nach deren Größe auftrennt. In der einfachsten Form dieses Verfahrens wird eine Lösung unter Druck durch eine Filtermembran mit Poren definierter Größe zwangsweise hindurchgeführt. Gelöste Stoffe, die größer sind als die Porengröße des Membranfilters, werden zurückgehalten, während kleinere gelöste Stoffe durch Konvektion zusammen mit dem Lösungsmittel durch die Membran hindurchtransportiert werden.

Derartige Membranfiltrations-Verfahren fallen allgemein in die Kategorien Umkehrosmose, Ultrafiltration und Mikrofiltration, je nach der Porengröße der Membran. In herkömmlicher Weise verwendet die Ultrafiltration Membranen, die zum Zurückhalten von gelösten Stoffen mit einem Molekulargewicht von zwischen ungefähr 1 und 1.000 kDa abgestimmt sind, die Umkehrosmose verwendet Membranen, die in der Lage sind, Salze und andere niedermolekulare gelöste Stoffe zurückzuhalten, und die Mikrofiltration, oder Mikroporenfiltration, verwendet Membranen mit Porengrößen im Bereich von 0,1 - 10 x 10&supmin;&sup6; m und wird typischerweise verwendet, um Kolloide und Mikroorganismen zurückzuhalten.

In den letzten 25 Jahren entwickelte sich die Ultrafiltration von einem Laborhilfsmittel kleinen Maßstabs zu einem voll etablierten Grundverfahren, das in der Lage ist, mehrere tausend Liter pro Stunde zu verarbeiten. Ultrafiltration ist zur Proteinkonzentration und Entfernung von Salzen und Alkoholen, sowie zur Entpyrogenierung von Betriebs- und Spülwasser, Salzlösungen und niedermolekularen Additiven weit verbreitet. Die Vorteile der Ultrafiltration umfassen geringen Energieaufwand, kostengünstige Ausrüstung und effiziente und steuerbare Arbeitsweise mit sehr geringer Denaturierung des Produkts.

Es gibt jedoch Einschränkungen hinsichtlich des mit Ultrafiltration erzielbaren Grades der Proteinreinigung. Diese Grenzen beruhen hauptsächlich auf den Phänomenen von Konzentrationspolarisierung, Fouling und breiter Größenverteilung der Membranporen. Daher ist die Unterscheidungskraft zwischen den gelösten Stoffen nur gering. Siehe beispielsweise Porter, Hrsg., "Handbook of Industrial Membrane Technology" (Noyes Publications, Park Ridge, New Jersey, 1990), S. 164-173.

Eine polarisierte Schicht gelöster Stoffe wirkt als zusätzlicher Filter in Serie zum ursprünglichen Ultrafilter und führt zu einem beträchtlichen Filtrationswiderstand für das Lösungsmittel. Der Grad der Polarisation nimmt mit steigender Konzentration des zurückgehaltenen gelösten Stoffes im Feed zu und kann zu einer Anzahl von scheinbar abnormalen oder unvorhersehbaren Effekten in realen Systemen führen. Beispielsweise können, im Gegensatz zu unpolarisierten Bedingungen, wo die Filtrationsgeschwindigkeiten üblicherweise linear mit dem Druck zunehmen, unter stark polarisierten Bedingungen die Filtrationsgeschwindigkeiten durch steigenden Druck nur wenig erhöht werden. Die Verwendung von offeneren Membranen mit stärkerem Durchfluß kann die Filtrationsgeschwindigkeit nicht erhöhen, da die polarisierte Schicht für den begrenzenden Filtrationswiderstand sorgt. Die Lage wird durch Wechselwirkungen zwischen zurückgehaltenen und eluierten gelösten Stoffen weiter erschwert.

Ein Ergebnis von Konzentrationspolarisation und Foulingvorgängen ist die Unfähigkeit, die Fähigkeit der Ultrafiltrationsmembranen zur makromolekularen Fraktionierung bei der Auftrennung makromolekularer Gemische, wie z.B. Blutplasma- Proteine, im großen Maßstab wirksam zu nützen. Siehe Michaels, "Fifteen Years of Ultrafiltration: Problems and Future Promises of an Adolescent Technology" in Anthony R. Cooper, Hrsg., Ultrafiltration Membranes and Applications, Polymer Science and Technology 13 (Plenum Press, NY, 1979), S. 1-19, S. 9. In der Folge wird die potentiell aufregende Verwendung von Membran-Ultrafiltration zur Trennung komplexer makromolekularer Gemische, die gegenwärtig durch Verfahren wie z.B. Gelpermeation, -Adsorption oder Ionenaustausch-Chromatografie, selektive Fällung oder Elektrophorese praktiziert wird, im großen Maßstab für schwer faßbar gehalten.

Die Vorteile verschiedener Mehrstufen- und Kaskaden-Querstromfiltrations- Methoden wurden für Papier mit leicht verbesserter Wirkung geprüft. Siehe Michaels und Matson, Desalination 53, 231-258 (1985), besonders S. 235. Siehe auch den experimentellen Fließkreislauf in Fig. 1 auf S. 535 von van Reis et al., J. Interf. Res. 2, 533-541 (1982) und M. Cheryan, Ultrafiltration Handbook, (Technomic Publishing Co., Inc.: Pennsylvania, 1986), S. 311, worin ein Kaskadenmembran-Umwälz-Bioreraktor- System zur Herstellung von Proteinhydrolysat-Fraktionen unterschiedlicher Molekülgrößen beschrieben wird.

Um die Auswirkungen der Konzentrationspolarisation zu umgehen, wurden mehrere Verfahren entwickelt, die Plasmaquelle des Feeds modifizieren, um Selektivität und Fluß (definiert als die Filtrationsgeschwindigkeit gebrochen durch die Fläche der Membran) zu verbessern. Beispielsweise beschreibt UK-A-2.065.129 ein Trennverfahren, worin Serum verdünnt wird, um Gesamtprotein und Salzkonzentration zu verringern, während der pH vor der Ultrafiltration aüf zwischen 3,3 und 4,7 eingestellt wird. Baeyer et al., J. Membrane Sci. 22, 297-315 (1985) beschreibt ein Verfahren, worin das Plasma vor der Ultrafiltration zuerst um einen Faktor 12 verdünnt wird. US-A-4.350.156 beschreibt ein Verfahren zur Entfernung von Makromolekülen aus Plasma durch Kühlen des Plasmas auf etwa 10ºC und anschließendes Abfiltrieren der Makromoleküle aus dem gekühlten Plasma, um einen filtrierten Plasmastrom mit niedrigem Molekulargewicht zu bilden. Dieses Verfahren verwendet keine Ultrafiltrationsmembran.

Ein Hauptansatz zur Verhinderung von Konzentrationspolarisation in Ultrafiltrationssystemen bestand darin, das Flüssigkeitsströmungs-Muster zu steuern, um den Transport der zurückgehaltenen gelösten Stoffe weg von der Membranoberfläche und zurück in den Hauptteil des Feeds zu fördern. In einem Verfahren, das als Tangentialfluß-Ultrafiltration (TFF) bekannt ist, wird der Feedstrom mit hoher Geschwindigkeit tangential zur Membranebene rezirkuliert, um den Massentransfer- Koeffizienten der Rückdiffusion zu erhöhen. Gabler, ASM News 50, 299 (1984). Die in paralleler Richtung zur Filtermembran strömende Flüssigkeit dient zur kontinuierlichen Reinigung der Filteroberfläche und verhindert Verstopfung durch nicht-filtrierbare gelöste Stoffe. Eine andere Filtrationsvorrichtung, die dieselbe Wirkung wie TFF erzielt, ist eine Rotationsfiltrations-Vorrichtung, die einen Außen- und einen Innenzylinder enthält, wobei der Innenzylinder zur Bildung eines Wirbels rotiert, um hohe Geschwindigkeit ohne Druckänderung zu erzeugen.

Bei TFF wird ein Druckunterschieds-Gradient, Transmembran-Druck ("transmembrane pressure", TMP) genannt, entlang der Membranlänge angelegt, um die Strömung von Flüssigkeit und filtrierbaren gelösten Stoffen durch das Filter zu verursachen. Der Fluß ist oberhalb eines gewissen Minimalwerts, der empirisch bestimmt werden kann, vom TMP unabhängig. Um maximalen Fluß zu erreichen, werden Ultrafiltrationssysteme typischerweise mit einem Auslaßdruck betrieben, der gleich dem oder größer als dieser Minimalwert ist. Daher ist der Fluß entlang der Membranlänge konstant, während der TMP variiert. Es wurden sowohl Ansätze mit laminarer als auch mit turbulenter Strömung mit gewissem Erfolg durchgeführt; herkömmliche TFF ergibt jedoch auch weiterhin nur geringe Auflösung nach Molekülgrößen.

Es wurden Versuche unternommen, Affinitätstrennung mit TFF zu kombinieren, um die Fähigkeit von TFF, auf der Basis von biologischen Unterschieden selektiv zu trennen, zu steigern. Siehe WO 87/04169, veröffentlicht am 16. Juli 1987. Bei TFF- Ultrafiltration wird ein lösliches Affinitätspolymer stromaufwärts der Filtermembran dem Gemisch zugefügt, das die zu trennenden Fraktionen enthält. Da das Polymer viel größer ist als die Teilchen des gelösten Stoffs, kann ein Filter ausgewählt werden, das ungebundenen gelösten Stoffen ermöglicht, durch das Filter zu treten, das jedoch den Durchtritt von Polymer und jeglicher daran gebundener Substanzen verhindert. Aufgrund der Probleme herkömmlicher TFF war jedoch auch dieser Versuch nur von mäßigem Erfolg gekrönt.

US-A-4.105.547, ausgegeben am 8. August 1978, beschreibt ein Filtrationsverfahren, das besonders für Ultrafiltration entworfen ist, worin eine filtrierbare Flüssigkeit unter Druck so durch eine Filtrationsstrecke entlang einer Seite eines Filters geleitet wird, daß es in Flußrichtung entlang der Filterfläche zu einem beträchtlichen Druckabfall kommt. In der verwendeten Vorrichtung wird der Druckunterschied zwischen den beiden Seiten des Filters über die gesamte Filterfläche im wesentlichen konstant gehalten. Die Patentinhaber lehren, daß ein Verstopfen des Filters, was zur Verringerung des Flusses führt, durch schrittweises Erhöhen des Betriebsdrucks auf einen Wert unterhalb des druckunabhängigen Bereichs der Fluß- TMP-Kurve kompensiert werden kann. Diese Erhöhung des Betriebsdrucks führt zu einer konstanten Filtrationsgeschwindigkeit, jedoch nicht zu höherer Selektivität. Zusätzlich beschreiben die Patentinhaber, daß der TMP bei der Durchführung der Filtration erhöht werden sollte. Andere von den Patentinhabern gelehrte Merkmale umfassen leichtere Reinigung der Membran.

US-A-4.191.182, ausgegeben am 4. März 1980, beschreibt in einer Ausführungsform ein Verfahren und eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Auftrennung von Blut in Plasma und Zellkomponentenfraktionen. Das Verfahren umfaßt die Abnahme und das Pumpen von Gesamtblut in eine Filtrierkammer einer Filtrationszelle und das kontinuierliche Filtrieren des Gesamtbluts, indem es in einem Strom über und parallel zu einer Membran mit einer Porengröße in einem gewissen Bereich und mit einer Fließgeschwindigkeit geleitet wird, die ausreicht, um an der Membrangrenzfläche für einen spezifischen Scherspannungs-Bereich innerhalb gewisser TMP-Grenzen zu sorgen. Anschließend wird die Zellkomponenten-Fraktion kontinuierlich mit einer Menge von Ersatzflüssigkeit vermischt, die im wesentlichen gleich der abgetrennten Plasmafraktion ist, und das Gemisch aus Zellkomponenten-Fraktion und Ersatzflüssigkeit wird kontinuierlich in ein Blutgefäß des Spenders zurückgeführt.

In einer Ausführungsform wird ein Teil der aus dem Gesamtblut abgetrennten Plasmafraktion in einem parallelen und gleichgerichteten Fluß zu jenem des Gesamtbluts über die Filtermembran, jedoch auf der dem Strom des Gesamtbluts gegenüberliegenden Seite rückgeführt, um über die gesamte Länge der Membran einen im wesentlichen einheitlichen TMP zu erhalten. Der Zweck dieser Ausführungsform ist es, die Filtrationsgeschwindigkeiten gegenüber jenen bei Entfernung des Plasmafiltrats aus der Filtratkammer ohne ein derartiges Rückführen zu verdoppeln. Ebenso ermöglicht sie die Verwendung von langen Flußwegen durch die Filtrierkammer und die Konstruktion von Filtrationszellen vom Spulentyp.

Neuerdings beschreibt US-A-4.789.482, ausgegeben am 6. Dezember 1988, ein Verfahren zur Trennung von Blutplasma in Ströme mit hohem und mit niedrigem Molekulargewicht. Das Blutplasma wird mit einer gewissen Scherrate in einen Einlaßabschnitt einer Trennenheit eingebracht, die mehrere dünne Kanäle oder Hohlfasern mit Wänden enthält, durch die die Ultrafiltration erfolgt. Die Ströme mit hohem und mit niedrigem Molekulargewicht werden von der Einheit getrennt, der hochmolekulare Strom wird zu einem Einlaßabschnitt der Trenneinheit rückgeführt, um einen Umlaufstrom zu bilden, und das Verhältnis der Fließgeschwindigkeiten von Umlaufstrom und Permeatstrom wird auf zwischen 5 und 100 geregelt, wobei das TMP- Verhältnis am Auslaß und am Einlaß der Trenneinheit zwischen etwa 0 und 0,85 liegt. Dieses Verfahren wendet die Ultrafiltration nach herkömmlicher Denkweise an, d.h., daß die TMPs an Aus- und Einlaß unterschiedlich sein müssen; daher löst es das der Ultrafiltration eigene Problem der Konzentrationspolarisation nicht.

Trotz all dieser Verbesserungsversuche und obwohl die Konzentrationspolarisation modifiziert werden kann und selbst bei sehr konzentrierten Lösungen recht hohe Filtrationsgeschwindigkeiten erzielt werden können, falls geeignete Fließbedingungen gewählt werden, kann die polarisierte Schicht niemals zur Gänze eliminiert werden. Dies ist bei einer Anzahl von Proteingemischen zu beobachten, und es entwickelte sich die Faustregel, daß die Fraktionierung von Proteingemischen durch einfache Ultrafiltration wahrscheinlich sehr ineffizient ist, solange sich die Spezien nicht um zumindest einen Faktor 10 im Molekulargewicht unterscheiden. Obwohl fallweise über einige Trennungen in engeren Bereichen berichtet wurde, erfolgten diese immer unter extremen und unpraktischen Verdünnungsbedingungen. Nelsen, "Ultrafiltration in Plasma Fractionation", in Proceedings of the Internat. Workshop on Technology for Protein Separation and lmprovement of Blood Plasma Fractionation, Reston Va, 7. - 9. September 1977, Sandberg, Hrsg., NIH, DHEW-Veröff.-Nr. NIH 78-1422, S. 137; Flaschel et al., "Ultrafiltration for the Separation of Biocatalysts", in Fiechter, Hrsg., Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Bd. 26 (Downstream Processing), S. 73-142 (1983), besonders S. 124; Cheryan, siehe oben, S. 218-219.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Tangentialfluß-Filtrationsverfahren zur Auftrennung von Spezien, wie z.B. Teilchen und Moleküle, nach der Größe bereitzustellen, die für die interessierenden Spezien selektiv sind, was zu deren hohem Reinigungsgrad führt.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte Filtrationsverfahren bereitzustellen, um biologische Makromoleküle, wie z.B. Proteine, aufzutrennen, die die Konzentrationspolarisation minimieren und die Filtrationsgeschwindigkeit nicht erhöhen.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Filtrationsverfahren bereitzustellen, das Spezien nach ihrer Größe trennen kann, die sich um weniger als das lofache in der Größe unterscheiden, und keine Verdünnung des Gemischs vor der Filtration erfordert.

Diese und andere Ziele werden dem Fachmann klar sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung von interessierenden Spezien mit einem Molekulargewicht von etwa 1 - 1.000 kDa aus einem Gemisch bereit, worin die interessierenden Spezien weniger als 10mal größer oder kleiner im Molekulargewicht als die anderen Spezien im Gemisch sind, wobei das Verfahren das Filtrieren des Gemisches mittels Tangentialfluß-Filtration durch eine Filtrationsmembran mit einer Porengröße umfaßt, die die interessierenden Spezien aus dem Gemisch abtrennt, während der Filtratfluß auf einer Höhe im Bereich von etwa 5 - 100% des Flusses am Übergangspunkt, im druckabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve, gehalten wird, wodurch die interessierenden Spezien selektiv aus dem Gemisch abgetrennt werden.

Vorzugsweise wird der Transmembran-Druck für die Filtration entlang der Membran im wesentlichen konstant auf einem Wert gehalten, der nicht größer als der Transmembran-Druck am Übergangspunkt der Filtration ist.

In einem spezifischeren Aspekt weist die interessierende Spezies eine Größe von bis zu etwa 10 x 10&supmin;&sup6; m auf. In einem noch spezifischeren Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung von interessierenden Spezien mit einem Molekulargewicht von etwa 1 - 1.000 kDa aus einem Gemisch bereit, das das Filtrieren des Gemisches mittels Tangentialfluß-Filtration durch eine Filtrationsmembran mit einer Porengröße umfaßt, die die interessierenden Spezien aus dem Gemisch abtrennt, während der Filtratfluß auf einer Höhe im Bereich von etwa 5 - 100% des Flusses am Übergangspunkt gehalten wird, wodurch die interessierenden Spezien selektiv aus dem Gemisch abgetrennt werden.

In noch einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung von interessierenden Spezien mit einer Größe von etwa 0,1 - 10 x 10&supmin;&sup6; m aus einem Gemisch bereit, das das Filtrieren des Gemisches mittels Tangentialfluß-Filtration durch eine Filtrationsmembran mit einer Porengröße umfaßt, die die interessierenden Spezien aus dem Gemisch abtrennt, während der Filtratfluß auf einer Höhe im Bereich von etwa 5 - 100% des Flusses am Übergangspunkt gehalten wird, wodurch die interessierenden Spezien selektiv aus dem Gemisch abgetrennt werden.

In noch einem weiteren Aspekt liefert diese Erfindung eine Tangentialfluß- Filtrationsvorrichtung zur Durchführung der obigen Verfahren, die eine Filtrationseinheit (97) mit einer Vielzahl von schichtweise angeordneten Filtrier- und Filtratkammern (95a), (95b), (95c), (95d) umfaßt, wobei alle außer der letzten Filtratkammer (95d) in der Schichtreihenfolge Einlaßeinrichtungen (93), (107), (117) und Auslaßeinrichtungen (101), (111), (121) aufweisen, die jeweils über Rückführkanäle, die die Einlaß- und Auslaßeinrichtungen jeder außer der letzten Filtratkammer (95d) mit dem entsprechenden getrennten Gefäß (91), (105), (115) verbinden, das dazu dient, das Filtrat vom Auslaß jeder Filtratkammer zu sammeln, in Flüssigkeitskommunikation stehen, und wobei die letzte Filtratkammer (95d) eine Auslaßeinrichtung (125) zur Rückführung von Filtrat zum Gefäß (91) aufweist, das über einen Rückführkanal als Verbindung der Auslaßeinrichtung mit der ersten Filtrierkammer (95a) in der Schichtanordnung in Flüssigkeitskommunikation steht, wobei jede Kammer eine Einrichtung (99), (109), (119) zum Pumpen von Flüssigkeit aus ihrem entsprechenden Gefäß zur Einlaßeinrichtung der Kammer aufweist, und wobei jede Kammer von ihrer benachbarten Kammer durch eine Filtrationsmembran (103), (113), (123) getrennt ist, wobei die Vorrichtung solcher Art ist, daß der Flüssigkeitsstrom von der Einlaß- zur Auslaßeinrichtung aller Kammern parallel und in gleicher Richtung erfolgt, wobei die erste Filtrationsmembran (103) in der Schichtreihenfolge eine Porengröße besitzt, die die größten interessierenden Spezien zurückhält, und die letzte Filtrationsmembran (123) in der Schichtreihenfolge eine Porengröße besitzt, die die kleinsten interessierenden Spezien zurückhält, und die mittlere Filtrationsmembran(en) (113) in der Schichtreihenfolge eine Porengröße besitzt (besitzen), die die interessierenden Spezien mit von der ersten zur letzten (der) mittleren Membran(en) abnehmender Größe zurückhält (zurückhalten).

In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Tangentialfluß- Filtrationsvorrichtung zur Durchführung der obigen Verfahren bereit, die umfaßt:

(a) ein erstes Gefäß (31) in Flüssigkeitskommunikation mit einer ersten Filtrationseinheit (37) mit einer ersten Filtrationsmembran (43), die die Einheit in eine erste Filtrier- und Filtratkammer (35a), (35b) teilt, wobei die Filtrier- und Filtratkammer einen Einlaß (33) und einen Auslaß (47) aufweist,

(b) eine Einrichtung (33), die einen Einlaß der ersten Filtrierkammer mit dem ersten Gefäß verbindet, die eine Einrichtung (39) zum Pumpen von Flüssigkeit aus dem ersten Gefäß zum Einlaß der ersten Filtrierkammer enthält,

(c) eine Einrichtung (49) zum Rückführen von Filtrat durch die erste Filtratkammer in derselben Richtung wie der und parallel zum Flüssigkeitsstrom in der ersten Filtrierkammer,

(d) ein zweites Gefäß (51) in Flüssigkeitskommunikation mit einer zweiten Filtrationseinheit (57) mit einer zweiten Filtrationsmembran (63), die die Einheit in eine zweite Filtrier- und Filtratkammer (55a), (55b) unterteilt, wobei die Filtrier- und Filtratkammer einen Einlaß (53) und einen Auslaß (67) aufweist,

(e) eine Einrichtung zum Rückführen des Filtrats vom Auslaß der ersten Filtratkammer zum zweiten Gefäß,

(f) eine Einrichtung (53), die einen Einlaß der zweiten Filtrierkammer mit dem zweiten Gefäß verbindet, die eine Einrichtung (59) zum Pumpen von Flüssigkeit aus dem zweiten Gefäß zum Einlaß der zweiten Filtrierkammer enthält,

(g) eine Einrichtung (69) zum Rückführen von Filtrat durch die zweite Filtratkammer in derselben Richtung wie der und parallel zum Flüssigkeitsstrom in der zweiten Filtrierkammer,

(h) ein drittes Gefäß (71) in Flüssigkeitskommunikation mit einer dritten Filtrationseinheit (77) mit einer dritten Filtrationsmembran (83), die die Einheit in eine dritte Filtrier- und Filtratkammer (75a), (75b) unterteilt, wobei die Filtrier- und Filtratkammer einen Einlaß (73) und einen Auslaß (87) aufweist,

(i) eine Einrichtung zum Rückführen des Filtrats vom Auslaß der zweiten Filtratkammer zum dritten Gefäß,

(j) eine Einrichtung (73), die einen Einlaß der dritten Filtrierkammer mit dem dritten Gefäß verbindet, die eine Einrichtung (79) zum Pumpen von Flüssigkeit aus dem dritten Gefäß zum Einlaß der dritten Filtrierkammer enthält, und

(k) eine Einrichtung (85) zum Rückführen des Filtrats vom Auslaß der dritten Filtratkammer zum ersten Gefäß zum Sammeln des Filtrats, worin die erste Filtrationsmembran (43) eine Porengröße besitzt, die die größten interessierenden Spezien zurückhält, die zweite Filtrationsmembran (63) interessierende Spezien mit einer bezüglich der Porengröße der ersten und der dritten Filtrationsmembran dazwischenliegenden Größe zurückhält, und die dritte Filtrationsmembran (83) eine Porengröße besitzt, die die kleinsten interessierenden Spezien zurückhält.

Gegebenenfalls enthält die letztere Vorrichtung ebenso Einrichtungen zum Erzeugen eines Druckgradienten innerhalb der dritten Filtratkammer.

Vorzugsweise sind alle Erzeugungseinrichtungen Einrichtungen zum Rückführen von Filtrat durch die Filtratkammer, parallel zur Richtung des Flüssigkeitsstroms in der Fitrierkammer.

Ebenso sind alle Membranen dieser letzteren Vorrichtung vorzugsweise Ultrafiltrationsmembranen mit in der Kaskade abnehmender Porengröße.

Ein großer Teil der bisherigen Literatur geht von der Annahme aus, daß die Trennung nach Größen im druckunabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"- Kurve erfolgen muß. Die Größentrennung dieser Erfindung wird durch Tangentialfluß- Filtration im druckabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve erreicht. Im allgemeinen wird die Filtrationsgeschwindigkeit gegenüber jener bei Durchführung der Filtration im im druckunabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve erhaltenen tatsächlich verringert. Weiters erfolgt die Filtration derart, daß der TMP mit der Zeit ungefähr konstant bleibt oder während der Filtration abnimmt.

Das Halten des TMPs innerhalb dieses druckabhängigen Bereichs führt zu einer drastischen Abnahme des Zurückhaltens von Molekülen mit Molekulargewichten unterhalb der Membranauslegung. Zusätzlich verbessert dieses Merkmal die Gesamtselektivität des Systems für die wünschenswerterweise zu reinigenden Spezien stark, wodurch die Barriere der Konzentrationspolarisation überwunden wird. Daher wird gegenüber herkömmlicher Tangentialfluß-Filtration, wo der Fluß größer als etwa 100% des Flusses am Übergangspunkt ist, ein höherer Reinigungsgrad der interessierenden Spezien erzielt. Ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß Spezien abgetrennt werden, deren Molekulargewicht weniger als 10mal kleiner ist als jenes der größeren Spezien im Gemisch.

Alle diese wünschenswerten Eigenschaften werden ohne die Notwendigkeit erzielt, den Betriebsdruck auf einen Wert zu erhöhen, der knapp unterhalb des Werts liegt, über dem der Filtratfluß von Betriebsdruck unabhängig ist. Diese Merkmale werden auch ohne die Notwendigkeit erzielt, das Gemisch vor der Filtration zu verdünnen. Daher kann das Verfahren bei der Konzentration des Proteins in jenem Verfahrensschritt, bei dem der TFF-Schritt einsetzt, durchgeführt werden, wobei eine bewußte Verdünnung der Proteinkonzentration in diesem Schritt vermieden wird.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1A zeigt eine grafische Darstellung von Fluß (Jf) gegenüber TMP für eine Tangentialfluß-Filtration unter Verwendung einer einzelnen Membran. ln dieser grafischen Darstellung ist der Bereich von 5 - 100% des Flusses am Übergangspunkt, sowie der Übergangspunkt (Jf*) und die Geraden und Kurven zur Bestimmung des später definierten Übergangspunkts angegeben.

Fig. 1B zeigt die Übergangspunkte für Einzel- und Doppelmembranen.

Fig. 2A zeigt ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung, die zur Durchführung des Hochleistungs-Tangentialfluß-Filtrationsverfahrens dieser Erfindung dient, worin zwei Pumpen an der Filtratkammer der Filtrationseinheit angebracht sind und eine Pumpe im Retentat-Abteil der Filtrationseinheit verwendet wird. Fig. 2B zeigt die Filtrationseinheit aus Fig. 2A, worin zwei parallele Membranen in Schichtanordnung anstatt einer verwendet werden.

Fig. 3 zeigt ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung, die für ein dreistufiges Kaskaden-Tangentialfluß-Filtrationsverfahren verwendet werden kann.

Fig. 4A zeigt ein schematisches Diagramm einer alternativen Vorrichtung, die nur drei Pumpen erfordert und für ein dreistufiges Kaskaden-Tangentialfluß- Filtrationsverfahren verwendet werden kann. Fig. 4B zeigt die Filtrationseinheit aus Fig. 4A, worin statt jeder in Fig. 4A dargestellten Membran zwei parallele Membranen in Schichtanordnung verwendet werden.

Fig. 5 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von Retentat-Proben aus einem ähnlichen Versuch wie in Fig. 6 für die Ausgangsmassenlösung (30 kD Masse), die Diavolumina (DV) 1,5 und 9 der Filtration und die Endmassenlösung, wobei der erste Peak t-PA und der zweite Cytochrom-C anzeigt.

Fig. 6 zeigt eine grafische Darstellung des Flusses bei 30ºC (leere Kreise) und der Cytochrom-C-Retention (volle Kreise) gegenüber dem mittleren TMP bei der Abtrennung von t-PA von Cytochrom-C.

Fig. 7 zeigt eine grafische Darstellung der berechneten % Ausbeute und Reinheitsgrad gegenüber den Diavolumina für die in Fig. 5 dargestellte herkömmliche Tangentialfluß-Ultrafiltration ("conventional tangential-flow ultrafiltration", C-TFF) ohne konstanten TMP (volle Kreise für die Ausbeute und volle Quadrate für den Reinigungsgrad) und für die in Fig. 6 dargestellte Hochleistungs-Tangentialfluß- Ultrafiltration (HP-TFF) (leere Kreise für die Ausbeute und leere Quadrate für den Reinigungsgrad).

Fig. 8 zeigt eine grafische Darstellung der berechneten % Ausbeute und Reinheitsgrad gegenüber den Diavolumina für die in Fig. 5 und 6 dargestellten C-TFF und HP-TFF unter Verwendung einer höheren Rückführrate als in Fig. 7.

Fig. 9 ist eine grafische Darstellung von Fluß gegenüber TMP für ein TFF- Versuchsmodul mit kurzer Weglänge unter Verwendung einer 30 kDa-Membran aus regenerierter Zellulose.

Fig. 10 ist eine grafische Darstellung von Retention gegenüber TMP für ein Gemisch, das Cytochrom-C (Quadrate), rh-GH (leere Dreiecke), rt-PA (volle Dreiecke) und Arginin (leere Kreise) enthält.

Fig. 11 ist eine grafische Darstellung von Retention gegenüber log Molekulargewicht für ein Gemisch, das Cytochrom-C, rh-GH, rt-PA und Arginin enthält, unter Anwendung von C-TFF (volle Kreise) und HP-TFF (leere Kreise).

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen A. Definitionen

Der Ausdruck "Spezien", wie hierin verwendet, meint im allgemeinen Teilchen oder Moleküle, die aus einer Lösung oder Suspension in einem flüssigen Medium, z.B. einer Flüssigkeit, abgetrennt werden sollen. Die Teilchen oder Moleküle werden von der Flüssigkeit und, in den meisten Fällen, von anderen Teilchen oder Molekülen in der Flüssigkeit abgetrennt. Die Größe der interessierenden, abzutrennenden Spezien bestimmt die Porengröße der zu verwendenden Membran. Vorzugsweise sind die Spezien biologische Einheiten natürlichen biologischen oder biochemischen Ursprungs oder nach biologischen oder biochemischen Verfahren hergestellt. Beispiele für bevorzugte Spezien umfassen Säugetierzellen und Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, Pilze und Hefen (wobei sowohl Zellen als auch Mikroorganismen für Mikrofiltrationsverfahren zugänglich sind), sowie Spezien mit für Ultrafiltration geeigneter Größe, einschließlich von Polypeptiden, Proteinen, Zellkomponenten, DNA, Kolloide, Mycoplasmen, Endotoxine, Viren, Kohlenhydrate und andere Moleküle von biologischem Interesse, gleich ob glykosyliert oder nicht.

Die für Ultrafiltration interessanten Spezien sind vorzugsweise biologische Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von zumindest etwa 1.000 Dalton und am meisten bevorzugt Polypeptide und Proteine. Es ist auch bevorzugt, daß die interessierende Spezies weniger als 10mal größer wie die Spezien, von der sie abgetrennt werden soll, z.B. von einer Verunreinigung, oder weniger als 10mal kleiner wie die Spezien, von der sie abgetrennt werden soll, ist.

Wie hierin gebraucht, betrifft der Ausdruck "Tangentialfluß-Filtration" ein Verfahren, worin das die durch Filtration zu trennenden Komponenten enthaltende Flüssigkeitsgemisch mit hohen Geschwindigkeiten tangential zur Membranebene rückgeführt wird, um den Massentransfer-Koeffizienten der Rückdiffusion zu erhöhen. ln derartigen Filtrationen wird entlang der Länge der Membran ein Druckunterschied (TMP) angelegt, um das Fließen der Flüssigkeit und der filtrierbaren gelösten Stoffe durch das Filter zu verursachen. Diese Filtration wird geigneterweise als Batch- Verfahren oder als Verfahren mit kontinuierlichem Fluß durchgeführt. Beispielsweise kann die Lösung wiederholt über die Membran geleitet werden, während jerie Flüssigkeit, die durch das Filter tritt, kontinuierlich in eine eigene Einheit abgezogen wird, oder die Lösung wird einmal durch die Membran geleitet und die Flüssigkeit, die durch das Filter tritt, kontinuierlich stromabwärts verarbeitet.

Hierin wird der Ausdruck "Ultrafiltration" für Verfahren verwendet, die Membranen anwenden, die dazu ausgelegt sind, gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 1 und 1.000 kDa zurückzuhalten.

Der Ausdruck "Umkehrosmose" betrifft, wie hierin gebraucht, Verfahren, die Membranen anwenden, die in der Lage sind, gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht von unter 1 kDa, wie z.B. Salze und andere gelöste Stoffe mit niedrigem Molekulargewicht, zurückzuhalten.

Hierin betrifft der Ausdruck "Mikrofiltration" Verfahren, die Membranen im Porengrößen-Bereich von 0,1 - 10 x 10&supmin;&sup6; m anwenden.

Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "Transmembran-Druck" oder "TMP" den Druckdifferential-Gradienten, der entlang der Länge einer Filtrationsmembran angelegt wird, um den Fluß der Flüssigkeit und der filtrierbaren gelösten Stoffe durch das Filter zu verursachen.

Der Ausdruck "im wesentlichen konstant" betrifft hierin, wenn für TMP gebraucht, einen TMP, der über die Länge der Membran im allgemeinen nicht um mehr als etwa 70 x 10³ N/m² des mittleren TMPs, und vorzugsweise um nicht mehr als etwa 35 x 10³ N/m², zu- oder abnimmt. Was den TMP-Wert während der Filtration betrifft, wird der TMP während des Konzentrationsschritts konstant gehalten oder gesenkt, um Selektivität bei höheren Konzentrationen beizubehalten. Daher betrifft ein "im wesentlichen konstanter TMP" den TMP gegenüber der Membranlänge, nicht gegenüber der Filtrationszeit.

Wie hierin gebraucht, bedeutet "gleiche Porengröße" für die Filtrationsmembran Membranen, die mit derselben Porengröße ausgelegt oder verkauft werden, selbst wenn die tatsächlichen Porengrößen der Membranen ein wenig variieren.

Der Filtrationsmembranen beschreibende Ausdruck "benachbart" bedebtet hierin im wesentlichen benachbart, sodaß die Membranen physikalisch aufeinander oder mit einem kleinen Zwischenraum zueinander geschichtet werden.

Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "Einrichtungen zur Erzeugung eines Druckgradienten innerhalb der Filtratkammer" einen Mechanismus zum Erzeugen eines Druckgradienten, sodaß der Transmembran-Druck im wesentlichen bei konstantem Wert im druckabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve gehalten werden kann.

Der Ausdruck "Einrichtungen zum Rückführen von Filtrat durch die Filtratkammer, parallel zur Richtung der Flüssigkeit in der Filtrierkammer" betrifft hierin einen Mechanismus oder eine Konfiguration, der (die) einen Teil der Flüssigkeit aus den Filtratkammern parallel zu und im wesentlichen in derselben Richtung (was gewisse Flußabweichungen zuläßt) strömen läßt, wenn der Flüssigkeitsstrom vom Einlaß zum Auslaß der Filtrierkammer durch die benachbarte Fitrierkammer fließt. Vorzugsweise ist diese Einrichtung eine Pumpeinrichtung.

Wie hierin gebraucht, betrifft der Ausdruck "Gefäß" einen Behälter oder Tank zum Lagern, Abgeben und/oder Aufnehmen von Flüssigkeit.

Der Ausdruck "Übergangspunkt" bedeutet hierin einen festgelegten Punkt auf einer "Fluß gegenüber TMP"-Kurve, der wie folgt bestimmt wird: Es werden Versuchsdaten von Fluß (Jf) gegenüber TMP gesammelt, entweder in einem Modul geringer Wegstrecke, worin der TMP an Ein- und Auslaß um ± 10% variiert, oder in einem Modul voller Wegstrecke, worin unter Verwendung von rückgeführtem Filtrat dieselben Bedingungen herrschen. Die Versuchsdaten werden an die durch die Gleichung:

Jf = Jmax x TMP/(k + TMP) (Gleichung 1)

definierte Kurve angepaßt, worin Jmax (ein asymptotischer Wert) und k durch lineare Regressionsrechnung von 1/Jf gegenüber 1/TMP bestimmt werden, was einen Schnittpunkt von 1/Jmax und einen Anstieg von k/Jmax ergibt. Unter Bezugnahme auf Fig. 1A wird der Übergangspunkt grafisch nach den folgenden Kriterien definiert: Bestimmen des Schnittpunkts von Jf = Jmax und der Tangente durch den Ursprung der Kurve, die nach Gleichung 1 definiert ist (die Tangente ist Jf = Jmax x TMP/k). Anschließend wird eine Gerade durch diesen Schnittpunkt und senkrecht auf eine Tangente der obigen Kurve gezogen. Der Schnittpunkt dieser letzteren Gerade und der Kurve definiert den Fluß am Übergangspunkt. Mathematisch ist dieser Übergangspunkt (Jf*) definiert als die reale Lösung der folgenden Gleichung im Bereich der Versuchsdaten:

(Jmax - Jf*)4 = -Jmax x k² (Jmax - 2Jf*). (Gleichung 2)

B. Durchführungsarten der Erfindung

In seinem weitesten Aspekt umfaßt das hierin betrachtete Hochleistungs- Tangentialfluß-Filtrationsverfahren das Leiten des Gemischs der zu trennenden Spezien durch eine oder mehrere Filtrationsmembranen in einer Vorrichtung oder einem Modul, die (das) für einen Tangentialfluß-Filtrationstyp unter gewissen Bedingungen für TMP und Fluß ausgelegt ist. Der TMP wird in einem Bereich im druckabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve gehalten, nämlich in einem Bereich, der den TMP-Wert am Übergangspunkt nicht übersteigt. Daher erfolgt die Filtration bei einem Fluß im Bereich von etwa 5% bis zu 100% des Flusses am Übergangspunkt. Siehe Fig. 1A und 1B, worin die "Fluß gegenüber TMP"-Kurve zusammen mit dem Übergangspunkt dargestellt ist. Als Ergebnis werden die interessierenden Spezien durch die Membran selektiv als Retentat zurückgehalten, während die kleineren Spezien als Filtrat durch die Membran hindurchtreten, oder die interessierenden Spezien treten als Filtrat durch die Membran hindurch und die Verunreinigungen im Gemisch werden durch die Membran zurückgehalten.

Es ist zu bemerken, daß der TMP im Lauf der Filtration nicht zunimmt und während der Filtration nicht unbedingt konstant gehalten werden muß. Der TMP kann über die Zeit ungefähr konstant gehalten werden oder kann mit Fortschreiten der Filtration abnehmen. Falls die zurückgehaltenen Spezien konzentriert werden, wird bevorzugt, den TMP im Zuge des Konzentrationsschritts zu senken.

Jede Membran weist vorzugsweise eine Porengröße auf, die Spezien mit einer Größe bis zu etwa 10 x 10&supmin;&sup6; m, noch bevorzugter 1 kDa bis 10 x 10&supmin;&sup6; m, zurückhält. Beispiele für Spezien, die mittels Ultrafiltration abgetrennt werden können, umfassen Proteine, Polypeptide, Kolloide, Mycoplasma, Endotoxine, Viren, Aminosäuren, DNA, RNA und Kohlenhydrate. Beispiele für Spezien, die mittels Mikrofiltration abgetrennt werden können, umfassen Säugetierzellen und Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien.

Da Membranfilter nicht perfekt sind und Löcher besitzen können, die manche beabsichtigte Retentat-Moleküle durchschlüpfen lassen, ist ein bevorzugter Aspekt hierin, mehr als eine Membran mit derselben Porengröße zu verwenden, wobei die Membranen so angeordnet werden, daß sie parallel zueinander, vorzugsweise aufeinander, in Schichten angeordnet sind. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Membranen für diese Zwecke zwei.

Obwohl der Fluß, an dem der Druck im obigen Bereich gehalten wird, geeigneterweise im Bereich von 5 - 100% liegt, ist die benötigte Membran-Oberfläche umso größer, je niedriger der Fluß ist. Daher wird zum Minimieren der Membran kosten bevorzugt, bei einem derartigen Druck zu arbeiten, daß der Fluß am oberen Ende des Spektrums liegt. Der bevorzugte Bereich liegt bei etwa 50 - 100% und der noch bevorzugtere Bereich bei etwa 75 - 100%, des Flusses am Übergangspunkt.

Obwohl der TMP entlang der Membranoberfläche nicht im wesentlichen konstant gehalten zu werden braucht, wird bevorzugt, den TMP im wesentlichen konstant zu halten. Eine derartige Bedingung wird im allgemeinen erreicht, indem ein Druckgradient auf der Filtratseite der Membran erzeugt wird. So wird das Filtrat durch das Filtratabteil der Filtrationsvorrichtung in dieselbe Richtung und parallel zum Strom des Gemischs im Retentatabschnitt der Vorrichtung rückgeführt. Die Einlaß- und Auslaßdrücke des rückgeführten Materials werden so gesteuert, daß der Druckabfall über das Filtratabteil gleich jenem des Retentatabteils ist.

Es können verschiedene praktische Einrichtungen verwendet werden, um diesen Filtrat-Druckgradienten zu erzielen. Ein Beispiel ist die in Fig. 2A dargestellte Konfiguration. Dabei tritt das zu trennende Gemisch durch die Einlaßleitung 1, die mit einem (nicht dargestellten) Fermentertank in Verbindung steht, in die Vorrichtung ein, falls die zu trennenden Produkte in einer Fermentationsbrühe vorliegen. Sie kann ebenso mit einem (nicht dargestellten) Gefäß in Verbindung stehen, das ein Zellysat oder einen Überstand nach dem Ernten von Zellen enthält. Die Fließgeschwindigkeit in Leitung 1 wird durch die Retentat-Pumpeinrichtung 3 gesteuert. Die Pumpe kann jede dem Fachmann bekannte, geeignete Pumpe sein, und die Fließgeschwindigkeit kann entsprechend der dem Fachmann bekannten Art der Filtration eingestellt werden.

Gegebenenfalls wird ein Manometer angebracht, um den Einlaßdruck des Stroms aus der Pumpeinrichtung 3 zu messen. Die Flüssigkeit in Einlaßleitung 1 tritt in Filtrationseinheit 7 ein. Diese Filtrationseinheit 7 enthält in ihrem Oberteil eine Filtrierkammer 7a und in ihrem Bodenteil eine Filtratkammer 7b. Diese beiden Abschnitte oder Abteile werden durch eine Filtrationsmembran 9 voneinander getrennt. Die Einlaßflüssigkeit strömt innerhalb der Filtrierkammer 7a in paralleler Richtung zur Filtrationsmembran 9. Die obenliegende Filtrierkammer 7a empfängt das die interessierende Spezies enthaltende Gemisch. Kleinere Spezien treten durch die Membran 9 hindurch in die untenliegende Kammer 7b ein. Das konzentrierte Retentat fließt von der Filtrationseinheit 7 durch die Auslaßleitung 11 ab, wo es gesammelt und falls notwendig weiter verarbeitet werden kann, um die gewünschte interessierende Spezies zu erhalten. Alternativ wird der Retentat-Strom zu einem Tank oder Fermenter rückgeführt, aus dem das Gemisch stammte, um durch Einlaßleitung 1 zur weiteren Reinigung rückgeführt zu werden.

Die Lösung, die Moleküle enthält, die durch die Membran 9 hindurch in die Filtratkammer 7b treten, verläßt die Filtrationseinheit 7 über die Auslaßleitung 13 am selben Ende der Filtrationseinheit 7, wo die Retentat-Flüssigkeit über die Auslaßleitung 11 austritt. Ein Teil dieses Filtrats verläßt das System über Leitung 13, um verworfen oder zu einem zweiten Tank oder Gefäß zur Weiterverarbeitung in einer Art Kaskaden- Filtration durch eine Membran geringerer Porengröße geleitet zu werden.

Gegebenenfalls wird zur Mikrofiltration eine Filtrat-Pumpeinrichtung 15 innerhalb der Leitung 13 angeordnet. Ein weiterer Teil wird über Leitung 17 zu einer Filtrat- Pumpeinrichtung 19 rückgeführt, die den Filtratdruck-Gradienten erzeugt. Dieser Teil der Flüssigkeit wird über Einlaßleitung 21 zum Einlaßende der Filtratkammer 7b rückgeführt, damit in Filtratkammer 7b ein zum zu trennenden Gemisch in Filtrierkammer 7a paralleler und gleichgerichteter Filtratstrom entsteht.

Die Betriebsrate der Pumpeinrichtung 19 wird so eingestellt, daß der Druck, mit dem das Filtrat in die Kammer 7b eingebracht wird (Filtrateinlaßdruck), und der Druck, mit dem das Filtrat über Auslaßleitung 13 entfernt wird (der Filtrat-Auslaßdruck), gesteuert werden kann, um für einen im wesentlichen konstanten TMP entlang der Membranlänge zu sorgen. Die bevorzugte Vorgangsweise besteht in der Einstellung des Druckunterschieds über die Kammer 7b auf denselben Wert wie jener des Druckabfalls über die Kammer 7a der Einheit 7, um den TMP über die gesamte Membran etwa gleich zu machen. Es können an Einlaß bzw. Auslaß der Rückführstrom-Schleife des Filtrats durch Filtratkammer 7b Druckmeßeinrichtungen 23a und 23b angebracht werden, um den Druckabfall zu überwachen und falls nötig einzustellen. Gegebenenfalls wird Druckmeßeinrichtung 23c in Auslaßleitung 11 angebracht, um den Druckabfall für die Filtrierkammer 7a zu überwachen. Die Filtratkammer 7b kann einen sich verengenden Flußweg umfassen, um einen geeigneten Druckgradienten zu ergeben, während die Rückführrate des Filtrats minimiert wird. Das Ergebnis dieser Konfiguration ist ein im wesentlichen konstanter TMP über die gesamte Membranoberfläche.

Die hierin verwendbare Filtrationseinheit kann geeigneterweise jede zurzeit bekannte oder in der Zukunft entwickelte Einheit sein, die als geeignetes Filtrationsmodul, besonders für Mikrofiltration und Ultrafiltration, dient. Die bevorzugte Ultrafiltrationseinheit besteht aus Hohlfasern oder einer Vorrichtung aus flachen Platten. Diese gesandwichten Filtrationseinheiten können zu einer Verbundzelle gestapelt werden. Ein bevorzugter Typ von rechteckigen Zellen vom Filtrationsplatten-Typ ist von Filtron Technology Corporation, Northborough, MA, unter dem Handelsnamen Centrasette erhältlich.

Eine andere geeignete Ultrafiltrationseinheit ist das Millipore-Pellicon- Ultrafiltrationssystem von Millipore, Bedford, MA.

In der in Fig. 2A dargestellten Konfiguration müssen die Membranen unter Berücksichtigung der Kammern 7a und 7b angeordnet werden, um für die angegebenen Fließgeschwindigkeiten und Druckunterschiede über die Membrän zu sorgen. die für das Verfahren dieser Erfindung geeigneten Membranen liegen im allgemeinen in Form von flachen Platten, aufgerollten Platten, Zylindern, konzentrischen Zylindern, Rohren verschiedener Querschnittsformen und anderen Konfigurationen, einzeln oder in Gruppen angeordnet und in der Filtrationseinheit in Reihe oder parallel geschaltet vor. Die Vorrichtung wird im allgemeinen so konstruiert, daß die Filtrier- und Filtratkammern über die Membranlänge verlaufen.

Geeinete Membranen sind jene, die die gewünschten Spezien von unerwünschten Spezien im Gemisch im wesentlichen ohne Verstopfungsprobleme und mit einer für kontinuierlichen Betrieb des Systems ausreichenden Rate abtrennen. Beispiele werden von Gabler, siehe oben, beschrieben. Es sind typischerweise synthetische Membranen entweder vom Mikroporen- oder vom Ultrafiltrationstyp. Eine Mikroporen-Membran weist typischerweise Porengrößen von 0,1 - 10 x 10&supmin;&sup6; m auf und kann so hergestellt werden, daß sie alle größeren Teilchen als die gewählte Größe zurückhält. Ultrafiltrationsmembranen besitzen kleinere Poren und werden durch die Größe des zurückgehaltenen Proteins gekennzeichnet. Sie sind in Inkrementen von 1.000 - 1.000.000 Dalton Nominal-Molekulargewichts-Grenzen erhältlich.

Ultrafiltrationsmembranen eignen sich meistens zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung. Ultrafiltrationsmembranen sind normalerweise asymmetrisch mit einem dünnen Film oder einer dünnen Haut auf der stromaufwärtigen Oberfläche, die für ihre Trennleistung verantwortlich ist. Üblicherweise werden sie aus regenerierter Zellulose oder Polysulfon hergestellt.

Membranfi lter zur Tangentialfluß-Filtration sind als Einheiten mit verschiedener Konfiguration, je nach den Volumina der zu behandelnden Flüssigkeit, und in einer Vielzahl von Porengrößen erhältlich. Besonders zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind in relativ breitem Rahmen die bekannten, kommerziell erhältlichen Tangentialfluß-Filtrationseinheiten.

In einer alternativen und bevorzugten Vorrichtung und aus obigen Gründen umfaßt die Filtrationseinheit 7 aus Fig. 2A mehrere, vorzugsweise zwei, Filtrationsmembranen, die in Fig. 2B als Membranen 9a bzw. 9b dargestellt sind. Diese Membranen werden in paralleler Konfiguration in Schichten angeordnet.

Die Erfindung umfaßt auch ein Mehrstufen-Kaskadenverfahren, worin das Filtrat aus dem obigen Verfahren in einer zweiten Tangentialfluß-Filtrationsvorrichtung durch eine Filtrationsmembran mit kleinerer Porengröße als die Membran der ersten Vorrichtung geleitet wird, das Filtrat aus dieser zweiten Filtration zur ersten Vorrichtung zurückgeführt und das Verfahren wiederholt wird.

In diesem Kaskadenverfahren ist die zweite Filtration typischerweise eine herkömmliche Filtration, worin der Fluß auf einem Wert gehalten wird, der größer als etwa 100% des Flusses am Übergangspunkt gehalten wird; ebenso wird im allgemeinen der TMP entlang der Membran nicht im wesentlichen konstant gehalten.

In einer noch bevorzugteren Ausführungsform des Kaskadenverfahrens umfassen beide Stufen Tangentialfluß-Ultrafiltration, worin die Porengröße zwischen 1 und 1.000 kDa beträgt.

ln einem dreistufigen Kaskadenverfahren wird das Filtrat aus der zweiten Filtration in einer dritten Tangentialfluß-Filtrationsvorrichtung durch eine Filtrationsmembran mit einer kleineren Porengröße als jene der zweiten Membran hindurchgeführt, das Filtrat aus dieser dritten Filtration zur ersten Filtrationsvorrichtung rückgeführt und das Verfahren wiederholt. Falls nur zwei Hochleistungs-Filtrationen im Kaskadenverfahren erforderlich sind, ist die dritte Stufe konventionell, d.h., der Fluß wird in dieser dritten Stufe auf einem größeren Wert als etwa 100% des Flusses am Übergangspunkt gehalten.

In einer noch bevorzugteren Ausführungsform dieses dreistufigen Kaskadenverfahrens umfassen alle drei Stufen Tangentialfluß-Filtration.

Eine zur Durchführung des Kaskadenverfahrens geeignete Tangentialfluß- Vorrichtung ist in Fig. 3 dargestellt. Hier ist ein ein erstes Gefäß 31 über Einlaßleitung 33 mit einer innerhalb einer Filtrationseinheit 37 liegenden Filtrierkammer 35a verbunden. Eine erste Einlaß-Pumpeinrichtung 39 ist zwischen dem ersten Gefäß 31 und Filtrierkammer 35a angeordnet. Die Filtrierkammer 35a ist über eine Auslaßleitung 41 mit dem ersten Gefäß verbunden. Die Filtrierkammer 35a wird von einer ersten Filtrier- und Filtratkammer 35b, die sich in der Filtrationseinheit 37 direkt darunter befindet, durch eine erste Filtrationsmembran 43 getrennt. Die erste Filtrier- und Filtratkammer 35b weist eine Auslaßleitung 47 auf, die mit dem Einlaß von Kammer 35b durch eine in Leitung 47 angebrachte Filtrat-Pumpeinrichtung 49 verbunden ist. Leitung 45, die mit Auslaßleitung 47 verbunden ist, ist ebenso mit dem zweiten Gefäß 51 verbunden.

Dieses Gefäß 51 ist über Einlaßleitung 53 mit einer zweiten Filtrierkammer 55a verbunden, die sich innerhalb einer zweiten Filtrationseinheit 57 befindet. Eine zweite Einlaß-Pumpeinrichtung 59 liegt zwischen dem zweiten Gefäß 51 und Filtrierkammer 55a. Die Filtrierkammer 55a wird von der zweiten Filtrier- und Filtratkammer Ssb, die sich innerhalb von Filtrationseinheit 57 direkt darunter befindet, durch eine zweite Filtrationsmembran 63 getrennt. Die zweite Filtrier- und Filtratkammer 55b weist eine Auslaßleitung 67 auf, die mit dem Einlaß von Kammer 55b durch eine in Leitung 67 angebrachte Filtrat-Pumpeinrichtung 69 verbunden ist. Leitung 65, die mit Auslaßleitung 67 verbunden ist, ist ebenso mit dem dritten Gefäß 71 verbunden.

Dieses Gefäß 71 ist über Einlaßleitung 73 mit einer dritten Filtrierkammer 75a verbunden, die sich innerhalb einer dritten Filtrationseinheit 77 befindet. Eine dritte Einlaß-Pumpeinrichtung 79 liegt zwischen dem dritten Gefäß 71 und Filtrierkammer 75a. Die Filtrierkammer 75a wird von der dritten Filtrier- und Filtratkammer 75b, die sich innerhalb von Filtrationseinheit 77 direkt darunter befindet, durch eine dritte Filtrationsmembran 83 getrennt. Die dritte Filtrier- und Filtratkammer 75b weist eine Auslaßleitung 87 auf, die mit Leitung 85 verbunden ist, die mit dem ersten Gefäß 31 verbunden ist, um das Filtrat zum ursprünglichen Tank rückführen zu können.

Gegebenenfalls ist die Auslaßleitung 87 der dritten Filtrier- und Filtratkammer 75b mit dem Einlaß von Kammer 75b durch eine Filtrat-Pumpeinrichtung 89 verbunden, die sich in Leitung 87 befindet.

Der Flüssigkeitsstrom von den Einlässen zu den Auslässen aller Kammern ist parallel und erfolgt in gleicher Richtung. Außerdem weist die erste Filtrationsmembran 43 eine Porengröße auf, die Spezien größerer Größe als jene der zweiten und dritten Filtrationsmembran 63 bzw. 83 zurückhält, und die zweite Filtrationsmembran 63 weist eine Porengröße auf, die Spezien einer größeren Größe als die dritte Filtrationsmembran 83 zurückhält.

Eine zweite Tangentialflußvorrichtung, die sich zur Durchführung des Kaskadenverfahrens eignet, ist in Fig.4A dargestellt. Hier ist ein erstes Gefäß 91 über eine Einlaßleitung 93 mit einer Filterkammer 95a innerhalb einer Filtrationseinheit 97 verbunden. Eine erste Einlaßpumpeinrichtung 99 ist zwischen dem ersten Gefäß 91 und der Filterkammer 95a angeordnet. Die Filterkammer 95a ist über eine Auslaßleitung 101 mit dem ersten Gefäß 91 verbunden. Die Filterkammer 95a ist durch eine erste Filtrationsmembran 103 von einer ersten Fitrier/Filtratkammer 95b getrennt, die direkt darunter innerhalb der Filtrationseinheit 97 angeordnet ist. Ein zweites Gefäß 105 ist über die Einlaßleitung 107 mit der ersten Fitrier/Filtratkammer 95b verbunden. Eine zweite Einlaßpumpeinrichtung 109 befindet sich zwischen dem zweiten Gefäß 105 und der ersten Fitrier/Filtratkammer 95b. Die erste Fitrier/Filtratkammer 95b ist über eine Auslaßleitung 111 mit dem zweiten Gefäß 105 verbunden. Die erste Fitrier/Filtratkammer 95b ist durch eine zweite Filtrationsmembran 11 3 von einer zweiten Fitrier/Filtratkammer 95c getrennt, die sich direkt darunter innerhalb der Filtrationseinheit 97 befindet.

Ein drittes Gefäß 11 5 ist über eine Einlaßleitung 11 7 mit der zweiten Fitrier/Filtratkammer 95c verbunden. Eine dritte Einlaßpumpeinrichtung 119 ist zwischen dem dritten Gefäß 115 und der zweiten Fitrier/Filtratkammer 95c angeordnet. Die zweite Fitrier/Filtratkammer 95c ist über eine Auslaßleitung 121 mit dem dritten Gefäß 115 verbunden. Die zweite Fitrier/Filtratkammer 95c ist durch eine dritte Filtrationsmembran 123 von einer Filtratkammer 95d getrennt, die sich direkt darunter innerhalb der Filtrationseinheit 97 befindet.

Die Filtratkammer 95d ist über eine Auslaßleitung 125 mit dem ersten Gefäß 91 verbunden, um es dem Filtrat zu ermöglichen, wieder zum ursprünglichen Gefäß zurückzufließen. Der Fluidfluß von den Einlässen zu den Auslässen aller Kammern erfolgt parallel und in der gleichen Richtung. Die erste Filtrationsmembran 103 besitzt eine Porengröße, die Spezien einer größeren Größe als jene der zweiten und dritten Filtrationsmembran 113 bzw. 123 zurückhält, und die zweite Filtrationsmembran 113 besitzt eine Porengröße, die Spezien einer größeren Größe als die dritte Filtrationsmembran 123 zurückhält.

Die Kaskadenvorrichtung von Fig.4A ermöglicht Hochleistungs-Tangentialfluß- Mehrfachfiltrationen mit allen Vorteilen; es sind nur drei Pumpen und ein Gerät und nicht fünf oder sechs Pumpen und drei Geräte erforderlich, die normalerweise für das in Fig.3 dargestellte Hochleistungs-Tangentialfluß-Filtrationskaskadensystem notwendig sind.

Wahlweise ist die Vorrichtung von Fig.4A solcherart konfiguriert, daß jede Filtrationsmembran eine Vielzahl an übereinandergeschichteten Membranen (vorzugsweise zwei) innerhalb der Filtrationsmembran 97 aufweist, wie dies aus Fig.4B ersichtlich ist (Membran 93b für die erste Membran 93a, Membran 113b für die zweite Membran 113a und Membran 123b für die dritte Membran 123a).

Die in Figuren 3 und 4 gezeigten Kaskadenvorrichtungen sind solcherart, daß die erste Membran 43 oder 103 eine Porengröße mit einem Cutoff aufweist, der größer als jener der zweiten Membran 63 bzw. 113 ist, die wiederum eine Porengröße mit einem Cutoff aufweist, der größer als jener der dritten Membran 83 bzw. 123 ist. Am bevorzugtesten sind diese Membranen alle Ultrafiltrationsmembranen.

Die Vorrichtungen von Figuren 3 und 4A sind ausgebildet, unter Verwendung dreier Filtrationsmembranen eine Dreistufentrennung durchzuführen. Die Erfindung betrifft hierin aber auch Geräte, worin nur zwei Filtrationsmembranen und zwei Gefäße beteiligt sind, sodaß beispielsweise in Fig.4A die zweite Fitrier/Filtratkammer 95c eine Filtratkammer mit einer Auslaßleitung ist und die Elemente 95d, 121, 123, 115, 117 und 119 nicht vorhanden sind. In anderen Variationen enthalten die Vorrichtungen der Figuren 3 und 4A mehr als drei Filtrationsmembranen und mehr als drei Gefäße, sodaß beispielsweise die zweite Filtrier/Filtratkammer 95c von Fig.4A über erie vierte Filtrationsmembran mit einer dritten Filtrier/Filtratkammer verbunden ist, die mit einer Einlaß- und einer Auslaßleitung in Fluidkommunikation mit einem vierten Gefäß ausgestattet ist und so weiter, wobei die letzte oder unterste Kammer eine Filtratkammer wie jene von 95d ist, die über die Leitung 125 mit dem ersten Gefäß 91 in Fluidkommunikation steht, wie dies aus Fig.4A ersichtlich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist an die Verwendung in kommerziellem und halbkommerziellem Maßstab gut angepaßt. Es kann chargenweise, kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt werden, d.h. auf der Grundlage des kontinuierlichen Flusses einer Lösung, welche die erwünschte Spezies enthält, am Tangentialflußfilter vorbei, bis eine gesamte große Charge somit gefiltert wurde, wobei zwischen den Filtrationsstufen Waschschritte eingeschaltet sind. Dann können frische Lösungschargen behandelt werden. Auf diese Weise kann man einen kontinuierlichen Kreislaufprozeß durchführen, um große Ausbeuten des gewünschten Produkts in zufriedenstellend reiner Form innerhalb relativ kurzer Zeiträume zu ergeben.

Das einzigartige Merkmal der hierin beschriebenen Tangentialflußfiltration, die eine kontinuierliche Filtration von Feststoffen enthaltenden Lösungen ohne Filterverstopfung ermöglicht, führt zu einem äußerst vorteilhaften Verfahren zur Abtrennung und Reinigung biologischer Reaktionsprodukte zur Verwendung auf kontinuierlicher Basis und in kommerziellem Maßstab. Außerdem ist das Verfahren für eine breite Palette biologischer Moleküle anwendbar, z.B. für Protein-Produkte zur Fermentierung mit natürlichen oder gentechnisch gebildeten Mikroorganismen, Antikörper mit hohem Molekulargewicht, zelluläre Sekrete usw.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken sie aber nicht ein.

BEISPIEL 1

In diesem Beispiel wurde die Trennung von rekombinantem t-PA (etwa 65 kDa) von Cytochrome-C (etwa 12,5 kDa) im herkömmlichen und Hochleistungs- Tangentialflußultrafiltrations-Modus verglichen.

Eine Probe von rekombinantem t-PA (US PSen 4.766.075; 4.853.330; 4.777,043; und 4.908.205) in 0,2 M Argininphosphatpuffer mit 0,002W0 Tween 80, pH-Wert 7,2, ("Puffer") wurde mit Wasser verdünnt, um zwei 1 l-Aliquote einer 0,9 mg/ml-Lösung von rt-PA zu erhalten. Cytochrome-C (Sigma) wurde zu einer endgültigen errechneten Konzentration von 0,1 mg/ml hinzugefügt.

Für den unten beschriebenen Versuch Nr.2 verwendete man ein Hochleistungs-TFF (HP- TFF)-Forschungsmodul, das im wesentlichen dem in Fig.2A dargestellten entsprach, unter Verwendung einer Membran, die aus etwa 0,04 m² Hoechst Kalle regenierter Zellulose für 30 kDa bestand, um den rt-PA vom Cytochrome-C im Gemisch zu trennen. Die Auslaßleitung 11 führt das Fluid zurück zu einem das Gemisch enthaltenden Großgefäß (30 kDa), das mit der Einlaßleitung 1 verbunden ist; die Auslaßleitung 13 ist mit einem Behälter (5 kDa) in der Art einer geschlossenen Schleifenkaskade mit einem herkömmlichen Millipore Pellicon Ultrafiltrationssystem verbunden, das 1 m² einer regenerierten Zellulosemembran für 5 kDa enthält. Diese Membran hält das Cytochrome zurück und bietet eine adäquate Filtrationsrate, um dem HP-TFF-Modul zu entsprechen. Das Filtrat aus dem 5 kDa-System wurde geteilt, wobei ein Teil mit dem 5 kDa-Retentat in einem 5 kDa Gefäß des Millipore-Systems und der andere Teil über eine 7016-Masterflex-Pumpe mit dem 30 kDa Großgefäß verbunden war. Diese Pumpe diente dazu, sowohl im 30 kDa Gefäß als auch im 5 kDa Gefäß gleichbleibende Flüssigkeitspegel aufrecht zu halten. Die Forschungs- und Pellicon- Module wurden ausgiebig mit Wasser ausgespült, entleert und dann mit Puffer geprimt. Das 30 kDa-System wurde dann entleert, auf Integrität/Unversehrtheit untersucht und mit 750 ml des oben beschriebenen Gemisches von rt-PA und Cytochrome-C gefüllt, während das 5 kDa-System entleert, die Integrität untersucht und mif 750 ml Puffer gefüllt wurde.

Bei Versuch Nr.1, der zu Vergleichszwecken die herkömmliche Durchführungsart darstellt, verwendete man das bzw. die 30 kDa-Forschungsmodul/5 kDa- Pelliconkaskade, wobei das Forschungsmodul im herkömmlichen Ultrafiltrationsmodus und nicht im oben beschriebenen HP-TFF-Modus betrieben wurde.

Die Parameter des für beide Versuche verwendeten Forschungsmodus sind wie folgt:

Kanal breite 3 cm

Kanalhöhe 0,8 mm

Kanallänge 152 cm

30 kDa-Umlaufpumpe Masterflex 7015 [6-6000 U/min] (Cole Parmer, Chicago IL) peristaltische Pumpe

30 kDa-Filtrationspumpe keine

30 kDa-Filtratumlaufpumpe Doppelkopf-Masterflex 7015 (6-600 U/min)

5 kDa-Umlaufpumpe Masterflex 7019 (Cole Parmer, Chicago IL) peristaltische Pumpe

5 kDa-Filtrationspumpe Masterflex 7016 (6-600 U/min) (Cole Parmer, Chicago IL) peristaltische Pumpe

Regenerierte für 30 kDa Zellulosemembran Hoechst Kalle Rollmaterialcharge #228

Regenerierte für 5 kDa Zellulosemembran Millipore Charge #C9CK7889

Versuche 1 und 2 erfolgten unter unterschiedlichen, un-n beschriebeneb Bedingungen, worin Qs die Zufuhrrate, QH2O die Wasserfiltrationsrate, Q die Verfahrensfiltrationsrate und Qrf die Umlauffiltratrate ist.

Versuch Nr.1 30 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.beiPo=35x10³ N/m²; QH2O/TMP=9.32x10&supmin;&sup5; L/h,Nm&supmin;²; Retentat-Temperatur = 23ºC.

5 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.beiPo=35x10³ N/m²; QH2O/TMP=6.53x10&supmin;&sup5; L/h,Nm&supmin;²; Retentat-Temperatur = 22ºC.

Qs-Qf = 305 ml/min

Qrf = 0 ml/min.

Qf = 93 ml/min.

Qs = 398 ml/min.

Modullänge [-] Anfang (kN/m²) Ende (kN/m²) Retentat-Druck Filtratdruck Pellicon 5 kDa; Pi = 234x10³ N/m²; Po = 138x10³ N/m².

30 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.bei Po=35x10³ N/m²; Retentat-Temperatur = 28ºC.

5 kDa Integritätsversuch:

ΔP=1400 N/m² in 1 min.bei Po=35x10³ N/m²; Retentat-Temperatur = 35ºC.

Versuch Nr. 2 30 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.bei Po=35x10³ N/m², worin Po der Auslaßdruck ist; QH2O/TMP = 9.45x10&supmin;&sup5; L/h,Nm&supmin;²; Retentat-Temperatur = 23ºC.

5 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.bei Po=35x10³ N/m²; QH2O/TMP=7.74x10&supmin;&sup5; L/h,Nm&supmin;²; Retentat-Temperatur = 23ºC.

Qs-Qf = 360.5 ml/min

Qrf = 847.0 ml/min

Qf = 83 ml/min

Qs = 443.5 ml/min

Normalisiert Anfang (kN/m²) Ende (kN/m²) Modullänge[-] Retentat-Druck Filtratdruck *N.D. = nicht bestimmt Pellicon 5 kDa; Pi (Einlaßdruck) = 241x10³ N/m²: Po (Auslaßdruck) = 131x10³ N/m².

30 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.bei Po=35x10³ N/m²; Retentat-Temperatur = 33ºC.

5 kDa Integritätsversuch:

ΔP=700 N/m² in 1 min.bei Po=35x10³ N/m²; Retentat-Temperatur = 40ºC.

Für Versuche 1 und 2 erfolgten zwei unterschiedliche Assays. Im ersten Assay wurden die A280nm und A410nm für die Anfangs- und Endbulks bestimmt. Die Cytochrome-C- Konzentration wurde durch A410nm bestimmt (t-PA absorbiert nicht bei 410 nm). Die t- PA-Konzentration wurde dann bei A280nm nach dem Subtrahieren der A28onm- Absorbanz aufgrund von Cytochrome-C bestimmt.

Im zweiten Assay wurden der Anfangsbulk (Gemisch vor dem Umlauf) und der Endbulk (Puffer nach dem Umlauf durch das 5 kDa System) sowie die Retentate und Filtrate für die 30 kDa bzw. 5 kDa Behälter durch TSK-200-Größenausschluß-HPLC mit einem Nachweis bei 214 nm geprüft.

Die Ergebnisse sind wie folgt:

A410nm = 0.41551 x 2 = {epsilonCytochrome-C,410nm=8.9} = 0.0934 mg/ml Cytochrome-C.

A280nm/A410nm Assay: Versuch Nr. 1: Herkömmliche Durchführungsart

kDa Anfangsbulk kDa Endbulk Massengleichgewicht Cytochrome-C % Ausbeute Reinigungsgrad 7.5-fach Versuch Nr. 2: Leistungsstarke Durchführungsart
kDa Anfangsbulk kDa Endbulk Massengleichgewicht Cytochrome-C % Ausbeute Reinigungsgrad 38-fach

Diese Ergebnisse zeigen, daß HP-TFF im Vergleich zu C-TFF eine um ein Mehrfaches höhere Reinigung ergab.

Eine Reihe von HPLC-Chromatogrammen, die die Entfernung von Cytochrome-C aus rt- PA darstellen, wird in Fig.5 gezeigt. Der Graph zeigt die saubere Abtrennung des t-PA von Cytochrome-C, das ein weniger als zehnmal kleineres Molekulargewicht als t-PA aufweist.

BEISPIEL II

Dieses Beispiel zeigt eine Untersuchung zur Bestimmung der Auftrennung von rt-PA und Cytochrome-C in einem Gemisch als Funktion von TMP sowohl bei der herkömmlichen als auch bei der Hochleistungs-Tangentialflußultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem Molekulargewichtscutoff bei 30 kDa. Der Fluß wurde für jeden Betriebszustand bestimmt. Auf der Grundlage der Auftrennwerte wurden die theoretische Reinigung und Ausbeute, die man durch beide Tangentialflußultrafiltrations-Verfahren erzielen kann, als Funktion von Diavolumina unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen 30-kDa/S-kDa- Kaskadentangentialfluß-Ultrafiltrationssystems ermittelt.

Außerdem untersucht dieses Beispiel die Auswirkung der Erhöhung der Umlaufrate auf die Reinigung.

Das Retentat und Filtrat aus Beispiel 1 wurden in einem 5-kDA Pellicon-System erneut kombiniert und konzentriert. Das Retentat aus dieser Konzentration wurde 0,2 um- gefiltert und in einem kalten Raum (2-8ºC) gelagert.

Das in Beispiel 1 beschriebene Forschungsmodul (etwa 0,04 m² Hoechst Kalleregenerierte Zellulose für 30 kDa) wurde in einem Gesamtrückführungs-Modus betrieben. Das Forschungsmodul wurde gründlich mit Wasser ausgespült, entleert und mit Puffer geprimt. Das 30 kDA System wurde dann entleert, die Integrität untersucht und mit etwa 750 ml des Gemisches aus rt-PA und Cytochrome-C von Beispiel 1 gefüllt.

Für jeden Versuch wurde die Filtration zehn Minuten durchgeführt, wobei nach 5 und 10 Minuten Flußmessungen erfolgen, um stabile Flußbedingungen zu gewährleisten. Retentat- und Filtratproben wurden nach 10 Minuten entnommen und einer HPLC- Analyse unterzogen.

Alle Versuche erfolgten bei einem Auslaßdruck (Po) von etwa 138 x 10³ N/m² und einem Einlaßdruck (Pi) von entweder 241 x 10³ oder 345 x 10³ N/m² (ΔP etwa 103 x 10³ und 207 x 10 ³ N/m²). Für HP-TFF mit einer Umlauf-Filtratpumpe wurde TMP auf 35 x 10³ und 70 x 10³ N/m² bei ΔP sowohl von 103 x 10³ und 207 x 10³ N/m² eingestellt. Versuche erfolgten auch unter Verwendung von HP-TFF ohne Umlauf- Filtratpumpe bei Po = 700 N/m² und ΔP von etwa 103 x 10³ und 207 x 10³ N/m². Die 30 kDa Umlaufpumpe, die Filtrationspumpe, die Umlauf-Filtratpumpe, der Retentatkanal, der Filtratträger, die regenerierte Zellulosemembran und das Fluid waren die gleichen wie in Beispiel 1.

30 kDa-Integritätsversuch:

ΔP = 700 N/m² in 1 min. bei Po = 35 x 10³ N/m²; QH2O/TMP = nicht bestimmt; Retentat-Temperatur = 22ºC.

Versuch 1:

Versuch 1 verwendet das Forschungsmodul, das in einem Hochleistungs-Modus bei Po = 138 x 10³ N/m², ΔP von etwa 207 x 10³ N/m² und TMP von etwa 35 x 10³ N/m² betrieben wird. Ein niederer TMP-Zustand wurde durch das Umlaufen von Filtrat mit Gegendruck auf den Filtratauslaß erzielt.

Qs-Qf = 531 ml/min

Qrf = 1093 ml/min

Qf = 67 ml/min

Qs = 598 ml/min

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 67 ml/min = = > Fluß = 103 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 31ºC.

Versuch 2:

Versuch 2 verwendet das Forschungsmodul, das in einem Hochleistungs-Modus bei Po von etwa 138 x 10³ N/m², ΔP etwa 207 x 10³ N/m² und TMP von etwa 70 x 10³ N/m² betrieben wird.

Qs-Qf = 480 ml/min.

Qrt = 1086 ml/min

Qf = 87 ml/min

Qs = 567 ml/min

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 87 ml/min = = > Fluß = 133 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 32ºC.

Versuch 3:

Versuch 3 verwendet das Forschungsmodul, das in einem herkömmlichen Modus bei Po von etwa 138 x 10³ N/m² und ΔP von etwa 207 x 10³ N/m² betrieben wird.

Qf = 493 ml/min

Qrf = 0 ml/min.

Qf = 118 ml/min.

Qs = 611 ml/min.

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 118 ml/min = = > Fluß = 182 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 29ºC.

Versuch 4:

Versuch 4 verwendet das Forschungsmodul, das in einem Hochleistungs-Modus bei Po von etwa 138 x 10³ N/m², ΔP von etwa 103 x 10³ N/m² und TMP von etwa 35 x 10³ N/m² betrieben wird.

Qs-Qf = 377 ml/min

Qrf = 878 ml/min

Qf = 46 ml/min

Qs = 423 ml/min

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 46 ml/min = = > Fluß = 71 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 30ºC.

Versuch 5:

Versuch 5 verwendet das Forschungsmodul, das in einem Hochleistungs-Modus bei Po von etwa 138 x 10³ N/m², ΔP von etwa 103 x 10³ N/m² und TMP von etwa 70 x 10³ N/m² betrieben wird.

Qs-Qf = 361 ml/min

Qrf = 886 ml/min

Qf = 74 ml/min.

Qs = 435 ml/min.

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 74 ml/min = = > Fluß = 114 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 30ºC.

Versuch 6:

Versuch 6 erfolgt in herkömmlicher Weise bei Po = 138 x 10³ N/m² und ΔP = 103 x 10³ N/m².

Qs-Qf = 361 ml/min

Qrf = 0 ml/min.

Qf = 80 ml/min.

Qs = 441 ml/min.

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 80 ml/min = = > Fluß = 123 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 27ºC.

Versuch 7:

Versuch 7 erfolgte bei Po = 7000 N/m² und ΔP = 103 x 10³ N/m².

Qs-Qf = 343 ml/min

Qrf = 0 ml/min.

Qf = 51 ml/min.

Qs = 394 ml/min.

Modullänge [-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 51 ml/min = = > Fluß = 78 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 23ºC.

Versuch 8:

Versuch 8 erfolgte bei Po = 7000 N/m² und ΔP = 207 x 10³ N/m².

Qs-Qf = 555 ml/min

Qrf = 0 ml/min

Qf = 77 ml/min

Qs = 632 ml/min

Modullänge[-] Retentat-Druck (kN/m²) Filtrat-Druck (kN/m²) Filtrationsrate = 77 ml/min = = > Fluß = 118 l/m²,h; Retentat-Temperatur = 24ºC.

Nach jedem Versuch und vor dem Reinigen erfolgte ein Integritätstest: ΔP = 700 N/m² in 1 min bei Po = 35 x 10³ N/m².

Die Filtrationsrate / der TMP nach dem Reinigen betrug für die Lagerlösung 30 kDa Qf/TMP = 8,4 x 10&supmin;&sup5; L/h,Nm&supmin;².

Die folgenden Proben wurden während der Versuche entnommen und durch das in Beispiel 1 beschriebene HPLC-Verfahren geprüft.

Proben

rt-Pa/Cytochrome-C-Gemisch vor Umlauf

30 kDa-Bulk, Versuche 1-8

30 kDa-Filtrat, Versuche 1-8

Die Daten sind nachstehend zusammengefaßt

Versuch Nr. Modus HP/C Rate ml/m

"Modus" ist entweder Hochleistung [HP] oder Herkömmlich [C].

"ΔP" ist der Druckabfall vom Retentateinlaß zum -auslaß.

"TMP" ist der durchschnittliche Transmembrandruck.

"Jf" ist der gemessene Fluß.

"L/m², h" ist Liter/Quadratmeter, Stunden.

"Temp." ist die zum Zeitpunkt der Flußmessung gemessene Bulktemperatur.

"Jf,30ºC" ist der korrigierte Fluß bei 30ºC, der auf der Grundlage der Korrekturfaktoren aus Prostak Maintenance, Seite 15, errechnet wird.

"RtPA" ist die rt-PA-Retention, die durch TSK-2000 HPLC mit Peak-lntegration bei 214 nm gemessen wird.

"RCytC" ist die Cytochrome-C-Retention, die durch TSK-2000 HPLC mit Peak- Integration bei 214 nm gemessen wird.

"Ausbeute" ist die theoretische Ausbeute von rt-PA in einem Kaskadensystem mit geschlossener Schleife mit einer ersten Stufe einer 30-kDa-Hochleistungs- Tangentialflußultrafiltration. Sie wird durch nachstehende Formel errechnet:

Ausbeute = 100% eDV(RtPa-1).

"Purif." ist das errechnete Reinigungsvielfache von rt-PA (Entfernung von Cytochrome-C) im gleichen System unter Verwendung der Formel:

Reinigung = edv(1-RcytQ).

Ergebnisse

Ein Graph des Flusses bei 30ºC (offene Kreise) und der Cytochrome-C-Retention (ausgefüllte Kreise) gegenüber dem durchschnittlichen TMP, der sich aus den obigen Daten zusammensetzt, ist aus Fig.6 ersichtlich. Man sieht, daß die Cytochrome-C- Retention mit einer Zunahme des TMP von 70 x 10³ auf 186 x 10³ N/m² zunimmt und daß der Fluß von 28 x 10³ bis 70 x 10³ N/m² drastisch ansteigt, und sich dann von 70 x 10³ bis 186 x 10³ N/m² TMP abflacht.

Versuche 1, 2, 4 und 5 verwenden Umlauf-Filtrat im HP-TFF-Modus, wobei der TMP im wesentlichen über der gesamten Membranoberfläche konstant ist. Die Ergebnisse zeigen eine geringere Retention von Cytochrome-C bei diesen Versuchen als bei HP-TFF ohne Umlauf-Filtrat (Versuche 7-8) und bei C-TFF (Versuche 3 und 6).

Versuche Nr. 7-8 dienten dazu festzustellen, ob man im druckabhängigen Teil der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve ohne Verwendung von Umlauf-Filtrat (worin der TMP über der gesamten Membranoberfläche abnimmt) im Vergleich zur herkömmlichen C-TFF, die im druckunabhängigen Teil der Kurve durchgeführt wird, eine gute Reinigung erzielt. Die Ergebnisse zeigen, daß dies der Fall ist (vergleiche die Retention von Cytochrome-C bei Versuchen 7-8 mit jener der Versuche 3 und 6 unter Verwendung des herkömmlichen Modus).

Versuche 1-3 und 8 verwenden eine durchschnittliche Umlaufrate von 600 ml/min, Versuche 4-7 eine durchschnittliche Umlaufrate von 425 ml/min. Die errechneten Ergebnisse des Rückführfiltrats unter Verwendung der Umlaufpumpe sind aus Figuren 7 und 8 für Versuche Nr.5-6 bzw. 2-3 ersichtlich. Die offenen Quadrate zeigen das theoretische hohe Reinigungsvielfache an, das unter Verwendung von Hochleistungs- TFF erreichbar ist, gegenüber dem geringen Reinigungsvielfachen unter Verwendung einer herkömmlichen Reinigung (ausgefüllte Quadrate). Die Produktausbeuten in den Kreisen scheinen bei zunehmenden Gemisch-Diavolumina nicht drastisch unterschiedlich zu sein. Fig.7 zeigt die Differenz zwischen C-TFF und HP-TFF bei der niedrigeren Umlaufrate. Andere Autoren versuchten die Konzentrationspolarisierung bei der TFF durch eine Steigerung der linearen Geschwindigkeit (Umlaufrate) zu verringern. Versuche Nr. 2-3 dienten dazu aufzuzeigen, ob HP-TFF gegenüber herkömmlicher TFF bei höheren Umlaufraten immer noch besser ist. Fig.8 zeigt, daß HP-TFF unter den gleichen Bedingungen hoher linearer Geschwindigkeit zu einem höheren Reinigungsvielfachen als C-TZFF führt.

Zusammenfassend zeigten die Berechnungen, daß man gute Ausbeuten (> 90%) einer zurückgehaltenen Spezies mit einem Ultrafiltrationskaskadensystem mit geschlossener Schleife bei 25 Diavolumina erzielen kann. Die Retentionsdaten zeigen an, daß eine 190-fache Entfernung von Cytochrome-C (R=0,79) aus rt-PA (R=0,997) unter Verwendung des neuartigen, in einem Kaskadenmodus mit 25 Diavolumina durchgeführten Tangentialfluß-Ultrafiltrationsverfahrens unter Verwendung einer regenerierten 30 kDa Zellulosemembran von Hoechst Kalle in der ersten Stufe und einer Cytochrome-C-retentiven Membran in der zweiten Stufe (durchgeführt im herkömmlichen Ultrafiltrationsmodus) erzielbar ist.

BEISPIEL III

Dieser Versuch dient dazu, die Retention von Arginin (Molekulargewicht 174 Dalton), Cytochrom-C (12,5 kDa), rh-GH (22kDa) und rt-PA (65 kDa) gegenüber TMP unter Verwendung einer regenerierten 30 kDa Zellulosemembran in einem Versuchsmodul kurzer Weglänge zu bestimmen. Eine kurze Weglänge diente dazu, die Differenz der Einlaß- und Auslaß-TMP zu minimieren. Die Effizienz der Abtrennung dieser Moleküle in einem Forschungsmodul wurde unter HP-TFF- und C-TFF-Bedingungen verglichen.

Die verwendete Protein lösung bestand aus 1 mg/ml rt-PA (siehe Beispiel 1), 1 ug/ml rekombinanten Human-Wachstumshormons ohne N-terminales Methionin und 0,1 mg/ml Cytochrome-C in 0,2 M Argininphosphatpuffer, pH-Wert 7,5.

Das verwendete Versuchsmodul kurzer Weglänge wies die folgenden Parameter auf:

Kanal breite 3 cm

Kanalhöhe 0,8 mm

Kanallänge 6 cm

Membran regenerierte Zellulose für 30 kDa

Umlaufrate 760 ml/min

Pumpe Masterflex (Cole Parmer, Chicago IL) peristaltische Pumpe

Dieses Modul unterscheidet sich dahingehend vom in Beispiel I verwendeten Forschungsmodul, daß die Kanallänge 6 cm und nicht 152 cm betrug.

Zum Vergleich der Abtrennung unter Verwendung von C-TFF und HP-TFF wurde das Forschungsmodul von Beispiel I verwendet. Für die C-TFF wurde der Auslaßdruck auf 138 x 10³ N/m² eingestellt. Der resultierende Einlaßdruck war 345 x 10³ N/m² bei einer Zufuhrrate von 760 ml/min. Der durchschnittliche TMP betrug 241 x 10³ N/m². Bei HP- TFF wurde der TMP auf 117 x 10³ N/m² eingestellt. Die Umlauf-Filtratrate wurde auf eine Rate reguliert, die über die Länge der Membran den konstantesten TMP ergab.

Fig.9 ist die "Fluß gegenüber TMP"-Kurve, die einen Übergangspunkt bei einem TMP von etwa 165 x 10³ N/m² zeigt. Fig.10 zeigt die Retention gegenüber TMP für die vier Spezien im Gemisch; es ist aus dieser Figur ersichtlich, daß rt-PA durch die Membran vollständig zurückgehalten wird, während Arginin ungehindert bei allen TMP-Werten floß. Fig.10 zeigt auch an, daß oberhalb eines TMP von 165 x 10³ N/m² (beim druckunabhängigen Fluß) Cytochrome-C, rh-GH und rt-Pa alle eine hohe Retention aufweisen. Unterhalb eines TMPs von 138 x 10³ N/m² (bei druckabhängigem Fluß) hängt die Retention dieser Spezien jedoch von ihrem Molekulargewicht ab.

Fig.11 ist ein Graph "Retention gegenüber dem log-Molekulargewicht" für die vier Spezien im Gemisch unter Verwendung von HP-TFF (offene Kreise) und C-TFF (ausgefüllte Kreise). Fig.11 zeigt, daß Cytochrome-C, rh-GH und rt-PA im C-TFF-Modus alle eine hohe Retention aufweisen, wobei eine geringe oder keine Auftrennung dieser Proteine erfolgt. Im HP-TFF-Modus jedoch kann man eine Auftrennung dieser Proteine auf der Grundlage der Molekulargewichtsdifferenzen erzielen.

Man beachte, daß bei allen Beispielen hierin die Ultrafiltrationsraten im allgemeinen abnahmen.

Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung können auch dazu verwendet werden, Zellbruchstücke von ganzen Zellen abzutrennen. In kontinuierlichen Perfusionskulturen wäre es wünschenswert, nicht nur die Medienkomponenten auszutauschen und Produkte zu entfernen, sondern auch Zellbruchstücke zu entfernen, die sich ansonsten während des Versuchs ansammeln würden. Dies kann durch das Hinzufügen eines Reinigungsstroms erreicht werden, der sowohl die Bruchstücke als auch die ganzen Zellen entfernt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung würde mit einer Membran betrieben werden, deren Porengröße nahe der Größe der ganzen Zellen liegt, d.h. mit einer mikroporösen Membran. Man kann erwarten, daß die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden könnte, eine bessere Größentrennung in Mikrofiltrationsverfahren zu erlangen, die den in den obigen Beispielen dargestellten Ultrafiltrationsverfahren analog sind.

Der Schutzbereich der Erfindung wird durch die hierin dargelegten als Veranschaulichung dienenden Ausführungsformen nicht eingeschränkt, sondern entsprechend den beigelegten Ansprüchen festgelegt. Variationen innerhalb des Umfangs der Erfindung können von Fachleuten auf dem Gebiet vorgenommen werden, ohne vom Wesen der hierin beanspruchten Erfindung abzuweichen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Abtrennung von interessierenden Spezien mit einem Molekulargewicht von etwa 1 - 1.000 kDa aus einem Gemisch, worin die interessierenden Spezien weniger als 10mal größer oder kleiner im Molekulargewicht als die anderen Spezien im Gemisch sind, wobei das Verfahren das Filtrieren des Gemisches mittels Tangentialfluß-Filtration durch eine Filtrationsmembran mit einer Porengröße umfaßt, die die interessierenden Spezien aus dem Gemisch abtrennt, während der Filtratfluß auf einer Höhe im Bereich von etwa 5 - 100% des Flusses am Übergangspunkt, im druckabhängigen Bereich der "Fluß gegenüber TMP"-Kurve, gehalten wird, wobei die interessierenden Spezien selektiv aus dem Gemisch abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Transmembran-Druck entlang der Membran im wesentlichen konstant auf einer Höhe gehalten wird, die nicht größer als der Transmembran-Druck am Übergangspunkt der Filtration ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Fluß etwa 50 - 100% des Flusses am Übergangspunkt beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Fluß etwa 75 - 100% des Flusses am Übergangspunkt beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gemisch unverdünnt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin Retentat aus der Filtration in einen Behälter, der das zu trennende Gemisch enthält, rückgeführt und das Verfahren wiederholt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, das mehrstufig ist und weiters das Filtrieren des Filtrats aus der Filtration in einem zweiten Tangentialfluß-Filtrationsschritt durch eine Membran mit einer kleineren Porengröße als die im ersten Filtrationsschritt verwendete Membran, und Rückführen des Filtrats aus diesem zweiten Filtrationsschritt zum ersten Filtrationschritt umfaßt, wodurch das Verfahren wiederholt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Fluß im zweiten Filtrationsschritt größer als etwa 100% des Flusses am Übergangspunkt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin beide Filtrationsschritte Ultrafiltrationen sind.

10. Verfahren nach Anspruch 7, weiters umfassend das Filtrieren des Filtrats aus dem zweiten Filtrationsschritt in einem dritten Tangentialfluß-Filtrationsschritt durch eine Membran mit einer kleineren Porengröße als die der zweiten Membran, und das Rückführen des Filtrats aus dem dritten Filtrationsschritt zum ersten Filtrationsschritt, wodurch das Verfahren wiederholt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Fluß im dritten Filtrationsschritt größer als etwa 100% des Flusses am Übergangspunkt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin alle drei Filtrationsschritte Ultrafiltrationen sind.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Transmembran-Druck mit fortschreitender Filtration abnimmt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Transmembran-Druck mit fortschreitender Filtration etwa konstant bleibt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin die interessierenden Spezien biologische Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Aminosäuren, Kolloiden, Mycoplasma, Endotoxinen, Viren, Kohlenhydraten, RNA und DNA, sind.

16. Verfahren nach Anspruch 1 5, worin die interessierenden Spezien Proteine oder Polypeptide sind.

17. Tangentialfluß-Filtrationsvorrichtung zur Durchführung des Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 16, umfassend eine Filtrationseinheit (97) mit einer Vielzahl von schichtweise angeordneten Filtrier- und Filtratkammern (95a), (95b), (95c), (95d), wobei alle außer der letzten Filtratkammer (95d) in der Schichtreihenfolge Einlaßeinrichtungen (93), (107), (117) und Auslaßeinrichtungen (101), (111), (121) aufweisen, die jeweils über Rückführkanäle, die die Einlaß- und Auslaßeinrichtungen jeder außer der letzten Filtratkammer (95d) mit dem entsprechenden getrennten Gefäß (91), (105), (11 5) verbinden, das dazu dient, das Filtrat vom Auslaß jeder Filtratkammer zu sammeln, in Flüssigkeitskommunikation stehen, und wobei die letzte Filtratkammer (95d) eine Auslaßeinrichtung (125) zur Rückführung von Filtrat zum Gefäß (91) aufweist, das über einen Rückführkanal als Verbindung der Auslaßeinrichtung mit der ersten Filtrierkammer (95a) in der Schichtanordnung in Flüssigkeitskommunikation steht, wobei jede Kammer eine Einrichtung (99), (109), (119) zum Pumpen von Flüssigkeit aus ihrem entsprechenden Gefäß zur Einlaßeinrichtung der Kammer aufweist, und wobei jede Kammer von ihrer benachbarten Kammer durch eine Filtrationsmembran (103), (113), (123) getrennt ist, wobei die Vorrichtung solcher Art ist, daß der Flüssigkeitsstrom von der Einlaß- zur Auslaßeinrichtung aller Kammern parallel und in gleicher Richtung erfolgt, wobei die erste Filtrationsmembran (103) in der Schichtreihenfolge eine Porengröße besitzt, die die größten interessierenden Spezien zurückhält, und die letzte Filtrationsmembran (123) in der Schichtreihenfolge eine Porengröße besitzt, die die kleinsten interessierenden Spezien zurückhält, und die mittlere Filtrationsmembran(en) (113) in der Schichtreihenfolge eine Porengröße besitzt (besitzen), die die interessierenden Spezien mit von der ersten zur letzten (der) mittleren Membran(en) abnehmender Größe zurückhält (zurückhalten).

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, worin jede Filtrationsmembran aus einer Vielzahl von parallelen, angrenzenden Membranen mit derselben Porengröße aufgebaut ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, worin jede Membran aus zwei parallelen, angrenzenden Membranen mit derselben Porengröße aufgebaut ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 17, worin die Filtrationseinheit drei Kammern und zwei Gefäße umfaßt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 17, worin die Filtrationseinheit vier Kammern und drei Gefäße umfaßt.

22. Tangentialfluß-Filtrationsvorrichtung zur Durchführung des Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 16, umfassend:

(a) ein erstes Gefäß (31) in Flüssigkeitskommunikation mit einer ersten Filtrationseinheit (37) mit einer ersten Filtrationsmembran (43), die die Einheit in eine erste Filtrier- und Filtratkammer (35a), (35b) teilt, wobei die Filtrier- und Filtratkammer einen Einlaß (33) und einen Auslaß (47) aufweist,

(b) eine Einrichtung (33), die einen Einlaß der ersten Filtrierkammer mit dem ersten Gefäß verbindet, die eine Einrichtung (39) zum Pumpen von Flüssigkeit aus dem ersten Gefäß zum Einlaß der ersten Filtrierkammer enthält,

(c) eine Einrichtung (49) zum Rückführen von Filtrat durch die erste Filtratkammer in derselben Richtung wie der und parallel zum Flüssigkeitsstrom in der ersten Filtrierkammer,

(d) ein zweites Gefäß (51) in Flüssigkeitskommunikation mit einer zweiten Filtrationseinheit (57) mit einer zweiten Filtrationsmembran (63), die die Einheit in eine zweite Filtrier- und Filtratkammer (55a), (55b) teilt, wobei die Filtrier- und Filtratkammer einen Einlaß (53) und einen Auslaß (67) aufweist,

(e) eine Einrichtung zum Rückführen des Filtrats vom Auslaß der ersten Filtratkammer zum zweiten Gefäß,

(f) eine Einrichtung (53), die einen Einlaß der zweiten Filtrierkammer mit dem zweiten Gefäß verbindet, die eine Einrichtung (59) zum Pumpen von Flüssigkeit aus dem zweiten Gefäß zum Einlaß der zweiten Filtrierkammer enthält,

(g) eine Einrichtung (69) zum Rückführen von Filtrat durch die zweite Filtratkammer in derselben Richtung wie der und parallel zum Flüssigkeitsstrom in der zweiten Filtrierkammer,

(h) ein drittes Gefäß (71) in Flüssigkeitskommunikation mit einer dritten Filtrationseinheit (77) mit einer dritten Filtrationsmembran (83), die die Einheit in eine dritte Filtrier- und Filtratkammer (75a), (75b) teilt, wobei die Filtrier- und Filtratkammer einen Einlaß (73) und einen Auslaß (87) aufweist,

(i) eine Einrichtung zum Rückführen des Filtrats vom Auslaß der zweiten Filtratkammer zum dritten Gefäß,

(j) eine Einrichtung (83), die einen Einlaß der dritten Filtrierkammer mit dem dritten Gefäß verbindet, die eine Einrichtung (79) zum Pumpen von Flüssigkeit aus dem dritten Gefäß zum Einlaß der dritten Filtrierkammer enthält, und

(k) eine Einrichtung zum Rückführen des Filtrats vom Auslaß der dritten Filtratkammer zum ersten Gefäß zum Sammeln des Filtrats, worin die erste Filtrationsmembran (43) eine Porengröße besitzt, die die größten interessierenden Spezien zurückhält, die zweite Filtrationsmembran (63) interessierende Spezien mit einer bezüglich der Porengröße der ersten und der dritten Filtrationsmembran dazwischenliegenden Größe zurückhält, und die dritte Filtrationsmembran (83) eine Porengröße besitzt, die die kleinsten interessierenden Spezien zurückhält.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, weiters umfassend eine Einrichtung (89) zum Rückführen von Filtrat durch die dritte Filtratkammer in derselben Richtung wie der und parallel zum Flüssigkeitsstrom in der dritten Filtrierkammer.

24. Vorrichtung nach Anspruch 22, worin die Rückführeinrichtung eine Pumpe ist.

25. Vorrichtung nach Anspruch 22, worin die Membranen Ultrafiltrationsmembranen mit in der Reihe abnehmender Porengröße sind.







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