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Dokumentenidentifikation DE19509279C1 15.05.1996
Titel Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen
Anmelder Privates Institut für Immunologie und Molekulargenetik GmbH, 76133 Karlsruhe, DE
Erfinder Seelig, Hans Peter, Prof. Dr.med., 76199 Karlsruhe, DE;
Renz, Manfred, Prof. Dr.rer.nat., 69126 Heidelberg, DE
Vertreter Müller-Boré & Partner, 81671 München
DE-Anmeldedatum 15.03.1995
DE-Aktenzeichen 19509279
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 15.05.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.05.1996
IPC-Hauptklasse C07K 14/245
IPC-Nebenklasse C12N 15/11   C12N 15/63   C12N 1/00   C12N 5/10   G01N 33/53   A61K 49/00   A61K 39/108   
IPC additional class // C12N 15/70(C12N 1/21,C12R 1:19)  
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen sowie dessen Verwendung.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen sowie dessen Verwendung.

Autoimmunerkrankungen kennzeichnen sich durch das Auftreten von Autoantikörpern, d. h. Antikörpern, die sich gegen Bestandteile des eigenen Organismus richten. Autoantikörper können eine Schädigung des Organismus, eines Organs oder eines Organbestandteils induzieren und hierdurch teils schwerwiegende lebensbedrohliche Erkrankungen auslösen. Die Entstehung einer solchen Erkrankung erfolgt durch verschiedenartige Pathomechanismen, wie durch Neutralisierung von Antigenen, z. B. Hormonen, durch Blockierung oder Stimulierung eines Rezeptors für biologische aktive Substanzen, z. B. durch Autoantikörper gegen den Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons bei Hyperthyreose, durch Bindung an bestimmte Zell- oder Gewebestrukturen mit Induktion einer Komplement-vermittelten Entzündung, z. B. Glomerulonephritis durch Antiautokörper gegen Glomerulus-Basalmembranen. Gewebeschädigungen können ferner durch Zell-vermittelte Mechanismen (Autoantikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität) oder durch lokalisierte und systemische Immunkomplexablagerungen nach Bindung der Autoantikörper an lösliche Antigene induziert werden.

Neben solchen offensichtlich direkt schädigenden Autoantikörpern treten beim Menschen eine Vielzahl von Autoantikörpern gegen Blut-, Zell- oder Gewebebestandteile auf, denen bisher eine gewebeschädigende Rolle noch nicht eindeutig zugesprochen werden kann.

Der Formenkreis der rheumatischen Erkrankungen, besonders der entzündlichen rheumatischen Erkrankungen, denen die Kollagenerkrankungen zugerechnet werden, ist durch das Auftreten zahlreicher Autoantikörper gekennzeichnet. Diese reagieren z. B. mit Antigenen des Zellkerns, wie mit Doppelstrang-DNA, Einzelstrang-DNA, RNA, Histonen, Non-Histonproteinen, Ribonukleoproteinen, Chromosomen-assoziierten Antigenen, z. B. Zentromeren oder Spindelapparat, oder mit Antigenen, die nur in bestimmten Phasen des Zellzyklus, z. B. Cyclin, exprimiert werden.

Bei Erkrankungen, wie Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, Mischkollagenose, Polymyositis, Sklerodermie, CREST-Syndrom, Wegener&min;sche Granulomatose und Dermatomyositis, werden vorstehende Autoantikörper gefunden. Ihr Nachweis erfolgt zumeist durch Umsetzung mit Kernextrakten aus Kalbs- oder Kaninchen-Thymozyten. Damit ist allerdings eine Differentialdiagnose dieser Erkrankungen, insbesondere von Dermatomyositis, nicht möglich. Eine solche ist aber Voraussetzung für die Wahl der Therapie.

Der vorliegende Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Dermatomyositis differentialdiagnostisch erfaßt werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, das die Aminosäuresequenz von Fig. 2 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfaßt.

Der Ausdruck "funktionelles Derivat oder Fragment" umfaßt jegliches Derivat oder Fragment der Aminosäuresequenz von Fig. 2, gegen die ein Autoantikörper gebildet werden kann. Insbesondere betrifft der Ausdruck Epitope in der Aminosäuresequenz, die als Antigene wirken können. Auch ist es selbstverständlich, daß die Aminosäuresequenz von Fig. 2 Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen kann, was auch für die funktionellen Derivate oder Fragmente davon gilt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein vorstehendes Autoantigen kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

  • (a) die DNA von Fig. 2 oder einen Teil davon,
  • (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
  • (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.


Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.

Die DNA von Fig. 2 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) als E.coli Hi-fl-213 unter DSM 9800 am 13. März 1995 hinterlegt.

Nachstehend werden eine erfindungsgemäße DNA bzw. ein durch sie kodiertes Autoantigen mit "Mi-2-DNA" ("Mi-2-cDNA") bzw. "Mi-2-Antigen" bezeichnet. Dies rührt daher, daß zur Herstellung einer solchen DNA Seren von Dermatomyositis-Patienten verwendet werden können, die mit "anti-Mi-2 positiv" bezeichnet sind. "Mi-2" weist dabei auf das Serum des Patienten hin, das erstmalig mit Kernextrakten aus Kalbs- oder Kaninchen-Thymozyten reagierte.

Zur Herstellung einer Mi-2-cDNA ist es günstig, eine Lambda-Phagen-Expressionsbibliothek mit vorstehenden Patientenseren zu screenen. Positive Klone können dann sequenziert und ggfs. für ein weiteres Screening verwendet werden. Die erfindungsgemäße Herstellung einer Mi-2-cDNA wird in den Beispielen 1-2 beschrieben. Ihre Strukturaufklärung sowie jene des durch sie kodierten Mi- 2-Antigens werden in den Beispielen 3-5 beschrieben.

Erfindungsgemäß kann eine Mi-2-cDNA in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T und pET3b, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFB0S, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, in einem Expressionsvektor vorliegende Mi-2-cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, und BL21, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine Mi-2-cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die Mi-2-cDNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.

Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das exprimierte Mi-2-Antigen zu isolieren und zu reinigen. Ein vorstehendes, rekombinant hergestelltes Mi-2-Antigen (nachstehend mit rMi-2-Antigen bezeichnet), wobei dieses auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Erfindungsgemäße Autoantigene zeichnen sich dadurch aus, daß sie Dermatomyositis-spezifische Autoantikörper erkennen. Sie eignen sich daher zur Differentialdiagnose von Kollagenerkrankungen, insbesondere von Dermatomyositis. Eine solche Diagnose kann in üblichen Nachweisverfahren, insbesondere in einem Western Blot, einem ELISA, einer Immunpräzipitation oder einer Immunfluoreszenz, erfolgen. Hierzu können die erfindungsgemäßen Autoantigene, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kombination mit markierten gegen sie gerichteten Antikörpern eingesetzt werden.

Desweiteren können erfindungsgemäße Autoantigene in einem Kit vorliegen. Dieser kann die Autoantigene, wie in vorstehender Form angegeben, zusammen mit üblichen Zusatzstoffen, wie Puffer und Trägermaterial, enthalten. Ein solcher Kit ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Darüber hinaus eignen sich erfindungsgemäße Autoantigene auch für therapeutische Zwecke. Beispielsweise können durch sie Autoantikörper affinitäts-chromatographisch aus dem Kreislauf von Dermatomyositis-Patienten entfernt werden. Auch ist an eine Entfernung von Dermatomyositis-spezifischen Autoantikörper-produzierenden Lymphozyten durch Kopplung der erfindungsgemäßen Autoantigene an Zell-Toxine zu denken.

Des weiteren eignen sich erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere DNAs, für diagnostische Zwecke aller Art.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Klonierung und Zusammensetzung der 218 kD Mi-2 cDNA. Der obere Teil der Abbildung zeigt eine Restriktionskarte mit einer Skala in kb. Die dicke Linie entspricht dem offenen Leseraster mit durch Pfeile angedeuteten Restriktions-Schnittstellen (H = Hind-III; B = BamHI; E = EcoRI; C = ClaI; S = SpHI). Die horizontalen Linien stellen isolierte Klone dar; die in beiden Mischungen sequenzierten Klone sind durch Punkte gekennzeichnet. Die beiden kleinen Klone in der linken unteren Ecke wurden nach dem RACE-Protokoll (vgl. Frohmann, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8998-9002) gewonnen. 1: nt 738-4980; 2: nt 89-1047; 3: nt 242-4991; 4: nt 2020-4970; 5: nt 2293-4977; 6: nt 3313-4977; 7: nt 3709-4977; 8: nt 3755-6244; 9: nt 3932-6328; 10: nt 4056-6244; 11: nt -89 - -38; 12: nt -79 - -38,

Fig. 2 zeigt die Nukleotid-Sequenz und kodierende Aminosäure-Sequenz der 218 kD Mi-2 cDNA. Die eingerahmten Sequenzen zeigen die sieben Helicase-spezifischen Motive (I, IA, II, III, IV, V, und VI). Die vier unterstrichenen Regionen enthalten elf potentielle Kern-Target- Sequenzen, von denen zehn in drei N-terminalen Regionen lokalisiert sind (Region a enthält 3 Motive; Region b 4 Motive und Region C 3 Motive). Die punktierte Linie (nt 490-520) zeigt eine Ansammlung von Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Resten, die möglicherweise elektrostatisch mit Chromatin (Histonen) interagieren,

Fig. 3 zeigt eine Northernblot-Analyse der 218 kD Mi-2 Gen-Expression in HEp-2-Zellen. RNA-Proben wurden mit Hilfe von Formaldehyd- Agarosegel-Elektrophorese entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und mit ³²P-markierter Mi-2 cDNA unter hoher Stringenz hybridisiert. Spur A: 5 µg Gesamt-RNA von HEp-2 Zellen; Spur B: 0,3 µg HEp-2-Zellen poly(A)&spplus; RNA. Die Größe der Bande im Autoradiogramm entspricht ungefähr 6,8 kb,

Fig. 4 zeigt eine Computer-assistierte Analyse funktioneller Domänen des 218 kD Mi-2 Proteins. NT: potentielle Kern-Target-Sequenzen; CB: potentielle Chromatin-bindende Region; I-VI: Helicase-spezifische Domänen. Die dicke horizontale Linie im unteren Teil der Abbildung weist ein rekombinantes Protein (rMi-2) aus, welches für immunologische Studien verwendet wurde. Oben ist eine Skala mit den Positionen der Aminosäuren eingezeichnet,

Fig. 5 zeigt die Lokalisierung des 218 kD Mi-2 Gens mit Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH) am kurzen Arm des humanen Chromosoms 12 (12p 13) (Pfeile),

Fig. 6 zeigt Immunoblots von SDS-PAGE getrennten (A) rekombinantem Mi-2-Polypeptid (rMi-2) und (B) Kernproteinen von HEp-2-Zellen, die mit Human- und Kaninchenseren und Affinitäts-gereinigtem anti-rMi-2-Ig reagierten. Spuren A1, B1: Humanes nicht-reaktives Kontrollserum. Spuren A2, B2: Humanes anti-Mi-2-positives Serum Nr. 1 (Tabelle 1) erkennt das rMi-2 mit 55 kD (Spur A2) als auch das natürliche 235 kD Protein (Spur B2) und ein zusätzliches zweites natürliches Kernprotein mit 80 kD. Spuren A3, B3: Affinitätsgereinigte Antikörper von Serum Nr. 1 (humanes anti-rMi-2-Ig) reagieren sowohl mit dem für die Affinitätsreinigung benutzten rMi- 2 als auch mit dem natürlichen 235 kD nukleären Protein. Die Spezifität der Antikörper-Präparation ist exemplarisch durch die ausbleibende Reaktion mit dem 80 kD Protein demonstriert. Spur A4, B4: Nicht-reaktives Kaninchen Preimmun-Serum. Spuren AS und B5: Das Kaninchen-Serum erkennt nach Immunisierung mit rMi-2 das rekombinante Antigen (rMi-2) und das natürliche 235 kD Protein. Spuren A6 und B6: Affinitäts-gereinigte Kaninchen-Antikörper (Kaninchen anti-rMi-2-Ig) reagieren auch mit beiden Proteinen, dem rekombinanten Antigen und dem natürlichen 235 kD Protein. Spur C (Kontrolle): Kernproteine von HEp-2-Zellen reagieren mit einer Vielzahl von humanen Autoantikörpern,

Fig. 7 zeigt Immunoblots von nukleären (N), mitochondrialen (Mt), mikrosomalen (Ms) und zytoplasmatischen (5-100, S) Fraktionen (80 µg Protein/cm) von HEp-2-Zellen, die mit Affinitäts-gereinigtem Kaninchen-anti-rMi-2-Antikörper reagierten. Das 218 kD Mi-2-Protein wurde fast ausschließlich in der Kernfraktion bei Mr = 235 kD gefunden. Ein sehr geringer Anteil an immunoreaktivem Protein ist im S-100-Überstand zu erkennen. Die Auswertung der Blot-Scans ergab folgende Verteilung des 218 kD Mi-2-Proteins: 97,5% im Kern, jeweils 0% in den mitochondrialen und mikrosomalen Fraktionen und 2,5% in der S-100-Fraktion,

Fig. 8a zeigt Immunpräzipitationen ³&sup5;S-Methionin-markierter Proteine von durch SDS-PAGE aufgetrennten HEp-2-Zell-Lysaten mit anti-Mi-2- Seren (P2-P1 2) von DM Patienten und gesunden Kontroll-Personen (C1, C2). bl = Protein A-Sepharose allein. Alle Patienten-Seren präzipitierten ein 235 kD Protein und außerdem zusätzliche durch Asterisks an der rechten Seite gekennzeichnete Proteine mit individuell verschiedenen Mustern; außerdem sind die Molekulargewichte angegeben,

Fig. 8b zeigt eine Immunpräzipitation von Proteinen eines HEp-2-Zell-Lysates mit dem DM Patientenserum Nr. 1 (P1), mit rMi-2-Protein Affinitäts-gereinigtem Antikörper des Serums Nr. 1 (P1 alg), Affinitäts-gereinigtem Kaninchen-Antikörper (Ra alg), Kaninchen-IgG (Ra Ig), Kaninchen-Immunserum (Ra IS) und Kaninchen-Präimmunserum (Ra pIS). Affinitätsgereinigte anti-rMi-2-Antikörper präzipitierten das gleiche 235 kD Protein wie das Patienten-anti-Mi-2- positive Serum,

Fig. 8c zeigt Immunpräzipitationen ³&sup5;S-Methion-markierter Proteine von HEp-2 Zellkernen und zytoplasmatischer Fraktionen von HEp-2- Zellen mit humanem und Kaninchen-Serum. bl = Protein A-Sepharose allein; C = Serum einer gesunden Person; P2 = Patient Nr. 2; P2 alg = Affinitäts-gereinigtes anti-rMi-2 spezifisches IgG des Patienten Nr. 2; Ra alg = Affinitäts-gereinigtes anti-rMi-2 lg des Kaninchens; Ra lS = Kaninchen-Immunserum; Ra pIS = Präimmunse-

rum. Sowohl das Patienten- als auch das Kaninchen-Serum präzipitierten das 235 kD-Protein vom Kernextrakt aber nicht von zytoplasmatischen Fraktionen. Die Muster, die mit Affinitäts-gereinigten Human- und Kaninchen-Antikörper erhalten wurden, sind fast identisch.

Fig. 9 zeigt eine Immunfluoreszenz von HEp-2-Zellen mit humanem und Kaninchen-anti-Mi-2-Serum. Diese Immunfluoreszenz zeigt eine deutliche Kernfluoreszenz. A1: Humanes anti-Mi-2-positives Serum (Nr. 3, Tabelle 1). A2: Serum des Patienten Nr. 9, welches mit anti-mitochondrialen Antikörpern versetzt wurde, zeigt nukleäre und mitochondriale Fluoreszenz. A3: Das in A2 gezeigte Mischserum wurde mit rMi-2 Affinitäts-gereinigt, was zu einer ausschließlichen Kernfluoreszenz führte. B1: Kaninchen-Präimmunserum. B2: Ein Kaninchenserum nach dem zweiten Booster mit rMi-2- Antigen zeigte intensive Kern-Fluoreszenz. B3: Die affinitätsgereinigten Kaninchen-anti-M2-Antikörper färbten den Kern,

Fig. 10 zeigt einen ELISA mit rMi-2-Antigen zum Nachweis von anti-218 kD Mi-2-Antikörpern. Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit 0,8 µg rMi-2-Antigen beschichtet und mit BSA abgeblockt. ODs von Serien-Verdünnungen anti-Mi-2-positiver Seren und ein Kontrollserum sind gezeigt. Zum Testen von Human-Seren wurden Verdünnungen von 1 : 200 gewählt, und

Fig. 11 zeigt den Nachweis von anti-Mi-2-Antikörpern mit dem rekombinanten Protein-ELISA. Gestrichelte Linie: Grenz-Region (OD 0,5-0,6). Die eingekreisten Zahlen bedeuten die Anzahl von getesteten negativen Seren mit ODs zwischen 0,05 und 0,5. DM: Dermatomyositis; SLE: Systemischer Lupus erythematodes; RA: Rheumatoide Arthritis; ANA positive Seren: Seren, die zur Analyse auf ANA eingesandt wurden und mit HEp-2-Zellen positiv reagierten (Titer 1: ≤160). Kontrollen: Seren von gesunden Personen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Screening und Isolierung von rekombinanten lambda Phagen

Die IgG-Fraktion eines humanen anti-Mi-2-positiven Serums wurde durch DEAE- Sepharose Chromatographie isoliert und zum Screenen von ungefähr 400 000 Plaques einer oligo(dT)-geprimten HeLa cDNA Expressionsbibliothek (λ UNI- ZAPXR, Stratagene, Heidelberg) benutzt. Nach wiederholter Reinigung wurde ein positiver Klon erhalten und sequenziert. Zwei 40mere Oligonukleotide, die zu den beiden Enden des Inerts dieses Klons (4.3 kb) komplementär waren, wurden nach radioaktiver Markierung zum nochmaligen Screenen der gleichen Bibliothek benutzt, um weitere cDNAs in 5&min;- und 3&min;-Richtung zu gewinnen. Außerdem wurden zusätzlich noch kürzere 5&min;-Klone mit einem Amplifinder RACE Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA) und Klonierung in das Plasmid Bluescript KS (Stratagene) gewonnen. Insgesamt wurden 15 Klone isoliert.

Beispiel 2 Sequenzierung der Klone und Aufbau der gesamten Mi-2 cDNA

Bluescript KS Plasmide wurden aus den λ-Klonen mit Helfer-Phagen nach Angaben des Herstellers (Stratagene) ausgeschnitten und die DNAs wurden nach Charakterisierung durch Hybridisierung und Reinigung mit Quiagen-Säulen (Quiagen GmbH, Düsseldorf) mit Hilfe einer Sequenzierungsmaschine (ALF, Pharmacia, Freiburg) nach der Dideoxy-Methode mit Fluoreszenz-ATP (Boehringer Mannheim) sequenziert. Alle Sequenzen der Klone wurden nach einer walking primer Strategie erstellt, wobei die Klone in beiden Richtungen sequenziert wurden. Die Sequenzdaten wurden- mit Hilfe der Assemgel Software von PC- GEne (IntelliGenetics Inc. Brüssel, Belgien) zusammengefügt.

Beispiel 3 Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz der Mi-2 cDNA

Computer-unterstützte Sequenz-Analysen wurden mit Hilfe der GCG Software (Genetics Computer Group Madison, Wisconsin, USA) ausgeführt. Die EMBL Nukleinsäure und die SWISS-PROT Protein Sequenz Datenbanken wurden mit den BLASTN und BLASTP Algorithmen (vgl. Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) auf Anwesenheit lokaler Ähnlichkeiten mit individuellen Sequenzen in der Mi-2 Nukleinsäure/Aminosäure-Sequenz gescannt. Die Suche nach funktionellen Motiven wurde mit dem PROSITE Algorithmus (vgl. Bairoch, A., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 2241-2245, Ergänzung) durchgeführt. Die Klonierungs- und Sequenzierungsstrategie ergab die in Fig. 2 aufgezeigte Nukleinsäuresequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz. Das erste ATG (nt 90) liegt in einer für Translokationsinitiation favorisierten Umgebung und startet ein offenes Leseraster von 5736 bp, welches für ein Protein mit 1912 Aminosäuren (217989 Dalton) kodiert (218 kD Mi-2 Protein).

In der 3&min; nicht-translatierten Region von nt 6234-6240 befindet sich ein dem Polyadenylierungs-Konsensus-Signal (AATAAA) sehr ähnliches Sequenz-Motiv (AAATAAA). Das 218 kD Mi-2-Antigen ist ein hydrophiles, saures Protein (pl = 5,48) mit einer fast gleichmäßigen Verteilung von geladenen oder polaren und hydrophoben Aminosäuren, die in N-Glycosylierungs- und N-Myrostoylierungs- Motive eingebettet sind. Außerdem gibt es viele potentielle Phosphorylierungsstellen.

Die Suche nach Sequenz-Ähnlichkeiten zwischen dem 218 kD Mi-2-Antigen und anderen Proteinen ergab keine ausgeprägte Homologie zu den in den Datenbanken deponierten Sequenzen. Es konnten jedoch mehrere funktionelle Domänen im 218 kD Mi-2 Protein eindeutig identifiziert werden. Die herausragensten Regionen sind charakteristisch für Helicasen und liegen im zentralen Teil des Proteins. Die größten Ähnlichkeiten zeigten 20 Proteine, die alle einer Superfamilie von Helicasen, definiert durch die SNF2 und RAD54 Hefehelicasen (vgl. Bairoch, A., vorstehend angegeben), angehören.

Beispiel 4 Größe der Mi-2 mRNA

Es wurde Gesamt-RNA und poly(A)&spplus; RNA aus einer humanen Zell-Linie isoliert, elektrophoretisch in einem Formaldehyd-Agarose-Gel nach Größe aufgetrennt und nach Transfer auf eine Membran mit radioaktiv markierter Mi-2 cDNA hybridisiert. Das Autoradiogramm (Fig. 3) zeigt ein Signal bei etwa 6,8 kb. Dieses Experiment demonstriert, daß die Mi-2 mRNA groß genug ist, um die 5,7 kb große Mi-2 cDNA zu beinhalten.

Beispiel 5 Chromosomale Lokalisation des 218 kD Mi-2 Gens

Ein Fragment der Mi-2 cDNA (nt 242-4991) wurde mit Biotin-dUTP markiert und für in situ Hybridisierung an humanen Metaphase-Chromosomen verwendet. Hybridisierte DNA wurde mit Fluoresceinisothiocyanat markiertem Avidin (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA USA) und einem Axiophot Photomikroskop (Zeiss, Oberkochen) nachgewiesen. Bilder wurden mit einer CCD-Kamera (Photometrics, Tuscon, AZ, USA) digitalisiert und mit einem Apple- Computer-System prozessiert. Spezifische Fluoreszenz-Signale wurden an der distalen Seite des kurzen Arms von Chromosom 12 (12p13) beobachtet. Zwölf von achtzehn überprüften Metaphasen Chromosomen zeigten spezifische Signale bei beiden Homologen).

Beispiel 6 Synthese eines Teils der kodierenden Region der Mi-2 cDNA in einem bakteriellen Expressionssystem

Ein Segment im zentralen Teil der Mi-2 cDNA (nt 1511-2998) (Fig. 1 und 2) wurde am 5&min;-Ende mit einer Ndel-Schnittstelle und am 3&min;-Ende mit sechs Histidin-Codons sowie einer BamHI-Schnittstelle versehen und nach Ligation in den bakteriellen Expressionsvektor pET3b in E.coli BL21 (DE3) pLysS (vgl. Studier, F.W. et al., Methods Enzymol. 185 (1990), 60-89) transformiert. Nach Anzucht der Kultur bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 wurde sie mit 1 mM Isopropyl-fl-D-thiogalactopyranosid induziert, 8 Std. lang weitergezüchtet und geerntet. Das Zellpellet wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 M Natriumphosphat und 8 M Harnstoff suspendiert und das unlösliche Material, welches das rekombinante Protein enthielt, durch Zentrifugation gewonnen, und in 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinium-HCl aufgelöst und mit Hilfe der Ni2+ -Chelat-Affinitätschromatographie (Quiagen) gewonnen. Die Ausbeute betrug etwa 200 mg rekombinantes Protein (rMi-2) pro ein Liter Kultur. Die Größe des Mi-2-Antigens nach Abschätzung in der SDS-PAGE entsprach dem abgeleiteten Molekulargewicht von 55 kD. Alle zwölf anti-Mi-2-positiven Seren von Dermatomyositis-Patienten reagierten in Immunoblots mit dem rMi-2-Antigen (Fig. 6, Spur A2, Tabelle 1).

Beispiel 7 rMi-2-spezifische humane und Kaninchen-Seren und anti-Mi-2 Seren reagieren mit dem gleichen natürlichen Kernprotein

Humane anti-Mi-2-positive Seren (Nr. 1, 2, 9 in Tabelle 1) und Kaninchen antirMi-2 Seren wurden mit an Nitrozellulose-Membranen immobilisierten rMi-2- Antigen Affinitäts-gereinigt. Beide Antikörper reagierten nicht nur mit dem rMi-2- Antigen sondern auch mit Epitopen eines natürlichen HEp-2 Zellkernproteins mit einem Mr ~ 235 kD (Fig. 6). Das 235 kD HEp-2 Zellkernprotein reagierte im Immunoblot auch mit den allermeisten anti-Mi-2-positiven Patientenseren. Da sowohl die humanen als auch die Kaninchen anti-rMi-2-Immunoglobuline das gleiche Kernprotein wie die Patientenseren erkannten, stellt das 218 kD Mi-2 Protein das Hauptantigen von Mi-2 dar. Unterschiede zwischen dem von der DNA-Sequenz berechneten Molekulargewicht (M) und dem mit Hilfe der SDS- PAGE gemessenen Molekulargewicht (Mr), wie beim Mi-2-Antigen, werden häufig beobachtet.

Beispiel 8 Indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Alle humanen anti-Mi-2 Seren erzeugten mit HEp-2-Zellen eine charakteristische, feingranuläre Kernfluoreszenz, in manchen Fällen ohne den Nucleoli zu färben. Die Antikörpertiter bewegten sich zwischen 1 : 160 und 1 : 5120 (Fig. 9, A1, Tabelle 1). Ein identisches nukleäres Immunfluoreszenzmuster wurde mit einem humanen anti-Mi-2-positiven Serum nach Affinitätsreinigung mit rMi-2 Protein und mit dem Kaninchen anti-rMi-2-Immunglobulin beobachtet.

Beispiel 9 ELISA für die Bestimmung von anti-218 kD Mi-2 Antikörpern in Patientenseren

Mikrotiterplatten (Immunolon, Dynatech, Denkendorf) wurden mit je 100 µl pro Vertiefung mit einer Lösung bestehend aus 8 µg/ml rMi-2-Antigen und 0.1 M Natriumcarbonat (pH 9.6)16 Std. lang bei 4°C inkubiert und anschließend mit 300 µl pro Vertiefung mit einer Lösung bestehend aus PBS und 0,1% BSA, 16 Std. bei 4°C abgeblockt. Antikörper-Screening wurde mit 200 µl Serum pro Vertiefung (Serum-Verdünnungen: 1 : 300 in PBS, 0,01% Tween und 0.1% BSA) während einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C durchgeführt. Nach einem Waschschritt (5 × PBS, 0,01% Tween, 30 Min. bei 37°C wurden die Vertiefungen mit je 200 µl eines 1 : 20000 verdünnten Peroxidase-markierten Kaninchen anti-human-IgG F(ab&min;)&sub2; in PBS, 0,01% Tween und 0,5% BSA 30 Min. bei 37°C inkubiert und wieder gewaschen. Gebundene Antikörper wurden mit OPD visualisiert, und die Enzym-Reaktion wurde mit 50 µl 4 M H&sub2;SO&sub4; je Vertiefung gestoppt. Die Absorption wurde bichromatisch bei 492/620 nm gemessen. Mit diesem Assay wurden 1368 humane Seren getestet (Fig. 10). Der mittlere OD-Wert einer Kontroll-Gruppe von 189 gesunden Personen betrug 0,25 ± 0 08: ODs zwischen 0,5 und 0,6 wurden als grenzwertig bewertet, ODs >0,6 als positiv. Die Antikörperkonzentrationen (ODs) der zwölf anti-Mi-2 positiven Dermatomyositis-Patienten sind in Fig. 11 aufgelistet. Mit Ausnahme eines Serums, was im ELISA negativ aber im Immunblot-Assay positiv war, zeigten alle Patienten-Seren OD-Werte, die deutlich über dem Grenzwert lagen.


Anspruch[de]
  1. 1. Dermatomyositis-spezifisches Autoantigen, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon, gegen das ein Autoantikörper gerichtet sein kann.
  2. 2. DNA, kodierend für das Autoantigen nach Anspruch 1.
  3. 3. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA umfaßt
    1. (a) die DNA von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder einen Teil davon, gegen dessen Aminosäuresequenz ein Autoantikörper gerichtet sein kann,
    2. (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
    3. (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
  4. 4. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 2 oder 3.
  5. 5. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 4.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung des Autoantigens nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 5 unter geeigneten Bedingungen.
  7. 7. Kit, umfassend das Autoantigen nach Anspruch 1 und übliche Zusatzstoffe.






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