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Dokumentenidentifikation DE68924319T2 15.05.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0364559
Titel ALS THERAPEUTISCHE MITTEL VERWENDBARE SUBSTITUIERTE ADENINDERIVATE.
Anmelder The Scripps Research Institute, La Jolla, Calif., US
Erfinder CARSON, Dennis, A., Del Mar, CA 92014, US;
CARRERA, Carlos, J., San Diego, CA 92111, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, Anwaltssozietät, 80538 München
DE-Aktenzeichen 68924319
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 16.03.1989
EP-Aktenzeichen 899044317
WO-Anmeldetag 16.03.1989
PCT-Aktenzeichen US8901088
WO-Veröffentlichungsnummer 8908658
WO-Veröffentlichungsdatum 21.09.1989
EP-Offenlegungsdatum 25.04.1990
EP date of grant 20.09.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.05.1996
IPC-Hauptklasse C07H 19/19
IPC-Nebenklasse A61K 31/70   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft Mittel, die zur Behandlung chronischer entzündlicher Erkrankungen, Infektionen und Autoimmunstörungen verwendbar sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine Verbindung, die gegen Monozyten-vermittelte Erkranklingen oder Krankheitszustände (Störungen) wirksam ist.

Neuere Berichte deuten darauf hin, daß das Virus der humanen Immundefizienz (EV) zusätzlich zu den T-Zellen auch Makrophagen und Monozyten befällt. Levy et al. (1985) Virology, 147:441-448; Gartner et al.; (1986) Science, 233:215-219; und Wiley et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7089-7093. Das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) beruht auf der Infektion mit HIV, das auch als humanes T-lymphotropes Virus Typ III (HTLV-III) bekannt ist.

AIDS ist durch ausgedehnte Immunsuppression gekennzeichnet, die eine Prädisposition der Patienten für lebensbedrohende opportunistische Infektionen ebenso wie für unübliche Formen von Neoplasmien verursacht. Was die anderen bekannten Untergruppen oder Typen humaner T-lymphotroper Viren betrifft, so wird von Typ I (HTLV-I) angenommen, daß er T-Zellen-Proliferation bei Leukämie verursacht. Die Rolle des HTLV-II in der Pathogenese bleibt unklar, obwohl es mit seltenen Fällen von T-Zellen-Varianten der Haarzellen-Leukämie in Zusammenhang gebracht wurde. Golde et al. (1986), Seminars in Hematol. 23:3-9.

Es wird angenommen, daß die Synthese einer DNA, die komplementär zu viraler RNA ist, sowohl für die retrovirale Integration in Wirts-DNA als auch für die Bildung neuer Virionen erforderlich ist. Aus diesem Grund ist die HIV-codierte reverse Transkriptase ein logisches Ziel für die Entwicklung von Mitteln zur Behandlung von Patienten mit erworbenem Immundefizienz-Syndrom [De Clercq et al. (1986) J. Med. Chem., 29:1561-1569], und mit anderen Erkrankungen retroviralen Ursprungs.

Mitsuya et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7006-7100 berichteten, daß 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT) die Replikation von HIV in gezüchteten humanen T-Lymphoblasten blockiert und die zytopathischen Wirkungen des Virus inhibiert. AZT wird voraussichtlich durch die T-Zellen phosphoryliert und in das 5'-Triphosphat-Derivat umgewandelt. Von diesem Derivat berichten jene Autoren, daß es ein Inhibitor der Aktivität von HIV reverser Transkriptase sei. Yarchoan et al. (1986) Lancet, i:575-580, verabreichten AZT an Patienten mit AIDS oder AIDS-verwandten Krankheitskomplexen. Dem Bericht nach wurde das Arzneimittel gut vertragen und überschritt die Blut/Gehirn-Schranke.

In neuerer Zeit berichteten Mitsuya et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1911-1915, daß die 2',3'-Dideoxynukleosid-Derivate von Adenosin, Guanosin, Inosin, Cytidin und Thymidin ebenso die Infektionswirkung und die zytopathische Wirkung des HIV in vitro bei Konzentrationen inhibierten, die 10-20-fach geringer als jene waren, die die Proliferation von uninfizierten T-Zellen blockierten. Von diesen Verbindungen wurde auch berichtet, daß sie gegenüber den T-Zellen des Wirts relativ untoxisch wären. Die Adenosin- und Cytidin-Derivate wurden als wirksamer als die Guanosin- und Inosin-Derivate beschrieben.

Die 2',3'-Dideoxynukleoside werden in der 5'-Position in den T-Zellen phosphoryliert, um die 5'-Nukleotid-Triphosphat-Derivate zu bilden. Von diesen Derivaten ist es allgemein bekannt, daß sie Substrate für Moleküle der reversen Transkriptase sind. Ono et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Comm., 2:498-507.

Jene 2',3'-Dideoxynukleosid-5'-Triphosphate werden auch von den Säugetier-DNA-Polymerasen Beta und Gamma verwendet. Waquar et al. (1984) J. Gell. Physiol., 121:402-408. Sie sind jedoch wenig wirksame Substrate für DNA-Polymerase Alpha, das Enzym, das hauptsächlich für sowohl Reparatur als auch replikative DNA- Synthese in humanen Lymphozyten verantwortlich ist. Zum Teil mögen diese Eigenschaften die selektive Anti-HIV-Wirkung der 2',3'-Dideoxynukleoside erklären.

J.A. Mgntgomery et al., J. Med. Chem. 29, 2389 (1986) berichteten über die Toxizität von 2'-Deoxy-2'-fluorguanosin gegenüber T-Zellen. Die Verbindung wurde durch Deaminierung des analogen Adenosins hergestellt.

Chan et al. (1982) J. Cell Physiol, 111:28-32 studierten die Pfade des Pyrimidin-Nukleotid-Stoffwechsels in murinen peritonealen Makrophagen und Monozyten und berichteten über nicht feststellbare Gehalte an Deoxycytidin-Kinase oder Thymidin-Kinase in diesen Zellen. Es wurden jedoch hohe Gehalte an Adenosin-Kinase gefunden.

Ähnlich hohe Gehalte an Adenosin-Kinase wurden in humanen Monozyten und humanen von Monozyten abgeleiteten Makrophagen (MDM) bei einer Arbeit gefunden, die in dem Laboratorium des Erfinders durchgeführt wurde. Bei dieser vorangehenden Arbeit zeigte es sich, daß die MDM etwa 1/10 bis etwa 1/4 der Nukleosid- Kinase-Aktivität von CEM T Lymphoblasten (z.B. ATCC CCL 119) gegenüber Uridin, Deoxycytidin und Thymidin und etwa 2/3 der Adenosin-Kinase-Aktivität von CEM- Zellen aufwiesen. Zusätzlich dazu zeigte es sich, daß Adenosin-Kinase-Aktivität von MDM-Zellen mindestens um das etwa 10-fache höher war als beliebige der anderen Kinase-Aktivitäten. Diese Studien deuteten auch auf relativ niedrige Ausmaße an Nukleosid-Phosphorylierung bei Verwendung von AZT, Dideoxycytidin (ddC) und 2',3'-Dideoxyadenosin (ddA) in intakten CEM T Lymphoblasten und noch niedrigere Ausmaße bei MDM hin.

Die Fähigkeit von AZT, ddC und ddA zur Inhibierung der Synthese des p24 (gag) Antigens von HIV in CEM- und MDM-Zellen wurde ebenso untersucht. Für CEM-Zellen waren die Ergebnisse für alle drei Verbindungen ähnlich jenen, die in Mitsuya et al. (1987) Nature, 325:773-778 besprochen sind, wobei in einem 3-tägigen Versuch ddC die stärkste inhibierende Wirkung bei der niedrigsten Konzentration ergab, gefolgt von AZT und anschließend von ddA. Bei Einsatz der gleichen Konzentrationen (0,1-100uM) in einem ähnlichen 3-tägigen Versuch ergab keine dieser Verbindungen eine Inhibierung der p24 (gag) Produktion von MDM-Zellen.

Die obigen Resultate erklären zum Teil die in klinschen Untersuchungen mit AZT gemachten Beobachtungen. Diese Ergebnisse zeigten zum Teil, daß die Behandlung von Patienten mit AIDS oder AIDS-verwandtem Komplex mit AZT zu einer Erhöhung der Anzahl der peripheren Blutzellen CD4 (T4), zur Wiederherstellung von cutaner verzögerter Hypersensitivität und Herabsetzung der Rate opportunistischer Infektionen und der Todesfälle führte; Ergebnisse, die auch mit der Wirkung von AZT auf T-Zellen im Zusammehang stehen können.

AZT hatte jedoch keine Wirkung auf die Virus-Isolationsraten aus peripheren Blutzellen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß eine Untergruppe infizierter Zellen bestehen bleibt, wodurch ein Reservoir von fortgesetzter viraler Replikation geschaffen wird, und, im Zusammenhang mit der obigen Arbeit mit den MDM-Zellen, ergibt sich der Hinweis darauf, daß Makrophagen mindestens einen Teil des in vivo Reservoirs für HIV darstellen.

Wie oben angegeben, inhibiert 2',3'-Dideoxyadenosin (ddA) in vitro die Infektivität und die zytopathischen Wirkungen von HIV. Mitsuya et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1911-1915. ddA ist jedoch ein bekanntes Substrat für Adenosin- Deaminase (auch bekannt als Adenosin-Aminohydrolase, EC 3.5.4.4), die die Umwandlung in 2',3'-Dideoxyinosin (ddI) bewirkt. Frederiksen (1966) Arch. Biochem. Biophys., 113:383-388. Die Adenosin-Deaminase-Gehalte in den Blutzellen von AIDS-Patienten sind relativ hoch im Vergleich zu normalen Personen. Somit würde man annehmen, daß dda in vivo rasch durch die Wirkung von endogener Adenosin-Deaminase zu 2',3'-Dideoxyinosin abgebaut würde. Obwohl 2',3'-Dideoxyinosin Anti-HIV-Aktivität aufweist, ist diese Verbindung doch weniger wirksam als AZT oder ddA (Mitsuya, 1986, siehe oben).

Von mehreren 2-substituierten Adenosin-Derivaten wurde berichtet, daß sie durch Adenosin-Deaminase nicht deaminiert werden. Zum Beispiel berichteten Coddington (1965) Biochem. Biophys Acta, 99:442-451, daß Deoxyadenosin-1-N-oxid ebenso wie 2-Hydroxy-, 2-Methyl-, 2-Chlor-, 2-Acetamido- und 2-Methylthio-Adenosine weder Substrate noch Inhibitoren für Adenosin-Deaminase waren. Montgomery gibt in Nucleosides, Nucleotides, and Their Biological Applications, Rideout et al., Hg., Academic Press, New York, Seite 19 (1983) eine Tabelle mit Vergleichsdaten von Km und Vmax für die Deaminierung von Adenosin, 2-Haloadenosinen, 2-Halodeoxyadenosinen und 2-Fluorarabinoadenosin, aus der auch hervorgeht, daß jene 2-Haloadenin-Derivate schlechte Substrate für das Enzym im Verhältnis zu Adenin selbst sind. Stoeckler et al. (1982) Biochem. Pharm., 31:1723-1728 berichteten, daß die 2'-Deoxy-2'-azidoribosylund 2'-Deoxy-2'-azidoarabinosyl-Adenin-Derivate Substrate für humane erythrozytische Adenosin-Deaminase sind, wogegen die Arbeit anderer Autoren darauf hindeutet, daß 2- Fluoradenosin eine vernachlässigbare Aktivität für Adenosin-Deaminase hat.

Die EP-A-0285432, die zum Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung unveröffentlicht war, offenbart die Verwendung bestimmter 2'-Deoxy-2'-Fluoradenosin- Derivate bei der Behandlung von HIV-Infektionen.

2-Chlor-2'-Deoxyadenosin wird durch nicht-teilende (normale) humane periphere Blutlymphozyten phosphoryliert und wird in das 5'-Triphosphat umgewandelt. Dieses Adenin-Derivat wird durch intakte humane Zellen oder Zellextrakte nicht signifikant katabolisiert und wird in wirksamer Weise durch T-Lymphozyten phosphoryliert. Carson et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:6865-6869.

Wie oben besprochen, wurden hohe Gehalte von Adenosin-Kinase in murinen peritonealen Makrophagen und in humanen Monozyten gefunden. Adenosin- Kinase kann die 2'-Deoxyadenosin-Derivate phosphorylieren, tut dies jedoch weniger wirksam als Deoxycytidin-Kinase. Hershfield et al. (1982) J. Biol. Chem., 257:6380- 6386.

Zusätzlich zu AIDS sind andere infektiöse Erkrankungen, bei welchen die pathogenen Organismen in chronisch infizierten Monozyten/Makrophagen persistieren, die Chagas' Krankheit und andere von Trypanosomen hervorgerufene Erkrankungen, Leishmaniosen, mykobakterielle Infektionen, systemische und lokale Pilzerkranklingen und Protozoen-Infektionen, wie etwa Toxoplasmose, Malaria und Pneumocystis.

Die Inhibierung des Wachstums von Leishmania tropica promastigotes (eher als anastigotes) durch 9-(2'-Deoxy-2'-fluor-ß-D-arabinofuranosyl)-hypoxanthin wird in der EP-A-0219829 berichtet.

In ähnlicher Weise haben viele Autoimmunkranklieiten gewisse Merkmale mit der Pathogenese von viralen Infektionen gemeinsam. Der spezifische Mechanismus, der die Autoimmunstörungen vermittelt, kann durch Amplifikationssysteme verstärkt werden, bei denen Lymphokine oder humorale Bestandteile beteiligt sind.

Eine Form von Autoimmunkrankheit geht unter Beteiligung eines zytotoxischen Mechanismus vor sich, bei welchem ein zirkulierender Autoantikörper mit einem Selbstantigen, das auf einer Zelloberfläche vorliegt, reagiert. Der zytotoxische Prozeß kann durch Komplement oder durch Zellen vermittelt werden, wie etwa bei Antikörper-abhängender Zelle-vermittelter Zytotoxizität. Das Endergebnis des zytotoxischen Mechanismus ist in der Regel die Zell-Lyse, Eliminierung oder Inaktivierung der Zelle und darin liegt der Mechanismus vieler autoimmuner hämatologischer Störungen.

Eine zweite Form von Autoimmunkrankheit geht unter Beteiligung der Bildung von Immunkomplexen von Autoantikörper plus Selbstantigen vor sich, die das Komplement ebenso fixieren, wie entzündliche Prozesse anregen können. Organe, in welchen solche Komplexe abgelagert werden, unterliegen der Entzündung und schließlich der Zerstörung. Von Nukleinsäuren ist es bekannt, daß sie für diesen Mechanismus bei systemischem Lupus erythematosus (SLE) als Antigene wirken. Die Ablagerung von Immunkomplex scheint die Ursache für die Glomerulonephritis zu sein, die bei vielen Autoimmunstörungen vorkommt.

Ein dritter Mechanismus für Autoimmunstörungen wird durch die Wechselwirkungen von Zellen oder ihren löslichen Produkten eher mit Antigen, als mit Antikörper und Komplement vermittelt. Dieser Mechanismus zeigt sich in klassischer Weise bei verzögerter Hypersensitivität, die durch eine Reaktion gekennzeichnet ist, die zeitabhängig ist, eine spezifische histologische Sequenz hinsichtlich Entzündung und zellulärer Infiltration aufweist und nur durch Zellen und nicht durch Serum übertragen werden kann.

Der Effektormechanismus der Zytotoxizität kann direkte Zellwechselwirkung mit Antigen oder eine Entwicklung von Lymphokinen und Monokinen einschließen. Die Lymphokine verstärken zuerst die Anfangsreaktion durch nicht spezifische Rekrutierung von Entzündungszellen, wie etwa Neutrophile und Makrophagen, im befallenen Bereich. An der Entzündungsstelle tritt eine Kaskadenwirkung auf, bei welcher die Zellen aktiviert werden, sich vermehren und weitere Cytokine ausscheiden.

Rheumatoide Arthritis ist ein chronisches wiederkehrendes systemisches Entzündungsleiden, das in erster Linie die Gelenke befällt. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß ein Virus, möglicherweise das Epstein-Barr-Virus, bei dieser Autoimmun- Störung beteiligt sein kann. Das Epstein-Barr-Virus ist ein polyklonaler Stimulator der B- Zellen und kann die Produktion der Rheumatoid-Faktoren durch B-Zellen stimulieren. Bei rheumatoider Arthritis besteht ein Anstieg in Alpha&sub2;-Globulin, eine polyklonale Hypergammaglobulinämie und Hypoalbuminämie. Kryopräzipitate von Immunglobulinen werden oft bei rheumatoider Vaskulitis beobachtet.

Rheumatoid-Faktoren können bei anderen Autoimmunstörungen ebenso wie bei rheumatoider Arthritis auftreten. Es wurde gefunden, daß Rheumatoid-Faktoren bei manchen Patienten mit systemischem Lupus erythematosus, Sjogren's Syndrom, Sklerodermie und Polymyositis auftreten.

Die Ablagerung von Immunkomplexen auf oder in den Synovien der Gelenke scheint die entzündliche Reaktion der Synovialmembran bei rheumatoider Arthritis anzuregen. Die abgeschiedenen Komplexe fixieren und aktivieren das Komplement, wodurch anschließend die Attraktion von Entzündungszellen stimuliert wird. Die tieferen Sehichten des Synoviums werden sowohl durch T- als auch durch B-Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen und gelegentlich Neutrophile infiltriert. Die infiltrierenden Zellen regen verschiedene Effektor-Moleküle der Entzündungsreaktion an, wodurch die Gelenksflüssigkeit in ein entzündliches Exsudat umgewandelt wird. Die Immunkomplexe gemeinsam mit den von den Lymphozyten freigesetzten Faktoren aktivieren den Gerinnungspfad, der zu Fibrin-Produktion und Ablagerung in den Gelenksspalten, dem Synovium und inm Knorpel führt.

Es wurden verschiedene Behandlungsmethoden zur Verbesserung der Symptome von Autoimmunstörungen, wie etwa rheumatoider Arthritis, eingesetzt. Viele von diesen richten sich auf Linderung und entzündungshemmende Methoden. In der Regel werden Salicylate verwendet, insbesondere Aspirin, in Dosierungen von etwa 3,6 bis etwa 5,4 Gramm (g) pro Tag. Mit hoch-dosierter Asparin-Therapie sind zahlreiche Nebenwirkungen verbunden, wie etwa gastrische Störungen, Tinnitus und herabgesetzte Plättchen-Haftung. Nicht-steroidale entzündungshemmende Mittel, wie etwa Phenylbutazon, Indomethazin, Fenoprofen, Ibuprofen, Naproxen, Sulindac, Tolmetin und Mefenaminsäure, sowie Antimalaria-Arzneimittel, wie Chloroquin und Hydroxychloroquin, wurden ebenso verwendet, haben jedoch bei längerem Einsatz ernstliche Nebenwirkungen. Andere therapeutische Mittel, wie etwa parenterale Goldsalze, Penicillamin und Corticosteroide, weisen ebenfalls signifikante Nebenwirkungen auf.

In letzter Zeit wurde in der Fachwelt die Verwendung spezifischer Deoxyriboside als entzündungshemmende Mittel beschrieben. Zum Beispiel bezieht sich die US-Patentschrift 4,481.197 von Rideout et al. auf die Verwendung unsubstituierter 3- Deaza-2'-deoxyadenosin-Derivate bei der Behandlung von Entzündungen. Die US-PS 4,381.344 von Rideout et al. bezieht sich auf ein Verfahren zur Synthese von Deoxyribosiden, bei welchem eine bakterielle Phosphorylase eingesetzt wird.

Ein Deoxyribosid-Derivat, 2-Chlor-2'-deoxyadenosin (CdA) erwies sich als wirksames Mittel bei der Behandlung von chronischer lymphozytischer Leukämie und manchen malignen Zuständen von T-Zellen. Carson et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2232-2236; Piro et al. (1988), Blood 72:1069-1073. Chronische lymphozytische Leukämie ist ein maligner Zustand der B-Lymphozyten, die das Oberflächenantigen Leu-1 tragen.

Die Leu-1 B-Zellen stellen einen kleineren Anteil der normalen Gesamtmenge von B Lymphozyten dar, in der Regel weniger als 20 Prozent. Die Leu-1 B-Zellen exprimieren Oberflächenmarker, die in der Regel auf Monozyten (Mac-1 Antigen) und T-Lymphozyten (Leu-1 Antigen) gefunden werden. Etwa 10 Pozent der Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie zeigen eine begleitende Autoimmunität und in neuerer Zeit ergab sich, daß Leu-1 B-Zellen an der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten beteiligt sind.

In der ersten Phase zeigten die Untersuchungen an Menschen, daß Infusion von ansteigenden Dosen von 2-Chlor-2'deoxyadenosin [0,1-0,5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag (mg/kg/Tag)] zu steigenden Plasmakonzentrationen des Arzneimittels führte [10-50 nanomolar (nM)]. Diese Infusionen deuteten darauf hin, daß das Arzneimittel gut vertragen wurde und keine Übelkeit, kein Erbrechen oder Fieber hervorrief. Die Dosis-limitierende Toxizität war die Knochenmarkssuppression, die in der Regel bei Dosen von mehr als etwa 0,2 mg/kg/Tag oder bei Plasmagehalten von mehr als etwa 20 nM auftrat.

Andere Untersuchungen, Montgomery et al. (1959) J. Am. Chem. Soc., 82:463-468, zeigten, daß 2-Fluoradenosin ein relativ hohes Ausmaß an Zytotoxizität bewirkt. Diese Autoren berichteten, daß schwarze C57 Mäuse, denen Adenokarzinom 755 (Ad755) implantiert worden war, nur etwa 1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht vertragen konnten. Es zeigte sich, daß 2-Fluoradensosin bei diesem Gehalt gegen Ad755, ebenso wie gegen Leukämie L1210 und den Erlich Ascites-Tumor unwirksam war.

Im folgenden werden chemotherapeutische Mittel beschrieben, die eine deutliche Wirkung gegenüber verbleibenden Lymphozyten und Monozyten aufweisen. Diese Mittel sind auch zur Behandlung von Autoimmunstörungen verwendbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung und eine Zusammensetzung zur Behandlung einer infektiösen Störung, bei welcher Mikroorganismen in infizierten Monozyten hausen, ebenso wie auf ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungen, insbesondere Entzündungen als Ergebnis von Monozyten-vermittelten Autoimmunstörungen. Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung ist ein substituiertes 2'-Deoxyadenosin, bei welchem der Substituent an den 1-, 2- und/oder 2'-Positionen hängt.

Eine Verbindung gemäß der Erfindung hat eine Struktur, die der von Formel I entspricht:

worin Z für O&supmin; steht,

Y Wasserstoff oder einen Substituenten bedeutet, der 1 bis etwa 20 Atome enthält, frei von rein ionischer Ladung bei physiologischen pH-Werten ist, ein lösliches Adenin-Derivat ergibt und dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung die Deaminierung des Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert; und

X für Wasserstoff oder Fluor steht, mit der Maßgabe, daß Y nur Wasserstoff darstellt, wenn X für Fluor steht. Bevorzugte Substituenten Y sind Halogen-, Niedgrigalkyl-, Hydroxyl-, Niedrigalkylthio- und Niedrigalkanoylamido-Reste.

Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine ausreichende Menge von einer oder mehreren der oben genannten Verbindungen der Formel I in gelöster oder dispergierter Form in einem pharmakologisch verwendbaren Träger, um eine therapeutisch wirksame Dosis zur Verfügung zu stellen. In Abhängigkeit von der Behandlungsmodalität werden die Zellen, wie im folgenden besprochen, mit einer Verbindung der Formel I bei einer Konzentration von etwa 0,5 nanomolar (nM) bis etwa 50 mikromolar (uM), bevorzugter mit etwa 10 nM bis etwa 10uM, in Kontakt gebracht.

Ein Verfahren zur Behandlung einer durch Monozyten vermittelten Störung wird in Betracht gezogen. Bei diesem Verfahren werden die Monozyten mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die einen pahramkologisch verwendbaren Träger enthält, in welchem selbst ein subtituiertes Adenin-Derivat mit einer Struktur, die der von Formel II entspricht, als Wirkstoff oder aktives Mittel, entweder allein oder in Kombination mit einem antimikrobiellen Mittel, gelöst oder dispergiert enthalten ist. Das substituierte Adenin-Derivat und das antimikrobielle Mittel, wenn dieses vorliegt, sind jeweils in einer Menge anwesend, die ausreicht, um eine therapeutisch wirksame Dosis während des Kontaktzeitraums zur Verfügung zu stellen. Die Monozyten werden in vivo durch Verabreichung der Zusammensetzung an ein Säugetier, wie etwa einen Menschen, mit demselben in Kontakt gebracht. In vitro Kontakt wird dadurch erreicht, daß die Zusammensetzung mit einem Monozyten-Präparat vermischt wird.

Ein substituiertes Adenin-Derivat der Formel II hat eine Strukturformel entsprechend:

worin Z für O&supmin; steht oder fehlt,

Y Wasserstoff oder einen Substituenten bedeutet, der 1 bis etwa 20 Atome enthält, frei von rein ionischer Ladung bei physiologischen pH-Werten ist, ein lösliches Adenin-Derivat zur Verfügung stellt und dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung die Deaminierung des Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert; und X für Wasserstoff oder Fluor steht, mit der Maßgabe, daß Y nur Wasserstoff ist, wenn Z vorliegt.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel II sind frei von der Z- Gruppe; d.h. Z fehlt, und sie enthalten eine Halogengruppe in der 2-Position. Besonders bevorzugt sind 2-Chlor-2'-Deoxyadenosin und 2-Chlor-2'-Deoxy-2'-arafluoradenosin.

Dieses Behandlungsverfahren senkt den Spiegel der infizierten Monozyten im Blut als Ergebnis der spezifischen Zytotoxizität der gegen die Monozyten eingesetzten Verbindungen. Wenn ein antimikrobielles Mittel in Kombination mit einer oben genannten Verbindung der Formel II verwendet wird, richtet dieses antimikrobielle Mittel zusätzlich seine Wirkung gegen den verursachenden Mikroorganismus selbst.

Gemäß einem Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung einer infektiösen Störung, bei welcher Mikroorganismen in Monozyten leben, in Betracht gezogen. Ublicherweise sind die Monozyten chronisch infiziert. Einem Säugetier, das von einer solchen mikrobiellen infektiösen Störung befallen ist, wird in vivo eine Zusammensetzung nach obigen Angaben verabreicht.

Ein spezielles Verfahren zur Behandlung einer viralen infektiösen Störung wird gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, wobei ein Säugetier, das von einer viralen Infektion befallen ist, mit einer wirksamen therapeutischen Dosis einer Verbindung der Formel II entweder allein oder in Kombination mit einem anderen antiviralen Mittel behandelt wird, wobei diese entweder gemeinsam oder getrennt und gemeinsam mit einem pharmakologisch verwendbaren Träger verabreicht werden. Bevorzugte Störungen, die zur Behandlung geeignet sind, sind jene, bei welchen das infektiöse Virus in Monozyten lokalisiert ist, bevor Zell-Lyse und Virus-Freisetzung in den Blutkreislauf erfolgt.

Die vorliegende Erfindung zieht auch ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungen, insbesondere Entzündungen, die während Autoimmunstörungen auftreten, durch Suppression oder Abtötung von Monozyten in Betracht. Hier wird wieder eine Zusammensetzung verwendet, die eine Verbindung enthält, deren Struktur jener der oben angegebenen Formel II entspricht.

Bei dieser Ausführungsform wird einem warmblütigen Tier mit einer Entzündung eine Menge der oben beschriebenen Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel II in einer ausreichenden Menge zur Schaffung einer therapeutisch wirksamen Dosis enthält, verabreicht. Vorzugsweise reicht die Menge aus, um in dem Plasma des Tieres eine Konzentration von etwa 0,5 nanomolar (nM) bis etwa 50 nM, bevorzugter von etwa 1 nM bis etwa 10 nM, zu schaffen. Dieses Verfahren ist besonders zur Behandlung von rheumatoider Arthritis bei Menschen verwendbar.

Vorzugsweise ist das zur erfindungsgemäßen Verwendung in Betracht gezogenen Mittel ein 2-Halo-2'-deoxyadenosin (2-Halo-2'-deoxy-9, 1'-beta-ribofuranosyladenin) oder ein 2-Halo-2'-deoxy-2'-arafluoradenosin und am bevorzugtesten ist die Halogengruppierung ein Chlor.

Ein weiterer von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener Aspekt umfaßt die perorale Verabreichung einer wirksamen Mengen eines Wirkstofts (Mittels) gemäß der Erfindung bei einem Verfahren zur Behandlung einer Krankheit. Hier wird eine Verbindung der Formel II verwendet, in welcher X für Fluor steht.

Bei jedem der oben beschriebenen Verfahren wird das substituierte 2'-Deoxyadenosin-Derivat in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die Wirkung einer Verbindung der Formel II ist sowohl zeit- als auch dosisabhängig. Infolgedessen kann man die Dosierung und den Zeitraum, während welchem eine spezielle Dosierung verabreicht wird, auf die zu behandelnde Krankheit und den Zustand des behandelten Wirtssäugetiers, wie etwa eines Menschen, zurechtschneidern. Somit kann zur Behandlung einer entzündlichen Störung die Beeinflussung der Monozyten-Funktion bereits ausreichen, um Erleichterung zu schaffen, und eine zur Begründung einer solchen Beeinflussung ausreichende Menge ist ein Maß für eine therapeutisch wirksame Menge. Wo der zu behandelnde Krankheitsstatus oder -zustand ernster oder lebensbedrohend ist, ist die Behandlung intensiver und eine therapeutisch wirksame Menge ist eine solche, die zur Abtötung von mindestens 50 Prozent der vorliegenden Monozyten ausreicht, ist jedoch geringer als jene, die die Funktion des Knochenmarks, wie sie durch übliche Verfahren bei der Verabreichung in vivo bestimmt wird, deutlich beeinträchtigt. Die Monozytenabtötende Menge einer Verbindung der Formel II ist ein weiteres Maß für eine therapeutisch wirksame Dosis und der Tod der Monozyten wird zu einem Zeitpunkt sieben Tage nach der anfänglichen Verabreichung gemessen.

Die vorliegende Erfindung hat mehrere günstige Eigenschaften und Vorteile.

Eine günstige Eigenschaft ist die, daß die Verwendung eines ihrer Verfahren die an Monozyten hängenden Pathogene aus dem Körper eines infizierten Tieres eleminieren kann.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, daß die Verwendung eines ihrer Verfahren die durch entzündliche Erkrankungen, wie etwa rheumatoide Arthritis, hervorgerufene Entzündung deutlich herabsetzen kann.

Noch ein weiterer Vorteil der Erfindung ist der, daß ihre Verfahren durch orale Verabreichung in die Praxis umgesetzt werden können.

Noch weitere günstige Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann auf diesem Gebiet aus der folgenden Beschreibung ersichtlich sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen, die einen Teil dieser Offenbarung darstellen, sind: Figur 1 eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse einer Untersuchung über die Zytotoxizität von 2-Chlordeoxyadenosin (CdA) gegenüber drei Zelltypen im peripheren Blut von sieben Patienten mit cutanem T-Zell-Lymphom zeigt. Eine kontinuierliche intravinöse Infusion von CdA (0,1 mg/ml in isotonischer Salzlösung) wird an jeden Patienten mit einer Dosis von 0,1 mg/kg pro Tag verabreicht, wobei die Patienten die Therapie sieben Tage lang erhalten. Täglich werden Blutproben entnommen und Zellzählungen durchgeführt, wobei gemittelte Werte angegeben sind. Die graphischen Symbole sind wie folgt: = Monozyten, + = Neutrophile (X10&supmin;¹); und = Lymphozyten. Die Zellkonzentration (Ordinate) wird für den Behandlungstag (Abszisse), an welchem die Messung durchgeführt wird, aufgetragen.

Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die dosisabhängige Zytotoxizität von 2-Chlordeoxyadenosin (CdA) gegenüber normalen humanen Monozyten ( ), die humane Fibroblast-Zell-Linie GM01380, die aus normaler fetaler Lunge stammt ( ) und normale humane Lymphozyten ( ), wenn diese in vitro gezüchtet werden, darstellt. Die Zellen wurden nach der Beschreibung von Beispiel 2 in vitro fünf Tage lang in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von CdA von 0 bis 125 nanomolar (nM) gezüchtet, nach welchem Zeitraum die lebensfähigen Zellen bestimmt wurden. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen, der nach der Behandlung verblieb (Ordinate), wurde gegen die verwendete Konzentration des CdA in einer linearen Abhängigkeit (Abszisse) aufgetragen. Der Effekt der Anwesenheit von Deoxycytidin (dCyd 100uM) auf die CdA- Toxizität gegenüber Monozyten ( ) wird ebenso dargestellt.

Figur 3 ist eine Graphik der Dosis- und Zeitabhängigkeit der Zytotoxizität des 2-Chlordeoxyadenosins (CdA) gegenüber menschlichen Monozyten in vitro.

Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Dosis- und Zeitabhängigkeit von CdA bei der Hervorrufung von DNA-Strangbrüchen in Monozyten in vitro.

Figur 5 ist eine graphische Darstellung der biochemischen Wirkungen, die in humanen Monozyten in vitro durch Einwirkung von 1 uM CdA während eines Zeitraums von 16 Stunden hervorgerufen werden. Es sind die Effekte der CdA-Einwirkung auf die Lebensfähigkeit der Monozyten ( ), den NAD-Gehalt ( ), die RNA-Synthese ( ) und die DNA-Strangbrüche (ds-DNA; ) dargestellt.

Figur 6 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen relativ niedriger Dosen von CdA, die zur Kontaktierung von Monozyten während eines Zeitraums von 72 Stunden verwendet werden, darstellt. Es wurde die Monozyten-Freisetzung von Interleukin-6 (IL-6; ) und die Phagozytose von Antikörper-beschichteten roten Blutzellen (RBC; ) untersucht ebenso wie die Lebensfähigkeit von gezüchteten Monozyten ( ). Die Wirkungen sind als Prozentsatz von Vergleichswerten gegenüber der CdA- Konzentration in Nanomolen (nM) ausgedrückt.

Figur 7 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse einer Untersuchung der Zytotoxizität von CdA gegenüber Monozyten und Lymphozyten eines Patienten mit rheumatoider Arthritis, der die CdA-Tberapie erhielt, darstellt. Eine kontinuierliche intravenöse Infusion von CdA (0,1 mg/ml in isotonischer Salzlösung) wurde mit einer Dosis von 0,1 mg/kg pro Tag während eines Zeitraums von fünf Tagen verabreicht. Die Anzahl der Monozyten ist in offenen Quadraten und die Anzahl der Lymphozyten in geschlossenen Rauten dargestellt. Drei Infusionszyklen von CdA wurden verabreicht und sind als offene Rechtecke für die Zeiträume von fünf Tagen für jede Infusion an einer Stelle in der Graphik oberhalb der Tage in dem Behandlungsprotokoll, an welchen die Infusionen verabreicht wurden, dargestellt.

Detaillerte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung und eine Zusammensetzung, die diese Verbindung enthält, zur Behandlung einer durch Monozyten vermittelten Störung. Es versteht sich, daß die im folgenden besprochene Monozytopenie und Inhibierung der Monozyten-Funktion unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens vollkommen unerwartet waren.

Diese Ergebnisse waren besonders unerwartet im Hinblick auf die vor kurzem veröffentlichten Arbeiten von Urba et al. (1989) Blood, 73:38-46 und Bakul et al. (1989) Cancer, 63:14-22, die Patienten mit Haarzell-Leukämie behandelten, einer anderen Erkrankung, bei welcher ein Verfahren ähnlich dem hier geoffenbarten verwendbar ist. Diese Behandlungen verwendeten Deoxycoformyzin gemeinsam mit Interferon Alpha-2a bzw. Deoxycoformyzin allein.

Deoxycoformyzin ist ein irreversibler Inhibitor der Adenosin-Deaminase und seine Verwendung ist die Ursache dafür, daß sich Adenosin und Deoxyadenosin in ziemlich ähnlicher Weise wie ein hier verwendbares Adenin-Derivat in den Zellen anreichem. Es wird angenommen, daß Lymphozytopenie und DNA-Strangbrüche, die bei der Behandlung beobachtet werden, durch die Anreicherung von Deoxyadenosin-Nukleotiden vermittelt werden.

Urba et al. berichteten, daß spezifische Lymphozyten, die CD4- und CD8- Marker tragen, während der Behandlung abnahmen. Bakul et al. untersuchten die absoluten Anzahlen der Zellen ihrer Patienten und berichteten eine allgemeine Abnahme der Zahlen während der Behandlung. Beide Gruppen berichteten jedoch eine Steigerung der Monozytengehalte während der Behandlung.

Somit bringt die Verabreichung von Deoxycoformyzin, obwohl Deoxycoformyzin die Adenosin-Deaminase irreversibel inhibiert und eine Anreicherung von Adenosin und Deoxyadenosin erlaubt, was ein ähnliches Resultat ist wie das, das durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens auftritt, einen Anstieg der Monozytengehalte während der Behandlung mit sich, während eine Behandlung unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zumindest eine Beeinträchtigung der Monozyten- Funktion oder Monozytopenie (Monozyten-Tod), wie dies im folgenden besprochen wird, verursacht. Diese Unterschiede in der Monozyten-spezifischen Aktivität, die von einem ähnlichen anfänglichen Ereignis herrühren, d.h. der Anreicherung von Adenosin oder Deoxyadenosin oder eines hier beschriebenen Derivats, sind vollkommen überraschend und unerwartet.

A. Verbindungen

Eine gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Verbindung ist ein substituiertes 2'-Deoxy-arabinofuranosyladenin (substituiertes Adenin-) Derivat, dessen Struktur durch die Formel I dargestellt ist:

worin X entweder für Fluor oder Wasserstoff steht; Z ein Oxidrest (O&supmin;)ist; und Y für Wasserstoff oder einen Rest steht, der ein bis etwa zwanzig Atome enthält, frei von rein ionischer Ladung bei physiologischen pH-Werten ist, ein lösliches Adenin-Derivat zur Verfügung stellt und dessen Anwesenheit auf der Adeningruppierung die Deaminierung des Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert, und vorzugsweise ein Mitglied der Halogengruppe, bestehend aus Fluor, Chlor und Brom, ist; mit der Maßgabe daß Y nur Wasserstoff bedeutet, wenn X für Fluor steht.

Vorzugsweise ist Y Chlor. Andere Substituenten Y sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niedrigalkyl-, Niedrigalkanoylamido-, Niedrigalkylthio- und Hydroxylresten. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen steht X für Fluor, wenn Y Chlor bedeutet.

Von den Verbindungen der Formel I sind jene, in welchen X für Fluor steht, besonders bevorzugt zur Verwendung durch orale Verabreichung.

Beispiele von Verbindungen der Formel I sind die folgenden Arabinofuranosyl-Derivate des Adenin:

2-Chlor-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin-1-Noxid;

2-Fluor-9,1'-beta-Z-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin-1-Noxid;

2-Brom-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofüranosyladenin-1-Noxid;

2-Methyl-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin-1-Noxid;

2-(N-Acetamido)-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin-1-Noxid;

2-Hydroxy-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin-1-N-oxid;

2-Methylthio-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin-1-N-oxid;

2-Fluor-9,1'-beta-D-2'-deoxyadenosin-1-oxid; und

2-Chlor-9,1'-beta-D-2'deoxyadenosin-1-oxid.

Eine Verbindung aus einer etwas größeren Gruppe von Adenin-Derivaten ist bei einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar. Eine Verbindung dieser größeren Gruppe hat eine Struktur, die durch die Formel II dargestellt wird:

worin Z für einen Oxidrest (O&supmin;) steht oder fehlt;

Y ist Wasserstoff oder ein Rest, der 1 bis etwa 20 Atome enthält, frei von rein ionischer Ladung bei physiologischen pH-Werten ist, ein lösliches Adenin-Derivat zur Verfügung stellt und dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung die Deaminierung des Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert; und

X für Wasserstoff oder Fluor steht, mit der Maßgabe, daß Y nur Wasserstoff ist, wenn Z vorhanden ist.

Die durch die Formel I dargestellten Verbindungen sind ebenso wie zusätzliche Verbindungen von den Verbindungen der Formel II umfaßt. Bevorzugte zusätzliche Verbindungen, die von Formel II, jedoch nicht von Formel I umfaßt sind, sind:

2-Chlor-9,1'-beta-D-2'deoxyribosyladenin (2-Chlordeoxyadenosin);

2-Brom-9,1'-beta-D-2'deoxyribosyladenin;

2-Methyl-9,1'-beta-D-2'-deoxyribosyladenin;

2-Fluor-9,1'-beta-D-2'-deoxyribosyladenin;

2-Acetamido-9,1'-beta-D-2'-deoxyribosyladenin;

2-Methylthio-9,1'-beta-D-2'-deoxyribosyladenin; sowie die

2'-Fluor-Analoga der vorangehenden Verbindungen.

Im Hinblick darauf, daß die Substituenten X, Y und Z einer Verbindung beider Formeln I und II die gleichen sein können und die Verbindungen der Formel I von der Formel II umfaßt sind, unabhängig von den Maßgaben, daß Teile dieser Formeln unterschiedlich sind, ist die folgende Diskussion dazu gedacht, sich auf eine Verbindung beider Formeln zu erstrecken.

Es sei festgehalten, daß, wenn X für Wasserstoff steht, der Zuckerring als ein 2'-Deoxyribosyl oder 2'-Deoxyarabinofuranosyl-Rest bezeichnet werden kann. Es werden hier beide Nomenklaturen verwendet. Wenn die durch die Formel I oder Formel II umfaßte Verbindungsklasse besprochen wird, werden alle Verbindungen hier als Derivate der Arabinose betrachtet. Wenn jedoch spezielle Verbindungen der Unterklasse, wo X gleich H ist, besprochen werden, wird die üblichere Deoxyribose-Nomenklatur verwendet, wie etwa bei Deoxyadenosin. Diese Verbindungen werden hier auch einfacher als ein Adenin-Derivat bezeichnet.

In den obigen Formeln und bei allen anderen hier gezeigten Formeln sind die Wasserstoffatome an den Purin- und Furanosidylringen, die nicht unbedingt zur Darstellung der Konfiguration bei einer speziellen Bindung erforderlich sind, nicht dargestellt. Somit ist der Adenin-Wasserstoff in der Position 7 nicht gezeigt.

Es versteht sich auch, daß die D-Isomeren der Verbindungen gemäß den Formeln die in Betracht gezogenen Isomeren sind. Weiters sei festgehalten, daß die hier verwendete Bezeichnung "Halo" dazu gedacht ist, Fluor-, Chlor- und Brom-Derivate zu umfassen und Jod-Derivate auszuschließen, da diese instabil sind und sich zersetzen, ebenso Astatin-Derivate, die radioaktiv sind. Wenn spezifische Halogen-Derivate in Betracht gezogen werden, werden diese Verbindungen ausdrücklich benannt.

Wie er hierin verwendet wird, umfaßt der Ausdruck "ein von rein ionischer Ladung freier Substituent" sowohl geladene als auch ungeladene Reste, in welchen der substituierende Rest geladen ist und ein internes zwitterionisches Ladungspaar vorliegt, das zum Fehlen einer eindeutigen ionischen Ladung für das Molekül bei physiologischen pH-Werten führt. Beispiele solcher Substituenten sind N-Oxidverbindungen.

Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "lösliches Adenin- Derivat" ein Adenin-Derivat, das zur Auflösung befähigt ist und in einer Körperflüssigkeit, wie etwa Blut, mit einer therapeutisch wirksamen Dosis, wie sie im folgenden besprochen wird, löslich bleibt.

Wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "Substituent, dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung die Deaminierung eines Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert", daß, wenn 100 Mikroliter einer 1 millimolaren Lösung des substituierten Adenin-Derivats 3 Stunden bei Raumtemperatur mit 25 Einheiten von Kalbsmilz-Adenosin-Deaminase inkubiert wird (1 Einheit katalysiert die Deaminierung von 1 Mikromol Adenosin pro Minute), der Substituent einen einzigen UV-absorbierenden Fleck in der DÜnnschicht-Chromatographie auf Zellulose mit der Reaktionsmischung ergibt, deren Rf-Wert der gleiche ist wie der des verwendeten substituierten Adenin-Derivats.

Der Metabolismus einer Verbindung durch Adenosin-Deaminase kann durch das folgende Verfahren erforscht werden. Die einzelnen Nukleoside werden bei Konzentrationen von 5-200uM in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, bei 18-20 Grad C mit 0,01 EU/ml Kalbsintestinal-Adenosin-Deaminase inkubiert. Die Veränderung der optischen Dichte bei 265 nm und 250 nm wird spektrophotometrisch überwacht. Die Kmund Vmax-Werte werden unter Verwendung des Δ EM&sub2;&sub6;&sub5; zwischen Adenosin und Inosin nach der Methode von Lineweaver-Burke bestimmt.

Das Verhältnis Vmax/Km liefert auch ein Maß für die relative Wirksamkeit der Deaminierung durch das Enzym. Ein Substituent, der ein Verhältnis Vmax/Km liefert, das etwa 1 Prozent oder weniger als das unter Verwendung von 2'-Deoxyadenosin erhaltene Verhältnis beträgt, ist auch ein "Substituent, dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung die Deaminierung eines Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert."

Wie hier verwendet, umfassen die Niedrigalkyl-Reste C&sub1;-C&sub6; geradkettige, verzweigte und zyklische Alkylgruppen, zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Butyl, t-Butyl, n- Hexyl, 1-Ethylbutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und dergleichen. Niedrigalkanoylamido- Reste umfassen C&sub1;-C&sub6;-Reste, zum Beispiel Formamido, Acetylamido, Propionamido, Hexamoylamido und dergleichen. Niedrigalkylthio-Reste umfassen C&sub1;-C&sub6; geradkettige, verzweigte und zyklische Alkylgruppen, wie sie oben besprochen sind, die an einen Thio- Rest gebunden sind.

Die pharmakologisch verwendbaren Salze einer Verbindung der Formel I oder der Formel II werden ebenso eingesetzt. Der Ausdruck "pharmakologisch verwendbare Salze", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf nicht-toxische Säure-Additionssalze, die im allgemeinen durch Reaktion einer Verbindung mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Salze umfassen das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Zitrat, Acetat, Maleat und dergleichen.

B. Zusammensetzungen

Eine Verbindung der Formel I, die in oder gemeinsam mit einem pharmakologisch verwendbaren Träger gelöst oder dispergiert ist, stellt eine Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung dar. Da jedoch eine Verbindung der Formel I von der Formel II umfaßt ist und eine Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel II enthält, in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, wird eine Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I enthält, im folgenden häufig unter Bezugnahme auf eine Zusammensetzung einer Verbindung der Formel II besprochen werden.

Eine Verbindung der Formel II und ihre pharmakologisch verwendbaren Salze sind sowohl bei Kurzzeit- als auch bei Langzeit-Behandlung verwendbar. Zum Beispiel wird ein 2'-substituiertes 9,1'-Beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin an ein warmblütiges Tier intem, z.B. parenteral, oral oder rektal als ein Suppositorium, in einer wirksamen Menge verabreicht.

Obwohl eine Verbindung der Formel II und ihre pharmakologisch verwendbaren Salze in Form des reinen Chemikals verwendet werden können, ist es doch bevorzugt, sie als eine pharmazeutische Zusammensetzung zu verabreichen. In beiden Fällen wird sie in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine therapeutisch wirksame Dosis, wie sie im folgenden besprochen werden wird, zur Verfügung zu stellen.

Dementsprechend verwendet die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Dosis einer Verbindung der Formel I oder der Formel II, in welcher vorzugsweise X für Fluor steht, oder ein pharmakologisch verwendbares Salz derselben, welche im folgenden als "Wirkstoff" oder "Mittel" bezeichnet werden, umfaßt, in Form einer Lösung oder Dispersion in einem pharmakologisch verwendbaren Träger oder Verdünnungsmittel.

Eine pharmazeutische Zusammensetzung wird durch ein beliebiges in der Fachwelt der Pharmazie allgemein bekanntes Verfahren hergestellt, von denen alle den Wirkstoff und den dazu verwendeten Träger miteinander in Kontakt bringen. Für therapeutische Zwecke kann eine gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung in der Form üblicher pharmazeutischer Zusammensetzungen verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen können so formuliert werden, daß sie für orale oder parenterale Verabreichung oder als Suppositorien geeignet sind. In diesen Zusammensetzungen wird das Mittel in der Regel in einem physiologisch verträglichen Träger gelöst oder dispergiert.

Ein Träger oder Verdünnungsmittel ist ein zur Verabreichung des Wirkstoffs verwendbares Material und muß "pharmakologisch verwendbar" in dem Sinn des Wortes sein, daß es mit den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung kompatibel und für den Empfänger derselben nicht schädlich ist. So wie sie hier verwendet werden, sind die Ausdrücke "physiologisch tolerierbar" und "pharmakologisch verwendbar" miteinander austauschbar und beziehen sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine allergische oder ähnliche ungünstige Reaktion hervorrufen, wie Magenunverträglichkeit, Benommenheit und dergleichen, wenn sie an ein Säugetier verabreicht werden. Der physiologisch tolerierbare Träger kann in einer großen Vielzahl von Formen vorliegen, je nach der für die Verabreichung gewünschten Zubereitung und nach der beabsichtigten Art der Verabreichung.

Als ein Beispiel einer verwendbaren Zusammensetzung kann eine Verbindung der Formel II in flüssigen Zusammensetzungen verwendet werden, wie etwa als sterile Suspensionen oder Lösungen, oder als isotonische Präparate, die geeignete Konservierungsmittel enthalten. Besonders gut geeignet für die vorliegenden Zwecke sind injizierbare Medien, die aus wässerigen injizierbaren isotonischen und sterilen Salz oder Glukoselösungen bestehen. Zusätzliche flüssige Formen, in welchen diese Verbindungen zur Verabreichung eingebaut werden können, umfassen wohlschmeckende Emulsionen mit eßbaren Ölen, wie etwa Baumwollsamenöl, Sesamöl, Kokosöl, Erdnußöl und dergleichen, ebenso wie Elixiere und ähnliche pharmazeutische Vehikel.

Die Mittel können auch in Form von Liposomen verabreicht werden. Es ist in der Fachwelt bekannt, daß Liposome im allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipid-Substanzen abgeleitet werden. Liposome werden durch mono- oder mulit-lamellare hydratisierte Flüssigkristalle gebildet, die in einem wässerigen Medium dispergiert sind. Beliebige nicht-toxische physiologisch verwendbare und metabolisierbare Lipide, die zur Bildung von Liposomen befähigt sind, können verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposom-Form können Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Träger und dergleichen zusätzlich zu dem Wirkstoff enthalten. Die bevorzugten Lipide sind die Phospholipide und die Phosphatidylcholine (Lecithine), sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs.

Verfahren zur Bildung von Liposomen sind in der Fachwelt bekannt. Vgl. zum Beispiel Prescott, Hg., Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), S. 33 ff.

Ein Mittel der Formel II kann auch in Zusammensetzungen, wie etwa in Tabletten oder Pillen, verwendet werden, die vorzugsweise eine Dosiseinheit der Verbindung enthalten. Zu diesem Zweck wird das Mittel (der Wirkstoft) mit üblichen Tablettierungsbestandteilen, wie etwa Maisstärke, Laktose, Saccharose, Sorbit, Talkum, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dikalziumphosphat, Gummi, oder ähnlichen Materialien als nicht-toxische physiologisch tolerierbare Träger gemischt. Die Tabletten oder Pillen können laminiert oder auf andere Weise compoundiert werden, um die Dosierungseinheitsformen mit verlängerter oder verzögerter Wirkung zur Verfügung zu stellen.

Es versteht sich, daß zusätzlich zu den oben erwähnten Trägerbestandteilen die hier beschriebenen pharmazeutischen Formulierungen je nach Eignung ein oder mehrere zusätzliche Trägerbestandteile, wie etwa Verdünnungsmittel, Puffer, Geschrnacksstoffe, Bindemittel, oberflächenaktive Mittel, Verdicker, Gleitmittel, Konservierungsmittel (inklusive Antioxidantien) und dergleichen sowie Substanzen enthalten können, die dazu dienen, die Formulierung mit dem Blut des zu behandelnden Empfängers isotonisch zu machen.

Die Tabletten oder Pillen können auch mit einer magensäureresistenten Schicht versehen sein, die in Form einer Hülle dazu dient, dem Zerfall im Magen zu widerstehen, und die es gestattet, daß der Wirkstoff in intakter Form in den Zwölffingerdarm gelangt oder daß seine Freisetzung verzögert ist. Es kann eine Vielzahl von Materialien für derartige magensäureresistente Schichten oder Überzüge verwendet werden, inklusive polymerer Säuren oder Mischungen solcher Säuren mit Materialien, wie Shellack, Shellack und Getyl-Alkohol, Zellulose-Acetat-Phthalat und dergleichen. Eine besonders geeignete magensäureresistente Beschichtung umfaßt ein Styrol-Maleinsäure- Copolymer gemeinsam mit bekannten Materialien, die zu den Eigenschaften der Magensäureresistenz der Beschichtung beitragen. Verfahren zur Herstellung von mit solchen Schichten überzogenen Tabletten sind beschrieben in der US-PS 4,079.125 von Sipos, die hier als Referenz angegeben ist.

Der Ausdruck "Dosiseinheit", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosierungseinheiten zur Verabreichung an warmblütige Tiere geeignet sind , wobei jede solche Einheit eine vorherbestimmte Menge des Mittels enthält, die zur Hervorrufung eines gewünschten therapeutischen Effekts gemeinsam mit dem pharmazeutisch verwendbaren Verdünnungsmittel berechnet wird. Beispiele von geeigneten Dosierungsformen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulverpäckchen, Granulate, Waffein, Säckchen und Teelöffelmengen, Tropfenmengen, Ampullen, Phiolen, Gruppen beliebiger der vorgenannten Formen und dergleichen.

Die orale Verabreichung der Verbindung ist eine besonders attraktive Form der Verabreichung. Ein Nachteil, der im allgemeinen bei der oralen Verabreichung von bioaktiven Nukleosid-Verbindungen auftritt, ist jedoch deren mögliche Zersetzung unter den sauren Bedingungen des Magens. Das heißt, daß die glykosidische Bindung unter sauren Bedingungen zur Hydrolyse neigt.

Wo jedoch orale Verabreichung erwünscht ist, werden Substitutionen an der Position 2 des Adeninrings der Verbindung der Formel II gemeinsam mit einem 2'- Fluor-substituierten Arabinofuranosidyl-Ring verwendet.

Marquez et al. (1987) Biochem. Pharm., 36:2719-2722 berichteten die Herstellung von 2'-Fluor-2',3'-dideoxyribose- und 2'-Fluor-2',3'-dideoxyarabinose-Derivaten des Adenins. Aufgrund ihrer Ergebnisse wird angegeben, daß beide Derivate bei einem pH-Wert von 1 bei 37ºC stabil sind, während Dideoxyadenosin eine Halbwertszeit von 35 Sekunden unter diesen Bedingungen hatte.

Die Fähigkeit eines Adenin-Derivats, ein Substrat für Adenosin-Deaminase zu sein oder nicht zu sein, ist eher eine Funktion des 2'-Substituenten oder des Fehlens desselben auf dem Adenin-Anteil des Moleküls, als eine Funktion von Substituenten an dem angebundenen Zuckerring-Anteil, mindestens was die Substituenten an den beiden Ringen hierin betrifft.

C. Methoden

Wie früher angegeben, wird hier ein Verfahren zur Behandlung einer durch Monozyten vermittelten Störung in Betracht gezogen. Allgemein werden bei diesem Verfahren Monozyten mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die einen pharmakologisch verwendbaren Träger enthält, in welchem als Wirkstoff ein substituiertes Adenin-Derivat (substituiertes 2'-Deoxyadenosin) gelöst oder dispergiert ist, dessen Struktur der der oben besprochenen Formel II entspricht. Das Mittel der Formel II kann allein oder in Kombination mit einem antimikrobiellen Mittel als einem zweiten Wirkstoff (Mittel) vorliegen. Das substituierte Adenin-Derivat und das antikikrobielle Mittel, wenn dieses vorliegt, sind jeweils in der Zusammensetzung in einer Menge vorhanden, die ausreicht, eine therapeutisch wirksame Dosis während des Kontaktzeitraums zur Verfügung zu stellen.

Besonders in Betracht gezogen wird, daß der Kontakt zwischen den Monozyten und dem Mittel einer Zusammensetzung in vivo stattfindet. In vitro-Kontakt, wie er im folgenden erläutert wird und wie er durch allgemein bekannte extrakorporale Verfahren erreicht werden kann, wird jedoch ebenfalls in Betracht gezogen.

Der Ausdruck "durch Monozyten vermittelt" wird hier verwendet, um darzulegen, daß Monozyten oder Zellen der Monozyten-Familie, wie etwa Makrophagen, an der Krankheit oder dem Zustand, der allgemein als die zu behandelnde "Störung" bezeichnet wird, beteiligt sind. Das Ausmaß der Beteiligung der Monozyten bei einer gegebenen Störung ist eine Funktion dieser Störung und kann für unterschiedliche Arten von Störungen verschieden sein. Zum Beispiel beherbergen im Fall von mikrobieller (bakterieller, parasitärer, viraler und dergleichen) Erkrankung die Monozyten die Mikroben und können sie vor der Behandlung mit üblichen Arzneimitteln schützen. Im Fall von entzündlichen Störungen, wie etwa Arthritis, reichern sich die Monozyten und/oder Makrophagen an der Stelle der Entzündung an und tragen zu der Störung durch einen oder mehrere Mechanismen bei, wie etwa durch Phagozytose, Freisetzung hydrolytischer Enzyme und Zytokine, wie etwa IL-6, Freisetzung von fiebererregendem Protein, wie etwa IL-1, und Abschirmung des entzündeten Bereichs.

Ein Verfahren zur Behandlung von infektiösen Störungen, bei welchen Mikroorganismen, wie etwa Viren, Bakterien, Parasiten oder dergleichen, in chronisch infizierten Monozyten hausen, wird als spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrachtet. Die Behandlung von Virus-Infektionen, und insbesondere von T-lymphotropen Virus-Infektionen und Störungen, bei welchen sich das infektiöse Virus in den Monozyten eines befallenen Säugetieres befindet, ist ein besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Derartige befallene Säugetiere sind vorzugsweise menschliche Patienten.

Somit wird eine Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel II enthält, entweder allein oder in Kombination mit einem antimikrobiellen Mittel an ein Säugetier, das von einer solchen mikrobiellen Störung befallen ist, in Mengen verabreicht, die ausreichen, um eine therapeutisch wirksame Dosis jedes Arzneimittels für das Säugetier zur Verfügung zu stellen. Das antimikrobielle Mittel wird dem Säugetier entweder gemeinsam mit oder getrennt von der Verabreichung der Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel II enthält, verabreicht. Die Zusammensetzung bleibt innerhalb des Säugetiers, bis ihre Bestandteile durch die üblichen Körperprozesse ausgeschieden werden.

Die Menge einer Verbindung der Formel II, die in einer Zusammensetzung vorliegt und bei einem Verfahren nach obiger Beschreibung verwendet wird, ist eine Funktion mehrerer Variabler, wie allgemein auf dem Gebiet der Medizin bekannt ist. Unter diesen Variablen ist auch die Tatsache, ob die Verabreichung in vivo oder in vitro vor sich geht, ferner wenn sie in vitro durchgeführt wird, die Anzahl der vorliegenden zu behandelnden Zellen, das zu behandelnde Tier, die zu behandelnde Störung in dem Tier oder in den Zellen, sowie die Art und Weise der Verabreichung. Beispielhafte Angaben der Konzentrationen sind im folgenden sowohl für die Verwendung in vivo als auch in vitro angegeben.

Unabhängig von den oben genannten Variablen wird bei Störungen, wo es bekannt ist, daß ein Mikroorganismus beteiligt ist, wie bei jenen oben besprochenen und im folgenden angegebenen (nicht-entzündliche Störungen oder jene anderen als autoimmun-bezogenen Störungen) das substituierte 2'-Deoxyadenin-Derivat in einer Menge verabreicht, die zur Abtötung von mindestens etwa 50 Prozent der vorliegenden Monozyten während der Behandlungsdauer ausreicht. Vorzugsweise werden etwa 90 bis 100 Prozent der ursprünglich vorliegenden Monozyten abgetötet.

Wenn die Verabreichung in vivo erfolgt, ist die verabreichte Menge geringer als jene, die die Funktionen des Knochenmarks, wie sie durch übliche Verfahren bestimmt werden, deutlich beeinträchtigt. Wenn die Verabreichung in vitro erfolgt, wie etwa bei einer extrakorporalen Verabreichung an ein Tier, wie etwa einen Menschen, wo das 2'-Deoxyadenin-Derivat den Körper des behandelten Tieres nicht wirklich betritt, ist eine Grenzkonzentration jene, die gegenüber anderen Zellen, die vorliegen können, nicht prohibitiv zytotoxisch ist.

Eine ausreichende Menge zur Abtötung von mindestens etwa 50 Prozent der ursprünglich vorliegenden Monozyten, bei welcher die Funktion des Knochenmarks während des Zeitraums der Behandlungs mit dem Mittel nicht wesentlich beeinträchtigt wird, ist eine Art der Definition einer therapeutischen Dosis.

Die obige Menge eines 2'-Deoxyadenin-Derivats der Formel II oder seines pharmakologisch verwendbaren Salzes, die in der Zusammensetzung vorliegen, ist auch eine ausreichende Menge zur Schaffung von etwa 0,04 bis etwa 0,20 mg/kg Körpergewicht des behandelten Wirtssäugetiers pro Tag, bevorzugter etwa 0,05 bis etwa 0,15 mg/kg/Tag, und am bevorzugtesten etwa 0,1 mg/kg/Tag, bei in vivo Verabreichung. Diese Menge ist ein anderer Weg der Definition einer therapeutisch wirksamen Dosis, der besonders dann verwendbar ist, wenn eine Verbindung der Formel II durch Infusion verabreicht wird.

Die molare Plasmakonzentration der Verbindung der Formel II oder der pharmakologisch verwendbaren Salze derselben während der Behandlung liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 Nanomolar (nM) bis etwa 100 nM, insbesondere etwa 5 nM bis etwa 50 nM und bevorzugter bei etwa 10 nM bis etwa 20 nM. Die Molarität des 2'- Deoxyadenin-Derivats im Plasma des behandelten Tieres (dem die Verabreichung zuteil wird) stellt somit noch ein anderes Maß für eine therapeutisch wirksame Dosis zur Verfügung, aus welcher die Menge einer Zusammensetzung errechnet werden kann.

Es versteht sich, daß die obigen therapeutisch wirksamen Dosierungen nicht das Ergebnis einer einzigen Verabreichung sein müssen und in der Regel das Ergebnis der Verabreichung einer Vielzahl von Dosierungseinheiten darstellen. Solche Dosierungseinheiten können ihrerseits Portionen einer täglichen oder wöchentlichen Dosis umfassen und somit wird die therapeutisch wirksame Dosis während des Zeitraums der Behandlung (Kontakt-Zeitraum) bestimmt.

Die orale Verabreichung ist, wie bereits angegeben wurde, die bevorzugte Verabreichungsart für die 2'-Fluoradenin-Derivate. Zur Erzielung der gewünschten Plasmakonzentration des Mittels kann ein Dosisbereich in Abhängigkeit von der spezifischen Verabreichungsart, dem Ziel der speziellen Behandlung, der besonderen verwendeten Verbindung und ähnlichen Betrachtungsweisen verwendet werden.

Zum Beispiel kann für orale Verabreichung die tägliche Dosis bei etwa 0,04 bis etwa 0,20 mg/kg Körpergewicht, bevorzugter bei etwa 0,05 bis etwa 0,15 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten bei etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht liegen. Im allgemeinen kann die Menge des aktiven substituierten Adenin-Derivats, die verabreicht wird, über einen relativ großen Bereich variieren, um die gewünschte Plasmakonzentration zu erreichen und vorzugsweise aufrecht zu erhalten.

Dosiseinheitsformen des Adenin-Derivats können etwa 0,1 mg bis etwa 15 mg desselben enthalten. Eine bevorzugte Dosiseinheitsform enthält etwa 0,1 bis etwa 1 mg des Mittels und kann 2 bis 5mal pro Tag verabreicht werden. Es sei jedoch festgehalten, daß eine kontinuierliche Infusion mit einer Rate, die zur Aufrechterhaltung der oben beschriebenen Plasmakonzentration ausgerichtet ist, ebenfalls in Betracht gezogen wird.

Die Dauer einer speziellen Behandlung kann ebenso in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung, von der Tatsache, ob die Behandlung für eine akute Manifestation oder für prophylaktische Zwecke gedacht ist, sowie von ähnlichen Betrachtungsweisen variieren. Eine typische Verabreichung erfolgt während eines Zeitraums von etwa 5 bis etwa 14 Tagen, wobei ein 7-tägiger Verlauf üblich ist. Verabreichungsfolgen (Zyklen) können ebenfalls in monatlichen Intervallen wiederholt werden oder es können parenterale Dosiseinheiten in wöchentlichen Intervallen gegeben werden. Orale Dosiseinheiten können in Intervallen von ein bis mehreren Tagen verabreicht werden, um die bestimmte therapeutisch wirksame Dosis zur Verfügung zu stellen. Somit schafft eine in vivo Verabreichung einer oben besprochenen Dosierung während eines Zeitraums von etwa 5 bis etwa 14 Tagen oder bei wöchentlichen oder täglichen Intervallen eine ausreichende Menge, um mindestens etwa 50 Prozent der ursprünglich anwesenden Monozyten abzutöten.

Dieses Behandlungsverfahren schafft eine Abnahme des Gehalts an Monozyten im Blut aufgrund der Toxizität der verwendeten Verbindungen der Formel II gegenüber Monozyten. Dieses Verfahren kann zur Herabsetzung der Anzahl der im Blutstrom eines behandelten Säugetiers zirkulierenden Monozyten um etwa 90 Prozent jener Anzahl verwendet werden, die vor der Behandlung während eines 7-tägigen Behandlungszeitraums vorlagen, wobei die Menge der zirkulierenden Monozyten etwa 2 Wochen nach Abbruch der Behanldung auf jene Gehalte zurückkehrt, die vor der Behandlung vorlagen. Diese beispielhafte Untersuchung wird im folgenden erläutert.

Die Kombinations-Therapiemethode gemäß der vorliegenden Erfindung richtet sich auf therapeutische Mittel gegen sowohl das verursachende infektiöse Mittel als auch den Monozyten-Wirt. Beispiele spezieller Erkrankungen, die für diese Behandlung zugänglich sind (und dabei auch therapeutische Mittel, die derzeit bei ihrer Behandlung verwendet werden) sind beim Menschen die folgenden:

Morbus Chagas (Nifurtimox)

Leishmaniose (Stibogluconat; Amphotericin B; Pentamidin-Isethionat)

Toxoplasmose (Pyrimethamin; Sulfonamid)

Malaria Chloroquin; Primaquin; Pyrimethamin, Mefloquin)

Pneumocystis (Trimethoprim-Sulfamethoxazol; Pentamidin-Isethionat)

Therapeutische Mengen und Behandlungsweisen für die oben angegebenen therapeutischen Mittel in der Klammer sind allgemein bekannt und können leicht aus üblichen Quellen entnommen werden, wie etwa Physicians Desk Reference, 42. Ausg., Medical Economics Corp., Oradell, N.J. (1988).

Bei einer beispielhaften Ausführungsform wird ein Patient, der von einer Leishmaniose befallen ist, mit einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt. Der Patient erhält eine Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel II in einer therapeutisch wirksamen Dosis enthält, gemeinsam mit der Verabreichung von Pentamidin. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Patient oral mit einer Zusammensetzung behandelt, die 0,15 mg/kg/Tag 2-Chlor-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofüranosyladenin in einem pharmakologisch verwendbaren Träger enthält, und erhält 4 mg/kg/Tag Pentamidin durch intramuskuläre Injektion während eines Zeitraums von etwa 7 Tagen.

Andere Erkrankungen unbestimmter Ursache, bei welchen angenommen wird, daß Monozyten/Makrophagen beteiligt sind, sind Sarcoidose, chronische granulomatöse Hepatitis, Wegener's Granulomatose, Morbus Paget, Atherosklerose, entzündliche Darmerkrankungen und granulomatöse Uveitis. Diese Erkrankungen werden in der Regel in erster Linie mit Steroiden, wie etwa Prednison oder Etidronat (Morbus Paget) oder Sulfasalazin (granulomatöse Uveitis) behandelt.

Bei der Behandlung einer Virusinfektion wird menschlichen Patienten oder niedrigen Tieren, etwa Versuchstieren, wie Mäusen, Ratten, Schimpansen und dergleichen, sowie veterinärmedizinisch behandelten Tieren, wie etwa Hunden, Katzen, Rindern, Schafen, Schweinen und dergleichen, eine Zusammensetzung verabreicht, die eine Verbindung der Formel II entweder allein oder in Kombination mit einem anderen antiviralen therapeutischen Mittel in Mengen enthält, die ausreichen, um therapeutisch wirksame Dosen eines oder beider Arzneimittel bei ihrer Anwendung zur Verfügung zu stellen.

Bei einer beispielhafen Behandlungsmethode werden Patienten, die von AIDS befallen sind, mit einer Kombination von Azidothymidin (AZT), Dideoxycytidin (ddC), Interferon, Acyklovir und dergleichen sowie mit einem substituierten 2'-Deoxyarabinofuranosyladenin-Derivat, wie etwa 2-Chlordeoxyadenosin (CdA) oder 2-Methyl-9,1'-beta-2'deoxy-2'-fluor-D-arabino-furanosyladenin behandelt. Die AZT-Kombinationstherapie wurde in neuerer Zeit zur Behandlung von AIDS verwendet, wobei niedrigere Dosierungen von AZT gemeinsam mit herabgesetzten Dosierungen eines zweiten chemotherapeutischen Mittels verabreicht werden, wie detailliert angegeben ist in AIDS/HIV Experimental Treatment Directorv, Vol 2 [American Foundation for AIDS Research (1988)]. Zum Beispiel erhalten die Patienten eine therapeutisch wirksame Dosis von AZT (etwa 200 mg oral in Abständen von 4 Stunden) über 4 Wochen gemeinsam mit etwa 0,04 bis 0,20 mg/kg Körpergewicht pro lag CdA während etwa 5 bis etwa 14 Tagen, in der Regel während etwa 7 Tagen.

Die Verabreichung des CdA (oder einer analogen Verbindung der Formel II) bewirkt eine dramatische Abnahme der Blutmonozyten, in welchen das Virus eingenistet ist, als Ergebnis der verstärkten Toxozität der Verbindung gegenüber Monozyten. Die gleichzeitige Verabreichung von AZT (oder eines anderen antiviralen Mittels) tötet die Viren (oder inhibiert die virale Replikation) durch Eintreten in die von den Viren befallenen Zellen und voraussichtlichen Einbau in die wachsenden DNA-Ketten, was zu einem Abbruch der Ketten und anschließender Inhibierung der viralen Replikation innerhalb dieser Zellen sowie weiterer Infektion führt.

Die Kombinations-Behandlungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung ist somit sowohl gegen aktive Viren, die in Zellen eindringen, als auch gegen latente, in Monozyten-Wirtszellen vorliegende Viren wirksam. Zusätzliche therapeutische Mittel zur Behandlung von HIV und entpsrechende Dosierungen zur Verabreichung finden sich in der obigen Literaturstelle AIDS/HIV Experimental Treatment Directory.

Unter dem Ausdruck "Entzündung" ist der reaktive Zustand von Hyperämie und Absonderung aus den Blutgefäßen mit anschließender Rötung, Hitze, Schwellung und Schmerzen zu verstehen, mit welchen ein Gewebe auf physikalische oder chemische Verletzung oder bakterielle Invasionen reagiert. Solche Entzündungen werden durch Monozyten und andere Phagozyten vermittelt.

Klinische Zustände, mit welchen Monozyten-vermittelte Entzündung in Verbindung steht und für welche somit ein entzündungshemmendes Mittel angezeigt ist, schließen zum Beispiel Arthritis, inklusive rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis, post-operative Entzündung, dentale Entzündung und akute und chronische Augenentzündungsleiden, wie etwa Konjunktivitis, ein.

Als ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Entzündung zur Verfügung gestellt, insbesondere einer solchen, die während Autoimmunstörungen auftritt. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Zusammensetzung nach obiger Beschreibung in einer ausreichenden Menge, um eine therapeutisch wirksame Dosis einer Verbindung der Formel II oder eines pharmakologisch verwendbaren Salzes derselben zur Verfügung zu stellen. Vorzugsweise erfolgt diese Verabreichung auf oralem Wege und steht X für Fluor.

Eine Dosierung während eines Zeitraums, der oben für nicht-autoimmunbezogene Zustände beschrieben ist, kann auch für die Behandlung von Entzündungen verwendet werden. Obwohl eine solche Behandlung wirksam ist, kann sie jedoch ziemlich aggressiv sein und kann das behandelte Wirtstier in einem unnotwendig immunkompromittierten Zustand zurücklassen.

Eine weniger aggressive Behandlungsweise wird daher auch in Betracht gezogen. Hiebei wird ebenfalls ebenfalls eine oben beschriebene Dosierung, z.B. Plasma- Konzentration, verwendet, jedoch während eines kürzeren Kontakt-Zeitraums, sodaß die Monzyten-Funktion zwar gestört ist, die Monozyten jedoch als Folge der oben erwähnten Behandlungsweise nicht wirklich abgetötet werden. Die Beeinträchtigung der Monozyten- Funktion ist hierin definiert als eine Reduktion von mindestens etwa 25 Prozent der spontanen Ausscheidung von Interleukin-6 (IL-6) durch Monozyten, die in Gegenwart einer Verbindung der Formel II während eines Zeitraums von 72 Stunden gezüchtet werden. Ein brauchbarer Assay für die Beeinträchtigung von Monozyten wird später hierin besprochen.

Bei einer beispielhaften Behandlungsweise wird eine Verbindung der Formel II in einer Menge von etwa 0,04 bis 0,20 mg/kg/Tag, bevorzugter von etwa 0,05 bis 0,15 mg/kg/Tag, und am bevorzugtesten von etwa 0,1 mg/kg/Tag verabreicht, um eine Plasma-Konzentration von etwa 1 nM bis etwa 100 nM und bevorzugter von etwa 5 nM bis etwa 20 nM bereitzustellen. Diese einzige Verabreichung wird wöchentlich während eines Zeitraums von mehreren Monaten, z.B. von etwa drei bis etwa neun Monaten, wiederholt.

Eine solche Verabreichung kann auf ambulanter Basis für Menschen durchgeführt werden, die eine intravenöse Infusion mit der Dauer von etwa 2 bis etwa 4 Stunden in der Ordination eines Arztes erhalten. In dieser Form ist die Behandlung wesentlich weniger invasiv als eine kontinuierliche Infusion während eines Zeitraums von mehreren Tagen, die in der Regel einen Spitalsaufenthalt für das Wirtssäugetier, d.h. den menschlichen Patienten, erfordert.

Zustände, wo die Unterdrückung der Immunreaktion wünschenswert ist, umfassen Autoimmunkrankheiten, wie etwa systhemischen Lupus erythematosus, hämolytische Anämie, ulzerative Colitis, Nephrose und das Verhindern der Abstoßung fremder Zellen, wie bei Aufpfropfungen, inklusive Organ-Transplantationen.

D. Synthese der Verbindung

Eine hier verwendbare Verbindung, in welcher Z fehlt, kann durch direktes Kondensieren eines geeignet substituierten Adenins an einen geeignet substituierten Zuckerring, etwa nach den in Montgomery et al., (1986) J. Med. Chem., 29:2389-2392, beschriebenen Verfahren, nach der in der US-PS Nr. 4,082.911 gelehrten Methode oder nach der Beschreibung in den Zitaten von Herdewijn et al. (1987) J. Med. Chem., 30:2131-2137, welche Offenbarungen hierin als Referenz angegeben sind, hergestellt werden. Ein geeignet substituiertes Adenin kann hergestellt werden, indem nach den angegebenen Literatur-Synthesen oder analogen Synthesen gearbeitet wird. In neuerster Zeit stellten außerdem noch Wright et al. (1987) J. Org. Chem., 52:4617-4618, 2-Chlor- und 2-Brom-2'-deoxyadenosine durch direkte Umsetzung des geeigneten 2,6-Dihalopurins mit einer 3',5'-geschützten Alpha-1-Chlor-ribose unter Verwendung von Natriumhydrid in Acetonitril und anschließende Behandlung mit methanolischem Ammoniak bei 60ºC zur Abspaltung der Schutzgruppe von den entstehenden 3',5'-Hydroxylen und zur Bildung der 6-Aminogruppe in dem endgültig hergestellten Adenosin dar. Fukukawa et al. (1983) Chem. Pharm. Bull., 31(5):1582-1592 berichten auch über Synthesen von 2'-Deoxy-2'- arahalo-substituierten Adenosin-Derivaten.

Die 2'-Deoxy-2'-fluor-arabinofuranosyladenin-Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden nach der Beschreibung der folgenden Beispiele hergestellt. Die Synthese ist ähnlich der, die in Marquez et al. (1987) Biochem. Pharmacol., 36:2719-2722, gelehrt wird, was hierin als Referenz aufgenommen ist, in welcher 6- Chlorpurin mit 3-0-Acetyl-5-0-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-D-arabinofuranosylbromid kondensiert wird. Der funktionalisierte Halozucker wird nach dem von Reichman et al. (1975) J. Carbohyd. Res., 42:233 berichteten Verfahren hergestellt und die 2'-Deoxy-2'- fluor-arabinofuranosyladenin-Verbindung wird durch Ammonolyse mit konzentriertem methanolischem Ammoniak gewonnen, der die Schutzgruppen abtrennt.

Die Adenosin-1-N-oxid-Gruppe der Verbindungen, d.h. wo Z vorliegt, ist von besonderem Interesse, da diese Materialien an sich besonders dazu neigen, nicht in eine wachsende Polynukleotidkette eingebaut zu werden, da die Anwesenheit der N- Oxidgruppe wahrscheinlich mit den Wasserstoffbindungen während dieser Synthese interferiert. Es wird eher angenommen, daß die N-Oxid-Verbindungen vor ihrem Einbau in die wachsende Kette und vor dem Abbruch derselben durch eine endogene Reduktase reduziert werden.

Nichtsdestoweniger können die N-Oxid-Verbindungen, da sie frei von reiner ionischer Ladung sind, jedoch ein internes zwitterionisches Ladungspaar besitzen, durch die Zellmembranen hindurchtreten. Jene Verbindungen sind auch um einiges wasserlöslicher als die entsprechenden nicht-oxidierten Verbindungen.

Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird dennoch angenommen, daß die N-Oxid-Verbindungen in die Zelle eintreten und phosphoryliert werden, was in Übereinstimmung mit dem Bericht über eine solche Phosphorylierung in Lindberg et al. (1967) J. Biol. Chem., 242:350-356, ist. Ein Pool solcher Derivate wird intrazellulär bis zu dem Zeitpunkt aufrechterhalten, wo die N-Oxid-Funktion reduziert und das Nukleotid eingebaut ist, um die entsprechende wachsende Polynukleotidkette abzubrechen.

Die 1-N-Oxid-Verbindungen werden leicht durch das Verfahren von Klenow et al. (1961) Biochem. Biophys. Acta, 52:386-389, mit geringer Modifikation, wie sie im folgenden besprochen wird, hergestellt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die anschließenden Beispiele weiter erläutert, die nicht in irgendeiner Weise zur Begrenzung des Rahmens der Erfindung gedacht sind.

BEISPIEL 1: Zytotoxizität von CdA in Vivo

Die Wirkung der Verabreichung von 2-Chlordeoxyadenosin (CdA) auf den Spiegel der zirkulierenden peripheren Blut-Monozyten, Lymphozyten, Neutrophilen und Plättchen wurde wie folgt bestimmt.

An sieben Patienten mit cutanem T-Zell-Lymphom wurde eine kontinuierliche intravenöse Infusion einer Zusammensetzung, die 2-Chlordeoxyadenosin mit einer Dosierung von 0,1 mg/kg Körpergewicht pro Tag in isotonischer Salzlösung enthielt, verabreicht. Blutproben wurden täglich entnommen und die Anzahl der lebensfähigen vorliegenden Zellen wurde täglich während sieben Tagen nach der Behandlung ausgezählt.

Die jeweils hinsichtlich der drei Zellarten erhaltenen mittleren Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt, wo die verstärkte Toxizität von 2-Chlordeoxyadenosin gegenüber Blut-Monozyten gezeigt ist. Die Abnahme des mittleren Gehalts an Monozyten, die durch den Kontakt der Monozyten mit der Cdaenthaltenden Zusammensetzung verursacht war, betrug am Tag 7 80 %. Bei fünf der sieben Lymphom-Patienten verschwanden die Monozyten am fünften Behandlungstag vollständig aus dem Kreislauf.

Die Plättchen- und Hämoglobingehalte waren während des gezeigten Zeitraums konstant. Wie ersichtlich, wurde keine signifikante Abnahme der Anzahl der zirkulierenden Neutrophilen beobachtet, wogegen die Anzahl der zirkulierenden Lymphozyten mit dem Ende des Zeitraum der CdA-Infusion um 30 % abnahm. Die Monozyten- Zahlen kehrten innerhalb von etwa 2 Wochen nach Abbruch der CdA-Verabreichung auf etwa die Werte vor der Behandlung zurück.

Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herabsetzung der Anzahl der im Blut zirkulierenden Monozyten zur Verfügung. In ähnlicher Weise wurde gefunden, daß die Verabreichung von 2-Chlordeoxyadenosin an autohämolytische Anämie-Patienten zu einer signifikanten Abnahme der Autoantikörper-Produktion und zu gleichzeitiger Herabsetzung der Hämolyse führte.

BEISPIEL 2: Zytotoxizität von CdA In Vitro

Die Vergleiche hinsichtlich der Zytotozizität von 2-Chlordeoxyadenosin (CdA) gegenüber gereinigten humanen Monozyten, Lymphozyten und humanen Fibroblast-Zellen wurden wie folgt bestimmt.

Periphere Blut-Monozyten und Lymphozyten wurden nach allgemein bekannten Methoden aus normalen Individuen isoliert. Die Zellen wurden, solange sie frisch waren, mit einer Dichte von etwa 5x10&sup5; Zellen pro ml in Gewebskulturplatten mit 96 flachbödigen Vertiefungen unter Verwendung einer Kontaktzusammensetzung gezüchtet, die das Medium RPMI 1640 mit einer Ergänzung durch 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2- Mercaptoethanol und 20 % autologem Plasma (komplettes Medium) und außerdem verschiedene Konzentrationen (0-125 nanomolar) CdA enthielt, während eines Zeitraums von fünf Tagen bei einer Temperatur von 37ºC in Luft, die 5 % CO&sub2; enthielt, gezüchtet. Die humane Fibroblast-Zell-Linie GMO1380 wurde ursprünglich von NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, NJ, erhalten und unter den gleichen Bedingungen wie oben gezüchtet. Diese Zell-Linie stammte aus einer normalen fetalen Lunge.

Toxizität gegenüber den Monozyten und Fibroblasten wurde in einer Modifikation des MTT-Reduktionsassays bestimmt, der in Mosmann (1983) J. Immunol. Meth., 65 55-63, beschrieben ist. Nach der Züchtung während bis zu fünf Tagen wurde das 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) mit 0,2 mg (40 ul) zu jeder Vertiefung zugemischt und die Inkubation wurde weitere 4 Stunden fortgesetzt. Dann wurden die Platten mit 1000Xg 10 Minuten zentrifugiert und die Überstände sorgfältig mit einer fein gezogenen Pipette abgesaugt.

Angesäuertes Isopropanol (100ul; unter Verwendung von 0,04 N HCl) wurde zu jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platten wurden versiegelt, vor Licht geschützt und bei -20ºC etwa 18 Stunden aufbewahrt, um vollständige Auflösung der blauen Formazan-Niederschläge zu gestatten.

Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde unter Verwendung eines Dynatech Mikroplatten-Spektrophotometers bestimmt, wobei die dekadische Extinktion bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern (nm) unter Verwendung der Bezugswellenlänge von 630 nm gemessen wurde. Der Assay konnte so geringe Monozyten-Zahlen wie 2000 inaktivierte Monozyten feststellen und die Extinktion von MTT Formazan bei 570 nm war über einen Bereich von etwa 2,5-20 x 10³ Zellen linear im Hinblick auf die Anzahl der Monozyten.

Die Toxizität von CdA gegenüber Zell-Linien und Lymphozyten in Suspension wurde durch Ausschluß des Farbstofts Erythrosin B unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt.

Die Ergebnisse dieses in vitro Zytotoxizitäts-Assays sind in Figur 2 dargestellt. Die Zytotoxizität ist als Prozentsatz der lebensfähigen Zellen ausgedrückt, die nach fünf Tagen Einwirkung von CdA verbleiben im Vergleich zur Anzahl der lebensfähigen Zellen nach fünf Tagen ohne CdA-Zusatz zu dem Kulturmedium (lebensfähige Zellen % des Vergleichs). Während 50 % der gezüchteten Monozyten nach fünf Tagen Einwirkung von 20 nM CdA abgetötet waren, wurde keine merkbare Toxizität beim Wachstum von Fibroblast-Zellen bei der gleichen CdA-Konzentration beobachtet. Es wurde weiters festgestellt, daß die Empfindlichkeit der Monozyten gegenüber CdA in Anwesenheit von Deoxycytidin (100uM) wesentlich herabgesetzt war. Dieses Ergebnis scheint auf eine Deoxycytidin-Kinase-Aktivität bei der Zytotoxizität von CdA hinzuweisen.

Es sei betont, daß diese Ergebnisse unerwartet waren. Es wurde gefunden, daß die Toxizität von CdA von ihrer Phosphorylierung und Umwandlung in CdA-5'-Triphosphat abhängt. Die Bildung von CdA-Nukleotiden ist eine Funktion des Verhältnisses zwischen Deoxycytidin-Kinase-Aktivität und 5'-Nukleotidase-Aktivität. Da von humanen Makrophagen berichtet wurde, daß sie niedrige Deoxycytidin-Kinase-Gehalte und viel 5'- Nukleotidease aufweisen, war es für Zellen der Monozyten-/Makrophagen-Familie nicht zu erwarten, daß sie eine Empfindlichkeit gegenüber CdA zeigen würden. Wichtig ist, daß die Konzentrationen von CdA, die in vitro für Monozyten toxisch sind, in der gleichen Größenordnung liegen wie jene, die in dem Plasma von Patienten gemessen wurden, die eine laufende Chemotherapie mit CdA wegen chronischer lymphoider Malignität erhalten.

Da außerdem die Zellen der Monozyten-/Makrophagen-Familie weitgehend für entzündliche Reaktionen verantwortlich sind, können die Ergebnisse dieser Untersuchung darauf hindeuten, daß die Verbindungen der Formel II zur selektiven Herabsetzung der Anzahl der zirkulierenden Blut-Monozyten verwendet werden können und hiedurch Entzündungen bessern.

BEISPIEL 3: In Vitro Zytotoxizität von CdA gegenüber Monozyten

Frisch isolierte humane Monozyten wurden mit einer Konzentration von 10&sup5; Zellen/Vertiefung in Gewebskulturplatten mit 96 flachbödigen Vertiefungen gezüchtet. Die Zellen wurden im Anschluß an das ursprüngliche Aufstreichen in vollständigem Medium (Beispiel 2) etwa 12 Stunden inkubiert. Dann wurden die Zellen durch Zusatz verschiedener Konzentrationen von CdA behandelt, um spezifische Vertiefungen für Monozyten-enthaltende Zusammensetzungen zu bilden und die Platten wurden, wie oben angegeben, inkubiert.

Es wurde sechs Tage lang täglich der Prozentsatz an lebensfähigen Zellen in den Vertiefungen, die die behandelten Monozyten enthielten, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 3 zusammengestellt, worin gezeigt ist, daß CdA für Monozyten toxisch ist und einen signifikanten Abfall der Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb von 2 Tagen Behandlung mit 50 nM CdA hervorruft.

BEISPIEL 4: DNA-Schädigung in Monozyten durch Einwirkung von CdA

Die Monzyten wurden wie oben besprochen aufgestrichen und wurden dann mit Zusammensetzungen in Kontakt gebracht, die verschiedene Konzentrationen von CdA enthielten. Das Ausmaß der DNA-Schädigung in den Monozyten, auf die das CdA eingewirkt hat, wurde durch den Fluoreszenz-Assay hinsichtlich DNA-Abrollung in alkalischer Lösung bestimmt, der von Birnboim und Jevcak (1981) Cancer Res., 41:1889- 1892 beschrieben und an geringere Zellzahlen angepaßt ist (Thierry et al. (1985) Radiation Res., 102:347-358) bestimmt.

Die Abrollgeschwindigkeit der DNA in alkalischer Lösung bei 15ºC ist proportional der Anzahl der DNA-Strangbrüche oder Alkali-labilen Stellen. Die Ethidiumbromid-Fluoreszenz von verbleibender Duplex-DNA in Proben, die eine Stunde lang einem PH-Wert von 12,8 ausgesetzt waren, wurde mit der Fluoreszenz eines aliquoten DNA-Anteils, der dem Alkali nicht ausgesetzt war, verglichen. Die Prozente der restlichen doppelstrangigen DNA nach 1 Stunde wurden als Maß für die DNA-Schädigung in der Probe herangezogen. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt.

Die DNA-Brüche erschienen innerhalb von 2 Stunden in menschlichen Monozyten, die 10 nM CdA ausgesetzt waren, und reicherten sich mit der Zeit während der CdA-Einwirkung an. Der Grad an DNA-Schädigung war dosisabhängig.

BEISPIEL 5: Biochemische Wirkungen des CdA in humanen Monozyten

Der zelluläre NAD-Gehalt wurde in humanen Monozyten im Anschluß an die Inkubierung in Kultur mit CdA (1 uM) gemessen. Es wurde ein Alkohol-Dehydrogenase-Zyklus-Assay nach der Beschreibung von Jacobsen und Jacobsen (1976) Arch. Biochem. Biophys. 175:627-634 zur Messung von NAD verwendet.

Monozyten, die nach obiger Beschreibung gezüchtet und in Kontakt gebracht waren, wurden von den Kulturvertiefungen abgelöst und mit Perchlorsäure (0,5 M) 10 Minuten bei 4ºC behandelt. Die Mischung wurde geklärt und mit KOH, das Kaliumphosphat-Puffer (0,33 M) enthielt, bei pH 7,5 neutralisiert. Monozyten-ATP wurde in Perchlorsäure-Extrakten durch Anionenaustausch-HPLC unter Verwendung einer Whatman SAX Säule mit einer isokratischen mobilen Phase, die aus KH&sub2;PO&sub4; (0,25 M), KCl (0,5 M) und Acetonitril (2 %) bei pH 3,6 bestand, quantitativ bestimmt gemäß den Verfahren von Carson et al. (1980) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 77:6865-6869.

Der NAD+-Verbrauch für die Synthese von Poly-(ADP-Ribose) ist eine bekannte Konsequenz von starker DNA-Schädigung in eukaryotischen Zellen. Um die mögliche Rolle des NAD-Entzugs in der deutlichen Toxizität von CdA gegenüber Monozyten zu bestimmen, wurden die temporären Veränderungen in oxidiertem NAD und ATP in Zellen untersucht, die CdA mit 1 uM ausgesetzt waren.

Figur 5 zeigt die Veränderungen in oxidiertem NAD in den Monozyten, die CdA ausgesetzt waren. Im Gegensatz zu Messungen der DNA-Integrität [doppelstrangige (ds)-DNA] blieb der NAD-Gehalt der Monozyten während der ersten 4 Stunden der Einwirkung relativ konstant (> 95 % des Vergleichs-NAD), nahm anschließend daran jedoch zunehmend ab. Der Abfall des NAD fand statt, bevor ATP und die Lebensfähigkeit der Zellen abnahmen, was zuerst nach einer Einwirkung von CdA während 16 Stunden deutlich wurde.

Die Synthese von Monozyten-RNA im Anschluß an die Einwirkung von CdA wurde durch Messung des Einbaus von ³H-Uridin untersucht. Die Monozyten wurden dem ³H-Uridin (20uCi/10&sup6; Zellen) während der letzten 1 Stunde der CdA-Einwirkung (1 uM) ausgesetzt. Die gemessene Radioaktivität war in den auf Zelluloseacetat- Filtern aufgefangenen Trichloressigsäure-Fällungen enthalten und wurde durch Flüssig- Scintillationszählung gemessen. Figur 5 zeigt, daß 1 uM CdA eine zunehmende Absenkung der RNA-Synthese verursachte, was nach der ersten Stunde Kulturzeit feststellbar war und mit dem Auftreten der DNA-Schädigung zusammenfiel.

BEISPIEL 6: Monozytenfunktions-Assays

Die Wirkungen von sub-letalen CdA-Konzentrationen auf die Monozyten- Funktion in vitro wurde ebenfalls untersucht. Die Zellen wurden mit CdA (5-20 nM) drei Tage lang in Kontakt gebracht und gezüchtet, worauf Phagozytose und die IL-6 Aktivität des Überstands untersucht wurde. Figur 6 zeigt, daß trotz unveränderter Lebensfähigkeit der Zellen die Phagozytose von Antikörper-beschichteten Erythrozyten-Zielen deutlich durch 10 und 20 nM CdA unterdrückt wurde.

Die Fähigkeit von dialysierten Kulturüberständen, die Proliferation von B9.9 Hybridomzellen zu begünstigen, ist ein Maß für die IL-6 Aktivität (Helle et al. (1988) Eur. J. Immunol., 18:1535-1540). Die Monozyten scheiden spontan IL-6 beim Haften auf Kunststoff während einer kurzzeitigen in vitro Kultur aus (Guerne et al. (1989) J. Ciin. Invest., 83:585-592). Monozyten, die in autologem Plasma mit 20 % drei Tage lang gezüchtet wurden, schieden etwa 18 Einheiten pro ml IL-6 aus, wie durch die Bioassay-Standardkurve unter Verwendung von rll-6 bestimmt wurde.

Figur 6 zeigt auch, daß der Kontakt von Monozyten mit sub-toxischen Konzentrationen von CdA während drei Tagen die spontane Ausscheidung von IL-6 in den Kulturüberstand inhibierte. Bei zytotoxischen Konzentrationen von CdA enthielten die Überstände jedoch hohe Mengen an IL-6, was voraussichtlich auf die Zell-Lyse und Freisetzung des Monokins aus intrazellulären Speichern zurückzuführen ist.

Monozyten-Phagozytose wurde unter Verwendung von autologen Erythrozyten-Zielen, die mit einem subagglutinierenden Titer von Kaninchen-anti-human- Erythrozyten-IgG (Cappel, Malvern, PA) sensibilisiert worden waren, untersucht. Die Monzyten (2x10&sup5; Zellen/Vertiefung) wurden sub-toxischen Konzentrationen von CdA 72 Stunden lang in Mikrowell-Platten ausgesetzt. Das komplette Medium wurde durch ein Medium ersetzt, das 10 % fetales Rinderserum enthielt, und eine Suspension von sensibilisierten Erythrozyten (0,25 % gepacktes Zellvolumen) wurde zu den anhaftenden Monozytenschichten zugesetzt. Nach der Inkubation während 4 Stunden bei 37ºC wurde das Ausmaß der Phagozytose quantitativ durch das spektrophotometrische Verfahren von Jungi (1985) J. Immunol. Meth., 82:141-153 bestimmt. Dieser Assay basiert auf der Hämoglobin-katalysierten Peroxidation von Diaminoberzidin durch Detergens-Lysate von mononuklearen Phagozyten.

Die spontane Ausscheidung von IL-6 durch gezüchtete Monozyten wurde durch den Hybridom-Wachstumsfaktor-Bioassay nach der Beschreibung von Guerne et al. (1989) J. Clin. Invest., 83:585-592 gemessen. Bei diesem Assay hängt die Proliferation eines B9.9 murinen Hybridom-Subklons von der Anwesenheit von IL-6 ab. Die aufgefangenen Überstände der bis zu 72 Stunden mit CdA gezüchteten Monozyten wurden zuerst zur Abtrennung des Arzneimittels dialysiert, dann 1:12 in Vertiefungen verdünnt, die B9.9 Zellen aus dem IL-6 Bioassay enthielten. Zur Eliminierung der Stimulationswirkungen von kontaminierendem Lipopolysaccharid während der Monozyten-Isolierung wurde Polymixin B (12,5 ug/ml) zu den verwendeten Reagenzien, Puffern und Haftungsmedien zugesetzt, um Zellen für diese Untersuchungen zu bereiten.

BEISPIEL 7: Zytotoxizität von CdA In Vivo

Eine ähnliche Untersuchung wie die, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde an drei Patienten mit rheumatoider Arthritis durchgeführt. Bei dieser Untersuchung wurde eine Zusammensetzung, die CdA, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthielt, an die Patienten durch Infusion während eines 5-tägigen Zeitraums in drei Zyklen unter Verwendung von etwa vier bis sechs Wochen zwischen den Behandlungszyklen verabreicht.

Die Daten für Monozyten- und Lymphozyten-Zellzahlen sind in Figur 7 für den Patient 1, eine 63 Jahre alte Frau mit sero-positiver rheumatoider Arthritis gezeigt. Die Zahlen der Neutrophilen und Plättchen wurden ebenso untersucht und es zeigte sich, daß sie im wesentlichen während der 100 Tage dieser Untersuchung konstant waren. Ähnliche Ergebnisse für drei der vier Zell-Typen wurden bei den Patienten 2 und 3 erhalten. Patient 3 hatte eine Neutropenie, die temporär mit einem viralen Syndrom im Zusammenhang stand, sich jedoch nach Abbruch der Therapie mit nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln auflöste. Die Zell-Zahlen wurden, wie in Beispiel 1 besprochen, untersucht.

Wie aus Figur 7 ersichtlich, fielen die Monozyten-Zahlen während jedes CdA-Verabreichungszyklus praktisch auf Null. Dann kehrten die Monozyten-Zahlen innerhalb von etwa zehn Tagen, nachdem die Infusion von CdA bei jedem Zyklus abgebrochen wurde, auf etwa den ursprünglichen Wert vor der Behandlung zurück.

BEISPIEL 8: Synthese von 2-Chlor-9,1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin

1',3'-Di-O-aeetyl-5'-O-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluor-beta-D-arabinose (4,7 g, 13,8 mMol) wird zu 1 M HBr/CH&sub2;Cl&sub2; bei 0ºC zugesetzt und dann bei 5ºC 24 Stunden gehalten. Das Lösungsmittel wird durch Roto-Verdampfung unter negativem Druck abgezogen und das trockene Produkt in trockenem Toluol aufgelöst. Das Produkt wird durch Roto-Verdampfung unter vermindertem Druck getrocknet, um das 3'-O-Acetyl-5'-O- benzoyl-2'-deoxy-2-fluor-D-arabinofuranosylbromid (ABFA) zu ergeben.

ABFA wird in 200 ml Dichlorethan gelöst. 2,6-Dichlorpurin (2,61 g, 13,8 mMol) wird zu der ABFA-Lösung zugesetzt und die Mischung unter Rückfluß bei 100ºC 16 Stunden erhitzt. Dann wird die Lösung filtriert und durch Roto-Verdampfung unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das getrockuete Pulver wird in CHCl&sub3; gelöst und durch Flash-Chromatographie (200 g Silikagel, 230-400 Mesh. Elution mit 2:1 Cyclohexan-Ethylacetat) gereinigt, um das 2,6-Dichlor-9,1'-(3'-O-acetyl-5'-O- benzoyl-2'-deoxy-2'-fluor-beta-D-arabinofuranosyl)-9-purin zu ergeben. Dieses 2'-Fluorarabinofuranosyl-Derivat des 2,6-Dichlorpurins wird mit methanolischem Ammoniak zur Gewinnung eines 2-Chlor-9-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofüranosyladenins umgesetzt.

Anschließend wird das Lösungsmittel durch Roto-Verdampfung abgezogen und der entstehende Rückstand durch Rühren in kaltem (4ºC) Wasser (20 ml) gewaschen. Das Produkt wird durch Filtration abgetrennt. Das Hauptprodukt wird durch Flash-Silika-Säulenchromatographie (EtOAc:Methylalkohol mit 20:1), bis zu einem weißen Pulver durch Roto-Verdampfung eingeengt und durch NMR als 2-Chlor-9,1'-beta- 2'deoxy-2'-fluor-D-arabinosuranosyladenin identifiziert.

Ein ähnliches Ergebnis wird durch Umsetzung von ABFA (siehe oben) mit 2,6-Dichlorpurin in Natriumhydrid/Acetonitril erhalten, wie in Wright et al. (1987) J. Org. Chem., 52:4617-4618 angegeben, worauf Umsetzung mit methanolischem Ammoniak, wie oben besprochen, erfolgt.

BEISPIEL 9: Synthese von 2'-Deoxyadenosin-1-N-Oxid

2'-Deoxyadenosin (30 Mikromole) in 5 ml NH&sub4;HCO&sub3; bei pH 5,5 wurde mit 120 mMol des Magnesiumsalzes von Monoperphthalsäure bei einer Temperatur von 0ºC unter kontinuierlichem Rühren gemischt.

Nach einem Zeitraum von 12 Stunden wurde die Mischung lyophilisiert, in 2 ml Wasser gelöst und auf eine 20 ml Chromatographie-Säule Dowex AGIX-8 (Formatform) aufgebracht.

Das 1-N-Oxid wurde mit 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; eluiert. BEISPIEL 10: Komprimierte Tablette

Bestandteil Menge, mg/Tablette 2-Chlor-9,1'-beta-2'-deoxy- 2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin dibasisches Kalziumphosphat NF Stärke USP modifizierte Stärke Magnesiumstearat USP BEISPIEL 11: Hartwandige Kapsel
Bestandteil Menge, mg/Kapsel 2-Methyl-9,1'-beta-2'-deoxy- 2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin Laktose, sprühgetrocknet Magnesiumstearat BEISPIEL 12: Orale Flüssigkeit (Sirup)
Bestandteil Menge, Gew.%/Vol. 2-Hydroxy-9, 1'-beta-2'-deoxy-2'-fluor-D-arabinofuranosyladenin flüssiger Zucker Methylparaben USP Propylparaben USP Geschmackstoff gereinigtes Wasser, q.s. ad BEISPIEL 13: I.V. Injizierbare Lösung, Konzentrat
Bestandteil Menge, Gew.%/Vol. 2-Chlor-9,1'-beta-2'-deoxyadenosin-1-N-oxid Benzylalkohol NF gereinigtes Wasser

BEISPIEL 14: Magensäureresistent überzogenes Adenin-Derivat

Tabelle 1 gibt die Bestandteile einer Arzneimittel-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung (Zusammensetzung A) und einer magensäureresistenten Überzugszusammensetzung (Verbindung B) an.

Tabelle 1
Zusammensetzung Bestandteil Gewichtsprozent 2-Chlor-9,1'-beta-2'-deoxyadenosin Polyvinylpyrrolidon Modifizierte Stärke Natriumbicarbonat (wasserfrei) Zitronensäure Chloroform Methanol (wasserfrei) Zelluloseacetatphthalat Talkum # 127 USP FD&C#5 Gelb Diethylphthalat

Die für die Zusammensetzung A aufgelisteten Bestandteile werden gemeinsam unter langsamer Zugabe von wasserfreiem Isopropylalkohol (700 ml pro kg Zusammensetzung A) etwa 9 bis 15 Minuten gemischt. Die entstehende Mischung wird dann durch Extrusion in Tabletten zerteilt. Diese aufgetrennten Teilchen werden in einem Ofen bei 35ºC etwa 40 bis etwa 48 Stunden getrocknet. Das getrocknete Granulat wird durch ein 14 Mesh-Sieb gesiebt. Die Anteile, die durch das Sieb hindurchgehen, werden in einer Tablettenmaschine zur Herstellung von Tabletten mit etwa 4,8 mm Durchmesser und etwa 4 mm Dicke komprimiert.

Die getrockneten Tabletten werden dann mit dem pH-empfindlichen magensäureresistenten Beschichtungsmaterial (Zusammensetzung B) in einer Pfanne beschichtet, wobei etwa 0,45 Liter der Zusammensetzung B pro kg Tabletten eingesetzt werden, um einen gleichmäßigen Überzug mit einem Gewicht von etwa 5,5 Gew.% der endgültigen Tablette zu ergeben. Die feuchten beschichteten Tabletten werden dann getrocknet.

Die vorhergehende Beschreibung und die Beispiele sind zur Erläuterung gedacht und sollen nicht als Begrenzung angesehen werden. Es sind noch andere Variationen innerhalb der Idee und des Rahmens dieser Erfindung möglich und werden leicht für den Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar sein.


Anspruch[de]

1. Ein substituiertes Adenin-Derivat, dargestellt durch die Formel

worin Z für O&supmin; steht, Y Wasserstoff oder einen Substituenten bedeutet, der ein bis 20 Atome enthält, bei physiologischen pH-Werten frei von rein ionischer Ladung ist, ein lösliches Adenin-Derivat zur Verfügung stellt und dessen Anwesenheit auf der Adenin- Gruppierung Deaminierung des Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert, und X für Wasserstoff oder Fluor steht, mit der Maßgabe, daß Y nur dann Wasserstoff ist, wenn X für Fluor steht.

2. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 1, worin Y ein Rest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Halogen-, Niedrigalkyl-, Hydroxyl-, Niedrigalkylthio- und Niedrigalkanoylamido-Resten besteht.

3. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 2, worin Y ein Halogen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluor, Chlor und Brom besteht.

4. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 1, worin Y Chlor und X Wasserstoff ist.

5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein substituiertes Adenin-Derivat als Wirkstoff und einen physiologisch annehmbaren Träger umfaßt, wobei das genannte substituierte Adenin-Derivat in einer therapeutsich wirksamen Dosis vorliegt und eine Struktur hat, die der Formel

entspricht, in welcher Z für O&supmin; steht, Y Wasserstoff oder einen Substituenten bedeutet, der ein bis 20 Atome enthält, bei physiologischen pH-Werten frei von rein ionischer Ladung ist, ein lösliches Adenin-Derivat bildet und dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung Deaminierung des genannten Adenin-Derivats durch Adenosin-Deaminase inhibiert; und X für Wasserstoff oder Fluor steht, mit der Maßgabe, daß Y nur dann Wasserstoff ist, wenn X für Fluor steht.

6. Ein substituiertes Adenin-Derivat zur Verwendung bei der Behandlung eines Monozyten-mediierten Krankheitszustands bei einem Säugetier, wobei dieses substituierte Adenin-Derivat eine Struktur hat, die durch die Formel

dargestellt ist, worin Z für O&supmin; steht oder fehlt; Y Wasserstoff oder einen Substituenten bedeutet, der ein bis 20 Atome enthält, bei physiologischen pH-Werten frei von rein ionischer Ladung ist, ein lösliches Adenin-Derivat bildet und dessen Anwesenheit auf der Adenin-Gruppierung Deaminierung des genannten Adenin-Derivats durch Adenosin- Deaminase inhibiert; und X für Wasserstoff oder Fluor steht, mit der Maßgabe, daß Y nur dann Wasserstoff ist, wenn Z anwesend ist.

7. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 6, worin der genannte Y-Substituent ein Rest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Halogen-, Niedrigalkyl-, Hydroxyl-, Niedrigalkylthio- und Niedrigalkanoylamido-Resten besteht.

8. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 7, worin Y ein Halogen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluor, Chlor und Brom besteht.

9. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 8, worin X Fluor ist.

10. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 6, worin Y Chlor, X Wasserstoff und Z O&supmin; ist.

11. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 6, das 2-Chlor-2'-deoxy-2'-fluor-9,1'-beta-adebinofuranosyladenin ist.

12. Das Adenin-Derivat nach Anspruch 6, das 2-Chlor-2'-deoxy-2'-fluor-9,1'-beta-adenosin-1-oxid ist.

13. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Herstellung eines Arzueimittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Monozyten-mediierten Krankheitszustands bei einem Säugetier, wobei dieses Verfahren die Verabreichung des genannten Adenin-Derivates in einer zur Herabsetzung des Monozytengehalts im Blut dieses Säugetiers um mindestens etwa 50 Prozent während des Verlauls dieser Behandlung ausreichenden Menge umfaßt.

14. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13, wobei der genannte Monozyten-mediierte Krankheitszustand eine infektiöse Störung ist, bei welcher Mikroorganismen in infizierten Monozyten hausen.

15. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei diese Verabreichung das genannte Adenin-Derivat im Plasma des genannten Wirtssäugetiers in einer Menge von etwa 0,04 bis etwa 0,20 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht des Wirtssäugetiers pro Tag zur Verfügung stellt.

16. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das genannte Adenin-Derivat oral verabreicht wird.

17. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 14, wobei dieses Verfahren weiters die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines antimikrobiellen Mittels umfaßt.

18. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 17, wobei das genannte antimikrobielle Mittel an das genannte Wirtssäugetier getrennt von der Verabreichung des genannten substituierten Adenin-Derivates verabreicht wird.

19. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 18, wobei das genannte antimikrobielle Mittel ein antivirales Mittel ist.

20. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 19, wobei das genannte antivirale Mittel Azidothymidin ist.

21. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 17, wobei das genannte antimikrobielle Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nifurtimox, Stibogluconat, Amphotericin B, Pentamidin, Isethionat, Pyrimethamin, Sulfonamid, Chloroquin, Primaquin, Mefloquin, Trimethoprimsulfamethoxazol, Prednison, Etidronat-Natrium und Sulfasalazin besteht.

22. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung des genannten Adenin-Derivates in einer zur Erreichung einer Plasmakonzentration von etwa 1 nM bis etwa 100 nM in dem genannten Säugetier ausreichenden Menge umfaßt.

23. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13, wobei das genannte Säugetier ein Mensch ist.

24. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung von 2-Chlor-2'-deoxy-2'-fluor-9,1'-beta-adenosin-1-oxid, gelöst oder dispergiert in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel, umfaßt.

25. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 13, wobei die genannte Monozyten-Krankheit rheumatoide Arthritis ist.

26. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzueimittels zur Behandlung von Erworbenem Immundefizienz-Syndrom bei einem Menschen.

27. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 26, wobei das genannte Verfahren weiters die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines antiviralen Mittels umfaßt.

28. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 27, wobei das genannte antivirale Mittel an den genannten Menschen getrennt von der Verabreichung des genannten substituierten 2'-Deoxyarabinofuranosyladenin-Derivat verabreicht wird.

29. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 27, wobei dieses antivirale Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Azidothymidin, 2',3'-Dideoxycytidin, Acyclovir und Interferon besteht.

30. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach Anspruch 29, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung von 2-Chlor-2'-deoxyadenosin mit etwa 0,04 bis etwa 0,20 mg pro kg Körpergewicht pro Tag gemeinsam mit einer therapeutisch wirksamen Menge Azidothymidin umfaßt.

31. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Sarkoidose, chronischer granulomatöser Hepatits, Wegener's Granulomatose, Morbus Paget, Atherosclerose, entzündlicher Darmerkrankung und granulomatöser Uveitis.

32. Die Verwendung eines Adenin-Derivates nach einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Osteoarthritis, postoperativer Entzündung, Entzündungen im Zahnbereich oder akuten oder chronischen Augenentzündungserkrankungen.







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