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Dokumentenidentifikation DE69027925T2 19.12.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0466829
Titel VERFAHREN ZUR VERNETZUNG VON KOLLAGEN MITTELS DIPHENYLPHOSPHORAZID, DAS SO VERNETZTE KOLLAGEN UND BIOMATERIALIEN AUF DER BASIS VON VERNETZTEM KOLLAGEN
Anmelder Coletica, Lyon, FR
Erfinder PETITE, Herve, F-69500 Bron, FR;
MENASCHE, Philippe, F-75006 Paris, FR;
HUC, Alain, F-69110 Ste-Foy-les-Lyon, FR
Vertreter Beetz und Kollegen, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69027925
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 10.04.1990
EP-Aktenzeichen 909071011
WO-Anmeldetag 10.04.1990
PCT-Aktenzeichen FR9000253
WO-Veröffentlichungsnummer 9012055
WO-Veröffentlichungsdatum 18.10.1990
EP-Offenlegungsdatum 22.01.1992
EP date of grant 24.07.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.12.1996
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse A61L 27/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Vernetzung von Kollagen durch Diphenylphosphorylazid, derart erhaltenes vernetztes Kollagen und Biomaterialien auf der Basis von derart vernetztem Kollagen.

Es ist bekannt, daß Kollagen ein Drittel der Proteine von Lebewesen ausmacht. Seine schwache Immunogenität, seine Wirkung auf das Zellwachstum und seine bedeutenden mechanischen Eigenschaften machen es natürlich als Ausgangsmaterial für Biomaterialien interessant. Dennoch erfährt es bei seiner Implantation einen mehr oder weniger raschen Abbau gemäß der Form, in der es sich befindet (Lösungen, Schwämme, Filme oder native Gewebe), gemäß dem Ort der Implantation und gemäß der Tierart. Dieser Kollagen-Abbau ist manchmal wünschenswert (Nähte), manchmal nicht wünschenswert (Klappen-, Gefäßbioprothesen, etc.).

Außerdem ist der Abbau von Kollagen ein normaler Prozeß, der einen Teil des Wachstums, der Entwicklung und der Erneuerung von Bindegeweben bildet. Er ist auch ein integraler Bestandteil des Vernarbungsprozesses. Dieser Kollagen-Abbau involviert eine bestimmte Reihe von Enzymen, insbesondere Kollagenasen, die für den anfänglichen Angriff auf natives Kollagen bei neutralem pH verantwortlich sind. Sie spalten drei Peptidketten gleichzeitig. Die Spaltung findet zwischen den Resten GLY-LEU oder GLY-ILE statt. Dennoch wird derzeit eingeräumt, daß dieser Abbau die kooperierenden Wirkungen einer bestimmten Reihe von Enzymen erfordert, darunter Stromelysin und Gelatinasen.

Bei der Verwendung von Kollagen als Biomaterial ist es daher sehr interessant, die Bioabbaubarkeit von Kollagen in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung modulieren zu können. Diese Bioabbaubarkeit kann auf zumindest zwei Wegen moduliert werden, die entweder im Zusatz von Enzym-Inhibitoren (wie α-2-Makroglobulin oder β-1-Antikollagenase) oder auch in der Einführung chemischer Vernetzungsbindungen zwischen den Kollagenmolekülen bestehen. Dieses zweite Verfahren wird am häufigsten verwendet, da es hinsichtlich der Beständigkeit gegen einen Enzymabbau wirksamer ist. Die Vernetzungsbindungen können entweder durch physikalische Methoden erhalten werden, die den Vorteil haben, daß kein chemisches Mittel in das Gewebe eingeführt wird, die sich jedoch als wenig wirksam erweisen, oder auch chemische Methoden, die wirksam sind, jedoch im Gewebe Spuren des Vernetzungsmittels hinterlassen. So ist Glutaraldehyd (abgekürzt GTA) das am häufigsten verwendete Vernetzungsmittel, es hat jedoch leider die Eigenschaft, in Lösung zu polymerisieren. Daher kommt es bei der Vernetzung von Kollagen zur Bildung von GTA-Polymeren, die mit der Zeit GTA-Monomere (die in Konzentrationen von mehr als 10 bis 25 ppm cytotoxisch sind) in den Umgebungsgeweben ablagern, wodurch dem Kollagen ein Teil seiner biologischen Eigenschaften, für welche es ausgewählt wurde, verlorengeht.

Um die Verwendung von Glutaraldehyd zu vermeiden, haben die Erfinder bereits in der FR-A-8 710 317 = EP-A-0 301 977 ein Verfahren zur Vernetzung von Kollagen durch das Einführen von Azid- Gruppen in die Carbonsäure-Gruppen der Kollagen-Seitenketten vorgeschlagen. In diesem Dokument wurde die Vernetzung durch eine Veresterung der Carbonsäure-Gruppen von Kollagen bewirkt, dann wurden die Ester nacheinander in Hydrazide und anschließend in Acylazide transformiert. Die Acylazide reagierten schließlich in einem basischen Medium mit den Amin-Funktionen der Seitenketten von Kollagen, wobei Bindungen vom Peptid-Typ erhalten wurden. Dieses Verfahren hat, obwohl es sehr innovativ ist, den Nachteil, daß es langwierig ist, da die Vernetzung von Kollagen 8 Tage dauert, und es ist zur Verwendung im industriellen Maßstab wenig zweckmäßig, da diese Verzögerung mit einer industriellen Nutzung nur schwer vereinbar ist.

Daher setzten die Erfinder ihre Forschungen zur Vereinfachung des Vernetzungsverfahrens fort, wobei kein Vernetzungsmittel in das Endmaterial eingeführt und gleichzeitig ein Vernetzungsgrad von Kollagen erhalten wird, der aquivalent zu jenem ist, der in der FR-A-8 710 317 = EP-A-0 301 977 erhalten wird.

Diphenylphosphorylazid wurde als Kopplungsmittel zur Durchführung der Peptid-Synthese in der FR-A-2 172 162 beschrieben. Es wird auch als Mittel zur Durchführung der Herstellung cyclischer Peptide aus linearen Peptiden in der EP-A-0 070 021 und in Int. J. Peptide Protein Research, 22, 983, 374-380, beschrieben.

Daher ist die vorliegende Erfindung auf das Lösen des neuen technischen Problems gerichtet, das im Vorsehen eines vereinfachten Verfahrens zur Vernetzung von Kollagen besteht, wobei kein Vernetzungsmittel in das Endmaterial eingeführt und gleichzeitig ein Vernetzungsgrad von Kollagen erhalten wird, der äquivalent zu jenen ist, die durch bekannte beschriebene Verfahren erhalten werden, und insbesondere dem in der FR-A-8 710 317 = EP-A-0 301 977 beschriebenen.

Die vorliegende Erfindung hat auch das Ziel des Lösens des oben angegebenen, neuen technischen Problems mit einer drastisch reduzierten Vernetzungsdauer.

Die vorliegende Erfindung löst erstmals die oben angegebenen technischen Probleme auf äußerst einfache und reproduzierbare Weise, wobei die Verfahrensparameter beliebig und kostengünstig variiert werden können, um den Vernetzungsgrad von Kollagen in Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung beliebig regulieren zu können.

Daher sieht die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Vernetzung von Kollagen vor, welches die Bildung von Amid-Bindungen mit Hilfe von Acylazid-Gruppen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß Kollagen mit Diphenylphosphorylazid (DPPA) umgesetzt wird.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet das Umsetzen mit DPPA in einem nichtwässerigen Lösungsmittelmedium statt. Vorzugsweise ist dieses nicht-wässerige Lösungsmittel Dimethylformamid (DMF).

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante beträgt die DPPA-Konzentration zwischen 0,0125 % und 1,50 % V/V und vorzugsweise zwischen 0,25 und 0,70 %.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Umsetzen mit DPPA durch Inkubation bei einer Inkubationstemperatur zwischen etwa 0 und 10ºC, vorzugsweise bei ungefähr 4ºC, während einer Inkubationsdauer von einigen Stunden bis etwa 1 Tag, vorzugsweise ungefähr 1 Tag, durchgeführt.

Gemäß einem besonders vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach dem Umsetzen von Kollagen mit DPPA zumindest eine Spülung zur Eliminierung von DPPA durchgeführt und dann Acylazid-Gruppen umfassendes Kollagen in eine Borat- Pufferlösung eingebracht.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Inkubation von Acylazid-Gruppen umfassendem Kollagen in Borat-Puffer vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 0 und 10ºC, vorzugsweise bei etwa 40ºC, während einer Inkubationsdauer von einigen Stunden bis 1 Tag, vorzugsweise ungefähr 1 Tag, durchgeführt.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform weist der Borat Puffer einen pH von ungefähr 8,9 auf.

Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das als Ausgangsmaterial verwendete und mit DPPA umgesetzte Kollagen in Form eines Gels, Films oder natürlichen Gewebes, beispielsweise Perikard oder Gefäßtransplantat, Schwamms, Schlauchs oder einer Kollagenfaser vor.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform liegt das als Ausgangsmaterial verwendete Kollagen in Form eines natürlichen Gewebes vor, das nach Vernetzung mit DPPA in einer Ethanol-Lösung bei 70º konserviert wird.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird nach der Vernetzung von Kollagen mit DPPA eine Sterilisation, beispielsweise eine Sterilisation eines Kollagenfilms mit Gamma- Strahlen, durchgeführt.

Ohne den bei der Vernetzung von Kollagen mit DPPA vorliegenden Reaktionsmechanismus mit Sicherheit zu kennen, kann durch den Verweis auf die Analogie zum für die Bildung von Amid-Bindungen durch DPPA bei Carbonsäuren vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus der in der beigeschlossenen Fig.1 gezeigte Reaktionsmechanismus angegeben werden. Es wird festgestellt, daß das Carbonsäureanion (a), das von den Carbonsäure-Seitengruppen von Aspartam- oder Glutaminsäure der Peptidketten von Kollagen stammt, das Phosphoratom von DPPA (b) angreifen kann, wobei im wesentlichen eine pentakovalente Phosphor-Verbindung (c) erhalten wird. Dann findet eine Migration der Azid-Gruppe von Phosphoratom zum Carbonsäureatom durch eine Umordnung vom Typ einer internen nudeophilen Substitution statt.

Schließlich reagiert das gebildete Acylazid (d) mit den Amin-Seitengruppen von Lysin und Hydroxylysin der Peptidketten von Kollagen, um eine Amid-Bindung zu ergeben.

So wird festgestellt, daß auf völlig unerwartete Weise die Erfindung eine Vereinfachung des Verfahrens zur Vernetzung von Kollagen vorsieht, wobei dieses Verfahren äußerst einfach, kostengünstig ist und nur eine realtiv geringe Vernetzungsdauer erfordert, was einen bemerkenswerten und bestimmenden technischen Vorteil für Fachleute in bezug auf bekannte Techniken darstellt.

Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen klar aus der erläuternden Beschreibung hervor, welche mit Bezugnahme auf einige Ausführungsbeispiele folgt, die nur der Erläuterung dienen und daher den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.

In den Zeichnungen:

- zeigt Fig.1 eine Hypothese des Reaktionsmechanismus der Vernetzung von Kollagen durch das Umsetzen mit Diphenylphosphorylazid an den Carbonsäure-Gruppen von Kollagen;

- zeigt Fig.2 die Entwicklung des Prozentsatzes der Vernetzung von Kollagen, als RTP bezeichnet, der ausgehend von einer Peak-Denaturierungstemperatur (TP) von Kollagen am Perikard eines Kalbes als Funktion der DPPA-Konzentration gemessen wird; und

Fig.3 zeigt die Entwicklung des Prozentsatzes der Vernetzung, RTP, an Kollagenfilmen als Funktion der DPPA-Konzentration.

Beispiel 1: Vernetzung von Kälber-Perikard mit DPPA a) Herstellung des Ausgangsmaterials

In einem Schlachthaus werden Kälbern einige Stunden nach ihrem Tod die Perikarde entnommen. Diese Perikarde werden dann entfettet und in einer 0,9 % NaCl-Lösung gewaschen. Anschließend werden sie mit einer Lochstanze zu 1 cm² Pastillen gestanzt.

b) Vernetzung des Perikards:

Diese Reaktion kann wie folgt zusammengefaßt werden:

Vier Perikard-Pastillen, vorher gespült in 10 ml DMF während 5 min, um das Gewebe zu entwässern, werden 24 h lang bei 4ºC in 10 ml einer DMF-Lösung, enthaltend 0,75 % DPPA, inkubiert (Konzentration ausgedrückt als VIV). Dann wird DPPA durch Spülen in 10 ml DMF-Lösung aus dem Gewebe entfernt. Anschließlich wird das DMF durch Spülen in 10 ml einer Lösung von Borat-Puffer bei pH 8,9(0,04 M Natriumtetraborat, 004 M Borsäure) entfernt. Schließlich wird das Gewebe über Nacht in einem Borat-Puffer bei pH 8,9 inkubiert. Dann wird das Gewebe beispielsweise in einer Ethanol-Lösung bei 70º konserviert.

Beispiel 2: Vernetzung eines Kollagenfilms mit DPPA a) Herstellung des Ausgangsmaterials

Ein Gel wird aus Kalbshäuten hergestellt, die vorher mit einer Kalk-Sulfid-Mischung gewaschen und enthaart wurden. Dann werden sie in einem Bad entkalkt, das 2 % Ammoniumchlorid und Natriummetabisulfit enthält. Anschließend werden sie neutralisiert, dann werden die Salze durch zwei Waschungen mit Wasser eliminiert. Anschließend werden sie zerkleinert, dann mit Phosphatpuffer bei pH 7,8 (0,78 g/l Kaliumdihydrogenphosphat und 21,7 g/l Dinatriummonohyrogenphosphat) gewaschen. Anschließend wird das Phosphat durch zwei aufeinanderfolgende Waschungen mit permutiertem Wasser entfernt. Dann wird das zerkleinerte Material mit einer 10 % Essigsäure-Lösung angesäuert, wobei die Menge an Essigsäure 5 %, bezogen auf das Kollagen, beträgt. Anschließend wird das zerkleinerte Material geknetet, um eine homogene Paste zu erhalten. Diese Paste wird dann verdünnt, wobei ein Gel mit einer 0,7 % Kollagen-Konzentration erhalten wird. Dann wird das Gel in kleine Teflon-Schalen gegeben, dann eindampfen gelassen. Der so erhaltene Film wird anschließend mit einer Lochstanze zu 1 cm² Pastillen gestanzt.

b) Vernetzung des Films:

Vier Film-Pastillen mit einer Oberfläche von 1 cm² werden 24 h lang bei 4ºC in 10 ml einer DMF-Lösung, enthaltend 0,25 % DPPA, inkubiert (Konzentration ausgedrückt als V/V). Dann wird DPPA durch Spülen in 10 ml DMF-Lösung aus dem Film entfernt. Anschließlich wird das DMF durch Spülen in 10 ml einer Lösung von Borat-Puffer bei pH 8,9 (0,04 M Natriumtetraborat, 0,04 M Borsäure) entfernt. Schließlich werden die Filme über Nacht in einem Borat-Puffer bei pH 8,9 inkubiert. Dann werden sie beispielsweise auf einem Papierfilter getrocknet, dann im Freien getrocknet. Sie können anschließend beispielsweise mit Gamma- Strahlen sterilisiert werden.

Auf die gleiche Weise können Schwämme, Schläuche, Kollagenfasern, etc., vernetzt werden.

Beispiel 3: A. Einfluß der DPPA-Konzentration auf die Vernetzung von Kälber- Perikard

Ein erster Teil der Arbeiten besteht in der Untersuchung des Einflusses der DPPA-Konzentration auf den Vernetzungsgrad des Perikards. Zu diesem Zweck wird das Pericard in DPPA-Lisungen mit Konzentrationen, die zwischen 0,0125 % und 1,5 % (V/V) variieren, inkubiert.

Die Messung des Vernetzungsgrads von Kollagen erfolgt durch Flüssigkeits-Kalorimetrieanalyse. Diese Technik besteht, bei einem linearen Temperaturanstieg, in der Messung der Differenz der Energie, die der Probe und einer Bezugsprobe zugeführt werden muß, um sie bei einer identischen Temperatur zu halten. Wenn das Kollagen denaturiert, erscheint ein Hitzeabsorptions- Peak auf dem Schreiber. So werden die Temperatur am Anfang der Denaturierung (TD), die Temperatur des Denaturierungs-Peaks (TP) und die Temperatur am Ende der Denaturierung (TF) definiert.

Zur Berechnung eines Prozentsatzes der Vernetzung R von Kollagen wird die folgende Berechnung durchgeführt:

TM: maximale Denaturierungstemperatur, die bei der Vernetzung von Kollagen mit DPPA erhalten werden kann; für den vorliegenden Fall entspricht sie der mit einer DPPA-Konzentration ([DPPA]) von 0,75 % erhaltenen.

TI: Denaturierungstemperatur, die am unbehandelten Gewebe erhalten wird.

TX: Denaturierungstemperatur, die am Gewebe mit einer DPPA- Konzentration von X erhalten wird.

R ist der Prozentsatz der Vernetzung, berechnet ausgehend von TP, der Temperatur des Denaturierungs-Peaks, und wird RTP genannt. Die Entwicklung von RTP als Funktion von log([DPPA]x1000) ist in Fig.2 angegeben. So bestimmen die Erfinder, daß zwischen 0,0125 % und 0,50 % die Entwicklung von RTP als Funktion von log([DPPA]x1000) linear ist, und ausgehend von 0,5 bis 0,75 % eine maximale und konstante Vernetzung ungeachtet der DPPA-Konzentration erhalten wird.

Beim Vergleich der Denaturierungstemperatur, die mit 0,75 % oder 0,5 % DPPA erhalten wird, mit jener,- die mit dem in der FR-A-8 710 317 vorgeschlagenen Verfahren erhalten wird, und mit jener bei 0,6 % GTA (klassische Behandlung von Klappenbioprothesen) wird festgestellt, daß die Werte nicht signifikant unterschiedlich sind (Tabelle I).

B. Einfluß der DPPA-Konzentration auf die Vernetzung des Kollagenfilms

Der Einfluß der DPPA-Konzentration auf den Vernetzungsgrad des Kollagenfilms wurde untersucht. Zu diesem Zweck wird der Film in DPPA-Lösungen mit zwischen 0,125 % und 1,0 % (V/V) variierenden Konzentrationen inkubiert.

Wie mit dem Kälber-Perikard wurde die Entwicklung von RTP als Funktion log([DPPA]x1000) (Fig.3) berechnet. Dies ergab, daß zwischen 0,0125 % und 0,10 % die Entwicklung von RTP als Funktion von log([DPPA]x1000) linear ist. Eine maximale Vernetzung wird mit DPPA-Konzentrationen zwischen 0,25 % und 0,5 % erhalten.

Beim Vergleich der Denaturierungstemperatur, die mit 0,15 % oder 0,5 % DPPA erhalten wird, mit jener, die mit dem in der FR-A-8 710 317 vorgeschlagenen Verfahren erhalten wird, und jener bei 0,6 % GTA (klassische Behandlung bei Klappenbioprothesen) wird festgestellt, daß diese Werte nicht signifikant unterschiedlich sind (Tabelle I).

C. Bestimmung von DPPA nach Vernetzung des Perikards

Zur Bestimmung des DPPA-Verbleibs nach Vernetzung wird eine DPPA-Analyse mit Hilfe seiner Phosphor-Gruppe durchgeführt.

Zunächst wird Phosphor auf mit DPPA bei verschiedenen Konzentrationen behandeltem Material bestimmt, ohne daß eine Spülung durchgeführt wird. Das behandelte Material wird einfach in einem Ofen bei 110ºC getrocknet. Die Phosphor-Analyse wird durch Plasmaemissionsspektrometrie nach Mineralisierung mit einer Lösung von Perchlor- und Salpetersäure (2/3 und 1/3 VIV) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in % Phosphor in bezug auf die Masse an Trockengewebe ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Anschließend wird Phosphor auf mit DPPA bei Konzentrationen von 0,5 % und 1,0 % behandeltem Material nach dem Spülen des Gewebes entweder allein in Borat-Puffer oder in DMF, dann Borat- Puffer, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle I Vergleich der Denaturierungstemperaturen von Kälber-Perikard oder Kollagenfilm, behandelt mit GTA, Acylaziden gemäß dem Verfahren der FR-A-8 710 317, DPPA oder unbehandelt
Denaturierungstemperatur, ºC frisches Perikard Perikard mit Azid unbehandelter Film Film mit Azid
Tabelle II Prozentsatz verbleibender Phosphor, der direkt nach Behandlung von Perikard mit DPPA bei Konzentrationen von 0 % bis 1,5 % bestimmt wurde. Nach DPPA-Behandlung wurde keine Spülung durchgeführt.
Phosphor
Tabelle III Bestimmung von verbleibendem Phosphor nach Behandlung von Penkard mit DPPA bei Konzentrationen von 1,0 % bis 0,5 %. Die Menge an Phosphor, bestimmt nach 3 Spülungen des Gewebes in Borat, bei einer Konzentration von 0,5 % ist nicht von jener verschieden, die für ein Gewebe, inkubiert in DMF ohne Vernetzungsmittel, bestimmt wurde (siehe Tabelle II).
DPPA-Konzentration DMF-Spülungen 3 Borat-Spülungen

Es ist ersichtlich, daß mit einer DPPA-Konzentration von 0,5 % der verbleibende Phosphor, sogar nach nur 3 Spülungen mit Borat-Puffer, äquivalent zu jenem ist, der bei einem Perikard, inkubiert in DMF ohne Vernetzungsmittel, festgestellt wird (0,09 % bzw. 0,1 %).

Daher ist es klar, daß das Vernetzungsmittel im Gewebe nach der Vernetzung nicht vorhanden bleibt. So ist dieses neue Verfahren völlig innovativ. Es ermöglicht, wie das in der FR-A- 8 710 317 vorgeschlagene Verfahren, eine Vernetzung von Kollagen ohne die definitive Einführung eines Vernetzungsmittels, und außerdem findet es industriell erleichterte Verwendung.

Selbstverständlich umfaßt die Erfindung alle Mittel, die aquivalente Techniken zu den beschriebenen Mittel darstellen, sowie ihre verschiedenen Kombinationen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Vernetzung von Kollagen, welches die Bildung von Amid-Bindungen mit Hilfe von Acylazid-Gruppen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß Kollagen mit Diphenylphosphorylazid (DPPA) umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Umsetzen mit DPPA in einem nicht-wässerigen Lösungsmittelmedium stattfindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-wässerige Lösungsmittel Dimethylformamid ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DPPA-Konzentration zwischen 0,0125 % und 1,5 % V/V, vorzugsweise zwischen 0,25 und 0,70 %, beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Inkubation bei einer Temperatur zwischen 0 und 10ºC, vorzugsweise bei ungefähr 4ºC, durchgeführt wird, wobei die Dauer der Inkubation vorzugsweise zwischen einige Stunden bis 1 Tag, vorzugsweise ungefähr 1 Tag, beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Umsetzen mit DPPA zumindest eine Spülung zur Eliminierung von DPPA durchgeführt und dann Acylazid-Gruppen umfassendes Kollagen in eine Borat-Pufferlösung eingebracht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Inkubation bei einer Temperatur zwischen 0 und 10 4ºC, vorzugsweise bei ungefähr 4ºC, in Borat-Puffer durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Borat-Puffer einen pH von ungefähr 8,9 aufweist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das als Ausgangsmaterial verwendete Kollagen in Form eines Geis, Films oder natürlichen Gewebes, beispielsweise Perikard oder Gefäßtransplantat, Schwamms, Schlauchs oder einer Kollagenfaser vorliegt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangs-Kollagen ein natürliches Gewebe ist, das nach Vernetzung mit DPPA in einer Ethanol-Lösung bei 70º konserviert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Vernetzung von Kollagen mit DPPA eine Sterilisation, beispielsweise eine Sterilisation eines Kollagenfilms mit Gamma-Strahlen, durchgeführt wird.







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