PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE68927525T2 12.06.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0330344
Titel Verfahren zur Vernetzung von Collagen mit chemischen photo-aktivierbaren Vernetzungsmitteln. Anwendungen der so vernetzten Collagen oder Aminosäure enthaltenden Polymere.
Anmelder Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, Calif., US
Erfinder Nesburn, Anthony Bart, Malibu California 90265, US;
Gorin, Michael, Rockville Maryland 20852, US;
Martinez, Marvin, Hacienda Heights California 91745, US;
Kenney, Maria Cristina, Malibu California 90265, US;
Maguen, Ezra, Los Angeles California 90064, US
Vertreter LOUIS, PÖHLAU, LOHRENTZ & SEGETH, 90409 Nürnberg
DE-Aktenzeichen 68927525
Vertragsstaaten DE, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 09.02.1989
EP-Aktenzeichen 893012492
EP-Offenlegungsdatum 30.08.1989
EP date of grant 11.12.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.06.1997
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse A61L 25/00   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Aminosäure enthaltenden Polymeren, die durch photoaktivierbare chemische Vernetzungsmittel vernetzt wurden, die mit den Polymeren kombiniert wurden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur molekularen Vernetzung von Collagen durch photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel, die mit Collagen kombiniert wurden. Nach einer Photoaktivierung vernetzen reaktive Gruppen an diesen bifunktionellen Reagenzien das Collagen durch Bildung von Brücken zwischen Aminosäure-Seitenketten an dem Collagen- Molekül.

Hintergrund der Erfindung

Chemische Vernetzungsmittel sind zum Studium der molekularen Organisation von Zellmembranen und für das Verständnis des Weges, auf dem verschiedene Moleküle miteinander an der inneren oder äusseren Oberfläche der Membran wechseiwirken, verwendet worden (Peters, K., Richards, F.M., Ann. Rev. Biochem. 46:523-51, 1979). Proteinstruktur-Untersuchungen unter Verwendung chemischer Vernetzungen begannen während er 5oiger Jahre mit den Arbeiten von Zahn (Angew. Chem. 67:561-572, 1955; Makromol. Chem. 18:201-216, 1955; Makromol. Chem. 72:126-152, 1958) und wurden in den 60iger Jahren hauptsächlich mit den Arbeiten von Wold und seinen Kollegen (J. Biol. Chem. 263:106-111, 1961) fortgesetzt. Ferner wurden Vernetzungsmittel verwendet um Gewebe künstlich zu vernetzen und zu stabilisieren (Nimni, M., Biorheology 17:5182, 1980).

Bei Vernetzungstechniken für die oben diskutieren Membransystem-Untersuchungen wurden biofunktionelle Reagenzien verwendet, die entweder als homo- oder heterobifunktionell klassifiziert wurden. Homobifunktionelle Reagenzien besitzen zwei identische reaktive Stellen. Heterobifunktionelle Reagenzien tragen zwei verschiedene Bindungsstellen, eine lichtempfindliche und eine herkömmliche Stelle. Im allgemeinen wirken beide Arten von bifunktionellen Reagenzien zur Bildung chemischer Vernetzungen durch Einführung von Brücken zwischen Aminosäureketten.

Die Verwendbarkeit der homobifunktionellen Reagenzien als Vernetzungsmittel bei Membran-Untersuchungen war aufgrund verschiedener inherenter Probleme, einschliesslich zufälliger Kollisions-Vernetzungen, langer Reaktionszeit, Schwierigkeiten bei der Steuerung der Reaktionen und unselektiven Vernetzungen, beschränkt. Zufällige kollisionsabhängige Vernetzungen können bei einer signifikanten Frequenz auftreten, da Moleküle während zufälliger Kollisionen in fluiden Membranen nicht spezifisch vernetzen. Eine derartige willkürliche Bildung von Vernetzungen kann in einer grossen Vielzahl von vernetzten Produkten resultieren, die schwierig zu analysieren sind. Es ist daher möglich, dass vernetzte Produkte in geringer Ausbeute unbemerkt blieben. Diese Vernetzungen durch zufällige Kollisionen wurden in einigen Membränsystemen mit der Verwendung von lichtempfindlichen schnellvernetzenden Reagenzien vermieden (Ji, T.H., Biochimica et Biophysical Acta, 559:39-69, 1979).

Im Gegensatz dazu können Vernetzungen mit lichtempfindlichen, heterobifunktionellen Reagenzien leicht, schnell und sequentiell gesteuert werden. Vernetzungen mit heterobifunktionellen Reagenzien werden durch Binden der konventionellen Stelle an dem Reagenz an einer Aminogruppe über eine Amidbindung, und Ungebundenlassen der photoaktivierbaren Stelle bewirkt. Nach Photoaktivierung durch die Verwendung von ultravioletter oder sichtbarer Bestrahlung wird die photoaktivierbare Stelle in eine Spezies sehr hoher chemischer Reaktivität umgewandelt, die dann eine kovalente Verbindung mit einer weiteren Aminogruppe bildet.

Die Absorption von ultravioletter oder sichtbarer Strahlung durch das bifunktionelle Reagenz kann zu zwei allgemeinen Klassen von Spezies führen, die durch die Spaltung chemischer Bindungen erzeugt werden. Die Fragmentierung kann entweder an einer Einfachbindung, resultierend in der Bildung von zwei freien Radikalen, oder an einer Doppelbindung zu Kohlenstoff oder Stickstoff erfolgen. Zwei Arten von lichtempfindlichen Gruppen sind bekannt, die aus der Spaltung einer Doppelbindung zu Kohlenstoff oder Stickstoff resultieren: Ein Azid-Derivat und ein Diazo- Derivat. Nitrene werden aus Aziden erzeugt und Carbene nach der Photolyse von Diazo-Derivaten. Beides, Nitrene und Carbene, sind Verbindungen von sehr hoher chemischer Reaktivität

Ein herkömmliches, für die Photoaktivierung heterobifunktioneller Verbindungen verwendetes Verfahren ist das Bestrahlen mit einer kurzwelligen Ultraviolett- Lampe, z.B. timineral light" USV-11. Die Halbzeit der Photolyse varriert mit dieser Art Lampe. in Abhängigkeit von den Reagenzien und liegt in der Grössenordnung von 10 bis 50 Sekunden. Ein alternatives Verfahren, das mehrere Vorteile aufweist, ist die Blitzphotolyse für eine extrem kurze Dauer, normalerweise in der Grössenordnung von Millisekunden.

Collagen ist das einzige am meisten verbreitete tierische Protein. Es ist der strukturelle Hauptbestandteil von Säugetiergeweben und steht für ungefähr 30 % sämtlicher Säugetier-Proteine (Nimni, M., Biorheology, 17:51-82, 1980). Die molekulare Struktur von Collagen besteht aus drei ineinander verwundenen, helixartigen Polypeptidketten, ungefähr 1.050 Reste lang, die zur Bildung einer Dreifach Helix umeinander herumgewunden sind.

Es besteht eine grosse Einheitlichkeit in der Aminosäuren- Zusammensetzung von Collagen. Glycin bildet ungefähr 33 % und Prolin und Hydroxyprolin bilden ungefähr 25 % der Gesamtmenge der Reste in den Polypeptidketten. Prolin und Hydroxyprolin tragen dadurch zu der Starrheit des Moleküls bei, dass das beta C mit dem Peptid-Stickstoff über die Seitenkette verbunden ist, wodurch ein fünfgliederiger Ring gebildet wird, wodurch relativ wenig Rotationsfreiheit gewährt wird. Es ist dieser Verriegelungseffekt durch Prolin- und Hydroxyprolin-Reste und die Wasserstoffbrücken- Bildung durch die Hydroxyl-Gruppe von Hydroxyprolin, die Collagen seine grosse Stabilität verleihen. Die anderen Aminosäurereste in der Struktur schliessen 10 % Alanin und 20 % polare Seitenketten von Arginin, Lysin, Aspargin und Glycin ein. Diese spielen keine besonders wichtige Rolle in der Dreifach-Helix, sind aber nichts destotrotz wichtig bei den intermolekularen Verknüpfungen, die zur Faserbildung führen.

Das Vernetzen der Collagen-Moleküle erfolgt extra-zellulär und führt zur Bildung der Collagenfaser. Diese charakteristische Faser-Organisation ist verantwortlich für die funktionale Integrität von Geweben wie Knochen, Knorpel, Haut und Sehnen und für die strukturelle Vollständigkeit von Blutgeweben und den meisten Organen. Beides, intra- und intermolekulare Vernetzungen in Collagenen, sind von Lysin- und Hydroxylysin-Resten abgeleitet. Intramolekulare Vernetzungen werden gebildet, wenn spezielle Lysin- und Hydroxylysin-Reste in Collagen oxidativ zu peptidgebundenen Aldehyden deaminiert werden. Kupfer, ein Co-Faktor des Enzyms Lysil-Oxidase, bewirkt das Auftreten dieser Modifikation. Die tatsächliche Bildung der Vernetzungen erfolgt über eine Aldol-Kondensation, einer spontanen nicht-enzymatischen Reaktion, bei der die Lysine, die nahe den terminalen Endbereichen lokalisiert sind, zu Aldehyden umgewandelt werden. Intermolekulare Vernetzungen werden zwischen peptidgebundenen Aldehyden und nichtmodifizierten Aminogruppen anderer Lysin- und Hydroxylysin- Reste gebildet. Dieses sind vernetzungen von der Art Schiff'scher Basen, ansonsten als Aldamin-Vernetzungen (Aldehyd- und Amino-Gruppe) bekannt. Diese Art von Vernetzung wird auch als die physiologisch wichtigste betrachtet.

Die Vernetzung von Collagen ist eine Voraussetzung, damit die Collagenfasern den physikalischen Beanspruchungen widerstehen, denen sie ausgesetzt sind. In früheren Untersuchungen ist von chemischen Agenzien, insbesondere von Glutaraldehyd, herausgefunden worden, dass sie Anwendung für die Biosynthese intramolekularer und intermolekularer Vernetzungen besitzen. Künstliches Vernetzen von Collagen mit Glutaraldehyd ist industriell zur Stabilisierung von Schweineherzklappen verwendet worden, die dann beim Austausch künstlicher Klappen verwendet wurden (Nimni, M., Biorheology, 17:51-82, 1980). Das Collagen wird bei diesem Verfahren mit 25 % Glutaraldehyd (industriell) bei einem neutralen pH vernetzt. Die genaue Glutaraldehyd-Chemie der Vernetzung ist nicht klar, aber es werden zwei Schiff'sche Basen- Verbindungen von Glutaraldehyd mit zwei Lysin-Resten gebildet.

Viele Untersuchungen sind zur Entwicklung einer Substanz, entweder natürlich oder synthetisch, durchgeführt worden, die als nicht-traumatische Mittel zur Unterstützung der Reparatur von Geweben nach chirurgischen Eingriffen eingesetzt werden können. Das Hauptinteresse an der chirurgischen verwendung von polymeren Haftmaterialien begann in den frühen 60igern (Silverstone et al., Arch. Surg. 81:98, 1962). Die anfängliche Arbeit war auf wasserlösliche Systeme, wie Kasein und Polyvinylalkohol, beschränkt, wurde aber später auf alle erhältlichen synthetischen Haftmittel und andere Kunststoffe ausgeweitet. Die Anstrengungen an diesem Punkt waren auf Materialien mit keiner bekannten lokalen oder allgemeinen Toxizität beschränkt. Die Bemühungen von 1962 von Silverstone und seinen Kollegen waren mehr auf eine breitere Anwendung von Verbindungstechniken in der Arterien-Chirurgie gerichtet. Zusätzlich zu der Verstärkung von zur Resektion ungeeigneten Aneurysmen schlossen die beabsichtigten Verwendungen Verstärkungen von Verbindungen nach arteriellen Nähten und nahtloser Anastomose kleiner Arterien ein.

Obwohl andere Materialien untersucht worden sind, sind die meistverwendeten der Gewebehaftmittel die Cyanoacrylate. Diese sind eine homologe Reihe organischer Moleküle, die polymerisieren und an den meisten lebenden Geweben haften. Methyl-alpha-cyanoacrylat (MAC) ist insbesondere seit 1960 von vielen Forschern als ein Gewebehaftmittel zum nahtfreien Verbinden von Knochen verwendet worden. MCA ist ein flüssiges, monomeres Material, das unter geringem Druck innerhalb von Sekunden unter Erzeugung eines dünnen, festen, anhaftenden Films polymerisiert. Obwohl von MCA gezeigt wurde, dass es histotoxisch ist, zeigten Arbeiten mit höheren Homologen der n-alkyl-alpha-cyanoacrylate, dass, wenn man die homologe Reihe hinaufgeht, sich diese Histotoxizität verringert.

Die toxischen Effekte synthetischer Polymere auf Gewebe beziehen sich teilweise auf ihre Abbauprodukte und auf die Geschwindigkeit, bei der sie freigesetzt werden. Sämtliche Polycyanoacrylate werden in wässrigem Medium gemäss demselben Mechanismus abgebaut - der Spaltung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Hauptkette des Polymers und der letztendlichen Freisetzung von Formaldehyd und anderen Abbauprodukten. Dieser Abbaumechanismus ist im wesentlichen derselbe für sämtliche Alkylcyanoacrylate, obwohl die Geschwindigkeit recht unterschiedlich ist und von der Natur des Radikals abhängt.

Es ist berichtet worden, dass die geringer toxischen höheren Homologe der Cyanoacrylate spontan auf Gewebesubstraten polymerisieren und dadurch wirksamer beim Induzieren von Homeostase sind. Spontane Polymerisation ist jedoch ein Nachteil bei chirurgischen Anwendungen, wo die Bindung zweier Oberflächen aneinander gefordert ist, oder beim Anheften geschnittener Oberflächen eines Organs. In diesen Fällen wird eine ausreichende Arbeitszeit benötigt, um die Oberflächen der Gewebe vor dem Eintreten der Haftung anzunähen.

Zur Anpassung dieser chirurgischen Erfordernisse sind diese Verfahren zur Anwendung von Gewebehaftmitteln untersucht worden (Matsumoto, T., Tissue Adhesives Insurgent, Med. Exam. Pub. Co., N.Y. 1972). Gewebehaftmittel wurden unter Verwendung einer Sprühpistole oder eines Tropfenverfahrens angewendet. Die Polymerisation des Haftmittels erfolgte schneller, wenn dieses durch Sprühen aufgebracht wurde. Die Unterschiede in den Polymerisationsraten wurden durch die Tatsache erklärt, dass die Monomere beim Sprühen einen sich ausbreitenden Film bildeten, was dem Initiator eine grössere Oberfläche zur Verfügung stellt und dadurch eine grössere Polymerisationsrate ergab.

In vielen chirurgischen Verfahren besitzt das oben diskutierte Sprühverfahren einen deutlichen Vorteil, weil es nicht möglich ist, das Monomer einheitlich und in einem dünnen Film mit dem Tropfenverfahren aufzubringen. Sprühen hat jedoch einen Nachteil, der darin liegt, dass das Monomer schneller polymerisiert und eine schnellere Arbeit des Chirurgen erfordert. Die Vorteile von und der Bedarf für ein Haftmittel, bei dem der Chirurg die Polymerisationsrate steuern kann, ist daher offensichtlich.

Zusätzlich, obwohl die Berichte darauf hindeuten, dass Cyanoacrylat-Gewebehaftmittel Vorteile bieten, wenn sie zur Reparatur oder Homeostase verletzter Organe verwendet werden, ist bekannt, dass die Anwesenheit des Polymerfragments zwischen der eingeschnittenen Haut die Wundheilung verzögert. Dies ist der Fall, weil die Polymerfragmente die Proliferation von Fibroblasten und mikrozirkulatorischen Gefässen, die die verwundeten Oberflächen überbrücken, verhindern. Durchgeführte Studien, die die Zugfestigkeit von durch Nähte verschlossenen Wunden gegenüber denen durch Cyanoacrylat-Haftmittel verschlossenen verglichen haben, haben gezeigt, dass das Haftmittel für lange Zeiträume in dem Gewebe verbleibt und maximale Wundfestigkeit später als bei Nahtschlüssen erhalten wird.

Die Anwendung von Cyanoacrylat-Haftmitteln in ophthalmologischen Verfahren wurde 1963 eingeführt (Bloomfield, 5. et al., Amer. J. Ophthal., 55:752-748, 1963). Da die Beibehaltung einer empfindlichen metabolischen und Druckbalance innerhalb des Auges wesentlich für dessen optische und elektrophysiologische Funktion ist und von der Vollständigkeit der äusseren Schicht abhängt, war in der Ophthalmologie immer eine beträchtliche Aufmerksamkeit auf Verfahren zur Reparatur eines jeden Prozesses gerichtet, der die Cornea oder Sclera unterbricht. Frühere Erfahrungen mit Cyanoacrylat- Haftmitteln im Auge waren nicht besonders ermutigend. Von Methyl-2-Cyanoacrylaten wurde gefunden, dass sie eine geeignete Bindungsstärke besitzen, aber sie erwiesen sich als zu toxisch.

Über das letzte Jahrhundert sind eine Anzahl anderer Substanzen als die Cyanoacrylate zum Aufkleben eines Gewebes auf ein anderes vorgeschlagen worden, aber, genau wie mit den Cyanoacrylaten, erscheint keines vollständig erfolgreich gewesen zu sein.

Vernetzte Gelantine sind führende Wettbewerber mit den Cyanoacrylaten hinsichtlich der Aufmerksamkeit und dem Interesse von Forschern, die auf dem Gebiete von Gewebe- Biohaftmitteln arbeiten. Gelantine ist ein natürlich vorkommendes tierisches Protein mit angeborenen Hafteigenschaften. Die Molekulargewichte von Gelantine reichen von 30.000 bis 120.000 und chemisch ist es etwas dem Bindegewebe ähnlich. 1965 berichteten Braunwald und Tatooles (Surgery, 19:460, 1946) über die erfolgreiche Verwendung von vernetzter Gelantine zur Kontrolle der Blutungen aus Wunden der Leber und der Niere bei Hunden. Noch später beschrieben Bonchek und Braunwald (Ann. Surg., 164:420, 1967) auch die Verwendung von vernetzter Gelantine bei der Behandlung von Schnitten bei Hunden. Das Hauptproblem mit Gelantine als Biohaftmittel ist jedoch, dass sie sehr stark einem enzymatischem Abbau unterliegt.

Andere Substanzen mit gewissen Hafteigenschaften sind verwendet worden, um bei der schnellen und guten Heilung von okularen Wunden zu helfen. Parry und Laszlo berichteten über die Verwendung von Thrombin für ein schnelles und wirksames Versiegeln von Augenbindehautwunden bei cornealen scleralen Einschnitten bei der Katarakt-Chirurgie (Brit. J. Ophthal., 30:176-178, 1946). Town verwendete Fibrin bei Katarakt, Glaukom und traumatischer plastischer Chirurgie und bei der Keratoplastik (Trans. Amer. Acad. Ophthal. Otolaryng., 54:131-133, 1949). Young and Favata stellen aber heraus, dass Thrombin eine geringere Zugfestigkeit verleiht als gewöhnliche Nahtmaterialien (War. Med., 6:80- 85, 1944).

Ein weiteres Haftmittel, das untersucht wurde, ist Fibrinseal (FS), das ein natürliches Haftmaterial ist und aus Fibrinogen, Faktor VIII, Plättchenwachstumsfaktor, Anti-Plasmin-Thrombin und Kalziumchlorid zusammengesetzt ist. FS ist bei der Vaskular-Chirurgie zur Beschränkung des Blutverlustes und der Minimierung der Anzahl von Gefässtrauma und Fremdkörperreaktionen durch Herabsetzen der Anzahl von Stichen, die zum Erreichen einer technisch befriedigenden Arterial-Anastomose notwendig sind, verwendet worden. FS bewirkt jedoch früh in der postoperativen Phase einen Erhöhung der Menge von lymphocytischem Infiltrat in Proben. Wie die Autoren zugeben, sind ausführliche Untersuchungen zur Festlegung seiner Rolle und seiner Nachteile im Gange (Ikeossi- O'Connor, M.G., Journal of Surgical Oncology, 23:151-152, 1983).

Ein menschlicher Fibrinkleber ist bei der Oral-Chirurgie verwendet worden (Bull. Group. int. Rech. sc. Stomat. et Odont., 27:171-180, 1984). Die Substanz ist aus zwei Komponenten hergestellt. Eine ist hochkonzentriertes Fibrinogen und Faktor VIII zusammen mit anderen Plasmaproteinen, wie Albumin und Globulin. Die zweite Komponente ist eine Lösung von Thrombin und Kalziumchlorid, einem katalytischen Agenz. Der Faktor VIII induziert dem im Bindegewebe vorliegenden Collagen die Polymerisation mit dem Fibrin, wobei eine Brücke zwischen Collagen und Fibrin gebildet wird. Einige bekannte Nachteile dieses Fibrinklebers sind, dass er einmal hergestellt, innerhalb einer kurzen Zeit verwendet werden muss (so dass der Chirurg über Genauigkeit und Geschwindigkeit beim Operieren verfügen muss) sowie die mögliche Übertragung von Heptatitis und AIDS Viren.

Die vorstehende Diskussion beschreibt die Bemühungen zur Verwendung einer Vielzahl von Substanzen von sowohl natürlicher als auch künstlicher Herkunft als Gewebehaftmittel. Keine dieser Bemühungen war vollständig erfolgreich. Es verbleibt immer noch sowohl ein Bedarf an, als auch ein Wunsch für ein Gewebehaftmittel, das einfach und praktisch in der Anwendung ist, das nicht toxisch ist, das die Wundheilung nicht verzögert, das leicht und harmlos adsorbiert und auf normalen metabolischen Wegen eliminiert wird sobald es seinem Zweck gedient hat, und das keine carcinogene oder irgendwelche anderen schädlichen, potentiellen Langzeitprobleme aufweist.

Das folgende ist eine Liste der gewünschten Kriterien für Biohaftmittel, wobei eine oder mehrere derselben nicht durch Materialien aus dem Stand der Technik erfüllt wurden.

1. Leichte Anwendbarkeit.

2. Steuerung er Polymerisation.

3. Flexibilität der resultierenden Bindung.

4. Bindungs stärke.

5. Transparenz.

6. Niedrige Toxizität.

7. Bioabbaubarkeit.

Zusammenfassung der Erfindung

Die praktische Implementation der oben beschriebenen Verfahren hatte mit vielen Problemen zu kämpfen. Im Gegensatz zu der vorherigen Übung haben wir jedoch unerwarteterweise herausgefunden, dass die Verwendung von photoaktivierbaren Vernetzungsmitteln kombiniert mit Aminosäure enthaltenden Polymeren nach der Photoaktivierung ein hochmolekulares, vernetztes Produkt hervorbringt.

Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Vernetzung von Collagen mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel zur Bildung eines hochmolekularen, vernetzten Produktes zur in vivo Anwendung bereitgestellt, wobei das Vernetzungsmittel eine photoaktivierbare Stelle und eine herkömmliche Stelle besitzt, wobei bei dem Verfahren das Collagen mit dem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel so kombiniert wird, dass die herkömmliche Stelle des Vernetzungsmittels an ein Collagenmolekül gebunden ist und die andere, photoaktivierbare Stelle an dem Vernetzungsmittel gebunden ist, so dass, nach Photoaktivierung, Vernetzungen gebildet werden, wenn die photoaktivierte Stelle des Vernetzungsmittels an ein anderes Collagenmolekül bindet. Die Erfindung schliesst molekularvernetztes Collagen ein, das durch dieses Verfahren erhältlich ist, wobei das photoaktivierte heterobifunktionelle Vernetzungsmittel in DMSO gelöst ist.

Die Erfindung stellt auch ein molekularvernetztes Collagen bereit, bei dem die Collagen-Moleküle durch ein photoaktiviertes heterobifunktionelles Vernetzungsmittel miteinander vernetzt sind.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Aminosäure enthaltendes Polymer zur Verwendung als Biohaftmittel bereitgestellt, bevorzugt Collagen, das mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel kombiniert ist, so dass die herkömmliche Stelle des Vernetzungsmittels an ein Polymer-Molekül gebunden ist und die andere, photoaktivierbare Stelle des Vernetzungsmittels ungebunden ist, so dass nach Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn die photoaktivierte Stelle des Vernetzungsmittels an ein anderes Aminosäure enthaltendes Polymer bindet.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung als Material für Kontaktlinsen, Feuchtbandagen-Kontaktlinsenmaterial (moist bandage contact lens material), Linsen- oder Hornhaut-Implantationsmaterial für die kosmetische, plastische Chirurgie, Auskleidungsmaterial für künstliche Gelenke oder einen Mechanismus zur Freisetzung von Medikamenten aus einem Aminosäure enthaltenden Polymer, bevorzugt Collagen, das mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel vernetzt ist, wobei das Vernetzungsmittel eine photoaktivierbare Stelle oder eine herkömmliche Stelle besitzt, erhalten durch Kombinieren des Aminsoäure enthaltenden Polymers mit dem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel, so dass die herkömmliche Stelle des Vernetzungsmittels an ein Polymer- Molekül gebunden ist und die andere, photoaktivierbare Stelle an dem Vernetzungsmittel ungebunden ist, so dass nach einer Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn die photoaktivierte Stelle an dem Vernetzungsmittel an ein anderes, Aminosäure enthaltendes Polymer-Molekül bindet.

Erfindungsgemäss vernetztes Collagen kann als Biohaftmittel für nahtloses Schliessen des Auges oder irgendeiner anderen Wunde am Körper oder als superhydriertes Material für Kontaktlinsen, Feuchtbandagen-Kontaktlinsenmaterial (moist bandage contact lens material), Linsen- oder Hornhaut- Implantationsmaterial, einen feuchten Okklusionsverband, Transplantationspflaster, Implantationsmaterial zum Ersatz von Silicon in der kosmetischen, plastischen Chirurgie, Auskleidungsmaterial für künstliche Gelenke oder als Mechanismus zur Freisetzung von Medikamenten verwendet werden.

Ausserdem wird gewürdigt, dass dieses Verfahren gleichermasen auf das Binden Aminosäure enthaltender Polymere zu anderen Polymeren oder anorganischen Materialien verwendet werden kann. Potentielle klinische Anwendungen dieser Technik Schliessen das sichere Zementieren prosthetischer Vorrichtungen an ihrem Platz und das Einschliessen von Collagen-Zentren in Kontaktlinsen ein.

Die folgende Beschreibung ist hauptsächlich auf die Vernetzung von Collagen gerichtet, die Erfindung ist aber, in dem Fall der Verwendung als Biohaftmittel oder als Material für Kontaktlinsen, Feuchtbandagen- Kontaktlinsenmaterial (moist bandage contact lens material), Linsen oder Hornhaut-Implantationsmaterial, einem feuchten Okklusionsverband, Transplantationspflaster, Implantationsmaterial bei der kosmetischen, plastischen Chirurgie, Auskleidungsmaterial für künstliche Gelenke oder Mechanismus zur Freisetzung von Medikamenten, nicht auf dieses Material beschränkt.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird vernetztes Collagen hergestellt, das als Biohaftmittel verwendbar ist. Gewebehaftmittel sind in der Vergangenheit verwendet worden, sie leiden aber unter verschiedenen Problemen einschliesslich denen der Toxizität und schlechter Biokompatibilität. Unser Haftmittel ist andererseits nicht toxisch und biokompatibel, da es aus Collagen hergestellt ist, dem hauptsächlichen Struktur-Bestandteil von Säugetier-Geweben. Weiterhin befriedigt das Material alle erwünschten Kriterien für Biohaftmittel, die oben aufgeführt sind, wobei dies die Leichtigkeit der Anwendung, die Fähigkeit zur Steuerung der Polymerisation, die Flexibilität der resultierenden Bindung, hohe Bindungsstärke, Transparenz, niedrige Toxizität und Bioabbaubarkeit einschliesst.

In dieser Ausführungsform wird bearbeitetes, gereinigtes Collagen mit photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln gemischt. Die herkömmliche Stelle an dem Vernetzungsmittel bindet an die Aminosäure-Gruppen der Collagen-Moleküle, wobei die andere, photoaktivierbare Stelle ungebunden belassen wird. Diese Mischung wird dann auf das Gewebe aufgebracht. Mit entsprechender Photoaktivierung binden die photoaktivierten Stellen des Vernetzungsmittels an die Aminosäure-Gruppen von Collagen in der Mischung und dem Collagen in der Hornhaut, Haut und anderen Organen. Ein nahtioses Wundverschlussmaterial wird somit hergestellt.

Wie oben diskutiert, ist die Steuerung der Polymerisations- Rate von bisher bekannten Biohaftmitteln schwierig gewesen. Schnelle Polymerisation erzeugt Probleme für den Chirurgen, der schnell arbeiten muss, bevor das Haftmittel "abbindet". Unser Haftmaterial kann jedoch auf die Hornhaut oder andere Teile des Körpers aufgebracht werden und, sobald die Gewebe in der geeigneten Position sind, es können spezielle Wellenlängen des Lichtes zur endgültigen Aktivierung verwendet werden, wodurch das Haftmittel vernetzt wird oder abbindet.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine unerwartete, superhydrierte Form von Collagen produziert, die in vielen Bereichen der Medizin anwendbar ist. Collagen und andere hydrierte Substanzen tendieren aufgrund von Verdampfen zu einem sehr schnellen Austrocknen. Dieses Austrocknen verändert die Eigenschaften der Collagen- Materials. Erfindungsgemäss sind die molekularen Vernetzungen von Collagen-Molekülen eine ideale Matrix zum Einschliessen von Wasser, was einen extrem hohen Wassergehalt und dessen Beibehaltung ermöglicht.

Superhydriertes Collagen, das erfindungsgemäss hergestellt wurde, ist ein extrem wichtiges Kontaktlinsen-Material. Derzeit dehydrieren weiche Kontaktlinsen während sie sich auf dem menschlichen Auge befinden. Sie werden unbequem und verändern ihre Passform aufgrund dieses Wasserverlustes. Unser Material, verwendet als weiche Kontaktlisen, stellt eine extrem komfortable Kontaktlinse bereit, die kein Wasser verliert.

Wir schlagen weiterhin vor, dass die intraokulare Linse als ein superhydriertes Linsen-Implantationsmaterial, bei dem Wasser in dessen Zwischenräumen gebunden ist, Arzneimittel nicht in dem Ausmasse adsorbieren wie intraokulare Hydrogel-Linsen, die derzeit verwendet werden. Diese Eigenschaft der niedrigen Adsorption ist ein wichtiger Vorteil unseres Materials.

Unser hochvernetztes Collagen ist auch für plastische Chirurgen überaus nützlich, die derzeit Silicon für die Implantations-Chirurgie verwenden und Collagen zur Eliminierung von Falten unter die Haut injizieren, das nicht hochvernetzt ist. Das derzeit bei diesen Verfahren verwendete schwachvernetzte Collagen muss periodisch reinjiziert werden, weil es einem Abbau unterliegt. Das erfindungsgemässe hochvernetzte Collagen widersteht einem Abbau und kann als semipermanentes oder permanentes Implantat- oder Injektions-Material von plastischen Chirurgen zur Verwendung bei der rekonstruktiven und kosmetischen Chirurgie eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäss hergestellte superhydrierte Collagengel kann eingeschlossen ein niedrigschmelzendes Agarosegel enthalten, das eine Arzneimittel-Mischung enthält. Das Collagen kann dann auf dem Gewebe plaziert werden, wobei sich das niedrigschmelzende Agaraosegel auflöst und somit das gebundene Arzneimittel in einem speziellen Zielgebiet des Körpers freisetzt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Bis heute sind, basierend auf ihren strukturellen Unterschieden, zehn Arten von Collagen identifiziert worden. Collagen-Typ 1 ist in der Hornhaut am häufigsten vertreten und besitzt das niedrigste Antigenizitäts- Vorkommen.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Vernetzungsverfahrens benützen zwei kommerziell erhältliche zubereitungen dieses Collagen-Typ I - Vitrogen 100 (oder anders "Atelocollagen") und "Rat Tail" Typ I. Vitrogen 100 ist ein gereinigtes, pepsin-gelöstes bovines Hautcollagen, hergestellt durch Collagen Corp.. Bei diesem Collagen ist das für die Antigenizität des Collagen-Moleküls verantwortliche Telopeptid enzymatisch gespalten worden. "Rat Tail" Typ I ist ein nicht pepsin-behandeltes Collagen, hergestellt durch Collaborative Research, Inc..

Die erfindungsgemäss verwendete Konzentration von Collagen variiert in Abhängigkeit der beabsichtigten Verwendung des vernetzten Produktes. Der Bereich kann von 2,5 mg/ml bis 10 mg/ml variieren. Diese Konzentrationen der Collagen- Zubereitung können durch zwei gut bekannte Verfahren erzielt werden: durch Dialysieren des Collagens gegen Acetatpuffer bei pH 5 oder durch Lyophilisieren bekannter Mengen von Collagen und anschliesendem Resuspendieren des Collagens in schwachen Säuren, die 0,012 N HCL oder CH&sub3;COOH.

Der pH der Collagen-Zubereitung kann vor der Verwendung in einem Bereich von pH 2,0 bis zu der gepufferten Zubereitung, wie durch Harry S. Geggel et al. eingeführt ("Collagen Gel for Ocular Surf ace", Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, 1984), bei einem physiologischen pH von 7,4 liegen.

Vernetzungsmittel werden dann zu der Collagen-Zubereitung gegeben. Die Vernetzungs-Verfahren unserer Erfindung verwenden heterobifunktionelle Reagenzien, die reaktive Gruppen enthalten, welche eine Brücke zwischen Aminosäure- Seitenketten des Collagen-Moleküls bilden. Bifunktionelle Vernetzungsmittel, die erfindungsgemäss verwendet werden können, können Diazo-Verbindungen oder ein Aryl- oder Alkyl-Azid sein. Sie können 4-Azidobenzoesäure-N- Hydroxisuccinimid-Ester (HSAB) und 6-(4-Azido-2- Nitrophenyl-Amino)Hexansäure-N-Hydroxisuccinimid-Ester (SANAH) einschliesen, sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Vernetzungsmittel sind von der Sigma, Corp. erhältlich.

Dem erfindungsgemässen Verfahren einzigartig ist die Tatsache, dass, während ein Ende des bifunktionellen Reagenz peptid-ähnliche Bindungen mit den Aminosäure- Seitenketten des Collagens bildet, das andere Ende bis zur Photoaktivierung durch kurzwelliges ultraviolettes Licht ungebunden verbleibt. Dieses Ende wird dann in eine hochreaktive Verbindung, "Nitren" oder "Carben" genannt, umgewandelt, die wiederum mit einer Aminsoäure-Seitenkette von entweder Collagen-Molekülen des Gewebes und/oder Collagen in der Zubereitung Bindungen knüpft.

Die Konzentration der erfindungsgemäss verwendeten Vernetzungsmittel-Mischungen können zwischen 5 mM und 25 mM, gelöst in einem biologisch kompatiblen Lösungsmittel, wie DMSO, variieren. Die Konzentration des Lösungsmittels ist allgemein nicht kleiner als 50 % oder die Reagenzien beginnen sich abzuscheiden. Die optimale Konzentration des Vernetzungsmittels ist 10 mM, wie durch Lauf von (photoaktivierter) Collagen-Reagenzmischung auf Tris-Borat- Gelen ermittelt wurde.

Die Photoaktivierung der Reagenzien kann mit einer Wellenlänge im bereich von 220 Nanometern (nm) bis 310 nm erreicht werden. Die optimale Adsorptions-Wellenlänge ist ungefähr 265 nm mit einer Photoaktivierungszeit, die 20 Minuten nicht überschreitet. Die Dauer der Photoaktivierung variiert jedoch in Abhängigkeit des verwendeten Vernetzungsmittels.

Die Vernetzungseffizienz unseres Reagenz hängt stark von der Anzahl der verfügbaren Aminosäure-Seitenketten ab. Darüberhinaus kann ein Überschuss an Vernetzungsmittel den Vernetzungsprozess aufgrund potentieller competitiver Bindungen und innerer Umlagerungen behindern. Dies bedeutet, dass die aktiven Stellen des über eine peptidähnlichen Bindungsprozess an Amino-Seitenketten gebundenen Reagenz auf competitive Art durch dieses freie Reagenz gebunden werden können. Um dieses Auftreten zu vermeiden, soll die vor-photoaktivierte Mischung von Collagen und Vernetzungsmittel über eine Sephadex G-25 Säule gegeben werden. Die Fraktionen können dann gesammelt und bei 260 bis 320 nm durch ein Spektrophotometer zur Bestimmung von Peak-Collagen-Reagenz fraktionen gegeben werden. Die gesammelten Fraktionen können dann vereinigt werden und sind dann bereit für die Photoaktivierung.

Gemäss einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Vernetzen von Collagen mit photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln bereitgestellt, wobei die Vernetzungsmittel eine photoaktivierbare Stelle besitzen und eine herkömmliche Stelle, und dass das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Herstellen einer 9 mg/ml Konzentration von Collagen-Molekülen bei pH 7,2.

(b) Auflösen des photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittels in DMSO, so dass die Konzentration des Vernetzungsmittels 10 mM beträgt.

(c) Vereinigen der Collagen-Mischung mit den photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln, so dass die herkömmliche Stelle des Vernetzungsmittels an das Collagen-Molekül gebunden wird und die andere, photoaktivierbare Stelle des Vernetzungsmittels ungebunden ist, so dass nach Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn die photoaktivierbare Stelle des Vernetzungsmittels an ein weiteres Collagen-Molekül bindet.

(d) Säulen der vor-photoaktivierten Kombination von Collagen und Vernetzungsmittel in Schritt (c) über eine Sephadex G-25 Säule, so dass ungebundenes Vernetzungsmittel entfernt wird.

(e) Sammeln der Fraktionen von der Sephadex G-25 Säule nach Schritt (d) und Untersuchen der Fraktionen mit einem Spektrophotometer bei 260 bis 320 nml so dass die den Peaks entsprechenden Collagen Vernetzungsmittel-Fraktionen gesammelt werden können.

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Ausführung der Erfindung weiter zu erläutern und nicht zu irgendeiner Beschränkung des Rahmens der Erfindung.

Beispiel I - Verfahren für gepufferte Collagen-Zubereitungen

a. Unter Verwendung von R. Thoft ("Collagen Gel for Ocular Surface", Investig. Ophth. & Vis. Science) wird kaltes (4 ºC) 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; in gleichem Volumen mit 1,3 M NaCl, auch bei derselben Temperatur, gemischt. Dann wird ein gleiches Volumen 0,1 M NaOH zu der Pufferlösung gegeben.

b. Es werden acht Mal (8 x) eines äquivalenten Volumens von Vitrogen zu der Pufferlösung gegeben.

c. Es wird eine kalte Phenolrot-Lösung (5 mg / 100 ml) zugegeben, wenn pH Indikator benötigt wird.

Anmerkung: Die Collagen-Konzentration in der endgültigen Zubereitung kann nicht geringer als 1,45 mg/l sein.

Beispiel II - Verfahren zum Vernetzen von Collagen

a. Unter Verwendung des Verfahrens von H. Geggel und R. Thoft (Investig. Ophth. & Visual Sciences, 1984) werden vereinigte Fraktionen einer gepufferten Collagen- Reagenzmischung entweder in sterile 35 mm Petrischalen gegeben oder auf Polymethyl-Methacrylat (PMMA) Basen, die auf eine bestimmte Wölbung und Tiefe gedreht wurden. Vorvernetzte Gelmischungen werden bei 4 ºC gehalten, bis sie zur Vorbehandlung und Photoaktivierung bereit sind.

b. Die Schalen oder Basen werden dann bei 37 ºC mit 5 % CO&sub2;, 95 % Luft für 15 Minuten in einen wasserummantelten Gewebekultur-Inkubator gegeben.

c. Die Schalen oder Basen werden dann durch Photoaktivierung mit einem kurzwelligen UV-Licht (mineral light 254 nm, UV-Lampe Modell UVGL-25) für 15 bis 25 Minuten vernetzt.

Beispiel III - Verfahren zum Vernetzen von Collagen

a. Gesammelte Fraktionen gepufferter Collagen-Reagenzien von Sephadex-Säulen werden in sterile 35 mm Petrischalen oder PMMA-Basen gegeben und bei 4 ºC gehalten, bis sie bereit zur Verwendung sind.

b. Unter Verwendung des Verfahrens von T. Elsdale und T. Bard, J. (Cell Biol., 54:626-637, 1972) wuren die Schalen oder Basen für zwischen 3 und 30 Minuten, abhängig vom gewünschten Steifheitsgrad, in einer Ammonium-Hydroxid-Kammer plaziert.

c. Die Gele wurden dann zum Erzielen einer Vernetzung für 15 bis 20 Minuten photoaktiviert.

Beispiel IV - Waschen und Lagerung der Vernetzten Gele

a. Die Gele werden von den Petrischalen und PMMA-Basen entfernt und zweimal mit destilliertem H&sub2;O gewaschen.

b. Die Gele werden auf einer Glasplatte plaziert und es wird ein 6 oder 8 mm Trephin zum Ausstechen runder Gele verwendet, die in einzelne Reagenzgläser gegeben werden, welche 10 ml Phosphat-Pulver enthalten.

c. Für 4 bis 6 Stunden wird ein frischer Puffer alle 60 Minuten ersetzt.

d. Die Gele werden in einer ausgewogenen Salzlösung oder 0,9 % Natrium-Chlorid gelagert.

Anmerkung: Kontinuierliches intensives Waschen kann in PBS, BSS, NaCl (Bewässerung) oder destilliertem H&sub2;O vorgenommen werden.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Vernetzen von Collagen mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel zur Bildung eines hochmolekular vernetzten Produkts zur Anwendung in vivo, wobei das Vernetzungsmittel einen photoaktivierbaren Bereich und einen herkömmlichen Bereich besitzt und in dem Verfahren das Collagen mit dem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel so kombiniert wird, daß der herkömmliche Bereich des Vernetzungsmittels an ein Collagenmolekül gebunden ist und der andere, photoaktivierbare Bereich des Vernetzungsmittels, ungebunden ist, so daß nach Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn der photoaktivierte Bereich des Vernetzungsmittels an ein weiteres Collagenmolekül bindet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Collagen ein Atelocollagen (z. B. Vitrogen 100) oder Rat Tail Typ I ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentration des Collagens zwischen 2,5 mg/ml bis 10 mg/ml liegt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Konzentration durch Dialysieren des Collagens gegen einen Acetatpuffer bei pH 5 oder durch Lyophilisieren bekannter Mengen des Collagens und anschließendem Resuspendierenden in 0,012 NHCl oder CH&sub3;COOH erreicht wird.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH der Collagenzubereitung in dem Bereich zwischen 2,0 und 7,4 liegt.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel eine Diazoverbindung oder ein Aryl- oder Alkylazid ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel 4-Azidobenzoesäure-N- Hydroxisuccinimid-Ester (HSAB) oder 6-(4-Azido-2-Nitrophenyl- Amino)Hexansäure-N-Hydroxisuccinimid-Ester (SANAH) ist.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel in einem biologisch verträglichen Lösungsmittel gelöst ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Lsungsmittel DMSO ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Konzentration von DMSO nicht geringer als 50 % ist.

11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittels zwischen 5 mM und 25 InM beträgt.

12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Photoaktivierung mit einer Wellenlänge von 220 Nanometern (nm) bis 310 nm erreicht wird, mit einer optimalen Absorptionswellenlänge von ungefähr 265 nm und mit einer Photoaktivierungszeit, die 20 Minuten nicht überschreitet.

13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zuvor photoaktivierte Kombination von Collagen und Vernetzungsmittel über eine Sephadex G-25 Säule gegeben wird, um ungebundenes Vernetzungsmittel zu entfernen.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die von der Sephadex G-25 Säule gesammelten Fraktionen durch ein Spectrophotometer bei 260-320 nm gegeben werden, um die Peakfraktionen der Collagenreagenzien zu bestimmen und zu sammeln.

15. Verfahren zum Vernetzen von Collagen mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel, wobei das Vernetzungsmittel einen photoaktivierbaren Bereich und einen herkömmlichen Bereich besitzt, und das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Herstellen einer Konzentration von Collagenmolekülen von 9 mg/ml bei pH 7,2,

(b) Auflösen des photoaktivierbaren, heterofunktionellen Vernetzungsmittels in DMSO, so daß die Konzentration des Vernetzungsmittels 10 mM beträgt,

(c) Vereinigen der Collagenmischung mit dem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel, so daß der herkömmliche Bereich des Vernetzungsmittels an ein Collagenmolekül gebunden wird und der andere, photoaktivierbare Bereich des Vernetzungsmittels, ungebunden ist, so daß nach Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn der photoaktivierte Bereich des Vernetzungsmittels an ein weiteres Collagenmolekül bindet,

(d) Säulen der zuvor photoaktivierten Kombination von Collagen und Vernetzungsmittel in Schritt (c) über eine Sephadex G-25 Säule, so daß ungebundenes Vernetzungsmittel enf emt wird,

(e) Sammeln der Fraktionen von der Sephadex G-25 Säule nach Schritt (d) und untersuchen mit einem Spectrophotometer bei 260-320 nm, so daß die den Peaks entsprechenden Collagen- Vernetzungsmittel-Fraktionen gesammelt werden können.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem nach Photoaktivierung ein superhydriertes, vernetztes Collagen gebildet wird.

17. Molekular vernetztes Collagen, bei dem die Collagenmoleküle durch ein weiteres photoaktiviertes, heterobifunktionelles Vernetzungsmittel miteinander vernetzt sind.

18. Molekular vernetztes Collagen, erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das photoaktivierte, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel in DMSO gelöst ist.

19. Ein eine Aminosäure enthaltendes Polymer, das mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel kombiniert ist, so daß der herkömmliche Bereich des Vernetzungsmittels an ein Polymermolekül gebunden ist und der andere, photoaktivierbare Bereich, des Vernetzungsmittels ungebunden ist, so daß nach Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn der photoaktivierte Bereich des Vernetzungsmittels an ein weiteres Polymermolekül bindet, das eine Aminosäure enthält, zur Verwendung als Biohaftmittel.

20. Polymer gemäß Anspruch 19, wobei das Aminosäure enthaltende Polymer Collagen ist.

21. Polymer gemß Anspruch 20, wobei das Collagen ein Atelocollagen oder ein Rat Tail Typ I-Collagen ist.

22. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Konzentration des Aminosäure enthaltenden Polymers zwischen 2,5 mg/ml und 10 mg/ml liegt.

23. Polymer gemäß Anspruch 22, wobei die Konzentration durch Dialysieren des Polymers gegen Acetatpuffer bei pH 5 oder durch Lyosilisieren bekannter Mengen des Polymers und anschließendem Resuspendieren in 0,012 N HCl oder CH&sub3;COOH erreicht wird.

24. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei der pH der Aminosäure enthaltenden Polymerzubereitung in dem Bereich zwischen 2,0 und 7,4 liegt.

25. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei das photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel eine Diazoverbindung oder ein Aryl- oder Alkyl-Azid ist.

26. Polymer gemäß Anspruch 25, wobei das photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel 4-Azidobenzoesäure-N- Hydroxisuccinimid-Ester (HSAB) oder 6-(4-Azido-2-Nitrophenyl- Amino)Hexansäure-N-Hydroxisuccinimid-Ester (SANAH) ist.

27. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei das Vernetzungsmittel in einem biologisch verträglichen Lösungsmittel gelöst ist.

28. Polymer gemäß Anspruch 27, wobei das Lösungsmittel DMSO ist.

29. Polymer gemäß Anspruch 28, wobei die Konzentration von DMSO nicht weniger als 50 % beträgt.

30. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 29, wobei die Konzentration des photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittels zwischen 5 mM und 25 mM beträgt.

31. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 30, wobei die Photoaktivierung mit einer Wellenlänge im Bereich von 220 Nanometern (nm) bis 310 nm mit einer optimalen Wellenlängenabsorption von ungefähr 265 nm mit einer Photoaktivierungszeit, die 20 Minuten nicht überschreitet, erreichbar ist.

32. Polymer gemäß einem der Ansprüche 19 bis 31, wobei die zuvor photoaktivierte Kombination von Polymer und Vernetzungsmittel über eine Sephadex G-25 Säule zum Entfernen von nicht gebundenem Vernetzungsmittel gegeben wird.

33. Verwendung als Material für Kontaktlinsen, Feuchtbandagen- Kontaktlinsenmaterial (moist bandage contact lens material), Linsen- oder Hornhautimplantationsmaterial, einen feuchten Okklusionsverband, Transplantationspflaster, Implantationsmaterial für kosmetische, plastische Chirurgie, Auskleidungsmaterial für künstliche Gelenke oder einen Mechanismus zur Freisetzung von Medikamenten, aus einem eine Aminosäure enthaltendem Polymer, das mit einem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel vernetzt ist, das Vernetzungsmittel einen photoaktivierbaren Bereich und einen herkömmlichen Bereich besitzt und durch Kombinieren des Aminosäure enthaltenden Polymers mit dem photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittel erhalten wurde, so daß der herkömmliche Bereich an dem Vernetzungsmittel an ein Polymermolekül gebunden ist und der andere, photoaktivierbare Bereich an dem Vernetzungsmittel ungebunden ist, so daß nach einer Photoaktivierung Vernetzungen gebildet werden, wenn der photoaktivierte Bereich an dem Vernetzungsmittel an ein anderes, Aminosäure enthaltendes Polymermolekül bindet.

34. Verwendung gemäß Anspruch 33, wobei das Aminosäure enthaltende Polymer collagen ist.

35. Verwendung gemäß Anspruch 34, wobei das Collagen ein Atelocollagen oder ein Collagen vom Rat Tail Typ I ist.

36. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei die Konzentration des Aminosäure enthaltenden Polymers zwischen 2,5 mg/ml bis 10 mg/ml beträgt.

37. Verwendung gemäß Anspruch 36, wobei die Konzentration durch Dialysieren des Polymers gegen einen Acetatpuffer bei pH 5 oder durch Lyophilisieren bekannter Mengen des Polymers und anschließendem resuspendieren in 0,012 NHCl oder CH&sub3;COOH erreicht wird.

38. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei der pH der Aminosäure enthaltenden Polymerzubereitung in dem Bereich zwischen 2,0 und 7,4 liegt.

39. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 38, wobei das photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel eine Diazoverbindung oder ein Aryl- oder Alkylazid ist.

40. Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei das photoaktivierbare, heterobifunktionelle Vernetzungsmittel 4-Azidobenzoesäure-N- Hydroxisuccinimid-Ester (HSAB) oder 6-(4-Azido-2-Nitrophenyl- Amino)Hexansäure-N-Hydroxisuccinimid-Ester (SANAH) ist.

41. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 40, wobei das Vernetzungsmittel in einem biologisch verträglichen Lösungsmittel gelöst ist.

42. Verwendung gemäß Anspruch 41, wobei das Lösungsmittel DMSO ist.

43. Verwendung gemäß Anspruch 42, wobei die Konzentration von DMSO nicht geringer als 50 % ist.

44. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 43, wobei die Konzentration des photoaktivierbaren, heterobifunktionellen Vernetzungsmittels zwischen 5 mM und 25 mM beträgt.

45. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 44, wobei die Photoaktivierung in einem wellenlängenbereich von 220 Nanometern (nm) bis 310 nm erreicht wird, mit einem Absorptionsoptimum der Wellenlänge von ungefähr 265 nm mit einer Photoaktivierungszeit, die 20 Minuten nicht überschreitet.

46. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 45, wobei die zuvor photoaktivierte Kombination von Polymer und Vernetzungsmittel über eine Sephadex G-25 Säule gegeben wird, um ungebundenes Vernetzungsmittel zu entfernen.

47. Verwendung gemäß Anspruch 46, wobei die von der Sephadex G-25 Säule gesammelten Fraktionen durch ein Spectrophotometer 260- 320 nm gegeben werden, um die Peakfraktionen des Collagenreagenzes zu bestimmen und zu sammeln.

48. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 47, wobei nach Photoaktivierung ein superhydriertes, vernetztes, Aminosäure enthaltendes Polymer gebildet wird.

49. Verwendung eines molekular vernetzten, Aminosäure enthaltenden Polymers, wie in Anspruch 17 oder 18 beansprucht, als ein Material für Kontaktlinsen, Feuchtbandagen-Kontaktlinsenmaterial (moist bandage contact lens material), Linsen- oder Hornhautimplantationsmaterial, eine feuchte Okklusionsbandage, für Transplantationspflaster, Implantationsmaterial bei der kosmetischen, plastischen Chirurgie, Material zur Auskleidung von künstlichen Gelenken oder einen Freisetzungsmechanismus für Medikamente.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com