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Dokumentenidentifikation DE69125854T2 23.10.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0594592
Titel WACHSTUMSFAKTOR IN VERBINDUNG MIT KÜNSTLICHEN TRANSPLANTATEN
Anmelder Strid, Lars, Göteborg, SE
Erfinder Strid, Lars, Göteborg, SE
Vertreter PAe Reinhard, Skuhra, Weise & Partner, 80801 München
DE-Aktenzeichen 69125854
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 04.02.1991
EP-Aktenzeichen 919045336
WO-Anmeldetag 04.02.1991
PCT-Aktenzeichen SE9100079
WO-Veröffentlichungsnummer 9112014
WO-Veröffentlichungsdatum 22.08.1991
EP-Offenlegungsdatum 04.05.1994
EP date of grant 23.04.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.10.1997
IPC-Hauptklasse A61K 38/06
IPC-Nebenklasse A61L 27/00   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Für die Erfindung wird die biologische Aktivität des Kupfer- Komplexes des Tripeptids Glycyl-L-Histidyl-L-Lysin ausgenutzt. Dieses Peptid wird kovalent an künstliche Implantate gebunden, wo es eine chemisch anziehende Wirkung hat und auch wirkt, wenn es durch Hydrolyse aus den Implantaten freigesetzt wird. Das Peptid erhöht die Synthese von fibroblastischen Collagen, wodurch ein schnellerer Ersatz der Implantate durch menschliches Gewebe möglich wird.

Hintergrund

Die Entwicklung vielzelliger Organismen ist abhängig von der Fähigkeit der Zellen miteinander und mit ihrer Umgebung zu kommunizieren. Eine Methode, die die Zellen für ihre Kommunikation verwenden, besteht darin, Peptide freizusetzen, die eine spezifische Aktivität in der Empfängerzelle induzieren.

Ein solches Peptid mit biologischer Aktivität ist das kupferbindende Tripeptid Glycyl-L-Histidyl-L-Lysin (GHK-Cu²&spplus;) als menschlicher Plasma-Wachstumsfaktor.

L. Pickart und S. Lovejoy beschreiben die Eigenschaften des Peptids GHK-Cu²&spplus; in Methods in Enzymology, Band 147 (1987), Seiten 314-328, Academic Press. Es spielt eine physiologische Rolle bei der Heilung von Wunden durch Stimulierung des komplexen Verlaufs von Ereignissen, die notwendig sind zur Bildung von neuen Geweben, z.B. der Angiogenese und des Axon und Dendritwachstuns in Neuronen. Das Peptid hat auch eine chemisch anziehende Wirkung auf Zellen, die für die Wundheilung notwendig sind, wie Makrophagen, Monocyten, Mastzellen und Kapillarendothelzellen.

Collagen ist ein faseriges Protein, das ein Viertel der Gesamtmenge an Protein im menschlichen Körper ausmacht. Es ist das Hauptfaserelement von Haut, Knochen, Sehnen, Knorpeln, Bändern und Blutgefäßen. Collagen wird von Fibroblasten synthetisiert, einer Art von Zellen, die in dem Bereich, der andere Zellen und Gewebe umgibt, lokalisiert sind.

In einer Veröffentlichung in FEBS Letters, 238 (1988), 343- 346, zeigen F.-X. Marquart et al. Daten, die zeigen, daß GHK- Cu²&spplus; die Collagensynthese in Kulturen von Fibroblasten stimuliert. Diese Stimulation wird schon bei einer Peptidkonzentration von nur 10&supmin;¹²M beobachtet und erreicht ein Maximum bei 10&supmin;&sup9;M, wo der Anstieg der collagensynthese etwa 80% ist.

In der Europäischen Patentanmeldung 0 190 736 wird GHK-Cu²&spplus; mit einer modifizierten C-terminalen Carboxylgruppe als Salbe für die schnellere Heilung von Wunden verwendet.

GHK-Cu²&spplus; besitzt eine beträchtliche Superoxid-Dismutaseartige Aktivität mit einer Geschwindigkeitskonstante von etwa 25% der Aktivität von enzymatischer Cu,Zn-Superoxid-Dismutase auf molarer Basis. Wenn Wunden und beschädigtes Gewebe vorhanden sind, wandern Zellen aus dem Immunsystem in den verletzten Bereich und große Mengen an toxischen Sauerstoffradikalen werden freigesetzt, um eindringende Bakterien zu töten. Diese Radikale zerstören auch intaktes Gewebe, womit ein Circulus vitiosus beginnt, bei dem mehr Radikale freigesetzt werden, was die Heilung verzögert. Die GHK-Cu²&spplus; -Superoxid- Dismutase-Aktivität entgiftet die das Gewebe zerstörenden Peroxid-Anionen.

Eine Anhäufung von Blutplättchen ist die erste Stufe der Thrombose. GHK-Cu²&spplus; hemmt diese Ansammlung und hemmt auch das Hormon Thromboxan, das eine Thrombose verursacht.

Die Struktur des Tripeptids GHK-Cu²&spplus; ist in Figur 1 gezeigt. Die Affinität des Peptids für Kupfer ist sehr hoch mit einem pK für die Dissoziationskonstante von etwa 16. Für die biologische Aktivität muß die ε-Aminogruppe in der Seitenkette des Lysins frei sein.

Technisches Problem

Die Verwendung von künstlichen Materialien in der Chirurgie steigt nach und nach an. In der orthopädischen Chirurgie werden Implantate für Weichteile, wie Muskeln, Sehnen und Bänder verwendet. Im Fall von Bändern wurden als bevorzugtes Material Polypropylenbänder verwendet, die unglücklicherweise nicht abbaubar sind und die Ergebnisse waren in der langzeitigen Erprobung ungünstig. Wenn abbaubares Material verwendet wird, um Bänder zu ersetzen, ist es von höchster Wichtigkeit, daß dieses Material biologisch kompatibel ist. Polymere von Milchsäure und Glykolsäure werden zu nicht-toxischen Produkten abgebaut, die das lebende Gewebe toleriert. Im menschlichen Körper werden sie zu ihren Monomeren hydrolysiert. Milchsäure wird zu Kohlendioxid und Wasser im Zitronensäurecyclus metabolisiert, während Glykolsäure mit dem Urin ausgeschieden wird oder zu Pyruvat oxidiert wird und auch im Zitronensäurecyclus metabolisiert wird, was zu den gleichen Produkten, wie für Milchsäure, führt. Diese harmlosen Produkte sind sehr vorteilhaft verglichen mit den Hydrolyseprodukten vieler anderer Polymere. Polymere von Milchsäure und Glykolsäure werden seit langem für resorbierbares Nahtmaterial verwendet. Wenn dieses Material für künstliche Bänder verwendet wird, besteht das Hauptproblem darin, daß es so schnell hydrolysiert wird, daß der Körper nicht genug Zeit hat, um es durch eigenes Gewebe zu ersetzen, bei denen Collagen den Hauptteil bildet. Die schnelle Hydrolyse könnte kompensiert werden, wenn man die Rate der Collagensynthese erhöhen könnte.

Lösung

Die vorliegende Erfindung besteht darin, daß das Material, das für Implantate verwendet wird, den Kupferkompex des Tripeptids Glycyl-L-Histidyl-L-Lysin GHK-Cu²&spplus; beinhaltet. Wie in Figur 1 zu sehen ist, ist die C-terminale Carboxylgruppe nicht an der Kupferbindung beteiligt und aus diesem Grund ist sie für eine kovalente Bindung des Peptids an Implantate geeignet

Mit der wohlbekannten Peptidsynthese wird die freie Carboxylgruppe des Peptids an ein Polymer gekuppelt, das freie primäre Aminogruppen enthält, oder an ein Polymer, das so modifiziert werden kann, das es freie Aminogruppen enthält. Da das Peptid eine maximale Aktivität bei einer Konzentration von nur 10&supmin;&sup9;M hat, wo es die Fibroblastensynthese von Collagen fast verdoppelt, ist es voll ausreichend, daß ein Peptidmolekül an ein Polymermolekül mit einem Molekulargewicht von 500.000 gekuppelt wird.

Wegen der chemischen Anziehung werden, wenn das Peptid GHK- Cu²&spplus; durch Hydrolyse aus dem Implantat in das Gewebe freigesetzt wird, sehr spezifische biologische Prozesse in Gang gesetzt, die viele eng miteinander verbundene Reaktionen betreffen, die im Gleichgewicht sein müssen, damit eine Heilung eintritt. Dies schließt eine Erhöhung der Collagensynthese, ein Ansteigen der das Gewebe schützenden Superoxid- Dismutase-Aktivität und eine chemisch anziehende Wirkung unter anderem auf Mastzellen und Kapillarendothelzellen ein, die sich an der Implantatstelle ansammeln, wo sie die Bildung neuer Blutgefäße und die Ernährung des Gebietes stimulieren.

Beste Durchführungsform der Erfindung Beispiel 1

Die freie Carboxylgruppe der Poly-L-Milchsäure wird aktiviert mit Carbodiimid und dann mit einem Überschuß eines Diamins NH&sub2;(CH&sub2;)nNH&sub2;, worin n 2 bis 6 ist, abhängig von der Länge des gewünschten Spacerarms, reagieren gelassen. Das Carbodiimid ist Dicyclohexylcarbodiimid, wenn die Reaktion in organischer Lösung durchgeführt wird, oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, wenn die Reaktion in wäßriger Lösung durchgeführt wird.

Die Aminogruppe des Glycins, die Imidazolgruppe des Histidins und die ε-Aminogruppe des Lysins des Tripeptids NH&sub2;-Glycyl-L- Histidyl-L-Lysin-COOH wird mit 9-Fluorenylmethylchlorformiat (FMOC-Cl) blockiert. Die freie Carboxylgruppe des Lysins wird mit Carbodiimid, wie oben beschrieben, aktiviert und mit der freien Aminogruppe des Derivats der Poly-L-Milchsäure [Poly- L-Milchsäure-C-NH-(CH&sub2;)n-NH2] umgesetzt.

Nach der Entfernung der FMOC-Schutzgruppen mit Piperidin und der Zugabe von Kupfer(II)acetat wird das gewünschte Produkt erhalten, dessen Struktur in Figur 2 gezeigt ist. In dieser Figur wurde das Diamin NH&sub2;(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2; verwendet. Die gleichen Synthesemethoden gelten auch für Poly-DL-Milchsäure, Poly-D- Milchsäure, Poly-Glykolsäure und deren Copolymere.

In dem obigen Verfahren wurde FMOC als Blockierungsgruppe verwendet. Ein anderes Blockierungsmittel ist die tert.- Butoxycarbonylgruppe (t-BOC-). Die Abspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese wird in diesem Fall mit verdünnter Säure (25% Trifluoressigsäure) durchgeführt.

Das Peptid Glycyl-L-Histidyl-L-Lysin ist im Handel erhältlich.

Weitere Beispiele

Ein anderer Weg der Synthese erfolgt über die gewöhnliche Peptidsynthese, wobei an der Aminogruppe blockiertes L-Lysin, L-Histidin und Glycin nacheinander mit dem Aminoderivat des Polymers gekuppelt werden.

Milchsäure und Glykolsäure sind a-Hydroxycarbonsäuren. Eine Anzahl anderer cx-Hydroxycarbonsäuren sind für die Homo- oder Copolymerisation geeignet. Beispiele sind α-Hydroxybuttersäure, α-Hydroxyisobuttersäure, α-Hydroxyvaleriansäure, α- Hydroxyisovaleriansäure. Um die Menge an Peptiden pro Polymermolekül zu erhöhen, kann man die Poly-α-hydroxycarbonsäure vorsichtig hydrolysieren, um die Zahl der verfügbaren Carboxylgruppen zu erhöhen.

Von den β-Hydroxycarbonsäuren wurden D-β-Hydroxybuttersäure als Polymer für Implantate verwendet (Britisches Patent 1034123).

Ein Polymer auf Basis von p-Dioxanon wurde auch als Implantat verwendet. Dies hat die Formel

worin R und RV Wasserstoff, Methyl- oder Ethylgruppen bedeuten und n der Polymerisationsgrad ist.

Synthetische, biologisch abbaubare Polyesteramide wurden von T.H. Barrows et al., 3M-Center, St.Paul, Minnesota, USA, beschrieben.

Diese Polymere bestehen aus Einheiten der Formel

All diese Polymere können kovalent mit GHK-Cu²+ mit den oben beschriebenen Methoden gekuppelt werden.

Eine weitere Methode besteht darin, GHK-Cu²&spplus; mit anderen biologisch kompatiblen Materilien kovalent zu kuppeln, die resorbiert werden oder nicht, die eine Aminogruppe enthalten oder eine Stelle enthalten, an der eine Aminogruppe eingeführt werden kann. Z.B. kann Glas oder Kieselsäure mit 3- Aminopropyl-triethoxysilon silyliert werden. In diesem Fall könnte eine große Anzahl von GHK-Cu²&spplus;-Molekülen an Glas gebunden werden.

Glas

Wenn Metallimplantate hergestellt werden sollen, kann die Oberfläche zuerst mit einem Protein überzogen werden, z.B. Serumalbumin, und die Aminogruppen können dann mit Glutardialdehyd überbrückt werden. Nach Einführung neuer Aminogruppen kann GHK-Cu²&spplus; an das Protein gebunden werden.

Figur 1 zeigt die dreidimensionale Struktur von GHK-Cu²&spplus;. Die Seitenketten von Lysin und Histidin und die endständige Aminogruppe von Glycin sind für die Kupferbindung und für die biologische Aktivität notwendig. Eines der Wasserstoffatome des α-Kohlenstoffs in dem Glycin kann gegen einen anderen Rest ausgetauscht werden, ohne die Konformation des Kupferkomplexes zu stören. Vorschläge für neue Tripeptide können z.B. Ala-His-Lys, Val-His-Lys oder Leu-His-Lys sein. Ein Vorteil besteht darin, daß man die D-Form der aminoterminalen Aminosäure verwenden kann, was das Peptid resistenter gegenüber einer proteolytischen Hydrolyse macht.

In der praktischen Verwendung der Erfindung kann natürlich verstärkendes Material verwendet werden. Dieses Material kann abbaubar oder nicht abbaubar sein.


Anspruch[de]

1. Künstliches Implantat mit der Fähigkeit, die natürliche Collagensynthese zu erhöhen, dadurch gekennzeichnet, daß es den Kupferkomplex des Tripeptids Glycyl-L-Hystidyl-L- Lysin enthält, der auf dem Implantat durch eine kovalente Bindung der Carboxylgruppe des Lysins immobilisiert ist.

2. Implantat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Poly-L-Milchsäure, Polyglycolsäure oder einem Copolyrner hiervon besteht, wobei die Carboxylgruppe des Polymers zunächst durch eine Peptidbindung an ein Diamin, bevorzugt 1,6-Hexandiamin, gebunden wurde, und wobei die freie Aminogruppe des Produkts durch eine Peptidbindung an die Carboxylgruppe des Lysins im Kupferkomplex des Tripeptids Glycyl-L-Hystidyl-L-Lysin (GHK-Cu²&spplus;) gebunden wurde.

3. Implantat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Implantate Homo- oder Copolymere der Glycolsäure, Milchsäure, der α-Hydroxy-Derivate der Buttersäure, Isobuttersäure, Valeriansäure und der Isovaleriansäure sind.

4. Implantat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Implantat ein auf p-Dioxanon basierendes Polymer ist, bestehend aus Einheiten mit der Formel

wobei R und R' eine Wasserstoff-, Methyl- oder Ethylgruppe sind und n der Polymerisationsgrad ist.







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