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Dokumentenidentifikation DE69127440T2 02.01.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0524205
Titel LEBENDE VAKZINE
Anmelder The Wellcome Foundation Ltd., Greenford, GB
Erfinder DOUGAN, Gordon Langley Court, Kent BR3 3BS, GB;
CHARLES, Ian, George Langley Court, Kent BR3 3BS, GB;
HORMAECHE, Carlos, Estenio Pathology Dept. Univ., Hills Road Cambridge CB2 2QQ, GB;
JOHNSON, Kevin, Stuart Department of Pathology, Hills Road Cambridge CB2 2QQ, GB;
CHATFIELD, Steven, Neville, Beckenham Kent BR3 3BS, GB
Vertreter HOFFMANN · EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69127440
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 28.03.1991
EP-Aktenzeichen 919064931
WO-Anmeldetag 28.03.1991
PCT-Aktenzeichen GB9100484
WO-Veröffentlichungsnummer 9115572
WO-Veröffentlichungsdatum 17.10.1991
EP-Offenlegungsdatum 27.01.1993
EP date of grant 27.08.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.01.1998
IPC-Hauptklasse C12N 1/21

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft abgeschwächte Mikroorganismen, ihre Verwendung in der Immunprophylaxe beim Tier oder Menschen und sie enthaltende Impfstoffe.

Das der Impfung oder Immunprophylaxe zugrundeliegende Prinzip ist die Induzierung einer Immunantwort in einem Tier gegen einen pathogenen Organismus durch Inokulation mit einem abgeschwächten Stamm des Organismus, wodurch ein Schutz gegen eine nachfolgende Infektion verliehen wird. 1950 zeigten Bacon et al. (Br.J.Exp.Path.31, 714-724), daß bestimmte auxotophe Mutanten von S.typhi in Mäusen im Vergleich zum Ausgangsstamm abgeschwächt waren. Von diesen auxotrophen Mutanten wurden bestimmte als geeignete Kandidaten als Grundlage fur einen Gesamtzellimpfstoff vorgeschlagen. (Siehe z.B. Hosieth und Stocker, Nature, 1981 241, 238-239, und die europäische Patentpublikation 322,237). Zusätzlich zu Mutationen in einem essentiellen auxotrophen Weg wurden andere Loci identifiziert, wo Mutationen zur Abschwächung von Mikroorganismen fuhren. Beispiele solcher Loci schließen Regulons ein, die pleiotrophische Wirkungen ausuben, z.B. das cya/crp-System (Roy Curtiss III et al., Vaccine 6, 155-160, 1988) und das ompR envZ-System (Dorman et al., Infect.Immun. 57, 2136-2140, 1989) und das phoP-System (Fields et al., Science 243, 1059-1062, 1989).

In vielen Organismen werden zwischen einem und zwei Dutzend Proteine als Antwort auf eine Reihe verschiedener Umweltstreßfaktoren, wie z.B. hohe Temperatur, Nahrungsmangel, toxische Sauerstoffradikale und Storungen des Metabolismus produziert. Diese stellen einen Teil der koordinierten Regulation einer Reihe verschiedener Gene dar, die bei der Antwort auf den bestimmten Streßfaktor, dem der Mikroorganismus ausgesetzt ist, induziert werden. Die Familie der Hauptstreßproteine (ebenfalls bekannt als Hitzeschockproteine) gehört zu denen, die in der Natur am höchsten konserviert sind. Es existiert eine wesentliche Homologie unter den Mitgliedern dieser Familie, isoliert aus E.coli, Drosophilia spp. und dem Menschen (fur einen jungsten Überblick siehe Neidhardt, G.C. & Van Bogelen, R.A. (1987) Escherichia coli und Salmonella typhimurjum: Cellular and Molecular Biology. F.C. Neidhart et al., Herausgeber, Seiten 1334-1345. American Society for Microbiology, Washington DC). Zum Beispiel sind Hsp90, Hsp70 und Hsp60 Hitzeschockproteine, die in allen Prokaryonten und Eukaryonten gefunden werden. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen Hsp90 aus E.coli und der aus dem Menschen zeigt, daß ca. die Hälfte der Aminosäurereste identisch sind. Andere Vertreter dieser Streßproteinfamilie sind GrpE, GropEL, DnaK, GroES, Lon und DnaJ.

Die Gene, die die Familie der Hitzeschockproteine codieren, werden durch RNA-Polymerase in Co-Operation mit dem ³²-Faktor, dem Produkt des rpoH-Gens transkribiert (Übersicht von Neidhardt, F.C. und van Bogelen, R.A., 1987. In Escherichia coli und Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, F.C. et al., Herausgeber, Seiten 1334-1345, American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Vor kurzem haben Lipinska et al. (Nucleic. Acids. Res. 1988, 21, 10053-10067) ein Hitzeschockprotein in E.coli mit der Bezeichnung Htra beschrieben, welches ³² unabhängig zu sein scheint. Die Überprüfung der Promotorregion des htrA-Gens zeigt eine DNA-Sequenzhomologie mit dem P.3-Promotor des rpoH- Gens, einem Promotor, von dem man weiß, daß er durch den E ( ²&sup4;)-Faktor erkannt wird. Diese Ähnlichkeit legt nahe, daß der htrA-Promotor auch vom RNA-Polymerase- E ( ²&sup4;)-Holoenyzm erkannt wird.

Phenotypisch steigert eine Mutation im htrA-Locus bei E.coli die Fähigkeit des Bakteriums zum Überleben bei einer Temperatur über 42ºC (Lipinska et al., 1989, J.Bacteriol. 171, 1574-1584). Das Gen kartiert bei 4 min auf dem E.coli-Chromosom und codiert ein Protein mit einer relativen Molekularmasse (Mr) von 51.163. Dieser Proteinvorläufer unterliegt einer N- terminalen Prozessierung, woran die Entfernung einer Signalpeptidsequenz (Lipinska et al, 1988, Nucleic.Acids.Res. 21, 10053-10067) unter Erhalt der reifen Form des Polypeptids nach Sekretion durch die innere Membran des Bakteriums beteiligt ist. Unabhängig davon wurde das htrA-Gen als degP von Strauch, K.L. und Beckwith, J. 1988 (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 1576-1580) identifiziert, die E.coli-Mutanten mit verminderter Protease-Aktivität untersuchten, degP-Mutanten wurden durch TnphoA-Mutagenese isoliert (Manoil, C. & Beckwith, J. 1985, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82, 8129-8133) und wurden durch die erhöhte Stabilität eines rekombinanten Hybrid-Tsr-phoA (Tsr-AP2)-Proteins im degP-Hintergrund (Strauch, KL. und Beckwith, J. 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 1576-1690) erkannt. Die in E.coli als degP und htrA identifizierten Gene scheinen identisch zu sein und codieren für ein Protein, welches ein Mitglied der "Stress-response"-Familie ist.

Die Erfindung stellt einen Impfstoff zur Verfügung, der einen pharmazeutischen Träger und eine wirksame Menge eines durch eine nichtumkehrbare Mutation im htrA-Gen abgeschwächten Bakteriums enthält. Die Erfindung stellt auch ein Bakterium zur Verfügung, das durch eine nichtumkehrbare Mutation im htrA-Gen abgeschwächt wurde, zur Verwendung bei der prophylaktischen Behandlung eines Wirts gegen eine Infektion durch einen Mikroorganismus.

Die Bakterien zur erfindungsgemäßen Verwendung sind vorzugsweise Bakterien, insbesondere Gram-negative Bakterien, die in eukaryontische Zellen eindringen und innerhalb dieser wachsen und die mucosale Oberfläche kolonisieren. Beispiele davon umfassen Vertreter der Gattungen Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus und Escherichia. Insbesondere können die folgenden Arten Erwähnung finden: S.typhi - der Auslöser von Typhus beim Menschen; S.typhimurium - der Auslöser von Salmonellose bei mehreren Tierarten; S.enteritidis - der Auslöser von Lebensmittelvergiftung bei Menschen; S.choleraesuis - der Auslöser von Salmonellose bei Schweinen; Bordetella pertussis - der Auslöser von Keuchhusten; Haemophilus influenzae - der Auslöser von Meningitis und Neisseria gonorrhoeae - der Auslöser von Gonorrhoe. Die Erfindung umfaßt ein Salmonella-Bakterium, das durch eine nicht-umkehrbare Mutation im htrA-Gen abgeschwächt wurde.

Eine nicht-umkehrbare Mutation ist eine, die mit einem einzelnen Schritt nicht wieder beseitigt werden kann. Genetische Mutationen dieser Art umfassen Deletions-, Inversions-, Insertions- und Substitutionsmutationen. Deletionsmutationen können unter Verwendung von Transposons erzeugt werden. Diese sind DNA-Sequenzen, die zwischen 750 bis tausende von Basenpaare enthalten, die sich in die chromosomale DNA des Wirts integrieren können. Die Kontinuität der betreffenden DNA-Sequenz wird daher unter Verlust der Genfunktion unterbrochen. Transposons können aus der chrornosomalen Wirts-DNA deletiert werden; sehr häufig ist die Exzision unpräzise, was zu einer nicht-umkehrbaren Mutation führt. Substitutions- oder Insertionsmutationen können durch Verwendung einer auf einem Vektor getragenen inaktivierten DNA-Sequenz entstehen, die mit der betreffenden DNA-Sequenz in der chromosomalen DNA des Wirts rekombiniert oder einen Cross-over zeigt, mit anschließendem Verlust der Genfunktion.

Die Sequenz des htraA-Gens ist in Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1) (ebenfalls gekennzeichnet als degP) dargelegt.

Zur Verwendung in Form eines Lebend-Impfstoffes ist es ganz klar von Bedeutung, daß das erfindungsgemäß verwendete, abgeschwächte Bakterium nicht zu seinem virulenten Stadium zurückkehrt Die Wahrscheinlichkeit dieses Auftretens mit einer Mutation in einer einzelnen DNA-Sequenz wird als klein angesehen. Jedoch wird das Risiko einer Reversion, die bei einem Bakterium auftritt, welches durch das Vorliegen von Mutationen in jeweils zwei diskreten DNA-Sequenzen abgeschwächt wurde, als unbedeutend angesehen. Es ist daher bevorzugt, daß die Abschwächung des Bakteriums ebenfalls durch Vorliegen einer Mutation in einem zweiten Gen bewirkt wird. Das zweite Gen codiert vorzugsweise ein Enzym, das an einem essentiellen auxotrophen Weg beteiligt ist, oder ist ein Gen, dessen Produkt die Regulation von osmotisch responsiven Genen kontrolliert, d.h. ompR (Infect and Immun 1989 2136-2140). Am meisten bevorzugt liegt die Mutation in einem Gen, das im Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren involviert ist, insbesondere in den Genen, die für aroA, aroC oder aroD codieren (EP-A- 322237).

Die erfindungsgemäß verwendeten Bakterien werden durch Einführung einer Mutation in die DNA-Sequenz nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, konstruiert (Maniatis, Molecular cloning and Laboratory Manual, 1982). Nicht-umkehrbare Mutationen können erzeugt werden durch Einführen eines Hybrid-Transposons TnphoA in z.B. S.Typhimurium-Stämme. TnphoA kann enzymatisch aktive Proteinfusionen von alkalischer Phosphatase an periplasmatische oder Membranproteine erzeugen. Das TnphoA-Transposon trägt ein für Kanamycin-Resistenz codierendes Gen. Transduktante, die Kanamycin resistent sind, werden durch Wachsenlassen von Kolonien auf einem geeigneten Selektionsmedium selektiert.

Alternative Verfahren umfassen die donierung der DNA-Sequenz in einen Vektor, z.B. einen Plasmid oder Cosmid, und Einführen eines selektierbaren Markergens in die donierte DNA-Sequenz, was zu ihrer Inaktivierung führt. Ein Plasmid, welches die inaktivierte DNA-Sequenz und einen unterschiedlichen selektierbaren Marker trägt, kann in das Bakterium nach bekannten Techniken eingeführt werden (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Es ist dann durch geeignete Selektion möglich, eine Mutante zu identifizieren, worin die inaktivierte DNA-Sequenz sich in das Chromosom des Bakteriums rekombiniert hat, und die Wild-Typ DNA-Sequenz in einem als allelischen Austausch bekannten Prozeß nicht funktional gemacht wurde. Insbesondere ist der verwendete Vektor vorzugsweise im Bakterium unstabil und geht spontan verloren. Die mutierte DNA-Sequenz auf dem Plasmid und die Wild-Typ DNA-Sequenz kann durch ein genetisches Crossover-Vorkommnis ausgetauscht werden. Zusätzliche Verfahren eliminieren die Einführung von Fremd-DNA in Impfstoffstämme an der Mutationsstelle.

Ein abgeschwächtes Bakterium kann durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die Einführung einer Mutation in ein htrA-Gen umfaßt, entweder durch

a) Transposon-Mutagenese; oder

b) Transformieren des Bakteriums mit einem Vektor durch Einbau eines htrA-Gens, das eine nicht-umkehrbare Mutation enthält, und Screenen unter Selektion des erwünschten Bakteriums.

Das abgeschwächte Bakterium exprimiert optional ein heterologes Antigen. Diese Expression ist wahrscheinlich auf Grund der erhöhten Stabilität der mit dem degP-Phenotyp assoziierten rekombinanten Antigene in htrA-Mutanten bevorzugt. Solche Antigene können virale, bakterielle, Protozoen- oder höhere parasitäre Mikroorganismen sein. Solche Bakterien können dann die Grundlage für einen bi- oder multi-valenten Impfstoff bilden. Beispiele von geeigneten Antigenen umfassen die hitzelabile E.coli- Toxin Buntereinheit (LT-B), E.coli K88-Antigene, FMDV (Maul- und Klauen-)- Peptide, virale Grippeproteine, P.69-Protein aus B.pertussis. Andere Antigene, die nutzbringend exprimiert werden könnten, wären solche aus Chlamydia, Plattwürmern, Mycoplasma, Rundwürmern, Bandwürmern, Tollwutvirus und Rotavirus.

Ein Bakterium, das eine ein heterologes Antigen codierende DNA exprimiert, kann durch Transformation des Mikroorganismus mit einer Expressionskassette hergestellt werden. Expressionskassetten umfassen DNA- Sequenzen zusätzlich zu der, die für das heterologe Antigen codiert, welche transkriptionale und translationale Initiations- und Terminationssequenzen codieren. Die Expressionskassette kann auch regulatorische Sequenzen umfassen. Solche Expressionskassetten sind im Stand der Technik bekannt und ihre Konstruktion liegt ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns. Die Expressionskassette kann einen Teil eines Vektorkonstrukts oder eines natürlich vorkommenden Plasmids bilden. Ein Beispiel für eine gentechnisch abgeschwächte Salmonella, die zur Expression eines heterologen Antigens in der Lage ist, ist in EP-A-127,153 beschrieben. Die Expressionskassette kann auch gentechnisch hergestellt sein, um den Einbau des heterologen Gens in das Chromosom des Bakteriums zu ermöglichen.

Ein weiterer bivalenter Impfstoff, der ein abgeschwächtes Salmonella typhi enthält, was zur Expression der hitzestabilen E.coli-Enterotoxin- Untereinheit B in der Lage ist, wird von Clements et al. (Infection and Immunity, 46, Nr.2. 1984, 564-569) offenbart. Ty21a, ein abgeschwächter S.typhi-Stamm, wurde zur Expression anderer Antigene, wie dem Shigella sonnei-Form 1-Antigen, verwendet (Formal et al., Infection and Immunity, 34, 746-750, 1981).

Der erfindungsgemäße Impfstoff wird für die orale Verabreichung an einen Patienten vorteilhafterweise in einer lyophilisierten Form angeboten, z.B. in Kapselform. Solche Kapseln können mit einem enterischen Überzug versehen sein, der z.B. Eudragit "S" Eudragit "L", Celluloseacetat, Cellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulose enthält. Diese Kapseln können als solche verwendet werden, oder alternativ kann das lyophilisierte Material vor der Verabreichung rekonstituiert werden, z.B. als eine Suspension. Die Rekonstitution erfolgt vorteilhafterweise in einem Puffer bei einem geeigneten pH, um die Lebensfähigkeit des Organismus sicherzustellen. Zum Schutz der abgeschwächten Bakterien und des Impfstoffes vor der Säure im Magensaft wird eine Natriumbicarbonat- Präparation vorteilhafterweise vor jeder Verabreichung des Impfstoffes gegeben. Alternativ kann der Impfstoff durch parenterale Verabreichung, intranasale Verabreichung oder durch Verabreichung in die Brust hergestellt werden.

Ein Wirt (insbesondere ein menschlicher Wirt) kann prophylaktisch gegen eine Infektion behandelt werden, die durch einen Mikroorganismus verursacht wird, durch Verabreichung einer wirksamen Dosis eines erfindungsgemäßen Impfstoffes an den Wirt. Die in einem solchen Behandlungsverfahren eingesetzte Dosis hängt von verschiedenen klinischen Faktoren ab, einschließlich der Größe und dem Gewicht des Wirts, und dem Typ des formulierten Impfstoffes. Jedoch ist im allgemeinen für abgeschwächtes S.typhi eine Dosis, umfassend die Verabreichung von 10&sup9; bis 10¹¹ S.typhi-Organismen pro Dosis für einen erwachsenen menschlichen Wirt von 70 kg allgemein üblich.

Die folgenden Beispiele liefern experimentelle Einzelheiten über die Erfindung. Es ist selbstverständlich, daß diese Beispiele die Erfindung nicht in irgendeiner Weise einschränken sollen.

Figur - Legende

Figur 1. DNA-Sequenz des htrA-Gens und die Aminosäuresequenz des Proteins, die es codiert.

Figur 2. Empfindlichkeit der S.typhimurium htrA-Mutante 046 gegenüber Temperaturen oberhalb 42ºC und Sauerstoffradikalen.

Figur 3. In vivo-Kinetik von S.typhimurium-Stämmen, die eine Mutation in htrA (BRD726)- und htrA aro-Mutationen (BRD807) enthalten.

Beispiel 1 Identifikation des htrA-Gens in Salmonella typhimunum und Erzeugung einer htrA-Mutante.

TnphoA-Mutagenese wurde im virulenten Maus Salmonella typhimurium- Stamm C5 (Miller et al., 1989, Infect.Immunol., 57, 2758-2763) verwendet. Die Mutanten wurden selektiert, so daß sie wahrscheinlich Beschädigungen in Genen hatten, die eine Signalsequenz haben, d.h. Proteine, die wahrscheinlich durch eine Bakterienmembran geschleust werden. Die Isolierung der DNA, welche die TnphoA-Insertion flankiert, identifiziert das Gen, welches insertional aktiviert worden war. Dieses Gen wurde isoliert und seine DNA-Sequenz nach Standardverfahren bestimmt (s. Figur 1. SEQ ID Nr.: 1) (Maniatis et al., 1982. In Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y.; Sanger et al., 1977, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 5463-5467). Der Vergleich der translatierten Proteinsequenz mit Sequenzen aus der EMBL-Datenbank zeigte überraschenderweise, daß es eine 88%ige Homologie mit der Sequenz des htrA- Produkts aus E.coli aufwies (Fig.1. SEQ ID Nr.: 1)

Beispiel 2 Identifikation von htrA in S.typhimurium als ein bei der Streß- Response beteiligtes Gen.

E.coli-Mutanten, die Beschädigungen im htrA-Gen enthalten, sind unfähig, bei Temperaturen über 42ºC zu wachsen. Die S.typhimurium htrA- Mutante, 046, wurde auf Wachstum bei erhöhten Temperaturen getestet, und es wurde gefunden, daß sie so gut wie der vorliegende Stamm C5 wächst. Bei einem Test auf Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoffradikalen zeigte jedoch die Mutante 046 eine verringerte Resistenz im Vergleich zum Ausgangs-C5- Stamm, was klar darauf hindeutete, daß das Gen (zumindest teilweise) für diesen Aspekt der Streß-Response verantwortlich ist (s. Fig. 2.).

Beispiel 3 Vergleich des abgeschwächten Salmonella typhimurium-Stamms 046 mit dem virulenten Ausgangsstamm Salmonella typhimurium C5.

Die abgeschwächten Stämme wurden unter Anwendung von TnphoA- Transposon-Mutagenese wie zuvor beschrieben (Miller et al., 1989, Infect. Immun. 57, 2758-2763) konstruiert.

Nach oraler Verabreichung hatte der Mutantenstamm 046 eine Log&sub1;&sub0;LD&sub5; von größer als 9 Zellen im Vergleich zum Ausgangsstamm, C5, welcher eine Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; von 6,38 Zellen hat. (Alle LD&sub5;&sub0;-Werte wurden nach 28 Tagen berechnet.) Daher ist 046 hoch abgeschwächt. Nach intravenöser Verabreichung hatte 046 eine intravenöse Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; von 5,13 Zellen, im Vergleich zu weniger als 10 Zellen für C5, und wir ziehen wiederum daraus den Schluß, daß 046 hoch abgeschwächt im Vergleich zu C5 ist.

Beispiel 4 Schutz von Mäusen nach oraler Infektion.

Mäuse wurden mit 046 immunisiert und 28 Tage später mit dem virulenten Ausgangsstamm C5 infiziert. Die unter Verwendung von 10¹&sup0;-Zellen von 046 geimpften Mäuse zeigten elf Wochen nach der Impfung einen hervorragenden Schutz gegen Infektion mit C5. Die Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; der immunisierten Tiere war 9,64 Zellen im Vergleich zu 6,6 Zellen für nicht-immunsierte Kontrollen. Daher waren oral mit einer einzelnen Dosis von 046 geimpfte Mäuse gut gegen virulente C5-Infektion geschützt.

Beispiel 5 Konstruktion einer definierten S.typhimurium 5L1344 htrA-Mutante

Sequenzdaten ermöglichten die Identifikation der geeigneten Restriktions-Endonukleasestellen, die zur Einführung einer Deletion in das htrA-Gen verwendet werden konnten. Eine 1,2Kb-Deletion wurde durch Verdau mit ECORV und Religatierung eingeführt. Ein drogenresistenter Marker wurde ebenfalls in das Gen (Kanamycin Kassette, Pharmacia) nach Standardtechniken eingeführt, um die Selektion auf Anwesenheit des deletierten Gens zu ermöglichen. Das Plasmid, welches das deletierte htrA-Gen enthielt, wurde in einen pola-Stamm S.typhimurium (BRD207) eingeführt, in dem sich das Plasmid nicht replizieren kann. Die einzige Möglichkeit, daß Kanamycinresistenz im Wirt aufrechterhalten werden kann, ist daher, daß ein Rekombinationsvorkommnis zwischen S.typhimurium-Sequenzen auf dem Vektor und homologen Regionen auf dem Chromosom aufgetreten ist. Der Verlust an Ampicillinresistenz unter Beibehaltung der Kanamycinresistenz weist auf ein zweites homologes Rekombinations-Vorkommnis hin, was zum Ersatz des intakten htrA-Gens mit dem deletierten führt. Kolonien, die resistent gegen Kanamycin waren, wurden isoliert und auf Ampicillinresistenz geprüft. Eine Kolonie, die Kanamycin-resistent und Ampicillin-empfindlich war, wurde für weitere Untersuchungen selektiert und wurde als BRD698 bezeichnet (hinterlegt beim PHLS, NCTC, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, unter der Hinterlegungsnummer NCTC 12457 am 22. März 1991 gemäß Budapester Vertrag).

Ein P22-Lysat wurde auf diesem Stamm nach Standard-Techniken hergestellt (Dougan et al., J.Infect. Dis. 156, 1329-1335, 1988) und zur Infektion von SL1344 verwendet. Kanamycin-resistente Kolonien wurden isoliert und auf das Vorliegen der Deletion durch Southern Hybridisierung überprüft. Ein als BRD726 bezeichneter Stamm (hinterlegt beim PHLS unter der Hinterlegungsnummer NCTC 12458 am 22. März 1991 gemäß Budapester Vertrag) wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt.

Beispiel 6

Konstruktion einer S. typhimurium SL1344 aroA htrA-Doppelmutante Das auf BRD698 hergestellte P22-Lysat wurde zur Einführung der htrA- Deletion in einen S.typhimurium SL1344-Stamm verwendet, der bereits eine Deletion im aroA enthielt. Das Verfahren zur Einführung einer aroA-Deletion wurde bereits von Dougan et al., J.Infect.Dis. 158, 1329-1335, 1988, beschrieben. Ein Stamm, bei dem man fand, daß er Deletionen sowohl in aroA als auch htrA aufwies, wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt und wurde als BRD807 bezeichnet (hinterlegt beim PHLS unter der Hinterlegungsnummer NCTC 12459 am 22. März 1991 gemäß Budapester Vertrag).

Beispiel 7

Ein Vergleich der Abschwächung von DL1344 htrA (BRD726) und SL1344 htrA und aroA (BRD807) mit dem virulenten Ausgangsstamm SL1344

Nach oraler Verabreichung hatten BRD726 und BRD807 eine Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; von > 10,0 Zellen im Vergleich zu dem virulenten Ausgangsstamm, welcher eine Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; von 6,8 Zellen* hat. (* Alle LD&sub5;&sub0; wurden nach 28 Tagen berechnet). Beide Stämme waren daher hochabgeschwächt im Vergleich zum virulenten Ausgangsstamm SL1344.

Beispiel 8 Beurteilung des oralen Impfpotentials von BRD726 und BRD807

BALB/c-Mäuse wurden oral mit ca. 1010 Zellen von BRD726 und BRD807, wie zuvor beschrieben (Dougan et al., J.Infect.Dis. 158, 1329-1335, 1988) immunisiert und 4 und 10 Wochen später mit dem virulenten Ausgangsstamm SL1344 infiziert. Die LD&sub5;&sub0; wurde nac dem Verfahren von Reed und Muench (Am.J.Hyg. 27, 493-497, 1934) berech et. Alle Bestimmungen wurden mindestens zweimal durchgeführt. Mit BRD726 und BRD807 geimpfte Mäuse zeigten einen hervorragenden Schutz egen Infektion mit 5L1344 nach 4 Wochen, wobei die Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; > 10,0 und 9,7 Zellen war. Dies steht im Vergleich zu Log 6,1-Zellen für nich -immunisierte Kontrollen. Nach 10 Wochen war die Log&sub1;&sub0;LD&sub5;&sub0; für BRD726 9,11 und für BRD807 8,11 Zellen im Vergleich zu 6,5 für SL1344. Daher h tten die mit BRD726 immunisierten Mäuse eine hervorragende Langzeitimm nität gegenüber virulenter 5L1344- Infektion. Dieses steht in einem vorteilhaften Vergleich zum Schutz, welcher durch Doppel-aro-Mutanten von SL1344 (Dougan et al., J.Infect.Dis. 158, 1329-1335, 1988) ausgelöst wird. Der durch Impfung mit BRD807 bereitgestellte Langzeitschutz ist 46-fach besser als bei nichtimmunisierten Kontrollen. Daher bilden sowohl BRD726 als auch BRD807 gute Impfstoffstämme für BALB/c-Mäuse.

Beispiel 9 In vivo-Kinetik von BRD726 und BRD807 in BALB/c-Mäusen

Die Fähigkeit von BRD726 und BRD807 zum Wachstum in vivo nach intravenöser Verabreichung wurde beurteilt. Mäuse wurden mit ca. 10&sup5;- Organismen infiziert. Die Anzahl der Bakterien in der Leber und Milz wurde zu verschiedenen Zeiten während der Infektion bis zu 21 Tagen gezählt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3. gezeigt. Weder BRD726 noch BRD807 zeigten eine Initialperiode für die Replikation in Mäusegeweben. Die Stämme werden langsam aus den Organen geklärt, und bis zum Tag 21 war BRD807 beinahe vollständig aus Mäusegeweben geklärt, während BRD726 immer noch in niedrigen Spiegeln vorkam.

Beispiel 10 Formulierung

Ein abgeschwächter Mikroorganismus gemäß der Erfindung wird vorzugsweise in oraler Tablettenform angeboten.

Ein Träger, der 5 % Saccharose, 1 % Natriumglutamat und 1 % Bactocasiton in einem wäßrigen Lösungsmittel enthält, wird hergestellt. Die Organismen werden in diesem Träger suspendiert und dann gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wird mit Aerosil 200 vermischt, und die vermischte Mischung wird durch ein Sieb gegeben. Das gesiebte Pulver wird mit Dipac, Kolidan CL, Aricel pH102 und Magnesiumstearat in einem Mischer vermischt. Diese Mischung wird in Tabletten für den anschließenden enterischen Überzug gepreßt.

Es ist dem Fachmann offensichtlich, daß viele Bestandteile in dieser Formulierung durch funktional äquivalente, pharmazeutisch verträgliche Exzipienten ersetzt werden könnten.


Anspruch[de]

1. Impfstoff, enthaltend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine wirksame Menge eines durch eine nicht-umkehrbare Mutation im htrA- Gen abgeschwächten Bakteriums.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, worin die Mutation eine Deletionsoder Insertions-Mutation ist.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, worin das Bakterium ausgewählt ist aus der Gattung Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus und Escherichia.

4. Impfstoff nach Anspruch 3, worin das Salmonella-Bakterium ausgewählt ist aus Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis und Salmonella cholerasuis.

5. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Abschwächung des Bakteriums ebenfalls erfolgt durch eine Mutation in einem zweiten Gen.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, worin die Mutation eines zweiten Gens in einem Gen erfolgt, das im aromatischen Aminosäure-Biosyntheseweg involviert ist.

7. Impfstoff nach Anspruch 6, worin das im aromatischen Aminosäure-Biosyntheseweg involvierte Gen ausgewählt ist aus aroC-, aroAund aroD-Genen.

8. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Bakterium DNA exprimiert, die ein heterologes Antigen codiert.

9. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, angepaßt für die orale Verabreichung.

10. Bakterium, abgeschwächt durch eine nicht-umkehrbare Mutation im htrA-Gen, zur Verwendung bei der prophylaktischen Behandlung eines Wirts gegen Infektion durch einen Mikroorganismus.

11. Bakterium nach Anspruch 10, ausgewählt aus der Gattung Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus und Escherichia.

12. Salmonella-Bakterium, abgeschwächt durch eine nicht-umkehrbare Mutation im htrA-Gen.

13. Bakterium nach Anspruch 10, 11 oder 12, worin die Mutation eine Deletions- oder Insertions-Mutation ist.

14. Bakterium nach einem der Ansprüche 11 bis 13, ausgewählt aus Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis und Salmonella cholerasuis.

15. Bakterium nach einem der Ansprüche 10 bis 14, worin die Abschwächung auch durch Mutation in einem zweiten Gen erfolgt.

16. Bakterium nach Anspruch 15, worin die Mutation in einem zweiten Gen in einem Gen im aromatischen Aminosäure-Biosyntheseweg erfolgt.

17. Bakterium nach Anspruch 16, worin das im aromatischen Aminosäure-Biosyntheseweg involvierte Gen ausgewählt ist aus aroC-, aroA- und aroD-Genen.

18. Bakterium nach einem der Ansprüche 10 bis 17, das DNA exprimiert, die für ein heterologes Antigen codiert.







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