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Dokumentenidentifikation DE69031483T2 05.02.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0411925
Titel Verfahren zur Vernetzung von Kollagen und dadurch erzeugtes Produkt
Anmelder University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, N.C., US
Erfinder Mechanic, Gerald L., North Carolina 27514, US
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 10627 Berlin
DE-Aktenzeichen 69031483
Vertragsstaaten CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 01.08.1990
EP-Aktenzeichen 903084697
EP-Offenlegungsdatum 06.02.1991
EP date of grant 24.09.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.02.1998
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse A61L 27/00   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zum Vernetzen und Stabilisieren von Kollagenfibrillen und insbesondere ein Verfahren zum Photoxidieren von Kollagenfibrillen in der Gegenwart eines Photokatalysators, um jenes Material zu vernetzen und zü stabilisieren. Die Erfindung betrifft auch das resultierende vernetzte Produkt.

Reagentien und Verfahren, die gegenwartig zur Proteinvernetzung verwendet werden, hängen im allgemeinen vom Einbau des Vernetzungsreagens in die Proteinmatrix ab, um die ε-Aminogruppen von Lysin, Hydroxylysin und/oder anderen Gruppen im Protein zu vernetzen. übliche Vernetzungsreagentien in solchen Verfahren schließen Formaldehyd und Glutaraldehyd ein; andere Verfahren schließen die Einführung einer Phthaloyl- oder Adipoyl-Einheit in das Protein über Phthaloyldichlorid bzw. Adipoyldichlorid und/oder die Einführung eines Mercaptans zur Oxidation an eine Disulfidbindung ein.

Die meisten derartigen Vernetzungsverfahren umfassen den Einbau des Reagens in oder um das Protein herum. Zum Beispiel zeigen neuere Daten von Cheung und Nimni (Connec. Tissue Res. 10:201 (1982) und Connec. Tissue Res. 13:109 (1984)) zum Vernetzungsreagens Glutaraldehyd, daß, wenn dieses Reagens verwendet wird, um z.B. Kollagenfibrillen zu behandeln, sich um die Fibrillen herum ein polymerähnlicher Überzug bildet, der zu einer steiferen Kollagenmatrix führt.

Im Gegensatz dazu hängt das hierin offenbarte und beanspruchte Vernetzungsverfahren nicht vom Einbau eines Vernetzungsreagens in das zu vernetzende Material oder vom überzug des Materials mit einem Vernetzungsreagens ab. Das vorliegende Verfahren umfaßt einen photooxidativen Farbstoff, der als ein Vernetzungsoxidationskatalysator oder -promotor wirkt und der aus dem vernetzten Produkt entfernt werden kann.

Die Verwendung photooxidativer Katalysatoren in verschiedenen Photooxidationsverfahren ist bereits berichtet worden (siehe z.B. Ray, Method in Enzymol. 11:490 (1967); Westhead, Biochem 4:10 (1965); Ray und Koshland, Jr., J. Biological Chem. 18:409 (1967); und Foote, Science 162:3857 (1968)). Sie scheinen jedoch nicht für die Vernetzung proteinhaltiger Materialien verwendet worden zu sein. Zum Beispiel verwendeten Ray und Koshland, Jr., aaO., Methylenblau und Licht, um das Enzym Phosphoglucomutase zu photooxidieren, in einem Versuch, die Aminosäurereste jenes Proteins, die für die Aktivität des Enyzms wesentlich sind, durch selektive Zerstörung von Aminosäuren zu identifizieren. In ähnlicher Weise inaktivierte Westhead, aaO., Hefe-Enolase durch Photooxidation von Histidin-Resten mit dem Farbstoff Bengalrosa.

Anregung eines Farbstoffes durch Licht ist ebenfalls verwendet worden, um den Farbstoff kovalent an ein Protein zu koppeln (Brandt, et al., Biochemistry 13:4758 (1974)), und jene Technik hat zu einem Verfahren der farbstoffsensibilisierten Photomarkierung von Proteinen geführt (Brandt, et al., Anal. Biochem. 93:601 (1980). Obgleich die Technik für solche Zwecke wie das Studium der molekularen Anordnung von Komponenten proteinhaltiger Membranen (aaO.) und Proteinkonformation (Hemmendorff, et al., Biochem. Biophys. Acta 667:15 (1981)) nützlich ist, scheint die Technik keine inter- und/oder intramolekularen Vernetzungen in die Proteinmatrix einzuführen.

Ein farbstoffkatalysiertes Verfahren, von dem behauptet wird, daß es zur Herstellung thermostabiler, irreversibel vernetzbarer Kollagen-Polymere nützlich ist, ist beschrieben in U.S. Patent No. 3,152,976. Dieses Patent behauptet, daß das Produkt, das aus jenem Verfahren resultiert, gekennzeichnet ist durch bestimmte physikalisch-chemische Eigenschaften, die ähnlich sind zu denjenigen, die durch Gerbverfahren nach dem Stand der Technik erhalten werden. Die in jenem Patent vorgelegten Daten stützen jedoch nicht die Schlußfolgerung, daß das Produkt jenes Verfahrens die Eigenschaften von Produkten von Gerbverf ahren nach dem Stand der Technik besitzt, die jenes Produkt zu einem nützlichen biologischen Material für solche Anwendungen machen wirde, wie Gefäßtransplantate, Herzklappen, -Herzbeutel-Patchs, injizierbares Kollagen oder Ersatzligamente oder -sehnen. Stattdessen stellt jene Entgegenhaltung fest, daß das Produkt anfälliger gegenüber enzymatischem Abbau ist als "nicht-vernetztes" Kollagen. Solche Ergebnisse stehen natürlich in völligem Gegensatz zur Verwendung solch eines Produktes als, zum Beispiel, eine Herzklappe (man stelle sich eine Herzklappe vor, die durch sogar das mild proteolytische Enzym Papain in Stunden, oder sogar Sekunden, verdaut wird, wie beschrieben in Beispiel VII jener Entgegenhaltung). Diese anscheinend anormalen Ergebnisse können vielleicht teilweise erklärt werden durch die scheinbare Motivation, die in jenem Patent beschriebene Erfindung, nämlich die Bildung von "Formteilen", wie etwa Schwämmen oder Fibrillen (Nähte?), angeblich von einer Art zu machen, die ohne die Notwendigkeit der anschließenden Entfernung in den Körper implantiert werden kann.

Die im 976-Patent berichteten Ergebnisse können vielleicht auch mit einer näheren Untersuchung des Verfahrens erklärt werden, das darin beschrieben ist. Die Entgegenhaltung beschreibt z.B. die Herstellung eines "Ausgangsmaterials", mit dem das Verfahren, das in jenem Patent dargelegt ist, durchgeführt wird, indem Kollagen-Material in wässriger saurer Lösung dispergiert wird. Säure besitzt die gut bekannte Wirkung der Denaturierung des die Kollagenfibrille umfassenden Proteins. Es ist natürlich die dreidimensionale Struktur der die Kollagenfibrille umfassenden Proteine, die der Fibrille die einzigartigen Eigenschaften von Kollagen verleiht; verändere jene Struktur und das Protein kann nicht mehr in der Weise wechseiwirken, die erforderlich ist, um zu jenen Eigenschaften zu führen. Eine weitere Erklärung der in jenem Patent beschriebenen Ergebnisse wird vorgeschlagen von P.H. von Hipple, "Structural and Stabilization of the Kollagen Molecule in Solution" (in Treatise on Collagen, Vol 1: Chemistry of Collagen, G.N. Ramachandran (Hrg.), London: Academic Press Inc. (London) Ltd. (1967), 5. 253-338 auf 262), der berichtet, daß Kollagenmoleküle, die mit sauren und neutralen Salzverfahren extrahiert sind, sich in dem Umfang, in dem sie kovalent vernetzt sind, der Größe, der Form, der Wechseiwirkungseigenschaften und der Geschwindigkeit der Faserbildung unterscheiden. Obgleich auf der Basis vorläufiger Daten, so daß der Autor so vorsichtig war, herauszustellen, daß über Ergebnisse vqn anderen Forschern berichtet worden war, die keinerlei Unterschiede zeigten, stützen nachfolgende Experimente die Existenz solcher Unterschiede.

Stenzel et al., 3 Arin. Rev. Biophys. Bioeng. 231 (1974) offenbaren die Einführung von Vernetzungen in löslich gemachtes Kollagen und stellen fest, daß Bestrahlung in Luft den Abbau von Kollagen verstärkt, wohingegen Bestrahlung in einer Stickstoffatmosphäre den Abbau verzögert und die Vernetzung erhöht.

Im Lichte dieses Standes der Technik war es überraschend, herauszufinden, daß die Photooxidation eines Proteins in der Gegenwart eines Photokatalysators und ausreichend Sauerstoff, unter kontrollierten Bedingungen von pH und Temperatur, Kollagenfibrillen vernetzte und stabilisierte, ohne die Matrix wie in herkömmlichen Gerbverf ahren zu versteifen.

AUFGABEN DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe dieser Erfindung ist, ein wirksames und wirkungsvolles Verfahren zur nicht-spezifischen Vernetzung von Kollagenfibrillen zur Verfügung zu stellen.

Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit physikalisch-chemischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, die jenes Produkt geeignet machen zur Verwendung als biologisches Material zur Verwendung als eine künstliche Sehne, Herzklappe oder Herzbeutel-Patch.

Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist, ein Verfahren zur -Herstellung eines Produktes zur Verfügung zu stellen, das nicht antigen ist, wenn es in einen Säuger implantiert wird.

Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist, ein Produkt, und ein Verfahren zur Herstellung jenes Produktes, zur Verfügung zu stellen, das nicht kalzifiziert, wenn es in einen Säuger implantiert wird.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes zur Verfügung zu stellen, das nicht zytotoxisch ist, wenn es in einem Säuger implantiert ist, und über dem Endothelzellen wachsen können.

Andere Aufgaben der Erfindung, sowie die verschiedenen Vorteile der Erfindung, werden den Fachleuten auf diesem Gebiet beim Lesen der Beschreibung, der Beispiele und der beigefügten Ansprüche deutlich werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines vernetzten Produktes zur Verfügung gestellt, das zur Verwendung als ein biologisches Material geeignet ist, welches verdauungsresistent ist, wobei das Verfahren umfaßt, daß den natürlichen ähnliche Kollagenfibrillen mit einem photooxidativen Katalysator äquilibriert werden; und danach die Kollagenfibrillen, um Vernetzungen zwischen diesen zu bilden, in der Gegenwart von Sauerstoff oxidiert werden, indem die Kollagenfibrillen Licht ausgesetzt werden, während Temperatur und pH auf Niveaus gehalten werden, die ausreichend sind, um die Sauerstoffkonzentration im wäßrigen Medium aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise ist eine Probe des vernetzten Produktes herstellbar mit dem Verfahren: Äquilibrieren von Kollagenfibrillen mit einem photooxidativen Katalysator; und anschließendes Oxidieren der Kollagenfibrillen, um Vernetzungen zwischen diesen zu bilden, in der Gegenwart von Sauerstoff, indem die Kollagenfibrillen Licht ausgesetzt werden, während Temperatur und pH auf Niveaus gehalten werden, die ausreichend sind, um die Sauerstoffkonzentration im wäßrigen Medium aufrechtzuerhalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein vernetztes proteinhaltiges Produkt, das mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt ist.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt vernetzte, stabilisierte proteinhaltige Produkte zur Verfügung, die geeignete biologische Materialien zur Verwendung beim Ersatz und/oder bei der Reparatur von krankheitsbefallenen oder beschädigten Körpergeweben sind (medizinische Prothesen). Wenn so verwendet, sind die Produkte der vorliegenden Erfindung bisher eingesetzten Produkten überlegen, weil sie die mechanischen Eigenschaften des vorbehandelten Materials beibehalten, d.h. sie geschmeidig und glatt bleiben. Zusätzlich ist das Produkt vorzugsweise nicht- immunogen.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt Produkte zur Verfügung, die aufgrund ihrer Stabilität weiter vorteilhaft in medizinischen Prothesen sind. Das vernetzte Produkt widersteht in-vivo-Abbau und Kalzifizierung, wenn es implantiert wird. Daher ist das vernetzte Produkt, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, überlegen gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten biologischen Materialien, die anfällig sind gegenüber üblichem proteolytischen Abbau und Mineralisierung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 - Wirkung von Katalysator/Bestrahlung auf Protein-Vernetzung und -Stabilität, gemessen durch die Anfälligkeit von Gewebeproben gegenüber Pepsin-Verdauung.

Fig. 2 - Wirkung von Katalysator/Bestrahlung auf Protein-Vernetzung und -Stabilität, gemessen durch die Anfälligkeit von -Gewebeproben gegenüber Kollagenase-Verdauung.

Fig. 3 - Kalzifizierung von implantiertem vernetzten Gewebe. Zwei mit Glutaraldehyd vernetzte Rinderherzbeutelproben (A und B) sind dargestellt (A=X, B= ), zusammen mit mit Glutaraldehyd vernetzten Schweineklappensegeln (0) und einer Probe Rinderherzbeutel, vernetzt gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung (--).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Kollagenfibrillen, die photooxidiert werden sollen, werden zur Verarbeitung gemäß der vorliegenden Erfindung in einem wäßrigen Medium untergetaucht, dispergiert oder suspendiert (in Abhängigkeit von ihrer vorherigen Verarbeitung). Geeignete Medien zum Untertauchen der Kollagenfibrillen (aus Bequemlichkeitsgründen soll das Wort "Untertauchen" so verstanden werden, daß es Suspension und/oder Löslichmachung des proteinhaltigen Materials einschließt) schließen wäßrige und organische Pufferlösungen mit einem neutralen bis alkalischen pH ein, vorzugsweise einem pH von etwa 6,5 und darüber, wegen der durch sauren pH verursachten Denaturierung. Besonders bevorzugt sind gepufferte wäßrige Lösungen mit einem pH von etwa 6,8 bis etwa 8,6. Beispiele für Medien, die hierin verwendet werden können, schließen ein:

1. Wasser oder Puffer mit niedriger Ionenstärke;

2. phosphatgepufferte Salzlösung;

3. Puffer mit hoher Ionenstärke (IL=l,75-3,0); und

4. organische Puffer, die Kalium- oder Natriumphosphat oder Kalium- oder Natriumchlorid enthalten, wie etwa ein Good-Puffer (z.B. HEPES, TES oder BES - Research Organics, Inc.)

Die Medien können auch den Photokatalysator enthalten, der vorzugsweise darin löslich ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden zwei Mediumlösungen für das verwendet, was hierin als "Vorkonditionierung" der Kollagenfibrillen vor der Bestrahlung bezeichnet wird. Die Fibrillen werden "vorkonditioniert", indem Fibrillen, die in einer ersten Mediumlösung getränkt und in einer zweiten bestrahlt worden sind, scheinbar besser vernetzt sind, z.B. verbesserte mechanische Eigenschaften und verringerte Anfälligkeit gegenüber proteolytischem Abbau zeigen. Die Wirksamkeit der Vorkonditionierung wird beeinflußt von der Osmolalität der ersten Mediumlösung, wobei es bevorzugt ist, daß Lösungen mit hoher Osmolalität als das erste Medium verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Natrium-, Kalium- oder organische Pufferlösungen, wie etwa Natriumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat und Good-Puffer mit einem pH von etwa 6,8 bis etwa 8,6, deren Osmolalität durch Zugabe des gelösten Stoffes, wie etwa 4M Saccharose oder ein anderes lösliches Kohlehydrat mit hohem Molekulargewicht, auf zwischen etwa 393 mosm und etwa 800 mosm erhöht worden ist.

Der gelöste Stoff, der zugesetzt wird, um die Osmolalität zu erhöhen, scheint einen gegenteiligen Effekt auf den Grad der Vernetzung des Produktes zu haben, wenn er während der Bestrahlung vorliegt. Folglich werden Kollagenfibrillen, nach dem Tränken im ersten Medium, vorzugsweise daraus entfernt und zur Bestrahlung in einem zweiten Medium untergetaucht. Das zweite Medium ist vorzugsweise eine wäßrige gepufferte Lösung mit einem pH von etwa 6,8 bis etwa 8,6, in der der Photokatalysator gelöst ist. Bevorzugte zweite Medien sind Natrium- und Kaliumphosphat-Puffer mit einem pH von etwa 7,4 bis etwa 8, und einer Osmolalität von etwa 150 bis etwa 400 mosm, wobei 300 ± 10 mosm besonders bevorzugt ist.

Wenn das Material, das vernetzt werden soll, ein Gewebe-, Sehnen- oder Herzbeutelstück ist, wird jene Probe vorteilhafterweise nacheinander im ersten Medium und anschließend im den Katalysator umfassenden zweiten Medium vor der Photooxidation für einen Gesamtzeitraum untergetaucht, der ausreichend ist, um zu ermöglichen, daß Gewebe, Farbstoff und Medium vor der Bestrahlung ein Gleichgewicht erreichen. Wenn das Verhältnis der Konzentration des Mediums zu derjenigen des zu vernetzenden Materials im Bereich von etwa 10:1 bis 30:1 liegt, kann Gleichgewicht im allgemeinen leicht erreicht werden. Das Verhältnis der Konzentrationen ist im allgemeinen nicht kritisch und wird je nach Wunsch nach oben oder unten eingestellt. Die Zeit, die erforderlich ist, um das Gleichgewicht zu erreichen, schwankt in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie z.B. der Temperatur der Mediumlösungen, der Osmolalität des ersten Mediums und der Dicke des Gewebes oder der anderen Probe von Kollagenfibrillen. So wenig wie ein paar Minuten oder so lang wie mehrere Tage können ausreichend sein, aber Zeiträume mit einer Dauer von Minuten bis Stunden sind im allgemeinen für die meisten Kollagenmaterialien und Medien ausreichend, um zu äquilibrieren.

Allgemein gesprochen, hängt die Geeignetheit eines Katalysators für die Verwendung im vorliegenden Verfahren von der Fähigkeit des Katalysators ab, zu einem angeregten Zustand (T.) sensibilisiert zu werden, wenn er als ein Photosensibilisator dient. Das Substrat reduziert dann den (T.)-Zustand des Sensibilisators durch Elektronentransfer. Studien haben den Beweis erbracht, daß das Substrat anfänglich mit Katalysator im Triplett-Zustand reagiert, was sekundäre reaktive Radikale durch Elektronen- oder H-Atom-Transferreaktionen erzeugt. Siehe, Spikes und Straight, Ann. Rev. Phys. Chem. 18:409 (1967).

Die Katalysatoren, die zur Verwendung hierin in Betracht gezogen werden, sind photooxidative Katalysatoren (Photokatalysa-toren), die, wenn sie aktiviert sind, den Transfer von Elektronen oder Wasserstoffatomen bewirken und dadurch ein Substrat in der Gegenwart von Sauerstoff oxidieren werden. Obgleich schwankende Ergebnisse in Abhängigkeit von dem besonderen verwendeten Katalysator möglich sind, schließen geeignete Katalysatoren diejenigen ein, die in Oster, et al., J. Am. Chem. Soc. 81:5095, 5096 (1959) aufgelistet sind, sind aber nicht hierauf beschränkt. Besonders bevorzugte Katalysatoren schließen Methylenblau, Methylengrün, Bengalrosa, Riboflavin, Proflavin, Fluorescein, Eosin und Pyridoxal-5-phosphat ein.

Die Katalysatorkonzentration im Medium wird auf der Basis mehrerer Verfahrensparameter variieren, aber sollte ausreichend sein, um angemessenes Eindringen in das zu vernetzende Material sicherzustellen und die Photooxidation des Proteins zu katalysieren. Eine typische Katalysatorkonzentration liegt im Bereich von etwa 0,0001 % - 0,25 % (wt/Vol); die bevorzugte Konzentration liegt im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,1 %.

Um maximale Vernezung und Stabilisierung der Kollagenfibrillen zu erreichen, sollten die folgenden Schritte eingeschlagen werden: (1) der photooxidative Katalysator sollte vor der Verwendung im Reaktionsmedium vollständig löslich gemacht werden, um sicherzustellen, daß die gewünschte Farbstoffkonzentration erreicht wird; (2) die Konzentration des Katalysators im Gewebe oder in der Suspension sollte im Gleichgewicht stehen mit derjenigen im umgebenden Medium; und (3) die Katalysatorlösung sollte filtriert werden, um jegliches relativ große partikuläre Material, einschließlich chemischer Suspensionspartikel, daraus zu entfernen.

Da das vorliegende Verfahren primär eine oxidative Reaktion umfaßt, um die Vervollständigung der Reaktion sicherzustellen, -muß während der Photooxidation für eine angemessene Zufuhr von Sauerstoff gesorgt werden. Obgleich eine Sauerstoffkonzentration von etwa 20 Vol.-% (bezogen auf die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre über dem Medium) bevorzugt ist, um genügend gelösten Sauerstoff im Medium zu gewährleisten, um zu verhindern, daß der Sauerstoffgehalt geschwindigkeitsbeschränkend wird, werden auch Konzentrationen > 0 bis zu 25 % verwendet. In Abhängigkeit von der Temperatur, bei der die Kollagenfibrillen während der Einwirkung von Licht gehalten werden, können die Sauerstoffanforderungen z.B. erfüllt werden durch Rühren oder sonstiges Durchmischen der Lösung, Suspension oder Probe während des Reaktionsprozesses. Die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre über dem Medium während der Bestrahlung wird vorzugsweise im Bereich von etwa 5 % bis etwa 20 % gehalten. Solche Konzentrationen (wieder abhängig von der Temperatur) können ebenfalls z.B. erreicht werden durch Einleiten von Luft in das Medium während der Bestrahlung der Kollagenfibrillen oder, wenn höhere Konzentrationen als etwa 20 % erwünscht sind, durch Einleiten von Sauerstoffmischungen in das Medium.

Wie bei anderen Reaktionen vom katalytischen oder kinetischen Typ beeinflußt die Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, direkt die Reaktiansgeschwindigkeit und den im Medium verfügbaren Sauerstoff. Tests, die mit verschiedenen Medien durchgeführt wurden, die im pH von etwa 6,8 bis etwa 7,4 reichten und eine Osmolalität von 300 + 10 mosm besaßen, zeigen, daß, wenn die Temperatur des Mediums von 4 auf 50ºC ansteigt, die Sauerstoffkonzentration in grob gesagt linearer Weise von etwa 11 - 12 ppm auf etwa 5 ppm fällt. Der farbstoffkatalysierte Photooxidationsprozeß der vorliegenden Erfindung ist exotherm, und es ist daher bevorzugt, daß eine relativ konstante Temperatur während der Bestrahlung aufrechterhalten wird, um die Denaturierung der Kollagenfibrillen und das Austreiben des Sauerstoffs aus dem Medium durch den Anstieg der Temperatur zu verhindern. Üblicherweise ist ein Umwälzbad ausreichend, um die Temperatur im (in der) ummantelten Reaktionsgefäß oder -kammer aufrechtzuerhalten, aber das Einbringen der Reaktionskammer in eine kontrollierte Umgebung, wie etwa einen Kühlschrank oder ein Gefriergerät, wird ebenfalls funktionieren. Wie hierin offenbart, hat es sich gezeigt, daß eine Photooxidation, die bei Temperaturen im Bereich von etwa -2ºC bis 40ºC durchgeführt wird, wirkungsvoll ist; die bevorzugten Temperaturen liegen bei von etwa 0 bis etwa 25ºC. Um Denaturierung des Proteins, das die Kollagenfibrillen umfaßt, zu verhindern, sind Temperaturen unterhalb der Denaturierungstemperatur jenes Proteins bevorzugt. In ähnlicher Weise sind auch Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes des Reaktionsmediums bevorzugt.

Man glaubt, daß die Kombination und/oder Wechselwirkung der variablen Temperatur, pH und Sauerstoffkonzentration, die hierin beschrieben sind, bisher noch nicht als kritisch bei photooxidativer Vernetzung identifiziert worden sind. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird daher bei Temperaturen durchgeführt, die niedrig genug sind, um Wärmedenaturierung zu vermeiden, und bei einem pH, der hoch genug ist, um Säuredenaturierung der Kollagenfibrillen während der Vernetzung zu vermeiden. In ähnlicher Weise wird die Temperatur auf einem Niveau gehalten, das ausreichend ist, um die Sauerstoffkonzentration im Medium, in dem die Kollagenfibrillen während der Bestrahlung untergetaucht sind, aufrechtzuerhalten.

Wenn die Probe erst einmal hergestellt ist, wird sie photobestrahlt, vorzugsweise in der zweiten Mediumlösung und in einem kontrollierten System, in dem Temperatur, Abstand zur Lichtquelle, Bestrahlungsenergie und Wellenlänge, Sauerstoffkonzentration und Bestrahlungszeit überwacht und/oder aufrechterhalten werden können. Photooxidation wird im allgemeinen unter Verwendung von weißem Glühlicht oder fluoreszierendem Licht, d.h. sichtbarem Licht, oder demjenigen Lichtanteil im sichtbaren Bereich, der vom Katalysator absorbiert wird, erreicht. Lichtquellen, wie etwa Haushaltsglühbirnen, Fluoreszenzlampen und Strahler, sind für die Verwendung hierin geeignet.

Die Intensität des eingesetzten Lichtes und die zur Vernetzung gegebener Kollagenfibrillen erforderliche Zeit werden in Abhängigkeit von mehreren Faktoren variieren. Diese Faktoren schließen ein: (1) die Art und Menge der Kollagenfibrillen; (2) die Dicke der Gewebeprobe; (3) den Abstand zwischen den Kollagenfibrillen und der Bestrahlungsquelle; (4) den eingesetzten Katalysator; (5) die Katalysatorkonzentration; und (6) die Art und Intensität der Lichtquelle. Zum Beispiel kann die Bestrahlungszeit von so wenig wie ein paar Sekunden bis zu so viel wie etwa 160 Stunden variieren. Im Hinblick auf die Intensität des Lichtes können eine oder mehrere Lampen mit einer Intensität verwendet werden, die vorzugsweise im Bereich von bis zu 150 Watt liegt, vorzugsweise gehalten in einer Distanz von etwa 2,5 cm bis 12 cm von der Probenoberfläche. Längere Belichtungszeit ist erforderlich, wenn Fluoreszenz- oder Niederenergielampen eingesetzt werden. Diese Bereiche sind recht variabel; sie können jedoch fur ein gegebenes Material ohne die Notwendigkeit übermäßiger Experimente unter Verwendung der Offenbarung und Beispiele, die hierin als eine Richtlinie zur Verfügung gestellt sind, leicht bestimmt werden. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform wird die Intensität des Lichts und die Bestrahlungszeit geeigneterweise in Lumenstunden ausgedrückt, und wenn übliche Fluoreszenzlampen als Lichtquelle verwendet werden, wird ein Bereich von etwa 100 bis 20.000 Lumenstunden zur Vernetzung der meisten Proben aus proteinhaltigem Material verwendet.

Der Nachweis der Vernetzung von Kollagenfibrillen durch Photooxidation in der Gegenwart eines Katalysators gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch mehrere Tests zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel belegt Polyacrylamid-Gelelektrophorese des bestrahlten Materials in Natriumdodecylsulfat (z.B. 0,1 %) eine solche Vernetzung durch eine signifikante Abnahme der Menge an Material mit niedrigem Molekulargewicht bei gleichzeitigem Auftreten von Material mit hohem Molekulargewicht. Obgleich Aminosäureanalyse von Hydrolysaten von vernetzten Kollagenfibrillen eine Armut an Methionin, Tyrosin und Histidin belegt (die alle durch photokatalytische Oxidation zerstört werden), ist diese Verringerung nicht notwendigerweise ein Beweis für Vernetzung. Wenn z.B. Kollagenfibrillen mit KI/1&sub2;-Lösung behandelt werden, tritt Derivatisierung von Tyrosin und Histidin auf, wodurch diese Aminosäuren ohne Vernetzung im wesentlichen aus einem Aminosäureprofil eliminiert werden, wie belegt ist durch das Fehlen einer Veränderung im Gelelektrophoresemuster.

Ein weiterer Beweis für die Vernetzung wird bereitgestellt durch Löslichkeits- und Verdaubarkeitstests, wie etwa denjenigen, die in den Beispielen angegeben sind, die folgen. Zum Beispiel sind vernetzte Kollagenfibrillen im allgemeinen unlöslich, so daß Löslichkeitstests einen direkten Beweis für den Grad der Vernetzung liefern. Die Verdaubarkeitstests umfassen die Inkubation des Produktes mit einem proteolytischen Enzym, wie etwa Papain, Trypsin, Pepsin oder bakterieller Kollagenase, und das anschließende Testen des Mediums, in dem das Produkt und Enzym inkubiert werden, auf lösliche Abbauprodukte des vernetzten Produktes. Der Test wird im allgemeinen durchgeführt, indem das nicht-verdaute, vernetzte Produkt durch Zentrifugation pelletiert und der resultierende Überstand auf Abbauprodukte getestet wird. Das letztere ist insbesondere nützlich im Lichte der Zerstörung der Aminosäure Histidin durch Photooxidation; Analyse des Überstands auf Histidin-Gehalt und ein Vergleich jenes Gehaltes mit der Menge einer Aminosäure, wie etwa Hydroxyprolin, die nicht durch Photooxidation zerstört wird, im Überstand liefert einen besonders empfindlichen Test auf den Grad der Vernetzung. Dieser Vergleich kann vorteilhafterweise ausgedrückt werden als ein Verhältnis von Histidin zu Hydroxyprolin (his/hyp-Verhältnis), wobei höhere his/hyp-Verhältnisse ein Anzeichen sind für wirkungsvollere Vernetzung.

Das hierin offenbarte Verfahren wird in einer diskontinuierlichen, intermittierenden oder kontinuierlichen Art und Weise durchgeführt. Im Anschluß an die Photobestrahlung wird das vernetzte Produkt vorteilhafterweise verschiedenen Behandlungen zur Entfernung des Katalysators und anderer Chemikalien oder Verunreinigungen, die darin anzutreffen sind, unterzogen, bevor es als Gefäßtransplantat, Herzklappensegel oder für andere Verwendungen, die oben aufgelistet sind, verwendet wird. Mehrfache Spülungen in einer frischen Pufferlösung werden z.B. verwendet, gefolgt von zumindest teilweiser Entwässerung mit z.B. Ethanol. Die Zahl der Spülungen und das Volumen der Spüllösung, die erforderlich sind, hängt ab von der Masse des Gewebes oder des suspendierten Materials und der eingesetzten Katalysatorkonzentrat ion.

Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschreiben die Erfindung in weiterem Detail.

1. Reine Kollagenfibrillen, vernetzt bei 18ºC

Reine rekonstituierte lösliche Rinderhaut-Kollagenfibrillen (0,25 Gramm) wurden in 0,065 Liter 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, der 0,01 % (wt/Vol) Methylengrün enthielt, eingemischt und suspendiert. Die Kollagenfibrillen wurden in einem ummantelten Wasserbad, das bei 18ºC gehalten wurde, bestrahlt. Ein Thermometer wurde im Reaktionsgefäß plaziert, um die Temperatur zu überwachen. Zwei 150 Watt-Strahler, die etwa 6 cm oder 2,4 Inches von der Suspensionsoberfläche angeordnet waren, wurden angestellt und die Temperatur im Reaktionsgefäß begann anzusteigen, was zeigte, daß möglicherweise (1) eine exotherme Reaktion stattfand und/oder (2) Lichtenergie vom Katalysator im Medium absorbiert wurde, was eine Erhöhung in der Temperatur der Suspension bewirkte.

Die Lampen blieben an und die Reaktion ließ man für vier Stunden fortschreiten. Die Temperatur erreichte ein anfängliches Maximum von 45ºC, das dann für den Rest der Reaktionszeit auf etwa 18ºC verringert und dabei gehalten wurde. Die Sauerstoffkonzentration im Reaktionsmedium wurde auf einem Niveau gehalten, das ausreichend war, um angemessenen Sauerstoff im Medium sicherzustellen, indem das Reaktionsgefäß zur Atmosphäre hin offengehalten wurde, während die Reaktionsmischung kräftig gerührt wurde.

Das offenbarte Verfahren wurde für wirkungsvoll beim Vernetzen von proteinhaltigem Material gehalten, wenn weder das Erhitzen des Kollagenproduktes auf 65ºC (was natürlich vernetztes natives Kollagen denaturieren und löslich machen würde), noch Verdauung mit Pepsin bei 15ºC (was ebenfalls das native Kollagen löslich machen würde) erfolgreich darin waren, es abzubauen. Keine Denaturierung des Kollagenproduktes wurde beobachtet.

2. Reine Kollagenfibrillen, vernetzt bei 0ºC

Unter Befolgung der Vorgehensweisen, die in Beispiel 1 angegeben sind, wurden mehrere Proben, die ungefähr 0,25 Gramm reine rekonstituierte Rinderhaut-Kollagenfibrillen enthielten, in 0,065 Litern 0,02 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, der 0,01 % (wt/Vol) Methylengrün enthielt, eingemischt und suspendiert. Photobestrahlung der Suspension wurde durchgeführt in ummantelten Wasserbädem, die bei einer Temperatur von 0ºC gehalten wurden. Zwei 150 Watt-Strahler, die etwa 6 cm oder 2,4 Inches von der Oberfläche jeder Suspension angeordnet waren, wurden angeschaltet und die Reaktionen ließ man für Zeiträume von bis zu 6 Stunden ablaufen. Die Sauerstoffkonzentration in den Gefäßen wurde auf ausreichenden Niveaus gehalten durch Offenhalten der Reaktionsgefäße gegenüber der ungefähr 20 %igen Sauerstoffkonzentration der Atmosphäre und durch Rühren (siehe Beispiel 1).

Photooxidation der Proben wurde zu verschiedenen Zeitintervallen während der Bestrahlung gestoppt und Pepsinverdauung wurde eingesetzt, um die Vernetzung und Stabilität der resultierenden Produkte zu testen. In keiner der Proben wurde irgendein signifikanter Grad von Löslichmachung erreicht. Sogar verdünnte Essigsäure bei 100ºC oder Verdauung mit 5 % Pepsin (Enzym: Substrat) bei Temperaturen bis zu 18ºC erreichten keinen Abbau des vernetzten Kollagenproduktes.

3. Vernetzung von rekonstituierten löslichen Kollapenfibrillen

Lösliches Kollagen wurde aus 2 Jahre alter Rinderhaut extrahiert und gereinigt. Gereinigte rekonstituierte lösliche Kollagenfibrillen wurden unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen in 0,01 % und 0,1 % Katalysator für 6, 16, 24 und 48 Stunden bestrahlt. Versuche wurden unternommen, 0,4 mg-Proben der rekonstituierten Fibrillen bei Raumtemperatur zu lösen, nachdem sie in 0,25 ml 0,5 M Essigsäure sowie in 0,250 ml 0,1 M TRIS-Borat-Puffer, pH 8,6, der 4 M Harnstoff und 0,2 % SDS enthielt, vernetzt worden waren. Die (nicht-vernetzten) Kontroll-Fibrillen lösten sich in den letzteren zwei Lösungen leicht bei 100ºC und schwer bei Raumtemperatur. Die Kollagen- Suspensionen versagten darin, sich zu lösen, wenn sie auf 65ºC erhitzt wurden. Einige dieser Suspensionen wurden PAGE-Analysen unterzogen. Die rekonstituierten löslichen (nicht-vernetzten) Kollagenfibrillen, die sich lösten, zeigten normale Elektrophorese-Muster. Wenn jedoch die Uberstände der erhitzten vernetzten Fibrillen auf dem Gel laufengelassen wurden, waren die Elektrophorese-Muster extrem hell und kaum sichtbar.

Pepsin- und Kollagenase-Behandlungen wurden verwendet, um die Wirksamkeit der Vernetzungsreaktion zu bestimmen. Es gab scheinbar sehr wenig Auflösung, wenn überhaupt, die durch die Pepsin-Verdauung bewirkt wurde. Es trat ein wenig Niederschlag auf, der nach der Kollagenase-Behandlung übrig blieb. Aliquote der Überstände und Rückstände von jedem wurden gesammelt und hydrolysiert. Andere Aliquote wurden für PAGE-Analyse entnommen. Die Rückstände aus den Pepsin-Verdauungen waren im TRIS- Borat-Puffer, der oben beschrieben ist, bei 65ºC unlöslich.

4. Vernetzung von Rinderherzbeutelgewebe

Unter Verwendung eines modifizierten Reaktionsgefäßes mit Wassermantel, das ähnlich ist zu demjenigen, das in Beispiel 1 eingesetzt wurde, wurde eine Anzahl von Proben von Rinderherzbeuteln mit Abmessungen von ungefähr 2 cm² gleichzeitig mit zwei 150 Watt-Strahlern bestrahlt, die 7 cm bis 10 cm oder etwa 2,8 bis 4 Inches von den Proben angeordnet waren. Einzelne Proben wurden nach Zeiträumen im Bereich von 2,5 bis 22 Stunden Bestrahlung aus dem Gefäß entnommen.

In einer ersten Reihe von Experimenten bestand das Vernetzungsmedium aus 4,0 M Natriumchlorid mit einem µ = 0,164-Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4), der 0,1 % (wt/Vol) Methylengrün enthielt. Die Gewebeproben wurden mit der obigen Lösung äquilibriert, in den Apparat mit dem Medium gegeben, das unter Verwendung eines Magnetrührers kontinuierlich gerührt wurde. Das Reaktionsgefäß wurde anschließend bestrahlt, während die Temperatur des Mediums bei etwa 0ºC gehalten wurde. Nach verschiedenen Zeiträumen wurden die Gewebeproben aus den Medien entnommen und entfärbt durch Tränken in µ 0,164-Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4), bis die Proben im wesentlichen frei von Katalysator waren.

Um die Wirkung des Katalysators und der Bestrahlung getrennt und der Katalysator/Bestrahlungs-Kombination auf das Gewebe zu testen, ließ man Kontrollproben, die keinen Katalysator oder Katalysator, aber keine Bestrahlung, enthielten, in der obigen Reaktion laufen. Nach Waschen für 12 Tage, wobei die Waschlösung dreimal pro Tag gewechselt wurde, mit 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,9, 0,001 M CaCl&sub2;-Lösung wurde die Vernetzung und Stabilität der resultierenden Proteinprodukte auf der Grundlage der Anfälligkeit der Gewebeproben gegenüber Pepsin-Verdauung in einer 1 %igen Pepsinlösung in 3 %iger Essigsäure bei 4ºC für 24 Stunden bewertet. Die Reaktion der Proben mit dem Enzym wurde über variierte Zeiträume durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

Typischerweise zeigten Gewebeproben, die für von 2,5 bis 22 Stunden in der Gegenwart des Methylengrüns bestrahlt worden waren, signifikante Verringerungen der Löslichkeit des Proteins, verglichen mit den Kontrollproben. Überdies lieferte eine 6-stündige Pepsin-Verdauung des Kontrollgewebes ungefähr 30 nm Hydroxyprolin (hyp) pro mg Gewebe, während dieselbe Verdauung an einer Gewebeprobe, die für 22 Stunden in der Gegenwart von Methylengrün bestrahlt worden war, so niedrige Werte wie 10 nm pro mg lieferte. Offensichtlich vernetzte und stabilisierte das offenbarte Verfahren das Kollagen erfolgreich.

5. Wirkung von verringertem Gewebe/Volumen Katalysator

Proben von Rinderherzbeuteln wurden in 3,0 M KCL, µ = 0,176- Kaliumphosphat-Puffer getränkt, und anschließend wurden weniger Herzbeutelstücke, als in Beispiel 4 verwendet worden waren, in denselben Puffer gegeben, der 0,1 % Methylengrün enthielt, unter denselben Reaktionsbedingungen, wie beschrieben in Beispiel 4, und Licht für bis zu 22 Stunden ausgesetzt. In diesen Experimenten wurde Verdauung mit reiner bakterieller Kollagenase (1 % Kollagenase-Lösung in 0,15 M TES-Puffer, pH 7,5 in 0,001 M CaCl&sub2; bei 37ºC für 6 Stunden) verwendet, um Vernetzung und Stabilität zu bewerten. Die Kontrollprobe lieferte 206 nM hyp pro mg Gewebe, wohingegen die für 22 Stunden bestrahlte Probe 36 nM hyp pro mg Gewebe lieferte. Diese Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die verringerte Gewebeanfälligkeit gegenüber Kollagenase-Verdauung belegte die erfolgreiche Stabilisierung des Gewebes.

6. Vernetzung von löslichen Kollagenfibrillen

Lösliches Kollagen wurde hergestellt durch Extraktion von 2 Jahre altem Rindercorium mit 1 %iger Essigsäure. Kollagen wurde durch Salzausfällung aus der Essigsäurelösung und zwei Dialysen mit niedriger Ionenstärke gereinigt, anschließend in 1 %iger Essigsäure gelöst und durch Dialyse gegen 0,02 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, zu Fibrillen rekonstituiert. Aliquote des rekonstituierten Kollagens wurden in 0,02 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, der 0,01 % Methylengrün enthielt, in mit Aluminiumfolie umhüllten Kolben untergetaucht. Die Kolben wurden in einem Wasserbad bei 4ºC, während atmosphärische Luft dort hindurchgeleitet wurde, unter zwei 150 Watt-Strahlern für 24 Stunden in einem Abstand von etwa 3 cm gehalten und die Folie von einer ausgewählten Anzahl von Kolben entfernt.

Fibrillen aus bestrahlten und nicht-bestrahlten Aliquoten wurden gegen 0,02 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, dialysiert, um den Farbstoff zu entfernen, und anschließend zentrifugiert und in 3 %ige Essigsäure gegeben. Die nicht-bestrahlten Fibrillen lösten sich in der Essigsäure, während diejenigen, die bestrahlt worden waren, unlöslich blieben, sogar nach Erhitzen auf 65ºC, was zeigte, daß die bestrahlten Fibrillen wirksam vernetzt worden waren. Wenn der Überstand von den bestrahlten Fibrillen auf hyp-Gehalt hydrolysiert wurde, wurde nichts gefunden, was die Vernetzung des Kollagens bestätigte.

Fibrillen aus bestrahlten und nicht-bestrahlten Aliquoten wurden auch für sieben Tage mit drei Änderungen pro Tag gegen denselben Natriumphosphat-Puffer dialysiert, bis sie frei von Katalysator waren. Ein paar Gramm DOWEX 50 X8-Harz (20-50 mesh) in der H+-Form wurden in die Dialyseflüssigkeit einbezogen, um den Katalysator zu absorbieren. Proben von jeweils bestrahlten und nicht-bestrahlten Fibrillen wurden anschließend mit 6 N Salzsäure für 24 Stunden bei 110ºC in Vakuum hydrolysiert. Die Hydrolysate wurden getrocknet und etwa 50 mg gleichzeitig wurden einer Molekularsiebchromatographie auf einer BIO-GEL P2-400 mesh-Säule (1,6 x 100) unterzogen, die mit 0,1 M Essigsäure äquilibriert und mit einem 5 mg Säure- Hydrolysat von Na³BH&sub4;-reduzierten Kollagenfibrillen kalibriert worden war. Die Säule wurde überwacht, indem kleine Aliquote der Fraktionen abgenommen wurden, und entwickelte Färbung auf Aminosäure durch Ninhydrin und Szintillationszählung der Radioaktivität. Ruhevolumina (Fraktionen 33 bis 48) von natürlichen Vernetzungen von Kollagen (Vernetzungsfraktionen) wurden gepoolt, lyophilisiert und einer Aminosäureanalyse unterzogen.

Beim Vergleich der Aminosäure-Chromatogramme von den bestrahlten und nicht-bestrahlten Fibrillen tauchten sechs verschiedene neue Peaks im Hydrolysat aus den bestrahlten Fibrillen zwischen Phenylalanin und Hydroxylysin auf. Mit Ausnahme von Histadin (his) ist dieser Bereich üblicherweise eine Leerfläche bei einem nicht-bestrahlten Chromatogramm, und das Vorhandensein dieser Substanzen mit hohem Molekulargewicht zeigt die Bildung von vernetzten Aminosäuren an, die durch Photooxidation mit dem Farbstoff gebildet sind. Ein weiteres Anzeichen wurde geliefert durch das Nichtvorhandensein von his in diesem Bereich, wobei his durch Photooxidation zerstört worden war.

7. Wirkung von erhöhtem osmotischen Druck auf Vernetzung

Eine rechteckige Bestrahlungszelle wurde aus klarem Kunststoff konstruiert, mit einem Außenmantel aus demselben Material und Schläuchen, die mit der Innenkammer zur Zirkulierung von Medium und Farbstoff kommunizierten. Ein Rahmen, bestehend aus schmalen Streifen Kunststoff, die mit Abstand voneinander angeordnete Löcher entlang ihrer Länge einschlossen, zum Annähen von Gewebeproben daraus, wurde in einer Größe konstruiert, die in die Innenkammer der Zelle hineinpaßte. Nach dem Annähen eines Stücks Rinderherzbeutel an jenen Rahmen und Einbringen des Rahmens in die Innenkammer wurde ein Medium, das aus 2,8 M Kaliumchlorid, 11 = 0,164-Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4, der 50 % Saccharose einschloß, durch die Innenkammer der Bestrahlungszelle umgewälzt. Nach Tränken in dem Medium mit hohem osmotischen Druck wurde das Gewebe mit dem Medium, das Methylenchlorid einschließt, wie beschrieben in Beispiel 5 oben, inkubiert, und für 24 und 48 Stunden mit zwei 150 Watt-Strahlern in einem Abstand von etwa 4,5 cm bestrahlt, während die Temperatur bei zwischen -2ºC und 6ºC gehalten wurde.

Nach Bestrahlung wurden kleine Gewebestücke von jeder Probe mit Pepsin oder bakterieller Kollagenase verdaut, wie beschrieben in den Beispielen 4 und 5. Die folgenden Verhältnisse von hyp/mg Gewebe in Enzymsäulen belegen deutlich die Vernetzung der Gewebeproben.

Zusätzliche Gewebeproben wurden weiter stabilisiert (ohne scheinbare Veränderung in ihren taktilen Eigenschaften, z.B. Gewebetextur und Biegsamkeit) durch Reduktion der neu gebildeten Iminium-Bindungen durch Untertauchen in einer NaBH&sub4;-Lösung für eine Stunde, wie belegt durch die folgenden hyp/mg-Verhältnisse:

Zu Vergleichszwecken wurden, wenn ein kommerziell erhältlicher Herzbeutel-Patch, präpariert mit Glutaraldehyd-Gerbung, einer Pepsin-Verdauung bei 25ºC und 4ºC unterzogen wurde, Verhältnisse von 20 bzw. 16 nm hyp/mg Gewebe erhalten, und wenn verdaut mit Kollagenase bei 37ºC, wurden Verhältnisse von 32 und 35 nm hyp/mg Gewebe erhalten.

8. Vernetzung von Ratten-Kollagen

Lösliches BAPN-Ratten-Kollagen Typ I in 0,5 M HAc wurde aufgeteilt in sechs 4 ml-Proben und jede Probe in einen Dialysebeutel mit 300 mg NaCl gegeben (kein Salz wurde zugegeben zu Probe 5 und 6). Die Proben wurden in dem in Beispiel 7 beschriebenen Puffer mit hoher osmotischer Stärke (Proben 5 und 6 wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4, dialysiert) und 2 ml 0,2 % Methylenblau dialysiert. Proben 2 und 3 wurden in Puffer überführt, der 0,1 % Methylenblau in PBS einschloß, Probe 4 wurde überführt in PBS, die 0,01 % Methylenblau einschloß, und Proben 5 und 6 verblieben in PBS. Probe 2 wurde einem weißen 150 Watt-Strahler ausgesetzt, der etwa 7 Inches von der Oberfläche der Flüssigkeit angeordnet war, während die Temperatur zwischen etwa 8 und 12CC für 8 Stunden gehalten wurde. Proben 3 und 4 wurden für 24 Stunden unter denselben Bedingungen bestrahlt und Proben 5 und 6 wurden für 2 Stunden unter denselben Bedingungen bestrahlt. Alle Proben wurden anschließend in HAc zurückdialysiert, bis die Lösungen nicht länger blau waren, und anschließend mit SDS-PAGE analysiert, wie beschrieben in Beispiel 3 oben. Die Proben, die für 24 Stunden bestrahlt worden waren, waren stärker vernetzt, als diejenigen, die für 8 Stunden bestrahlt worden waren, und alle Proben waren stärker vernetzt als die Proben 5 und 6.

9. Verringerte Kalzifizierung in wachsenden Ratten.

Unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen wurde eine Reihe von Geweben prapariert und subkutan in den Bauch von wachsenden, drei Wochen alten Ratten implantiert. Die Kontrollgewebe waren kommerziell erhältlicher, mit Glutaraldehyd vernetzter Rinderherzbeutel (Pericard-A und Pericard B) und Schweineklappensegel (GL). Wie man in Fig. 3 sehen kann, kalzifizierte das Gewebe, das gemäß dem Verfahren behandelt worden war, nicht signifikant, verglichen mit dem kommerziellen Gewebe.

10. In-vivo-Abbau

Rinderherzbeutel-Proben, die behandelt worden waren wie beschrieben in Beispiel 3, wurden subkutan in den Bauch von erwachsenen, 6 Monate alten Ratten implantiert. Frischer Herzbeutel wurde als eine Kontrolle verwendet. Nach 3 Monaten Implantation war das frische Gewebe resorbiert, während der behandelte Herzbeutel intakt geblieben war, was wieder die vernetzte Natur des Produktes belegt.


Anspruch[de]

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines vernetzten Produktes, das zur Verwendung als ein biologisches Material geeignet ist, welches verdauungsresistent ist, wobei das Verfahren umfaßt, daß den natürlichen ähnliche Kollagenfibrillen mit einem photooxidativen Katalysator äquilibriert werden; und danach die Kollagenfibrillen, um Vernetzungen zwischen diesen zu bilden, in der Gegenwart von Sauerstoff oxidiert werden, indem die Kollagenfibrillen Licht ausgesetzt werden, während Temperatur und pH auf Niveaus gehalten werden, die ausreichend sind, um die Sauerstoffkonzentration im wäßrigen Medium aufrechtzuerhalten.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Probe der zu vernetzenden Kollagenfibrillen in einer wäßrigen Mediumlösung, die den photooxidativen Katalysator enthält, wobei die Mediumlösung auf einen pH im Bereich von 6,8 bis 8,6 gepuffert worden ist, für einen Zeitraum getränkt wird, der ausreichend ist, um Äquilibrierung der Konzentrationen von Mediumlösung, Kollagenfibrillen und Katalysator zu ermöglichen, und wobei die getränkten Kollagenfibrillen oxidiert werden durch Bestrahlung mit Licht in der Gegenwart von Sauerstoff für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um die Kollagenfibrillen zu vernetzen, während der pH der Mediumlösung im Bereich von 6,8 bis 8,6 und die Temperatur im Bereich von -2 bis 40ºC gehalten wird, um die Sauerstoffkonzentration der Mediumlösung aufrechtzuerhalten.

rechtzuerhalten.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei der pH im Bereich von 7,4 bis 8,0 gehalten wird.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Sauerstoffkonzentration im Medium während der Bestrahlung dadurch aufrechterhalten wird, daß die Sauerstoffkonzentration der Atmosphäre über dem Medium bei mehr als 0 bis zu 25 Vol.-% gehalten wird.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Sauerstoffkonzentration des Mediums während der Bestrahlung dadurch aufrechterhalten wird, daß die Sauerstoffkonzentration der Atmosphäre über dem Medium bei von 5 bis 20 Vol.-% gehalten wird.

6. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Kollagenfibrillen für von 100 bis 20.000 Lumenstunden bestrahlt werden.

7. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die Kollagenfibrillen in einer wäßrigen Pufferlösung getränkt werden, bevor sie in der wäßrigen Mediumlösung getränkt werden.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Osmolalität der Pufferlösung im Bereich von 393 bis 800 mosm liegt.

9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Osmolalität der Mediumlösung im Bereich von 150 bis 400 mosm liegt.

10. Ein Verfahrennach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei die Temperatur im Bereich von 0 bis 25ºC gehalten wird.







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