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Dokumentenidentifikation DE69311873T2 12.02.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0592692
Titel Fed-batch-Verfahren für Proteine sekretierende Zellen
Anmelder Teijin Ltd., Osaka, JP
Erfinder TAKAZAWA, Yoshiharu, Hino-shi, Tokyo 191, JP;
YOKOYAMA, Seiichi, Hino-shi, Tokyo 191, JP
Vertreter Müller-Boré & Partner, 81671 München
DE-Aktenzeichen 69311873
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 30.04.1993
EP-Aktenzeichen 939119657
WO-Anmeldetag 30.04.1993
PCT-Aktenzeichen JP9300586
WO-Veröffentlichungsnummer 9322448
WO-Veröffentlichungsdatum 11.11.1993
EP-Offenlegungsdatum 20.04.1994
EP date of grant 02.07.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.02.1998
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C12N 9/64   

Beschreibung[de]
Ausführliche Beschreibung der Erfindung Industrielles Anwendungsgebiet

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines brauchbaren Proteins, indem man Zellen das brauchbare Protein sekretieren läßt. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren, welches umfaßt die Züchtung einer menschlichen embryonalen, von der Niere stammenden 293-Zelle, die so transformiert ist, daß sie ein brauchbares Protein exprimiert, um eine Züchtungsflüssigkeit zu enthalten, welche das gewünschte brauchbare Protein in hoher Konzentration enthält, und die Gewinnung des brauchbaren Proteins aus der Züchtungsflüssigkeit.

Stand der Technik

Die Herstellung von brauchbaren Proteinen, insbesondere physiologisch aktiven Proteinen, durch Züchtung von tierischen Zellen, wird in weitem Umfang durchgeführt. Insbesondere sind Verfahren zur Herstellung von brauchbaren Proteinen durch Züchtung von tierischen Zellen, die so transformiert sind, daß sie die brauchbaren Proteine sekretieren, unerläßliche Arbeitsweisen zur Herstellung gewisser brauchbarer Proteine.

Tierische Zellen sind Bakterien und Hefen in der Fähigkeit der post-translationalen Modifikation überlegen. Wenn jedoch tierische Zellen verwendet werden, sind die Kosten für Medium und Reinigung verhältnismäßig hoch aufgrund der geringen Produktkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit. Daher ist es für die industrielle Erzeugung wichtig, die Konzentration der brauchbaren Proteine zu erhöhen, welche durch die tierischen Zellen sekretiert sind. Bei einer einfachen Ansatzzüchtungsmethode hält die Vermehrung der Zellen bei einem gewissen Punkt der Züchtungszeit an, hauptsächlich aufgrund der Erschöpfung der Nährstoffe, und auch die Sekretierung des Proteins hält ein. Um diese einfache Ansatzzüchtungsmethode zu verbessern, wird eine sogenannte Fed-batch-Züchtungsmethode durchgeführt, bei welcher erschöpfte Nährstoffe, z.B. Zucker, Aminosäuren oder ein frisches Medium, kontinuierlich oder intermittierend während der Züchtungsperiode zugeführt werden.

In dieser Beschreibung bedeutet eine "einfache Ansatzzüchtungsmethode" eine Methode, welche das Impfen von Zellen in ein Medium in einem Züchtungsgefäß zum Starten der Züchtung umfaßt, und die Durchführung der Züchtung ohne wesentliche Zugabe von einem Teil oder allen der Nährstoffe oder einem neuen Medium bis zur Beendigung der Züchtung, und ein "Fed-batch- Züchtungsverfahren" bedeutet ein Verfahren, das das Impfen von Zellen in ein Medium in einem Züchtungsgefäß zum Starten der Züchtung umfaßt und die Durchführung der Züchtung, während ein Teil oder alle der Nährstoffe oder ein frisches Medium kontinuierlich oder intermittierend in das Züchtungsgefäß zugegeben werden, ohne im wesentlichen Züchtungsflüssigkeit vom Züchtungsgefäß zu entnehmen.

Es ist bekannt, daß in einem Fed-batch-Züchtungsverfahren die Züchtungszeit verlängert und höhere Zelldichte und Produkt(Protein-)Konzentration erhalten werden können im Vergleich zu einer einfachen Ansatzzüchtungsmethode (J. B. Griffith, Animal Cell Culture and Production of Biologicals, S. 401-410, Klumer Academic Publishers, R. Sasaki und K. Ikura (Herausgeber), (1991), S. Reuveny et al., J. Immunol. Methods, 86, 53 (1986), S. Reuveny et al., J. Immunol. Methods, 86, 61 (1986)). In der obigen Literatur von J. B. Griffith wird ein Vergleich, der in der folgenden Tabelle 1 gezeigt ist, als typisches Beispiel angegeben.

Tabelle 1

Der obige S. Reuveny et al.-Artikel vergleicht eine einfache Ansatzkultur mit einer Fed-batch-Kultur in der letzteren der obigen Literaturstellen. Dieser Vergleichsversuch wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: (1) Die einfache Ansatzkultur umfaßte das Impfen von Hybridoma-Zellen mit einer Dichte von 3 x 10&sup5; Zellen/ml in 100 ml eines Mediums und die Durchführung der Züchtung für 8 Tage, und (2) die Fed-batch- Züchtung umfaßte das Impfen von Hybridoma-Zellen bei einer Dichte von 3 x 10&sup5;/ml in 60 ml eines Mediums, und dann Durchführung der Züchtung für 8 Tage, während 6 ml eines frischen Mediums einmal pro Tag zugesetzt wurden, nachdem die Dichte etwa 1 x 10&sup6; Zellen/ml 2 Tage nach dem Impfen bzw. der Inokulation geworden war. Die Ergebnisse zeigen, daß die Antikörperproduktivitäten in beiden Methoden 15 mg/l/Tag bzw. 27 mg/l/Tag sind. Somit lehren S. Reuveny et al. eine etwa 1,8- fache Zunahme der Produktivität (Antikörper) in der Fed-batch- Züchtung, verglichen mit der einfachen Ansatzzüchtung.

So können in einem Fed-batch-Züchtungsverfahren Zelldichte und Proteinkonzentration erhöht werden, verglichen mit einem einfachen Ansatzzüchtungsverfahren. Jedoch im Hinblick auf die Kosten des Mediums ist es bevorzugt, daß die Zellvermehrung bei einer gewissen Stufe eher unterdrückt wird und eine hohe Produktivität von Protein für lange Zeit aufrechterhalten wird. Ein Fed-batch-Züchtungsverfahren neigt dazu, daß viel Energie für die Zellvermehrung verbraucht wird. Wenn es daher möglich ist, die Zellvermehrung nach hinreichendem Zellwachstum zu unterdrücken und die Energie auf die Erzeugung der Substanz (Protein) zu richten, wird die Proteinkonzentration davon in der Züchtungsflüssigkeit weiter höher. Jedoch wurde bis jetzt kein billiges und wirksames Verfahren berichtet.

Andererseits zeigt EP 0343635A2 ein Verfahren, bei welchem die Calciumionenkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit bei einer niederen Konzentration von 0,002 bis 0,3 mM in einem Verfahren zur Züchtung einer anhaftenden tierischen Zellinie, wie einer humanen, embryonalen, von Nierenzellen stammenden 293- Zelle, der von Hamster abgeleiteten BHK-Zelle, der von Hamster abgeleiteten CHO-Zelle oder einer Transformation davon, kontinuierlich in einem serumfreien Medium in Suspensionszustand gehalten wird. Dieses Verfahren ist ein Verfahren zur Durchführung der kontinuierlichen Züchtung, wobei solche anhaftenden tierischen Zellen in einem Suspensionszustand gehalten werden, indem man die Calciumionenkonzentration bei dem obigen niederen Niveau hält, und ist ein sogenanntes Perfusions-Suspensions-Züchtungsverfahren, welches die kontinuierliche oder intermittierende Zufuhr eines frischen Mediums in das Züchtungsgefäß und die Entnahme des verbrauchten Mediums vom Züchtungsgefäß umfaßt. Somit ist es in diesem Verfahren schwierig, obwohl es möglich ist, anhaftende Zellen bei hoher Dichte und in einem Suspensionszustand für eine außerordentlich lange Zeitspanne zu züchten, ein brauchbares Protein, das durch die Zellen sekretiert wird, in einer hohen Konzentration anzusammeln, und die Kosten des Mediums zur Erzeugung des brauchbaren Proteins neigen dazu, beträchtlich hoch zu sein.

Probleme, die durch die Erfindung gelöst werden sollen

Das erste Ziel dieser Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Züchtung eines 293-Stamms bereitzustellen, der so transformiert ist, daß er ein gewünschte brauchbares Protein in einem Suspensionszustand gemäß einem Fed-batch-Züchtungsverfahren sekretiert.

Das zweite Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens einer Fed-batch-Züchtungsmethode, welches umfaßt die Vermehrung des Zellstamms bei der anfänglichen Stufe, die Unterdrückung einer wesentlichen Vermehrung der Zellen, nachdem die Zelldichte ein gewisses Niveau erreicht hat, und danach die Fortsetzung der Erzeugung des brauchbaren Proteins, indem man die Züchtung fur eine lange Zeitspanne aufrechterhält.

Das dritte Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens einer Fed-batch-Züchtungsmethode, wobei der Verbrauch an Medium bei der Erzeugung einer gewissen Menge des brauchbaren Proteins vermindert ist, nämlich ein Verfahren, bei dem Kosten des Mediums gespart werden.

Das vierte Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens umfassend die Züchtung des Zellenstammes in einer Suspensions-Fed-batch-Züchtung stabil für eine lange Zeitspanne, um eine Züchtungsflüssigkeit zu erhalten, welche ein brauchbares Protein in hoher Konzentration angesammelt enthält.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines industriellen Verfahrens, um eine Züchtungsflüssigkeit zu erhalten, welche ein brauchbares Protein in hoher Konzentration enthält, so daß das brauchbare Protein wirksam abgetrennt werden kann.

Ein noch weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Züchtungsverfahrens zur Erzielung der Züchtungsflüssigkeit, welche Protein C, aktiviertes Protein C oder ein physiologisch aktives Protein mit ähnlicher Aktivität zu ihnen in hoher Konzentration enthält.

Noch weitere Ziele dieser Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

Mittel zur Lösung der Probleme

Als Ergebnis sorgfältiger Forschungen haben die vorliegenden Erfinder gefunden, daß die Ziele und Vorteile dieser Erfindung erreicht werden können durch ein Fed-batch-Verfahren zur Erzeugung eines brauchbaren Proteins durch Züchtung in Suspension Zellen einer menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellinie (ATCC CRL 1573), die so transformiert ist, daß sie ein Gen enthalten, das dieses Protein kodiert, und dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Stufen umfaßt:

(a) Starten der Züchtung der Zellen in einem Züchtungsmedium, das in einem Züchtungsgefäß enthalten ist bei einer Zelldichte von 5 x 10&sup4; bis 5 x 10&sup5; Zellen/ml,

(b) Zugabe eines Zuckers in das Züchtungsgefäß, um eine Zukkerkonzentration von 1 bis 7 g/l zu jedem Zeitpunkt zu ergeben, nachdem die Zelldichte im Züchtungsgefäß dreimal höher geworden ist als die Ausgangszelldichte, und wenn die Zelldichte in einem Bereich von 5 x 10&sup5; bis 5 x 10&sup6; Zellen/ml ist,

(c) Fortsetzung der Züchtung, bis die Konzentration des Proteins nicht länger wesentlich zunimmt, während der pH- Wert der Züchtungsflüssigkeit aufrechterhalten wird, und dann Abbrechen der Züchtung, und

(d) Entnahme der Züchtungsflüssigkeit vom Züchtungsgefäß und Gewinnung des Proteins aus der Züchtungsflüssigkeit.

Im Verfahren dieser Erfindung kann eine wenigstens 6- bis 7- mal höhere Produktkonzentration erhalten werden, verglichen mit einer einfachen Ansatzzüchtung ohne Zugabe eines Zuckers, indem man einen transformierten 293-Stamm auswählt und eine gewisse Menge eines Zuckers in einer gewissen Stufe der Züchtung zusetzt. Weiter kann ein brauchbares Protein selbst beim Vergleich mit einem Verfahren, bei welchem ein frisches Medium zusätzlich in der Mitte der Züchtung zugesetzt wird, wie dies gewöhnlich bei einer Fed-batch-Züchtungsmethode in die Praxis umgesetzt wird, in mehrfach größerer Menge im Verfahren dieser Erfindung erhalten werden.

Obwohl der Grund nicht klar ist, dürfte dieses Phänomen dem inhärenten Charakter des 293-Stammes zuzuschreiben sein zu dem Zucker, der in der Mitte der Kultur zugesetzt wird.

Weiter zeigt eine andere Feststellung der vorliegenden Erfindung, daß es möglich wird, daß die 293-Zellen eine weitere große Menge von brauchbarem Protein sekretieren, indem man die Züchtung des 293-Stammes in einem Medium startet, welches Calciumionen in geringer Konzentration enthält, und ein Calciumsalz zusammen mit einem Zucker in einer gewissen Stufe der Züchtung zusetzt. Gemäß dieser weiteren Feststellung wird die Vermehrung der Zellen im wesentlichen unterdrückt, und die Sekretion des brauchbaren Proteins wird weiter durch die Zugabe des Calciums begünstigt. Daher wird es möglich, das brauchbare Protein in größerer Menge zu erhalten.

Somit wird gemäß einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung ein Fed-batch-Verfahren zur Erzeugung eines brauchbaren Proteins geliefert durch Züchtung in Suspension Zellen der humanen embryonalen Nieren-293-Zellinie (ATCC CRL 1573), die so transformiert ist, daß sie ein Gen enthalten, welches dieses Protein kodiert, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Stufen umfaßt:

(i) Starten der Züchtüng der Zellen in einem Züchtungsmedium, das in einem Züchtungsgefäß enthalten ist und eine Calciumionenkonzentration von 0,002 bis 0,25 mM hat bei einer Zelldichte von 5 x 10&sup4; bis 5 x 10&sup5; Zellen/ml,

(ii) Vermehrung der Zellen, bis die Zelldichte in der Züchtungsflüssigkeit dreimal oder höher wird als die Ausgangszellendichte in einem Bereich von 5 x 10&sup5; bis 5 x 10&sup6; Zellen/ml,

(iii) Zugabe eines Zuckers und von Calcium zu der Züchtungsflüssigkeit, so daß eine Zunahme der Zelldichte im wesentlichen unterdrückt wird und die Erzeugung des Proteins aufrechterhalten bleibt,

(iv) Fortsetzen der Züchtung, bis die Konzentration des Proteins im Züchtungsgefäß nicht mehr wesentlich zunimmt, und dann Abbrechen der Züchtung, und

(v) Entnahme der Züchtungsflüssigkeit aus dem Züchtungsgefäß und Gewinnung des Proteins aus der Züchtungsflüssigkeit.

Das Verfahren dieser Erfindung wird anschließend deutlicher beschrieben.

Eine Zellinie, die in dieser Erfindung benutzt wird, ist ein Transformant des menschlichen, embryonalen, von Nierenzellen stammenden 293-Stammes. Dieser menschliche, embryonale, von Nierenzellen stammende 293-Stamm selbst ist bekannt, und z.B. bei ATCC unter der Zugangsnummer CRL 1573 hinterlegt, und ist daher eine Zellinie, die leicht zu erhalten ist. Beim Verfahren dieser Erfindung wird ein Transformant gezüchtet, der erhalten ist durch Einführen eines brauchbares Protein exprimierenden Gens in diesen 293-Stamm. Dieser Transformant des 293- Stammes ist eine Zellinie, worin ein Gen so integriert wurde, daß es ein beabsichtigtes Protein sekretiert. Als brauchbare Zielproteine können Protein erwähnt werden, welche verschiedene physiologische Eigenschaften haben. Brauchbare Proteine können Gla-Proteine sein. Solche Gla-Proteine sind Proteine, die eine G1a-Domäne haben, und spezifische Beispiele sind Protein C, aktiviertes Protein C, der Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin, Osteocalcin, Protein S, Protein Z und dergleichen.

Insbesondere eignet sich das Verfahren dieser Erfindung zur Herstellung von menschlichem Protein C, aktiviertem menschlichen Protein C, Proteinen mit physiologischer Aktivität ähnlich zu diesen oder Vorläuferproteinen davon. In Obigem bedeutet Vorläuferproteine solche, die in menschliches Protein C, aktiviertes menschliches Protein C oder Proteine mit einer physiologischen Aktivität ähnlich zu diesen durch Verfahren, wie teilweise Konversion, Spaltung oder Deletion der Proteine überführt werden können.

Der 293-Stamm, der menschliches Protein C oder aktiviertes menschliches Protein C exprimiert, ist an sich bekannt, und die bekannten Transformanten des 293-Stammes eignen sich als Zellinie, die für das Verfahren dieser Erfindung anwendbar ist (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,968,626 und EP 319944A2).

Im Verfahren dieser Erfindung wird der Transformant des obenerwähnten 293-Stammes in einem Suspensionszustand durch ein Fed-batch-Verfahren gezüchtet. Bei dieser Gelegenheit kann ein zu verwendendes Züchtungsgefäß ein Gefäß sein, das bei der üblichen Ansatzzüchtung verwendet wird, z.B. ein Gefäß vom Tanktyp. Dieser Transformant des 293-Stammes ist eine anhaftende Zellinie, und um daher die Zellen in einem Suspensionszustand im Züchtungsgefäß zu halten, wird die Züchtung unter Rühren durchgeführt. Daher wird die Züchtung durch die übliche Züchtungsmethode unter Rühren durchgeführt.

Das Züchtungsgefäß ist mit Sauerstoffzufuhrmitteln zusammen mit Rührmitteln ausgerüstet. Sauerstoff kann zugeführt werden durch Einperlen von Sauerstoffgas oder Luft oder Verwendung eines gasdurchlässigen porösen Rohrs oder durch jede andere geeignete Maßnahme. Als poröses Rohr wird ein Teflon -Rohr oder ein Siliconkautschukrohr empfohlen. Sauerstoff wird so zugeführt, daß gelöster Sauerstoff bei etwa 2 bis 5 ppm, vorzugsweise etwa 3 ppm, in der Züchtungsflüssigkeit aufrechterhalten werden kann.

Viele Arten von Züchtungsmedien können für das Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Synthetische Medien, die wohlbekannt und in weitem Umfang verwendet werden, können als Grundmedien verwendet werden. Als Grundmedien seien erwähnt RPMI-1640 (RPMI-1640-Medium), MEM (Eagle's minimum essential medium), DME (Dulbecco's Modifizierung von Eagle's Medium), Isocove (Isocove's Modifizierung von Dulbecco's Medium), 199 (199-Medium), F10 (Ham's F10-Medium), F12 (Ham's F12-Medium), und dergleichen. Alle diese Grundmedien sind im Handel erhältlich und leicht zu haben.

Diese Medien werden allein oder in einer geeigneten Kombination von zwei oder mehr verwendet, und verschiedene Aminosäuren, Vitamine, anorganische Salze und Glucose können zusätzlich zugegeben werden, um ein modifiziertes Medium herzustellen.

Beim Verfahren dieser Erfindung kann ein serumfreies Medium benutzt werden, und seine Verwendung ist erwünscht, um die Kosten des Mediums zu verringern. Obwohl auch Medien, welche Serum enthalten, benutzt werden können, sind die Kosten des Mediums im allgemeinen hoch, und daher ist der Vorteil der Zugabe von Serum gering. Selbst wenn Serum zugegeben wird, ist die Menge vorzugsweise höchstens 5 Vol.-%, noch bevorzugter höchstens 3 Vol.-%.

Es ist industriell vorteilhaft, das Verfahren dieser Erfindung durchzuführen, indem man ein serumfreies Medium verwendet. Bei dieser Gelegenheit kann "eRDF"-Medium als Grundmedium benutzt werden. Dieses eRDF-Medium ist ein Medium, das erhalten wird durch Mischen von RPMI-1640-Medium, Hams's F12-Medium und Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium in einem Verhältnis von 2:1:1, und weiter Zugabe von Glucose, Aminosäuren und dergleichen erhalten ist, und ist ein Medium, das als solches bekannt ist (siehe Monoklonale Antikörper: Herstellung und Anwendung, S. 107-141, Alan R Liss, Inc. 1989, und Hiroki Murakami, "Serumfreie Medien, die zur Züchtung von Hybridomen benutzt werden").

Das obenerwähnte Grundmedium oder das eRDF-Medium enthält gewöhnlich etwa 0,3 mM oder mehr, insbesondere etwa 0,5 mM bis etwa 2 mM Calciumion.

Im Verfahren dieser Erfindung ist es erwünscht, zum Grundmedium weiter Wachstumsfaktoren zuzusetzen, z.B. ITES (ein Gemisch von Insulin, Transferrin, Ethanolamin und Natriumselenit).

Wie oben erwähnt, ist es eine der bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens dieser Erfindung, die Züchtung unter Verwendung eines Mediums zu starten, das Calciumion in geringer Konzentration enthält. Ein solches Calciumion in geringer Konzentration enthaltendes Medium (im folgenden manchmal als "geringes Ca-Medium" bezeichnet) bedeutet ein Medium, das 0,0025 bis 0,25 mM, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 mM Calciumionen enthält.

Da die obenerwähnten Grundmedien in vielen Fällen Calciumion in höherer Konzentration enthalten als diejenigen der geringen Ca-Medien, sollte speziell ein Medium, das kein Calciumion enthält oder Calciumion in außerordentlich geringer Menge enthält, speziell hergestellt werden, um ein geringes Ca-Medium für die bevorzugte Ausführungsform herzustellen. Somit ist es erwünscht, ein Medium zu verwenden, das hergestellt ist unter Verwendung einer eRDF-Zusammensetzung in einer geringen Calciumkonzentration als Grundmedium.

Bei der Fed-batch-Züchtungsmethode dieser Erfindung wird die Züchtung gestartet, indem man einen Transformant des 293-Stammes in das Medium in einem Züchtungsgefäß impft. Bei dieser Gelegenheit ist es vorteilhaft, die Zellen in einer Dichte im Bereich von 5 x 10&sup4; bis 5 x 10&sup5; Zellen/ml zu impfen, vorzugsweise in einer Dichte im Bereich von 8 x 10&sup4; bis 3 x 10&sup5; Zellen/ml. Wenn die Impfzellendichte geringer ist als der obige Bereich, erfordert es lange Zeit, eine gewünschte Dichte zu erhalten, und es werden beträchtliche Nährstoffe verbraucht, bevor die Dichte erreicht ist, und demgemäß wird es schwierig, ein gewünschtes brauchbares Protein effizient zu erhalten. Andererseits, wenn die Züchtungszellendichte höher ist als der obige Bereich, wird es nötig, eine Menge Zellen zuzubereiten, bevor die Züchtung gestartet wird, was wirtschaftlich nachteilig ist.

Im allgemeinen nimmt die Zelldichte allmählich zu, wenn die Züchtung gestartet und fortgesetzt wird, und dabei erhöht sich auch die Konzentration des brauchbaren Proteins, und nach weiterer Fortsetzung der Züchtung erreicht die Zelldichte einen Maximumswert. Die Zellen sterben danach, und die Züchtung geht zu Ende.

Im Verfahren dieser Erfindung wird ein Zucker zur Züchtungsflüssigkeit bei irgendeinem Punkt der Züchtungszeit zugesetzt, wenn nach dem Start der Züchtung die Zelldichte dreimal oder noch höher wird als die Impfdichte und den Bereich von 5 x 10&sup5; bis 5 x 10&sup6; Zellen/ml erreicht. Es ist besonders bevorzugt, den Zucker bei irgendeinem Punkt der Züchtugnsperiode zuzusetzen, wenn die Zelldichte viermal oder noch höher wird als die Impfzellendichte, und wenn die Zelldichte im Bereich von 8 x 10&sup5; bis 3 x 10&sup6; Zellen/ml ist.

Weiter ist es erwünscht, die Zugabezeit des Zuckers zu bestimmen, indem man die Zelldichte und die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit überwacht. Es ist nämlich vorteilhaft, einen Zucker zwischen der Zeit zuzusetzen, wenn die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 70% oder weniger, vorzugsweise 50% oder weniger wird als die Anfangskonzentration und der Zeit, wo die Zuckerkonzentration 0,2 g/l, vorzugsweise 0,3 g/l wird.

Im Verfahren dieser Erfindung ist es angemessen, die Zugabe eines Zuckers in der Mitte der Züchtung im obigen Bereich vorzunehmen, nach Überwachung der Zelldichte und der Zuckerkonzentration. Die Menge eines zuzusetzenden Zuckers hängt von der Zelldichte und der Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit zum Zeitpunkt der Zugabe, der Züchtungszeit oder der Calciumionenkonzentration und dergleichen ab. Jedoch wird der Zucker im allgemeinen so zugegeben, daß die Zuckerkonzentration mit der Züchtungsflüssigkeit 1 bis 7 g, vorzugsweise 2 bis 5 g pro Liter Züchtungsflüssigkeit werden kann.

Als zuzugebenden Zucker können Glucose, Mannose oder Fructose oder dergleichen erwähnt werden, jedoch sind Glucose oder Mannose bevorzugt, und Glucose ist am meisten erwünscht.

Die Anzahl der Zugaben des Zuckers kann einmal oder zweimal oder mehr sein, solange die Zugabe im Verlauf der obigen Zeit gemacht wird. Jedoch ist der Vorteil der wiederholten Zugabe eines Zuckers klein, und das Ziel wird vollkommen erreicht, indem man ihn einmal zusetzt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung ist es, eine Züchtung unter Verwendung eines niederen Calcium-Mediums, wie oben erwähnt, zu starten, und, wie oben erwähnt, eine spezifische Menge eines Zuckers zur Züchtungsflüssigkeit in der Mitte der Züchtung zuzusetzen und ein Calciumsalz zuzusetzen.

In diesem Fall ist es vorteilhaft, einen Zucker und ein Calciumsalz zur Züchtungsflüssigkeit so zuzusetzen, daß die Zelldichte im Züchtungsgefäß im Bereich von ±50% (-50% bis +50%), vorzugsweise im Bereich von ±30% (-30% bis +30%) der Standard- Maximumszelldichte gesteuert wird. Durch eine solche Zugabe des Zuckers und des Calciumsalzes wird die Zunahme der Zelldichte im wesentlichen unterdrückt, und die Züchtungszeit wird bemerkenswert verlängert, ohne irgendeine Abnahme der Sekretion eines brauchbaren Proteins. Die "Standard-Maximumszelldichte" bedeutet den Wert einer maximalen Dichte, der in der Züchtungsflüssigkeit erreicht wird, wenn eine einfache Ansatzzüchtung unter den gleichen Züchtungsbedingungen wie eine Fedbatch-Züchtung durchgeführt wird, in welcher Zucker und Calciumsalz in der Mitte der Züchtung zugegeben werden, und sie kann leicht durch einen vorläufigen Versuch bestimmt werden.

Die Zeit der Zugabe des Calciums kann in fast dem gleichen Bereich sein wie die des Zuckers, jedoch ist es unnötig, das Calcium zusammen mit dem Zucker zur gleichen Zeit zuzugeben. Vorzugsweise wird das Calciumsalz in solcher Menge zugegeben, daß die Calciumionenkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 0,3 bis 3 mM zu irgendeiner Zeit zwischen der Zeit wird, wenn die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 50% oder weniger der Zuckerkonzentration zum Zeitpunkt des Starts der Züchtung wird, und der Zeit vor dem Verlauf von zwei Tagen nach der Zugabe des Zuckers.

Wenn eine Züchtung so unter Verwendung eines niederen Calcium- Mediums gestartet wird, und ein Zucker und Calcium in der Mitte der Züchtung zugesetzt werden, wird die Zunahme der Zelldichte praktisch nach ihrer Zugabe unterdrückt, und die Erzeugung eines brauchbaren Proteins wird für eine lange Zeitspanne aufrechterhalten, und daher kann eine Züchtungsflüssigkeit erhalten werden, welche das brauchbare Protein in hoher Konzentration enthält.

Die Zugabe des Calciumsalzes wird vorteilhafterweise zu irgendeinem Zeitpunkt zwischen der Zeit, wenn die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 70% oder weniger der Zukkerkonzentration zum Zeitpunkt des Starts der Züchtung wird und der Zeit der Zugabe des Zuckers. Sie kann mit der Zugabe des Zuckers gleichzeitig erfolgen. Es ist noch bevorzugt, das Calcium so zuzugeben, daß die Calciumionenkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 0,5 bis 2,5 mM wird.

Zuzusetzende Calciumsalze können solche sein, die in Wasser löslich sind, z.B. Calciumchl6rid (CaCl&sub2;) oder Calciumnitrat (Ca(NO&sub3;)&sub2;).

Obwohl die Zellen durch die Zugabe des Calciumsalzes dazu neigen, zu aggregieren und Klumpen zu bilden, ist die Größe der Klumpen nicht so groß, daß sie eine wesentliche Behinderung der Aufrechterhaltung der Sekretion des brauchbaren Proteins bewirken, da die Zunahme der Zelldichte im wesentlichen unterdrückt wird.

Somit wird in der Züchtung im Verfahren dieser Erfindung der pH-Wert der Züchtungsflüssigkeit im Bereich von 6,5 bis 7,8, vorzugsweise im Bereich von 6,6 bis 7,5 gehalten.

Es ist erwünscht, daß die Züchtung fortgesetzt wird, während die Konzentration des brauchbaren Proteins in der Züchtungsflüssigkeit überwacht wird, und die Züchtung abgebrochen wird, wenn keine wesentliche Zunahme der Konzentration des brauchbaren Proteins mehr erkannt wird.

Nach Beendigung der Züchtung wird die Züchtungsflüssigkeit aus dem Gefäß entnommen, und die Zellen werden abgetrennt und entfernt. Zur Abtrennung der Zellen wird eine Maßnahme, wie Filtration oder Zentrifugieren, benutzt. Für die Gewinnung des brauchbaren Proteins aus der Züchtungsflüssigkeit, aus welcher die Zellen entfernt sind, wird eine geeignete Methode gewählt, je nach der Art des brauchbaren Proteins. Z.B. wird immunologische Adsorption, Adsorption an Ionenaustauscherharz oder dergleichen angewandt.

Wenn das brauchbare Protein menschliches Protein C, aktiviertes menschliches Protein C, ein Protein mit einer physiologischen Aktivität ähnlich der von ihnen oder ein Vorläuferprotein davon ist, kann das brauchbare Protein z.B. durch eine Trennmethode gewonnen werden unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, wie dies im US-Patent Nr. 4,902,614 gezeigt ist, oder eine Abtrennmethode unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, wie dies im US-Patent Nr. 4,981,852 gezeigt ist.

Wirkung der Erfindung

Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung ist es möglich, eine Züchtungsflüssigkeit zu erhalten, welche ein brauchbares Protein in hoher Konzentration enthält, und die Menge des verbrauchten Mediums pro erhaltenem brauchbaren Protein außerordentlich zu erniedrigen durch die Züchtung eines Transformanten des 293-Stammes. Somit ist es möglich, die Kosten der Erzeugung eines brauchbaren Proteins signifikant zu verringern, da der Verbrauch an teurem Medium herabgesetzt wird und die Zucker und Calciumsalze, die in der Mitte der Züchtung zuzusetzen sind, außerordentlich billig sind.

Das folgende sind ein Verbrauch des Mediums pro Einheitsmenge (mg) des brauchbaren Proteins in einer kontinuierlichen Perfusionszüchtungsmethode, einer einfachen Ansatzzüchtungsmethode, einer herkömmlichen Fed-batch-Züchtungsmethode und der Fedbatch-Züchtungsmethode gemäß der Erfindung.

Züchtungsmethoden:

(A) eine kontinuierliche Perfusionszüchtungsmethode (EP 0343635A2),

(B) eine einfache Ansatzzüchtungsmethode (ein frisches Medium, ein Zucker und ein Calciumsalz wurden überhaupt nicht in der Mitte der Züchtung zugesetzt),

(C) eine herkömmliche Fed-batch-Züchtungsmethode (ein frisches Medium wurde in der Mitte der Züchtung zugesetzt),

(D) eine Fed-batch-Züchtungsmethode der Erfindung (ein Zucker und ein Calciumsalz wurden in der Mitte der Züchtung zugesetzt).

Die Voraussetzungen für die Berechnung:

(1) Zellenstamm

Der menschliche Protein C-erzeugende 293-Stamm, der in Beispiel 1 verwendet wird.

(2) Brauchbares Protein

Menschliches Protein C (PC).

(3) Medium

ITES eRDF, enthaltend 0,1 mM Calciumionen.

(4) Volumen des Züchtungsgefäßes 350 ml.

(5) Kontinuierliche Perfusionszüchtungsmethode

Es wird angenommen, daß, nachdem die PC-Konzentration das Maximum erreicht hat, die Konzentration während der Züchtungsperiode aufrechterhalten bleibt (die Perfusionsgeschwindigkeit ist 300 ml/Tag).

(6) Züchtungszeit

6 Monate (im Fall der Ansatzzüchtungsmethode wird die anfängliche Ansatzzüchtung durchgeführt, bis die PC-Konzentration das Maximum erreicht hat, und es wird angenommen, daß der Ansatz wiederholt wird, wobei die Anzahl der Tage, die für die anfängliche Ansatzzüchtung nötig sind, als sich wiederholende Einheit genommen wird).

(7) Maximale PC-Konzentration in der Züchtungsflüssigkeit und die Anzahl der Tage der Züchtung

Wie in Tabelle 2 gezeigt.

(8) Menge des verwendeten Mediums und Menge des erzeugten PC Wie in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 2
Tabelle 3

Wie aus den obigen Tabellen ersichtlich ist, ist es gemäß dem Verfahren dieser Erfindung möglich, ein Protein mit einer außerordentlich kleinen Menge an Medium zu erzeugen. Eine gewöhnliche Fed-batch-Züchtungsmethode (C) ist im allgemeinen eine Methode der Zugabe eines frischen Mediums, jedoch im Verfahren dieser Erfindung ist es möglich, die Menge des verwendeten Mediums stärker zu senken als bei dieser Methode (C).

Kurze Beschreibung der Zeichungen

Fig. 1 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Beispiel 1 zeigt.

Fig. 2 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Vergleichsbeispiel 1 zeigt.

Fig. 3 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Vergleichsbeispiel 2 zeigt.

Fig. 4 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Beispiel 2 zeigt.

Fig. 5 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Beispiel 3 zeigt.

Fig. 6 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Vergleichsbeispiel 3 zeigt.

Fig. 7 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Vergleichsbeispiel 4 zeigt.

Fig. 8 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Vergleichsbeispiel 5 zeigt.

Fig. 9 ist eine Zeichnung, welche die Ergebnisse der Züchtung von Vergleichsbeispiel 6 zeigt.

Fig. 10 ist eine Zeichnung, welche den Umriß der Herstellungsverfahren für BHK/J3-26 zeigt.

Beispiele

Das Verfahren dieser Erfindung wird spezifisch nachfolgend gemäß den Beispielen beschrieben.

Beispiel 1 1) Medium

Als Grundmedium wurde eRDF (ein Gemisch von RPMI-1640, DME und F12 in einem Verhältnis von 2:1:1, angereichert mit Aminosäuren, Glucose, usw.), dem Calciumsalze (Calciumchlorid und Calciumnitrat) mit Ausnahme von Calciumpantothenat entzogen waren [im folgenden als niederes Ca-eRDF bezeichnet], benutzt. Insulin, Transferrin, Ethanolamin und Natriumselenit (ITES) wurden als Wachstumsfaktoren zugegeben. Die Konzentration von ITES war 9 µg/ml, 10 µg/ml, 10 µM bzw. 20 µM.

2) Züchtungsmethode und Ergebnisse

Das Züchtungsmedium wurde in ein 350 ml-Züchtungsgefäß gegeben, vorher im Autoklaven sterilisiert, so daß das Netto-Züchtungsvolumen etwa 300 ml wurde, und dahinein wurde ein Protein C-erzeugender Stamm 293/21-26 geimpft, der durch Einführung eines Gens erhalten war, welches die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C kodiert, in den 293-Stamm, der von einer menschlichen embryonalen Nierenzelle abgeleitet war, welche von ATCC erhalten war unter Verwendung der Methode, die in WO 92/13079 gezeigt ist.

Sauerstoffgas wurde in die Gasphase über der Züchtungsflüssigkeit im Züchtungsgefäß eingeführt, um die gelöste Sauerstoffkonzentration bei 3 ppm zu halten.

Die Züchtungsflüssigkeit im Züchtungsgefäß wurde bei 37ºC gehalten. Das Züchtungsgefäß war mit einem Kreiselrührer vom Schiffsschraubentyp ausgerüstet, und die Rührgeschwindigkeit war 40 UpM.

Acht Tage nach Starten der Züchtung wurden 1,0 g D-Glucose und 32,6 mg Calciumchloriddihydrat in Form von 3 ml einer gemischten wäßrigen Lösung zugegeben (die Konzentration jeder Komponente in der Züchtungsflüssigkeit war 19 mM für Glucose und 0,74 mM für Calciumchlorid).

Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. In Fig. 1 bedeutet PC menschliches Protein C (dies gilt für die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele). Die Zellinie, das Medium und die Zusätze in der Mitte der Züchtung, die in diesem Beispiel verwendet wurden, waren wie folgt.

Zellen: 293/21-26

Medium: 0,1 mM CaCl&sub2; + niederes Ca eRDF + ITES

Zusätze in der Mitte der Züchtung:

1 g Glucose + 32,6 mg Calciumchloriddihydrat (3 ml einer gemischten wäßrigen Lösung)

Vergleichsbeispiel 1

Die gleichen Arbeitsgänge wie in Beispiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß keine Zugabe in der Mitte der Züchtung vorgenommen wurde. Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Die Zellinie, das Medium und die Zusätze in der Mitte der Züchtung, die in diesem Beispiel verwendet wurden, waren wie folgt.

Zellen: 293/21-26

Medium: 0,1 mM CaCl&sub2; + niederes Ca eRDF + ITES

Zusätze in der Mitte der Züchtung: keine

Vergleichsbeispiel 2

Die gleichen Arbeitsgänge wie im Vergleichsbeispiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß eRDF (Calciumionenkonzentration = 0,74 mM) als Grundmedium benutzt wurde. Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Die Zellinie, das Medium und die Zusätze in der Mitte der Züchtung, die in diesem Beispiel verwendet wurden, waren wie folgt.

Zellen: 293/21-26

Medium: eRDF + ITES

Zusätze in der Mitte der Züchtung: keine

Beispiel 2

Die gleichen Arbeitsgänge wie in Beipsiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß nur Glucose als Zusatz in der Mitte der Züchtung verwendet wurde. Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Die Zellinie, das Medium und die Zusätze in der Mitte der Züchtung, die in diesem Beispiel benutzt wurden, waren wie folgt.

Zellen: 293/21-26

Medium: 0,1 mM CaCl&sub2; + niederes Ca eRDF + ITES

Zusätze in der Mitte der Züchtung:

1 g Glucose (3 ml einer wäßrigen Lösung)

Beispiel 3

Die gleichen Arbeitsgänge wie in Vergleichsbeispiel 3 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß eRDF als Grundmedium benutzt wurde. Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Die Zellinie, das Medium und die Zusätze in der Mitte der Züchtung, die in diesem Beispiel verwendet wurden, waren wie folgt.

Zellen: 293/21-26

Medium: eRDF + ITES

Zusätze in der Mitte der Züchtung:

1 g Glucose (3 ml einer wäßrigen Lösung)

Vergleichsbeispiel 3

Die gleichen Arbeitsgänge wie in Beispiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß nur Calciumchlorid als Zusatz in der Mitte der Züchtung benutzt wurde. Die Züchtungsergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Die Zellinie, das Medium und der Zusatz in der Mitte, die in diesem Vergleichsbeispiel verwendet wurden, waren wie folgt.

Zellen: 293/21-26

Medium: 0,1 mM CaCl&sub2; + niederes Ca eRDF + ITES

Zusätze in der Mitte der Züchtung:

32.6 g Calciumchloriddihydrat (3 ml einer wäßrigen Lösung)

Vergleichsbeispiel 4

Die gleichen Arbeitsgänge wie in Vergleichsbeispiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß das anfängliche Züchtungsvolumen 150 ml war, und ein frisches Medium wurde mit konstanter Geschwindigkeit (6,25 ml/h) über eine Zeitspanne vom vierten Tag bis zum fünfte Tag der Züchtung zugeführt, um das Züchtungsvolumen auf 300 ml zu bringen. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.

Die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 3 und Vergleichsbeispiele 1 bis 4 sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Vergleichsbeispiel 5

Die gleichen Arbeitsgänge wie im Vergleichsbeispiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß ein menschliches Protein C erzeugende Zellinie Stamm BHK/J3-26 anstelle von 293/21-26 verwendet wurde. Dieser BHK/J3-26 ist eine Zellinie, die erhalten ist durch Einführung eines Gens, welches die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C kodiert in den BHK-Zellstamm gemäß der unten beschriebenen Methode. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 6

Die gleichen Arbeitsgänge wie im Beispiel 1 wurden durchgeführt mit der Ausnahme, daß die in Vergleichsbeispiel 5 erwähnte BHK/J3-26-Zellinie anstelle von 293/21-26 verwendet wurde und der folgende Zusatz in der Mitte der Züchtung benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt.

0,5 g Glucose + 32,6 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O

(3 ml einer gemischten wäßrigen Lösung)

In den obigen Beispielen und Vergleichsbeispielen wurden 293/21-26 bzw. BHK/J3-26 nach den folgenden Methoden hergestellt.

(A) Herstellung von 293/21-26

Der 293-Stamm wurde mit dem Plasmid TZm5-PC9002 transformiert, das eine DNA-Sequenz hat, welche die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C kodiert, wie dies auf S. 25 der WO 92/13079 beschrieben ist gemäß der Methode, die ebenfalls in WO 92/13079 beschrieben ist, um die menschliches Protein C erzeugende Zellinie 293/21-26 zu erhalten.

(B) Herstellung von BHK/J3-26

Das Plasmid TZm1D-9002, das eine DNA-Sequenz hat, welche die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C kodiert, wurde in den BHK-Stamm eingesetzt, und das Plasmid ZmB4 KEX2, das eine DNA-Sequenz hat, welche die Aminosäuresequenz von KEX2 kodiert (Herstellungsmethode nachfolgend beschrieben), und das obige TZm5-PC9002 wurden co-transfiziert, um BHK/J3-26 zu erhalten.

Methoden zur Herstellung von TZm1D-9002 und ZmB4 KEX 2

TZm1D-9002 und ZmB4 KEX2 wurden hergestellt aus ZmB3 KEX2 und ZmB4 1058 (die Herstellungsmethoden sind nachfolgend beschrieben) durch die folgenden Arbeitsweisen. Die Arbeitsweisen sind in Fig. 10 umrissen.

ZmB3 KEX2 wurde mit SfiI und NdeI gespalten, und das das KEX2- Gen enthaltende DNA-Fragment von 4,31 Kbp wurde isoliert (K- Fragment). Weiter wurde ZmB4 1058 mit ApaI, SfiI und NdeI gespalten, und das das DHFR-Gen enthaltende DNA-Fragment von 3,46 Kbp wurde isoliert (D-Fragment). K-Fragment und D-Fragment wurden ligiert, um ZmB4 KEX2 zu erhalten.

Weiter wurde TZm1D-9002 mit SfiI und NdeI gespalten, und das menschliches Protein C enthaltende DNA-Fragment von 5,98 Kbp wurde isoliert (P-Fragment). P-Fragment und D-Fragment wurden ligiert, um TZm1D-9002 zu erhalten.

Methode zur Herstellung von ZmB3 KEX2

Das Plasmid KEX/Zem 229, das in EP 0319944A2 beschrieben ist, wurde mit Bam HI gespalten, und das das KEX2-Gen enthaltende DNA-Fragment wurde isoliert (D'-Fragment). Weiter wurde das Plasmid ZmB3, das in WO 91/09960 beschrieben ist, mit Bam HI gespalten, und das erhaltene Fragment und das D'-Fragment wurden ligiert, um ZmB3 KEX2 zu erhalten.

Methode zur Herstellung von ZmB3 1058

pDX/PC1058, beschrieben in EP 0266190, wurde mit EcoRI gespalten, und das menschliches Protein C enthaltende DNA-Fragment wurde isoliert (P'-Fragment). Weiter wurde das Plasmid PC962/ZMB-4, beschrieben in WO 91/09960, mit EcoRI gespalten, und das DNA-Fragment, welches kein menschliches Protein C kodierende DNA enthielt, wurde isoliert (Z-Fragment). Das P'- Fragment und Z-Fragment wurden miteinander ligiert, um ZmB4 1058 zu erhalten.


Anspruch[de]

1. Fed-batch-Verfahren zur Herstellung eines brauchbaren Proteins durch Züchtung in Suspension von Zellen der menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellinie (ATCC CRL 1573), die so transformiert ist, daß sie ein Gen enthalten, welches dieses Protein kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Stufen umfaßt:

(a) Starten der Züchtung der Zellen in einem Züchtungsmedium, das in einem Züchtungsgefäß enthalten ist, bei einer Zelldichte von 5 x 10&sup4; bis 5 x 10&sup5; Zellen/ml,

(b) Zugabe eines Zuckers in das Züchtungsgefäß, um eine Zuckerkonzentration von 1 bis 7 g/l zu ergeben zu irgendeiner Zeit, nachdem die Zelldichte im Züchtungsgefäß dreimal höher geworden ist als die Ausgangszelldichte, und wenn die Zelldichte in einem Bereich von 5 x 10&sup5; bis 5 x 10&sup6; Zellen/ml ist,

(c) Fortsetzen der Züchtung, bis die Konzentration des Proteins nicht länger wesentlich zunimmt, während der pH-Wert der Züchtungsflüssigkeit aufrechterhalten wird, ünd dann Abbruch der Züchtung, und

(d) Entnahme der Züchtungsflüssiqkeit vom Züchtungsgefäß und Gewinnung des Proteins aus der Züchtungsflüssigkeit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in dem Züchtungsmedium gestartet wird, das eine Calciumionenkonzentration von 0,002 bis 0,25 mM hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Züchtungsflüssigkeit im Bereich von 6,5 bis 7,8 aufrechterhalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker zugesetzt wird, um eine Konzentration von 2 bis 5 g/l zu ergeben.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker zu irgendeiner Zeit zwischen der Zeit zugesetzt wird, wenn die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 50% oder weniger der Zuckerkonzentration zu Beginn der Züchtung ist, und der Zeit, wenn die Zukkerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 0,2 g/l ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Calcium in solcher Menge zugesetzt wird, daß die Calciumionenkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 0,3 bis 4 mM zu irgendeiner Zeit zwischen der Zeit, wenn die Zukkerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 50% oder weniger der Zuckerkonzentration zu Beginn der Züchtung und der Zeit vor Ablauf von zwei Tagen und nach Zugabe des Zuckers zugesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker wenigstens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Mannose und Fructose.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in einem serumfreien Medium durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das serumfreie Medium hergestellt wird unter Verwendung von eRDF-(angereichertes RDF-)Medium als Grundmedium.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Protein mit einer Gla-Domäne ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein menschliches Protein C, aktiviertes menschliches Protein C, ein Protein mit einer ähnlichen physiologischen Aktivität oder ein Vorläuferprotein davon ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß kein zusätzliches frisches Medium in das Züchtungsgefäß während der Züchtung gegeben wird.

13. Fed-batch-Verfahren zur Herstellung eines brauchbaren Proteins durch Züchtung in Suspension Zellen von menschlicher embryonaler Nieren 293-Zellinie (ATCC CRL 1573), die so transformiert sind, daß sie ein Gen enthalten, welches dieses Protein kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

(i) Starten der Züchtung der Zellen in einem in einem Züchtungsgefäß enthaltenen Züchtungsmedium, das eine Calciumionenkonzentration von 0,002 bis 0,25 mM hat bei einer Zelldichte von 5 x 10&sup4; bis 5 x 10&sup5; Zellen/ml,

(ii) Proliferation der Zellen, bis die Zelldichte in der Züchtungsflüssigkeit dreimal oder höher wird als die Ausgangszelldichte in einem Bereich von 5 x 10&sup5; bis 5 x 10&sup5; Zellen/ml,

(iii) Zugabe eines Zuckers und von Calcium zur Züchtungsflüssigkeit, so daß eine Zunahme der Zelldichte im wesentlichen unterdrückt wird und die Erzeugung des Proteins aufrechterhalten bleibt,

(iv) Fortsetzen der Züchtung, bis die Konzentration des Proteins im Züchtungsgefäß nicht länger wesentlich zunimmt, und dann Abbrechen der Züchtung, und

(v) Entnahme der Züchtunqsflüssigkeit aus dem Züchtungsgefäß und Gewinnung des Proteins aus der Züchtungsflüssigkeit.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe des Zuckers und des Calciums in das Züchtungsgefäß so durchgeführt wird, daß die Zelldichte im Züchtungsgefäß inhibiert wird, um im Bereich von ±50% der Standard-Maximum-Zelldichte zu liegen.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Züchtungsflüssigkeit im Bereich von 6,5 bis 7,8 gehalten wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker zugesetzt wird, um eine Konzentration von 1 bis 7 g/l, vorzugsweise 2 bis 5 g/l zu ergeben.

17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker zu irgendeiner Zeit zwischen der Zeit zugesetzt wird, wenn die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 50% oder weniger derjenigen zu Beginn der Züchtung ist, und der Zeit, wenn die Zuckerkonzentration in der Züchtungsflüssigkeit 0,2 g/l ist.

18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Calcium in solcher Menge zugegeben wird, daß die Calciumionenkonzentration im Züchtungsgefäß im Bereich von 0,3 bis 4 mM ist zu irgendeinem Zeitpunkt zwischen der Zeit, wenn die Zuckerkonzentration im Züchtungsgefäß 50% oder weniger der Zuckerkonzentration zu Beginn der Züchtung ist, und der Zeit vor Ablauf von zwei Tagen nach der Zugabe des Zuckers.

19. Verfahren nach Änspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker wenigstens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Mannose und Fructose.

20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in einem serumfreien Medium durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das serumfreie Medium unter Verwendung von eRDF-(angereichertes RDF-)Medium als Grundmedium hergestellt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Protein mit einer Gla-Domäne ist.

23. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein menschliches Protein C, aktiviertes menschliches Protein C, ein Protein mit einer ähnlichen physiologischen Aktivität oder ein Vorläuferprotein davon ist.

24. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß kein zusätzliches frisches Medium zum Züchtungsgefäß während der Züchtung gegeben wird.







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