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Dokumentenidentifikation DE19619505C2 26.03.1998
Titel Milch/Bakterienlysat zur Herstellung von Kosmetika und Arzneimitteln
Anmelder Zyma GmbH, 81379 München, DE
Erfinder Lauer, Eckhard, Dr., 12249 Berlin, DE
Vertreter Vossius & Partner GbR, 81675 München
DE-Anmeldedatum 14.05.1996
DE-Aktenzeichen 19619505
Offenlegungstag 11.12.1997
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 26.03.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.03.1998
IPC-Hauptklasse C12P 1/04
IPC-Nebenklasse C12N 1/06   A61K 7/00   A61K 35/74   A61K 35/20   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Milch/Bakterienlysat, Verfahren zu seiner Herstellung und die Verwendung in Kosmetika und Arzneimitteln mit einer Vielzahl von Anwendungsbereichen und Darreichungsformen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des Milch/Bakterienlysates als anti-inflammatorischer Zusatz in Arzneimitteln.
Die unkomplizierte Verwendung des Milch/Bakterienlysates ist dabei auf fehlende Nebenwirkungen zurückzuführen. Hervorzuheben ist auch die einfache und unkomplizierte Herstellungsweise des Milch/Bakterienlysates.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft neue Milch/Bakterienlysate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Kosmetika und Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen Bakterienlysate enthalten. Insbesondere dienen die erfindungsgemäßen Milch/Bakterienlysate in den Kosmetika und Arzneimitteln der Erfindung als antiinflammatorischer Zusatz.

Entzündung ist die vom aktiven Bindegewebe und den Blutgefäßen getragene, komplexe Reaktionskaskade des Organismus auf einen äußeren oder innerlich ausgelösten Entzündungsreiz (Adam, Med. Klin. Prax. 78 (1983), 12-21; Floh}, Giertz, Rev. Infect. Dis. 9 Suppl. 5 (1987), 553-561; Halliwell, Lancet 344 (1994), 721-724; Grisham, Lancet 344 (1994), 859-861; Cerutti, Lancet 344 (1994), 862-863) mit dem Zweck, diesen zu beseitigen, zu inaktivieren und die reizbedingte Gewebeschädigung zu reparieren. Dabei spielen chemische Radikalreaktionen, die unter dem Einfluß von katalytischen Faktoren, energiereicher Strahlung (UV-Licht), reaktionsfreudigen Molekülen (Radikale) und/oder Schwermetallen in Gang kommen, eine fundamentale Rolle bei der Zerstörung von Zellstrukturen, besonders der Zellmembranen, die die Zellen gegen die Umwelt abgrenzen.

Zur Behandlung solcher Entzündungserscheinungen sind zahlreiche Stoffe bekannt, so einfache Stoffe wie Vitamine, ungesättigte Fettsäuren, kurzkettige Fettsäuren wie Essig- oder Milchsäure, aber auch komplexe Stoffe tierischen und pflanzlichen Ursprungs wie Hormone (Cortison), Collagen, Elastin und Hyaluronsäure (Frese und Stahl, Parfümerie und Kosmetik 72. Jg. 9 (1991), 569-574). Auch Stoffe bakteriellen Ursprungs werden als anti-inflammatorische Wirkstoffe verwendet, wie Autolysate von Lactobacillus gasseri (Weirich-Schwaiger et al., Drug Research 45 (1995), 342-344), der Repair-Komplex aus Bifidobakterien (EP-A-0 043 128, US-Patent 4,646,362) oder Zellwand-Polysaccharide aus Bifidobakterien (EP-A-0 201 332). Die Verwendung von Bakterien in Form von Probiotika (Lactic Acid Bacteria, Hrsg. Salminen, von Wright, New York, 1993) oder zur Aufforstung der natürlichen Schleimhautbesiedlung (Hughes et al., Obstet. Gynecol. 75 (1990), 244-248) beruht zum Teil ebenfalls auf anti-entzündlicher, anti-inflammatorischer bzw. Radikalketten-hemmender Wirksamkeit.

Die Gewinnung derartiger Wirkstoffe (Cortison, Hyaluronsäure, Collagen, Elastin, Zellwandbestandteile etc.) aus komplexem pflanzlichem, tierischem oder bakteriellem Ausgangsmaterial oder unter Verwendung komplizierter Züchtungstechniken (Züchtung von Bakterien in komplex zusammengesetzten Nährmedien) ist praktisch ausnahmslos mit aufwendigen Extraktions- und Fraktionierungsverfahren verbunden, da der wirksame Bestandteil nur in gereinigter Form wirksam ist. Dies ist ein wesentlicher Nachteil. Derartiges Ausgangsmaterial kann potentiell bedenkliche Verunreinigungen unterschiedlichster Art enthalten, z. B. Endotoxine, Polyamine, Fremdeiweiß etc. Solche Verunreinigungen, aber auch Reste von Extraktionsmitteln können irritative Nebenwirkungen hervorrufen (Pharmainform. (Innsbruck) 10. Jg. (4) (1995), 1-4; Maes et al., Cosmetics und Toiletries 105 (1990), 43).

Besonders bei tierischem Ausgangsmaterial bestehen aufgrund besonderer Risiken (Zoonosen-Risiken (BAnz 164 (1991), 6120; Pharm. Ind. 53 (1991), 206) und Risiken der Verbreitung der spongioformen Encephalopathie (BAnz 40 (1994), 1851; BAnz, 96 (1994), 5500) strenge Auflagen für pharmazeutisch und kosmetisch verwendete Wirkstoffe. Die Extraktions- und Reinigungsverfahren unterliegen daher anerkannten Abreicherungsverfahren für bestimmte Erreger und zusätzlichen Einschränkungen, die eine Isolierung wirtschaftlich oft nicht sinnvoll erscheinen lassen.

Dies trifft auch auf die Gewinnung von Bakterienzellen aus komplexen Nährmedien zu, soweit diese Materialien tierische Herkunft aufweisen (Pepton, Leberextrakt, etc.).

Diese Risiken, aber auch eine in letzter Zeit stärker werdende Nachfrage nach neuen, möglichst "naturbelassenen", einfachen und toxikologisch unbedenklichen Wirkstoffen bzw. Produkten zur Verwendung im Arzneimittelbereich und im Kosmetikbereich haben zu einer intensiven Forschung im Bereich der "naturbelassenen" Produkte geführt.

Das Ziel ist die Verwendung von möglichst "naturbelassenen" und einfach zu gewinnenden Wirkstoffen unter Verwendung von Stoffen definierter Qualität. Bekannt ist die Verwendung von Fraktionen aus Pflanzenextrakten (Tragni et al., Pharm. Res. Comm. 20 Suppl. 5 (1988), 87-90), von Extraktauszügen aus Pflanzen, z. B. Kamille, Fenchel, etc., von Gesichtsmasken aus frisch geschnittenen Kartoffelschalen, Gurken etc. als altbekanntes Hausmittel zumeist zur Unterstützung der Hautfunktionen, von Rotwein, Schwarzem Tee und Grünem Tee (Serafini et al., Lancet 344 (1994), 626) und von entrahmter Milch (Taylor, Richardson, J. Dairy Res. 63 (1980), 1783-1795) als Antioxidantien.

Die Verwendung von Milch als Ausgangsstoff für "naturbelassene" Wirkstoffe ist noch kaum erschlossen, obwohl ihre Bestandteile gut bekannt sind (Niederauer, Parfümerie und Kosmetik 75. Jg. 10 (1994), 666-670; Harnett et al., ZFL 45. Jg. 78 (1994), 14-16). Bisher beschriebene Verwendungen beziehen sich vor allem auf aus der Milch gewonnene Bestandteile, wie auf aufbereitete Fraktionen des Caseins, das Wasserbindungs-, Gel- und Schaumbildungsvermögen und Emulgatoreigenschaften zeigt, auf Milch-Glykoproteine als neuartige Schutzstoffe als Alternative zu Hyaluronsäure oder zur Hautregeneration und auf Lactoperoxidase und Lactoferrin als anti-entzündlich wirksame Stoffe.

Als "naturbelassenes" Milchprodukt kommen durch Bakterien gesäuerte Milchprodukte therapeutisch zur Anwendung. Gewöhnliches Joghurt und ähnliche Sauermilch-Produkte werden therapeutisch in der gynäkologischen Praxis zur Wiederherstellung eines normal sauren Scheidenmilieus durch Milchsäurebildner angewendet (Berger, Karovic, Arch. Gynäk. 195 (1961), 46-49; Gunston, Fairbrother, S. Afr. Med. J. 49 (1975), 675-676; Fredricsson et al., Lancet (1987), 276; Hughes et al., Obstet. Gynecol. 75 (1990), 244-248), so z. B. Acidophilus-Joghurt, das auch bei schwangeren Frauen ohne Nebenwirkungen und Komplikationen verwendet wurde (Neri et al., Acta Obstet. Gynecol. Scand. 72 (1993), 17-19). Antioxidative Wirkungen von entrahmter Milch gegenüber ungesättigten Fettsäuren, z. B. Linoleat (Taylor, Richardson, J. Dairy Sci. 63 (1980), 1783-1795) und anti-mutagene in vitro- Wirkungen von Milch und von durch Bifidobacterium oder Lactobacillus gesäuerter Milch (Pool-Zobel et al., Nutr. Cancer Res. 20 (1993), 261-270; Cassand et al., J. Dairy Res. 61 (1994), 545-552; Morishita, Shiromizu, Bifidobacteria Microflora 9 (1990), 135-138) sind beschrieben. Dagegen sind anti-inflammatorische Wirkungen bisher weder bei Milch noch bei Milchprodukten beschrieben.

Die Verarbeitung von Milch in der Pharma- und Kosmetikindustrie ist zum Teil allerdings mit erheblichen Problemen behaftet. Solche Probleme beruhen unter anderem auf der Empfindlichkeit von Milch gegenüber Hitze (Bulletin of the Intern. Dairy Federation No. 238/1989, Heat-induced changes in milk, Hsg. P. F. Fox). In der Milch verarbeitenden Industrie stellt die sehr schonend durchgeführte Hitzeeinwirkung kein Problem dar. Bei weiterer Verarbeitung der Milch im Pharma- oder Kosmetik-Bereich führen jedoch erneute Hitze-Behandlungen zu unansehnlich braunen Verfärbungen (Maillard-Reaktionen) und unangenehm riechenden Abbauprodukten (Ledl et al., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 182 (1986), 19-24; Freimuth, Ludwig, Nahrung 26 (1982), 97-102; Ludwig, Nahrung 23 (1979), 531-536).

Des weiteren können bei Verwendung von durch Bakterien gesäuerten Milchprodukten bakterielle Aktivitäten zu optisch unansehnlich geronnener, inhomogener und schlecht riechender Milch führen, z. B. bei zu saurem Joghurt zu Abscheidung von Molke und geronnenem Eiweiß oder zur Zerstörung der milchweißen kolloidalen Suspension, was der Milch ein glasigflockiges Aussehen verleiht ("Peptonisierung"). Weitere unerwünschte Aktivitäten von Bakterien sind Proteolyse, Lipolyse oder Aminosäure-Dissimilation, die ebenfalls eine schlechte Geruchsbildung aufgrund der Bildung von Aminen, Ammoniak, Sulfhydrylverbindungen und Aldehyden mit sich bringen. Die Qualität derartiger Produkt ist auch toxikologisch bedenklich. Ein derartig verändertes Produkt eignet sich auch nicht für eine Weiterverarbeitung zu einem Wirkstoff für die kosmetische oder pharmazeutische Anwendung.

Die vorstehend beschriebenen Nachteile können bei Verwendung mild gesäuerter Milch/Bakterienprodukte vermieden werden. Allerdings sind bei all diesen Milch/Bakterienprodukten die wirksamen Bestandteile in den Zellen eingeschlossen. Lyse der Zellen zur Verbesserung der Wirksamkeit des bakterienhaltigen Produkts, z. B. durch mechanische Behandlung (EP-A- 0 043 128), durch proteolytische Behandlung (EP-A-0 201 332) oder durch Lysozym-Einwirkung auf die Zellwand (Chassy, Giuffrida, Appl. Environm. Microbiol. 39 (1980), 153-158; US-Patent 3,929,994) ist erforderlich. Zum Erhalt einer effizienten Lyse werden dabei vor der Lyse die Zellen vom Medium abgetrennt. Zuzätzlich werden im Anschluß daran Extraktions- und Reinigungsverfahren angewendet, so daß ein natürlich aussehendes "naturbelassenes" Produkt im eigentlichen Sinne nicht mehr vorliegt.

Besonders vorteilhaft für ein "naturbelassen" hergestelltes Produkt wäre deshalb die Anwendung der zelleigenen Autolyse, also die Lyse durch bakterieneigene Enzymsysteme, sog. Autolysine (Shockman, Barrett, Ann. Rev. Microbiol. 37 (1983), 501-527). Allerdings sind solche Verfahren noch zu wenig bekannt. Ungünstig auf die Aktivierung der Autolyse wirken sich hohe Kohlenhydratkonzentrationen aus (Dirar und Collins, J. Gen. Microbiol. 73 (1972), 233-238), und Lactose hemmt die Autolyse (Moustafa et Collins, J. Bac. 95 (1968), 592-602). Somit ist die hohe Lactose-Konzentration in Milch ein natürlicher Hemmfaktor, der die Anwendung der zelleigenen Autolyse verhindert. Auch die Verwendung von Lysozym erweist sich als problematisch, da in der Milch reichlich vorhandene N-Acetyl-glucosamin-haltige Glycoproteine die Aktivität des Lysozyms hemmen (Chipman et al., J. Biol. Chem. 242 (1967), 4388-4394; Nicolai et al. Hoppe-Seyler&min;s Z. Physiol. Chem. 362 (1981), 153-162).

So ist z. B. bei der Lysozym-empfindlichen Bakterienart Lactococcus lactis sowohl die zelleigene Autolyse als auch die Lysozym-abhängige Lyse in Milch stark gehemmt. Das ist nicht überraschend, da das an Milch als bevorzugten Standort angepaßte Bakterium einer Lyse in Milch zu widerstehen "gelernt" hat. Einer Lyse der Zellwand von gram-positiven Bakterien in Milch stellen sich somit große Hindernisse in den Weg.

EP-A2-0 432 490 beschreibt zwar ein Bakterienlysat, das durch die Kultivierung von Lactobacillus bulgarius in Kuhmilch und durch Zugabe von Lysozym zur Bakterienkultur hergestellt wird, allerdings wird keine Hemmung der Mureinbiosynthese nach Erreichen der log-Phase durchgeführt. DE-OS 22 55 744 offenbart ein immunisierendes und die Darmflora wiederherstellendes Arzneimittel, das aus zwei Komponenten besteht. Dabei stellt die zweite Komponente eine Lactobacillus-acidophilus-Kultur dar, die auf einem Milch-Hefeextrakt-Medium erhalten wird. Es erfolgt jedoch keine Lyse der Bakterien durch eine Mureinhydrolyse. Beide Dokumente geben somit keinen Aufschluß darüber, wie eine effiziente Lyse der Zellwand von Bakterien, wie beispielsweise Lactobacillus, in einem Milchmedium erreicht werden kann.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Milch/Bakterienlysat bereitzustellen, das ein attraktives äußeres Erscheinungsbild aufweist und qualitativ als Bestandteil für Kosmetika und Arzneimittel geeignet ist. Des weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Milch/Bakterienlysat bereitzustellen, das als anti-inflammatorischer Wirkstoff in Kosmetika und Arzneimitteln geeignet ist.

Die Lösung dieser Aufgabe wird erzielt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.

Die Erfindung betrifft also ein Milch/Bakterienlysat, das erhältlich ist durch

  • (a) Ansetzen einer Kultur von Bakterien in einem Milch-Hefeextrakt-Medium;
  • (b) Versetzen des Mediums mit einem Hemmstoff der Mureinbiosynthese nach Erreichen der log-Phase;
  • (c) Zugabe einer Mureinhydrolase zur Lyse der in der Kultur enthaltenen Bakterien; und
  • (d) Pasteurisieren des so erhaltenen Milch/Bakterienlysates.


Erfindungsgemäß lassen sich für die Herstellung dieses Milch/Bakterienlysates gram-positive Milchsäure-bildende Bakterien verwenden, die sich unter den erfindungsgemäßen Kulturbedingungen in einem Medium auf Milchbasis gut vermehren lassen, ohne die Milch in ihrem äußeren Erscheinungsbild allzu deutlich zu verändern, umfassend Milchsäurebakterien, Kokken oder Stäbchen mit einem DNA-Guanosin-Cytosin-Gehalt zwischen 30 und 50 Mol-%, mit den Gattungen Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus und Weissella. In allen genannten Gattungen sind geeignete Kandidaten mit geringem Risikopotential enthalten.

Als Milch-Hefeextrakt-Medium wird erfindungsgemäß vorzugsweise ein in hoher Schicht schonend zubereitetes und sterilisiertes Lösungsgemisch von 10% (G/V) Magermilchpulver und 0,5% (G/V) Hefeextraktpulver in destilliertem Wasser verwendet.

Üblicherweise wird die log-Phase in Abhängigkeit von der Bakterienart, deren Zellteilungsgeschwindigkeit und der Temperatur zu unterschiedlichen Zeitpunkten erreicht, bei erfindungsgemäßer Verwendung von Lactococcus lactis ist dies nach einer Züchtungsdauer von 3 Stunden bei 30°C der Fall. Als erfindungsgemäß verwendbare Hemmstoffe der Mureinbiosynthese werden vorzugsweise Glycin und Aminosäuren der D-Konfiguration, z. B. D-Serin, D-Threonin, D-Alanin und D-Methionin, aber auch Aminosäuren der L-Konfiguration in Verbindung mit einer Racemase verwendet. Diese Hemmstoffe hemmen in hohen Konzentrationen durch Wirkung auf die D-Ala-D- Ala-Ligase die Quervernetzung des Mureins. Sie werden in Abhängigkeit von der Bakterienspezies und dem Bakterienstamm in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Gew.-% verwendet. Als Mureinhydrolasen sind erfindungsgemäß N-Acetylmuramidasen, umfassend Lysozym und Mutanolysin, N-Acetylmuramyl-L- Alanin-Amidasen und N-Acetylglucosaminidasen verwendbar. Sie werden je nach Spezifität in einer Konzentration von 10³ bis 10&sup9; Enzymeinheiten pro Gramm Bakterienzellen verwendet. Das Pasteurisieren des erfindungsgemäß hergestellten Milch/Bakterienlysates erfolgt in üblicher Weise, beispielsweise durch Hitzebehandlung der Kultur bei mindestens 70°C für 30 Minuten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Milch/Bakterienlysates gehören die verwendeten Bakterien zur Gattung Lactococcus. Besonders bevorzugt wird der Stamm Lactococcus lactis ssp. lactis DSM 10605. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 25. März 1996 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, unter der Hinterlegungs-Nr. DSM 10605, hinterlegt. Die toxikologische Unbedenklichkeit dieses Stammes stützt sich auf die jahrzehntelange Erfahrung in der nutritiven Anwendung von Lactococcen als mesophile Starterkultur in der Sauermilchfabrikation und auf die organoleptisch angenehmen Eigenschaften des Milch/Bakterienlysates. Bedenkliche Abbau- oder Fäulnisprodukte konnten nicht festgestellt werden. Hinzu kommt, daß die Bakterien in nicht lebensfähiger Form angewendet werden und toxische Folgereaktionen aufgrund physiologischer Aktivitäten nicht auftreten.

Ferner ist es eine bevorzugte Ausführung des erfindungsgemäßen Milch/Bakterienlysates, bei seiner Herstellung als Hemmstoff der Mureinbiosynthese Glycin zu verwenden. Es wird in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 1 Gew.-% verwendet.

Ferner wird es erfindungsgemäß bevorzugt, als Mureinhydrolase das Enzym Lysozym in einer Konzentration von 10&sup6; bis 10&sup8; Einheiten pro Liter Kultur zu verwenden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Vollständigkeit der Lyse der in der Kultur enthaltenen Bakterien vor der Pasteurisierung gemäß Schritt (d) geprüft. Üblicherweise wird dies durchgeführt durch Bestimmung der Lebendkeimzahl (KBE/ml) durch herkömmliche Verfahren vor und nach der Lyse der Bakterien. Die Qualität der Lyse kann ferner anhand der Zellsedimentbildung durch Zentrifugation eines Aliquots der Kultur bei maximal 5000 × g, jeweils vor und nach der Lyse bestimmt werden, wobei sich nach der Lyse kein Sediment mehr bildet.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert des Mediums während der gesamten Kultur bei einem Wert zwischen 6 und 7 gehalten. Gegebenenfalls erfolgt eine Neutralisierung durch Zugabe üblicher alkalischer Zusätze, wie 1 N Natronlauge, Kalilauge, Binatriumcarbonatlösung oder Lösungen organischer Puffersubstanzen, etwa Trishydroxymethylaminomethan-Hydrochloridpuffer. Die verwendeten Mengen müssen zur Vermeidung der Maillard-Reaktion und des Präzipitierens des Milcheiweiß und der Bakterien gering gehalten werden. Sedimentation von partikulärem Material und zunehmende Ionen-Konzentration sind für die weitere Verarbeitung problematisch.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erläuterten Milch/Bakterienlysate. Dieses Herstellungsverfahren weist die vorstehend erläuterten Merkmale auf.

Weiterhin betrifft die Erfindung Kosmetika, enthaltend ein erfindungsgemäßes Milch/Bakterienlysat. Typischerweise handelt es sich bei diesen Kosmetika um Produkte, die das Milch/Bakterienlysat entweder als Salbengrundlage oder Lippenstiftmasse oder in flüssiger Suspension enthalten. Die Anwendung erfolgt durch Auftragen auf die Haut und dient allgemein der Pflege der Haut nach einem Sonnenbad oder nach täglicher Lichteinwirkung, dem Schutz vor entzündlichen Reaktionen der Lippen mit Begünstigung einer viralen Herpes-Entwicklung und der Anwendung auf fettender Kopfhaut mit Neigung zur Entwicklung von Akne oder dermatologischen Ekzemen. Die erfindungsgemäß einzusetzende Menge an Milch/Bakterienlysat in den Kosmetika hängt von der Formulierung und dem Verwendungszweck des Kosmetikums ab.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, die ein erfindungsgemäßes Milch/Bakterienlysat enthalten. Bevorzugte Ausführungsformen solcher Arzneimittel sind topisch anzuwendende Sonnenschutzmittel zur Pflege von Haut und Lippen nach Sonneneinstrahlung, anhaltender UV-Einwirkung oder allgemein Lichteinwirkung; Mittel zur Regeneration der Haut nach Sonnenbrand und zur prophylaktischen Therapie von durch Strahlen bedingter Degeneration der Haut; Mittel zur Vorbeugung von malignen Veränderungen, zur Beschleunigung des Epidermiswachstums nach Wundbehandlung, insbesondere bei Brandwunden.

Ferner eingeschlossen sind Schutzmittel zum Auftragen auf Schleimhäute (Mund, Rachen, Vagina) zur Behandlung von aufgesprungenen Lippen, erythematischer, juckender Stellen auf der Haut, im Intim- oder Afterbereich und zur Nachbehandlung von Gewebeschädigungen unterschiedlichster Formen. Die Anwendung erfolgt je nach den Erfordernissen äußerlich durch Auftragen auf die Haut oder durch orale Verabreichung in Form von Ölemulsionen in Weichgelatinekapseln, als Suppositorien auf Fettgrundlage oder in gefriergetrockneter Trockenmilch-ähnlicher Art, z. B. dosiert in Hartgelatine-Steckkapseln, Lutschtabletten oder in Kaugummimasse. Die erfindungsgemäß einzusetzende Menge an Milch/Bakterienlysat in den Arzneimitteln hängt von der Formulierung und dem Verwendungszweck des Arzneimittels ab.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Milch/Bakterienlysate in den erfindungsgemäßen Kosmetika bzw. Arzneimitteln als anti-inflammatorische Zusätze verwendet.

Die Anwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Milch/Bakterienlysates auf der Haut bewirkt einen Schutz gegen inflammatorische Reizzustände- und -symptome der Haut oder Schleimhaut, wie Erythem, Ödem oder Juckreiz. Der Wirkstoff kann darüber hinaus auch prophylaktisch angewendet werden.

Der Kosmetik-Wirkstoff bewirkt durch den inflammatorischen Schutz eine Stärkung der Epidermis-Zellen und eine verbesserte DNA-Reparaturaktivität, eine Kräftigung gegenüber beschleunigter Hautalterung und teratogenen Hautveränderungen. Der pharmakologisch angewendete Wirkstoff bewirkt eine verbesserte Heilung der inflammatorisch geschwächten oder geschädigten Haut.

Zur Testung der anti-inflammatorischen Wirksamkeit bedient man sich des Endotoxin-Tests als exogenem Stimulus an Makrophagen-Zellkulturen oder direkt auf der Haut unter Verwendung von UV-Licht, Allergenen oder Reizstoffen chemischer, pflanzlicher oder bakterieller Herkunft.

Im Makrophagentest wird die Ausschüttung pro-inflammatorischer Substanzen (endogene Mediatoren, wie Zytokine, Leukotriene, Sauerstoffradikale, etc.) gemessen. Es wird die Hemmwirkung des Wirkstoffs Milch/Bakterienlysat gegen Milch als Kontrolle gemessen.

Die Wirksamkeitstests auf der Haut werden in vitro auf der Mäusehaut haarloser Mäuse durchgeführt. Es wird die Dermis von frisch getöteten Mäusen abpräpariert und in Gewebekultur bei 37°C inkubiert. Von der Dermis wird die Epidermis abgetrennt und einem Test auf Bildung von wasserunlöslichem Formazan aus löslichem Methyltetrazoliumsalz als Maß der Vitalität unterworfen (Kietzmann et al., Naunyn Schmiedeberger&min;s Arch. Pharmacol. (Suppl.) R108 (1994), 349). Durch unterschiedlich lange UV-Bestrahlung wird eine kinetisch direkt korrelierte Schwächung der Aktivität gemessen. Die Wirksamkeit des Milch/Bakterienlysates wird im Vergleich zu Milch als Kontrolle gemessen.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Milch/Bakterienlysate besteht darin, daß sie sich unproblematisch weiterverarbeiten lassen, beispielsweise zu den erfindungsgemäßen Kosmetika und Arzneimitteln, weil sie praktisch partikelfrei und pH-neutral sind und sich äußerlich kaum von Magermilch unterscheiden. Das gesamte Herstellungsverfahren läßt sich bis zur fertigen Darreichungsform vollautomatisch und computergesteuert durchführen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung eines Milch/Bakterienlysates a) Herstellung des Milchkulturmediums Zusammensetzung (% G/V): Magermilchpulver (Reformhaus), ca. 10%; Hefe-Extrakt-Puder (Yeast Extract USP), 0,5%; dest. Wasser, ad 100% (G/V), pH-Wert: ca. 6.5

Milchpulver und Hefe-Extrakt (z. B. voll löslicher Hefe- Extrakt-Puder Oxoid L 21) werden jeweils als getrennte, wäßrige Lösungen, 10%ig bzw. 20%ig, unter leichtem Erwärmen hergestellt und autoklaviert (15 min/121°C). Von den auf ca. 30°C abgekühlten Lösungen werden 1000 ml bzw. 25 ml in einem Erlenmeyer-Glaskolben (2 Liter) aseptisch zu einer Lösung vereinigt. b) Kulturbedingungen

Kolonien einer Reinkultur von Lactococcus lactis ssp. lactis DSM 10605 werden zur Herstellung einer Vorkultur in 10 ml des Milchkulturmediums bei 30°C über Nacht bis zur frühstationären Wachstumsphase inkubiert (pH ca. 4,5; max. 5 g/l L-Milchsäure; ca. 1 × 10&sup9; KBE/ml). 1 ml dieser Vorkultur wird dann zur Herstellung der Hauptkultur in ca. 1000 ml Milchkulturmedium überimpft.

Die Hauptkultur wird 3 Stunden bei 30°C unter gelegentlicher leichter Schwenkbewegung inkubiert; der pH-Wert liegt danach bei 6,35, die Keimzahl beträgt ca. 3 bis 4 × 10&sup6; KBE/ml. Die gebildete Milchsäure liegt bei 1 g/l.

c) Lyse

100 ml 10%ige Glycinlösung werden aseptisch der Hauptkultur zugesetzt. Nach 20minütiger Einwirkung bei 30°C werden 50 ml 1%ige Lysozym-Lösung (Lysozym Serva 28262 mit einer spezifischen Aktivität von 146500 U/mg) zugesetzt, gut vermischt und das Kulturmedium 2 Stunden bei gelegentlicher Schwenkbewegung inkubiert. Dann wird die Lebendkeimzahl gemessen und die Reinheit und Identität koloniemorphologisch nach Ausstrich auf Blutagar geprüft.

Der Sollwert für die Keimzahl vor dem Pasteurisieren sollte < 100 KBE/ml betragen.

d) Pasteurisierung

Die Kultur wird im Wasserbad bei 70°C 30 min inkubiert.

e) Endkontrolle am Milch/Bakterienlysat

Das Milch/Bakterienlysat weist folgende Eigenschaften auf:

  • 1. Gärungsprodukt L-Milchsäure (enzymatisch): 1 bis 2 g/l.
  • 2. Identität (organoleptisch): milchähnlich weißlichhomogene Flüssigkeit ohne Sediment.
  • 3. Reinheit (mikrobiologisch): steril

f) Lagerung

Das pasteurisierte Produkt wird gekühlt in desinfizierte Behälter gefüllt und im Kühlschrank bis zur weiteren Verwendung gelagert. Falls erforderlich, kann das milchähnliche, weißlich homogen aussehende Produkt mit einem Konservierungsmittel konserviert werden. Beispiel 2 Herstellung eines Kosmetikums Rohstoff % (G/G) 1. Cetylstearylalkohol 12,500 2. Vaseline, weiß 19,500 3. Sorbitlösung (70%) 8 bis 13 4. Tween 80 (Polysorbat 80) 5,000 5. dest. Wasser und Milch/Bakterienlysat ad 100


oder

Rohstoff % (G/G) 1. Emulgator E 2155 6,000 2. Paraffinöl, dickflüssig 10,000 3. Mikrowachs 3,000 4. Isopropylmyristat 3,000 5. Glycerin 5,000 6. dest. Wasser und Milch/Bakterienlysat ad 100

Beispiel 3 Herstellung eines Arzneimittels auf Salben- und Creme-Basis

Die oben für ein Kosmetikum angegebene Rezeptur bzw. Technologie ist weiter für ein Arzneimittel einsetzbar.

Rohstoff % (G/G) 1. Lanette N (Gemisch aus Lanette O und Lanette E aus Wollwachs) 10,000 2. 2-Octyldodecanol 8,000 3. Paraffinöl, dickflüssig 4,000 4. Glycerol 4,500 5. dest. Wasser und Milch/Bakterienlysat ad 100


oder:

Rohstoff % (G/G) 1. Glycerolmonostearat 4,000 2. Cetylalkohol 6,000 3. Spreitendes Öl (mittelkettige Triglyceride) 7,500 4. Vaseline, weiß 20 bis 25 5. POE-Glycerolmonostearat (Tagat S2) 7,000 6. 1,2-Propylenglykol 10,000 7. dest. Wasser und Milch/Bakterienlysat ad 100.


Anspruch[de]
  1. 1. Milch/Bakterienlysat erhältlich durch:
    1. (a) Ansetzen einer Kultur von Bakterien in einem Milch- Hefeextrakt-Medium;
    2. (b) Versetzen des Mediums mit einem Hemmstoff der Mureinbiosynthese nach Erreichen der log-Phase;
    3. (c) Zugabe einer Mureinhydrolase zur Lyse der in der Kultur enthaltenen Bakterien; und
    4. (d) Pasteurisieren des so erhaltenen Milch/Bakterienlysates.
  2. 2. Milch/Bakterienlysat nach Anspruch 1, bei dem die Bakterien zur Gattung Lactococcus gehören.
  3. 3. Milch/Bakterienlysat nach Anspruch 2, bei dem das Bakterium der Gattung Lactococcus Lactococcus lactis ssp. lactis DSM 10605 ist.
  4. 4. Milch/Bakterienlysat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Hemmstoff der Mureinbiosynthese Glycin ist.
  5. 5. Milch/Bakterienlysat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Mureinhydrolase Lysozym ist.
  6. 6. Milch/Bakterienlysat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei vor der Pasteurisierung in Schritt (d) die Vollständigkeit der Lyse kontrolliert wird.
  7. 7. Milch/Bakterienlysat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei während der Kultivierung der Bakterien der pH-Wert des Mediums kontrolliert und gegebenenfalls das Medium neutralisiert wird.
  8. 8. Verfahren zur Herstellung eines Milch/Bakterienlysates, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:
    1. (a) Ansetzen einer Kultur von Bakterien in einem Milch- Hefeextrakt-Medium;
    2. (b) Versetzen des Mediums mit einem Hemmstoff der Mureinbiosynthese nach Erreichen der log-Phase;
    3. (c) Zugabe einer Mureinhydrolase zur Lyse der in der Kultur enthaltenen Bakterien; und
    4. (d) Pasteurisieren des so erhaltenen Milch/Bakterienlysates.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Bakterien zur Gattung Lactococcus gehören.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Bakterium der Gattung Lactococcus Lactococcus lactis ssp. lactis DSM 10605 ist.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem der Hemmstoff der Mureinbiosynthese Glycin ist.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem die Mureinhydrolase Lysozym ist.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei vor der Pasteurisierung in Schritt (d) die Vollständigkeit der Lyse kontrolliert wird.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei während der Kultivierung der Bakterien der pH-Wert des Mediums kontrolliert und gegebenenfalls das Medium neutralisiert wird.
  15. 15. Kosmetikum, enthaltend ein Milch/Bakterienlysat nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
  16. 16. Arzneimittel, enthaltend ein Milch/Bakterienlysat nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
  17. 17. Kosmetikum nach Anspruch 15 oder Arzneimittel nach Anspruch 16, wobei das darin enthaltene Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als anti-inflammatorischer Zusatz dient.






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