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Dokumentenidentifikation DE19717904A1 29.10.1998
Titel Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
Anmelder Institut für Diagnostikforschung GmbH an der Freien Universität Berlin, 14050 Berlin, DE
Erfinder Licha, Kai, Dr., 14169 Berlin, DE;
Riefke, Björn, 13595 Berlin, DE;
Semmler, Wolfhard, Dr. Dr., 13467 Berlin, DE;
Wrasidlo, Wolfgang, Dr., 14193 Berlin, DE
Vertreter Wablat, W., Dipl.-Chem. Dr.-Ing. Dr.jur., Pat.-Anw., 14129 Berlin
DE-Anmeldedatum 23.04.1997
DE-Aktenzeichen 19717904
Offenlegungstag 29.10.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.10.1998
IPC-Hauptklasse C09B 23/08
IPC-Nebenklasse A61K 49/00   C07H 15/24   C09B 69/10   C09B 3/78   C09B 19/00   C09B 21/00   C09B 47/00   C09K 11/06   G01N 33/52   A61K 31/415   A61K 31/40   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft säurelabile und enzymatisch spaltbare Verbindungen zur In-vivo- und In-vitro-Diagnostik mittels Nahinfrarot-Strahlung (NIR-Strahlung), die Verwendung dieser Verbindungen als optische Diagnostika und Therapeutika und diese Verbindungen enthaltende diagnostische Mittel.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft säurelabile und enzymatisch spaltbare Verbindungen zur In-vivo- und In-vitro-Diagnostik mittels Nahinfrarot-Strahlung (NIR-Strahlung) die Verwendung dieser Verbindungen als optische Diagnostika und Therapeutika und diese Verbindungen enthaltende diagnostische Mittel.

Die Nahinfrarotbildgebung ist ein nicht invasives diagnostisches Verfahren, bei dem die hohe Durchlässigkeit biologischen Gewebes für Licht der Wellenlänge 650-1000 nm ausgenutzt wird. Im Gegensatz zu Licht des ultravioletten und sichtbaren Spektralbereichs, das nur in die obersten Millimeter des Gewebes eindringen kann, werden bei Verwendung von Nahinfrarotlicht Eindringtiefen in Gewebe von bis zu mehreren Zentimetern erzielt. Die Ursachen für die prinzipiell geringe Eindringtiefe von Licht sind die Absorption körpereigener Farbstoffe, hauptsächlich des Hämoglobins und des Wassers, die jedoch im Spektralbereich des Nahinfrarotlichtes zwischen 650 und 1000 nm minimale Werte aufweisen. Dieser spektrale Bereich der größten optischen Gewebetransparenz wird daher auch diagnostisches/therapeutisches Fenster genannt (Boulnois, J., Lasers Med Sci 1986, 1: 47-66).

Dem Diagnostiker steht hiermit neben den modernen bildgebenden Verfahren, wie Röntgen, Magnetresonanztomographie oder Ultraschalldiagnostik, ein weiteres Verfahren zur bildlichen Gewebedarstellung zur Verfügung (Haller, E. B., Time-resolved transillumination and optical tomography. J Biomed Optics 1996, 1: 7-17).

Die Verwendung von NIR-Strahlung zur ortsabhängigen Aufzeichnung von Blutfluß und Oxygenierungsgrad im Gehirn von Säuglingen durch die Detektion der Absorption von Hämoglobin/Deoxyhämoglobin ist ein seit Jahren bekanntes und angewandtes Verfahren (Jöbsis, F. F., Science 1977, 198: 1264-67; Chance, B., Leigh, J. S., Miyake, H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988 85: 4971-75; Benaron D. A. et al., Science 1993, 33: 369A).

Das wesentliche Problem bei der Nutzung von nahinfraroter Strahlung ist die starke Streuung des Lichtes, so daß selbst bei unterschiedlichen photophysikalischen Eigenschaften von einem scharf begrenzten Objekt und seiner Umgebung sich dieses Objekt nur unscharf abzeichnet. Das Problem nimmt mit wachsender Entfernung des Objektes von der Oberfläche zu und kann als hauptsächlicher limitierender Faktor sowohl bei der Transillumination als auch bei der Detektion von Fluoreszenzstrahlung angesehen werden. Deshalb können Farbstoffe als Kontrastmittel, die die optischen Eigenschaften der Gewebe prägen und zu einer erhöhten Absorption und Fluoreszenz der zu detektierenden Gewebe führen, auch bei geringer Ortsauflösung eine eindeutige Detektion ermöglichen. Dabei kann das Absorptionsverhalten solcher Farbstoffverbindungen als bildgebende Information ausgenutzt werden. Besitzen die Farbstoffe darüberhinaus die Eigenschaft, die absorbierte Energie als Fluoreszenzstrahlung zu emittieren, so kann diese ebenfalls als bildgebende Information genutzt werden. Hierbei wird die gegenüber der Anregungsstrahlung rotverschobene Fluoreszenzstrahlung gesondert detektiert. Der Vorteil besteht u. a. darin, daß das Gewebe selbst im NIR-Bereich eine äußerst geringe Eigenfluoreszenz aufweist und somit der Untergrund minimal ist.

(S. Folli et al., Cancer Research 54, 2643-9 (1994); B. Ballou et al., Cancer Immunol. Immunother. 41, 257-63 (1995); X. Li et al., SPIE Vol. 2389, 789-98 (1995)).

In der Fluoreszenzdiagnostik ist die Voraussetzung dafür eine ausreichende, möglichst hohe Differenz in der Fluoreszenzemission zwischen zu detektierendem und umliegendem Gewebe. Dies kann prinzipiell durch eine Differenz in der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Substanzapplikation erreicht werden. Insbesondere für die Diagnostik in tieferen Gewebeschichten ist diese Differenz bei der Verwendung von Substanzen mit unspezifischem Anreicherungsverhalten oft nicht ausreichend.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwinden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I)



(F-L)m-A (I)



gelöst, worin

F für ein Farbstoffmolekül mit mindestens einem Absorptionsmaximum zwischen 600 und 1200 nm steht,

L für eine Linkerstruktur, welche eine säurelabile und/oder enzymatisch spaltbare Bindung enthält, steht,

m eine Zahl zwischen 1 und 80 ist,

wobei für den Fall, daß m eine Zahl zwischen 1 und 3 ist,

A ein Farbstoffmolekül mit mindestens einem Absorptionsmaximum zwischen 600 und 1200 nm, ein antibiotisch oder antizytostatisch wirksames Molekül, ein Biomolekül, ein nicht biologisches Makromolekül oder eine Verbindung B-(L-W)0 oder D-(L-W)0 darstellt, wobei

D ein nicht biologisches Makromolekül ist,

B ein Biomolekül ist,

L die oben genannte Bedeutung hat,

W ein antibiotisch oder antizytostatisch wirksames Molekül darstellt,

o eine Zahl zwischen 1 und 20 ist,

und wobei für den Fall, daß m eine Zahl zwischen 4 und 80 ist,

A ein Biomolekül, ein nicht biologisches Makromolekül oder eine Verbindung B-(L-W)0oder D-(L-W)0 darstellt, wobei

D, B, L, W und o die oben genannten Bedeutungen haben.

Die besondere Eigenschaft hinsichtlich der In-vivo-Detektion der nahinfraroten Fluoreszenzemission der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß diese eine geringe bis gar keine Fluoreszenzemission aufweisen und erst nach Spaltung dieses Konstruktes bzw. Abspaltung des Farbstoffes vom Konstrukt am Zielort (z. B. Tumor, Entzündungen) eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals auftritt. Die effektive Differenz des Fluoreszenzsignals zwischen zu detektierendem und umliegenden Gewebe wird demzufolge durch

  • a) die Konzentrationsdifferenz aufgrund pharmakokinetischer Mechanismen und
  • b) durch die Differenz in der Fluoreszenzquantenausbeute zum Zeitpunkt der Diagnostik
geprägt.

Es wurde gefunden, daß die Fluoreszenz der Farbstoffe gequencht wird, wenn ein Farbstoffmolekül an ein weiteres Molekül (Dimere) unter Erhalt der erfindungsgemäßen Verbindungen gekoppelt ist, d. h. es tritt eine äußerst geringe Fluoreszenzemission im Vergleich zum entsprechenden Farbstoffmolekül im ungebundenen Zustand auf. Es wurde darüberhinaus gefunden, daß ein vergleichbares Quenching auftritt, wenn andere Moleküle mit aromatischen Strukturen, welche sowohl Farbstoffe als auch Wirkstoffe (z. B. Zytostatika oder Antibiotika) sein können, mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind. Überraschenderweise tritt ebenso ein Quenching bei Kopplung der Farbstoffe an Antikörper, Antikörperfragmente und Proteine auf.

Grundsätzlich müssen sich die Farbstoffe, die struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Verbindungen sind, in ihrer monomeren unkonjugierten Form durch hohe molare Absorptionskoeffizienten und hohe Fluoreszenzquantenausbeuten auszeichnen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel I zeichnen sich dadurch aus, daß F und/oder A für einen

Polymethinfarbstoff, Tetrapyrrolfarbstoff, Tetraazapyrrolfarbstoff, Xanthinfarbstoff, Phenoxazinfarbstoff oder Phenothiazinfarbstoff stehen.

Besonders bevorzugt sind die Strukturen aus der Klasse der Polymethinfarbstoffe, da diese Absorptionsmaxima mit sehr hohen molaren Absorptionskoeffizienten im nahinfraroten Spektralbereich zwischen 700 und 1000 nm aufweisen (ε bis zu 300000 l mol-1 cm-1), wie beispielsweise Cyaninfarbstoffe, Squariliumfarbstoffe und Croconiumfarbstoffe, sowie Merocyanin- und Oxonolfarbstoffe.

Ferner sind solche erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bevorzugt, bei denen F und/oder A für einen

Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel II





stehen,

worin

R1 bis R4 und R7 bis R10 unabhängig voneinander für ein Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitrogruppe oder für einen Rest -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, -E1,

wobei E1 und E2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige C1-C50 -Alkylkette, wobei die Kette oder Teile dieser Kette gegebenenfalls eine oder mehrere aromatische oder gesättigte zyklische C5-C6- oder bizyklische C10-Einheiten formen können, steht,und wobei die C1-C50-Alkylkette von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen, 0 bis 5 Estergruppen, 0 bis 3 Carbongruppen, 0 bis 3 Aminogruppen, substituiert ist,

und wobei jeweils benachbarte Reste R1-R4 und/oder R7-R10 unter Bildung eines sechsgliedrigen aromatischen Kohlenstoffringes miteinander verknüpft sein können,

R5 und R6 unabhängig voneinander für einen Rest -E1 mit der oben angegebenen Bedeutung oder für eine C1-C4-Sulfoalkylkette stehen,

und/oder R1 bis R10 für eine Verknüpfung mit L stehen,

Q ein Fragment





ist,

worin

R11 für ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitrogruppe oder einen Rest -NE1E2, -OE1 oder -E1, wobei E1 und E2 die oben angegebene Bedeutung haben oder für eine Verknüpfung mit L steht,

R12 für ein Wasserstoffatom oder einen Rest E1 mit der oben angegebenen Bedeutung steht,

b eine Zahl 0, 2 oder 3 bedeutet,

X und Y unabhängig voneinander O, S, -CH=CH- oder ein Fragment





darstellt,

worin

R13 und R14 unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige C1-C10-Alkylkette, die durch bis zu 5 Sauerstoffatome unterbrochen und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, stehen, und wobei die Reste R13 und R14 unter Ausbildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes miteinander verknüpft sein können.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen Farbstoffe mit einem therapeutisch wirksamen Molekül über eine physiologisch spaltbare Bindung verknüpft sind, oder Farbstoff und Wirkstoff über physiologisch spaltbare Bindungen an Biomoleküle oder nicht biologische Trägermoleküle gekoppelt sind.

Besonders bevorzugt sind Konstrukte, bei denen die Fluoreszenz des Farbstoffes im gekoppelten Zustand gequencht und die therapeutische Aktivität des Wirkmoleküls durch die Kopplung an Farbstoff bzw. Trägermolekül maskiert ist (Pro-Drug-Effekt). Die Spaltung der Bindung führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenzemission bei gleichzeitiger Freisetzung der Aktivität des Wirkstoffes.

Wirkstoffe W und/oder A in der erfindungsgemäßen allgemeinen Formel (I) sind beispielsweise die im folgenden aufgeführten Verbindungen:

Antibiotika: Aclacinomycin, Actinomycin F1, Anthramycin, Azaserin, Bleomycine, Cactinomycin, Carubicin, Carzinophilin, Chromomycine, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Mtiomycine, Mycophenolsäure, Nogalamycin, Olivomycine, Peplomycin, Plicamycin, Porfiromycin, Puromycin, Streptonigrin, Tubercidin, Zorubicin, Folsäure-Analoga: Denopterin, Metothrexat, Pteropterin, Trimetrexat,

Pyrimidin-Analoga: Ancitabin, Azacitidin, 6-Azauridin, Carmofur, Cytarabin, Doxifluridin, Enocitabin, Floxuridin, 5-Fluor-Uracil,

Purin-Analoga: Fludarabin, 6-Mercaptopurin, Thiamiprin, Thioguanin und Derivate der genannten Verbindungen,

alkylierende Substanzen: Alkylsulfonate, Aziridine, Ethylenimine, Methylmelamine, Nitroharnstoffe, Stickstofflostverbindungen,

hormonell wirksame Substanzen wie Androgene, Antiadrenale, Antiandrogene, Antiestrogene, Estrogene, LH-RH-Analoga und Progestogene,

sowie weitere zytostatisch wirksame Substanzen, wie Taxol und Taxol-Derivate.

Weitere Wirkstoffe sind photodynamisch aktive Substanzen, die sich durch das Vermögen auszeichnen, nach Anregung eine photosensibilisierende Wirkung durch Bildung zytotoxischen Singulettsauerstoffs und von Radikalen entfalten. Solche Verbindungen sind in erster Linie Tetrapyrrole bzw. Tetraazapyrrole, bespielsweise Porphyrine, Benzoporphyrine, Chlorine, Purpurine, Phthalocyanine, Naphthalocyanine und Derivate der genannten Verbindungen. Weitere Verbindungen sind expandierte Porphyrine, Porphycene und Oxazin- bzw. Phenoxazinfarbstoffe.

Die chemische Bindung, die gemäß der allgemeinen Formel (I) in der Linkerstruktur L enthalten ist, ist strukturell derart beschaffen, daß diese bei bestimmten physiologischen Parametern, durch die erkrankte Gewebe (Tumoren) charakterisiert sind und welche sich von normalen Gewebebereichen unterscheiden, gespalten wird.

Es ist in der Literatur beschrieben, daß Tumore durch geringere pH-Werte im Vergleich zu Normalgewebe charakterisiert sind. Während der intrazelluläre pH-Wert weitgehend identisch ist (ca. pH 7.4) ist der extrazelluläre pH-Wert in Tumoren um bis zu 0.5 pH-Einheiten erniedrigt. Auch Entzündungen, insbesondere bakterieller Art, sind durch erniedrigte pH-Werte gekennzeichnet. Die Methoden zur Bestimmung der pH-Werte sind u. a. Messungen mit Mikroelektroden, Fluoreszenzmessungen mit pH-sensitiven Fluoreszenzproben und Messungen mit MR-Sonden (R. J. Gillies et al., Am. J. Physiol. 267, pC 195-203 (1994);

G. R. Martin und R. K. Jain, Microvascular Research 46, 216-230 (1993);

L. B. Gerweck und K. Seetharaman, Cancer Research 56, 1194-1198 (1996));

K. Engin et al., Int. J. Hyperthermia 11 (1995) 211-216, K. Engin et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 29 (1994) 125-132;

G. Helmlinger et al., Nature Medicine 3 (1997) 177-182.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Verbindungen mit Linkerstrukturen L, die durch erniedrigte physiologische pH-Werte gespalten werden. Solche Strukturen sind beispielsweise Alkylhydrazone, Acylhydrazone, Arylhydrazone, Sulfonylhydrazone, Imine, Oxime, Acetale, Ketale, Orthoester entsprechend den Fragmenten









worin p für eine Zahl zwischen 2 und 4 steht.

Die Spaltung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann neben der Spaltung aufgrund erniedrigter pH-Werte auch durch Enzyme, die in den zu detektierenden Geweben (z. B. Tumoren, bakterielle Entzündungen) in erhöhter Konzentration vorliegen, erfolgen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Verbindungen mit Linkerstrukturen L, die enzymatisch gespalten werden. Enzymatisch spaltbare Linkerstrukturen sind beispielsweise solche, die durch Kathepsine, Peptidasen, Carboxypeptidasen, α- und β-Glukosidasen, Lipasen, Oxidasen, Phospholipasen, Phosphatasen, Phosphodiesterasen, Proteasen, Elastasen, Sulfatasen, Reduktasen, Transferasen und bakterielle Enzyme, beispielsweise Penicillin-Amidasen sowie β-Lactamasen, gespalten werden (P. D. Senter et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995), 389-94).

Bevorzugte enzymatisch spaltbare Strukturen sind kurzkettige Peptidsequenzen, wie beispielsweise Sequenzen, die die Aminosäuresequenz Val-Leu-Lys enthalten.

Die Kinetik, die zu einer Anreicherung im zu detektierenden Gewebe bzw. zu einem entsprechenden Konzentrationsgradienten zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Applikation führt, muß sowohl mit der Kinetik der Spaltung der erfindungsgemäßen Verbindungen als auch der Kinetik des Abtransportes des freigesetzten Farbstoffmoleküls korrelieren und zu einem synergistischen Effekt führen.

Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeichnen sich dadurch aus, daß A und/oder B für einen Antikörper, deren Konjugate und Fragmente, spezifische Peptide und Proteine, Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, Nukleotide, natürliche oder synthetische Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren oder deren chemische Modifikationen, wie Aptamere oder Antisenseoligonukleotide, Lipoproteine, Lectine, Kohlenhydrate, Mono-, Di- oder Trisaccharide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysaccharide oder -saccharidderivate oder für ein Dextran steht.

Ferner sind die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bevorzugt, in denen D Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polylysin oder Polylysin-Dendrimere oder deren Derivate darstellen.

Die Verknüpfung der Strukturelemente A, D, B, L und W erfolgt entweder direkt oder über übliche funktionelle Gruppen. Solche Gruppen sind beispielsweise Ester, Ether, sekundäre und tertiäre Amine, Amide, Thioharnstoff-, Harnstoff-, Carbamatgruppen oder Maleimidostrukturen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur In-vivo-Diagnostik erkrankter Gewebebereiche mittels NIR-Strahlung sowie zur Therapie erkrankter Gewebebereiche.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein optisches Diagnostikum zur In-vivo-Diagnostik erkrankter Gewebebereiche mittels NIR-Strahlung, welches mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) enthält.

Diese Mittel werden nach den dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt, ggf. unter Verwendung üblicher Hilfs- und/oder Trägerstoffe sowie Verdünnungsmittel und dergleichen. Dazu gehören physiologisch verträgliche Elektrolyte, Puffer, Detergenzien und Substanzen zur Anpassung der Osmolarität sowie zur Verbesserung der Stabilität und Löslichkeit. Durch die in der Pharmazie gebräuchlichen Maßnahmen ist für die Sterilität der Zubereitungen bei der Herstellung und insbesondere vor der Applikation zu sorgen.

Die Synthese der Farbstoffe F und A erfolgt nach literaturbekannten Methoden, z. B.

F. M. Hamer in The Cyanine Dyes and Related Compounds, John Wiley and Sons, New York, 1964;

J. Fabian et al., Chem. Rev. 92 (1992) 1197;

L. A. Ernst et al., Cytometrie 10 (1989) 3-10;

P. L. Southwick et al., Cytometrie 11 (1990) 418-430;

R. B. Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 4 (1993) 105-11;

B. Terpetschnig et al., Anal. Biochem. 217 (1994) 197-204;

J. S. Lindsey et al., Tetrahedron 45 (1989) 4845-66, EP-0591820 A1;

L. Strekowski et al., J. Heterocycl. Chem. 33 (1996) 1685-1688;

S. R. Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 356-362;

M. Lipowska et al., Synth. Commun. 23 (1993) 3087-94;

B. Terpetschnig et al., Anal. Chim. Acta 282 (1993) 633-641;

M. Matsuoka und T. Kitao, Dyes Pigm. 10 (1988) 13-22 und N. Narayanan und G. Patronay, I. Org. Chem. 60 (1995) 2361-95.

Die Farbstoffe werden in Anlehnung an literaturbekannte Methoden mit Substituenten synthetisiert, die säurelabile oder enzymatisch spaltbare Bindungen enthalten oder aus denen solche Bindungen nach Kopplung entstehen; z. B. nach

B. M. Mueller et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990) 325-330;

K. Srinivasachar und D. M. Neville, Biochemistry 28 (1989) 2501-09;

D. M. Neville et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 14653-61;

T. Kaneko et al., Bioconjugate Chem. 2 (1991), 133-41;

B. A. Froesch et al., Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 55-63 und

J. V. Crivello et al., J. Polymer Sci: Part A: polymer Chem. 34 (1996) 3091-3102.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiele 1. Synthese von 5-(1-Oxoethyl)-1,1'-(4-sulfobutyl)-indotricarbocyanin-natriumsalz 1 (Fig. 1)

4-Hydrazinophenylmethylketon wird aus 4-Aminophenylmethylketon durch Diazotierung und Reduktion mit SnCl2 synthetisiert (in Anlehnung an T. Górecki et al., J. Heterocyclic Chem. 33 (1996) 1871-76). 4,8 g (32 mmol) 4-Hydrazinophenylmethylketon, 5,4 g Natriumacetat und 3,9 g (45 mmol) 3-Methyl-2-butanon werden in 40 ml Essigsäure 1 h bei Raumtemperatur und 4 h bei 120°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft, in 300 ml Dichlormethan aufgenommen und die organische Phase mit ges. NaCl-Lsg. gewaschen. Nach Trocknen über MgSO4 erhält man 7,5 g eines braunen Öls. Dieses wird mit 6,5 g (48 mmol) 1,4-Butansulfon 5 h auf 140°C erhitzt, nach dem Abkühlen mit Aceton verrührt und der ausgefallene Feststoff chromatographisch (RP C-18, Laufmittel Methanol/Wasser) gereinigt. Ausbeute: 2,5 g (23%) 5-(1-Oxoethyl)-1-(4-Sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolenin 2.

Zur Darstellung des Farbstoffes 1 werden 0,5 g (1,7 mmol) 1-(4-Sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolenin 3 mit 0,47 g (1,6 mmol) Glutaconaldehyddianilhydrochlorid in 10 ml Essigsäureanhydrid 30 min bei 120°C gerührt. Nach Abkühlen wird mit 0,6 g (1,8 mmol) 2, 10 ml Essigsäureanhydrid, 4 ml Essigsäure und 0,5 g Natriumacetat versetzt und 30 min auf 120°c erhitzt. Die tiefblaue Lösung wird abgekühlt, mit 200 ml Ether verrührt und der ausgefallene Feststoff abfiltriert. Nach chromatographischer Reinigung (RP C-18, Laufmittel Methanol/Wasser) und Gefriertrocknung erhält man 0,3 g (26%) Produkt 1.

Elementaranalyse:

Ber.: C 61,99; H 6,33; N 3,91; S 8,95;

Gef.: C 61,73; H 6,49; N 3,80; S 8,78.

Absorption: λmax (H2O) = 748 nm (ε = 148000 l mol-1 cm-1).

2. Modifizierung mit säurelabilen Linkern (Fig. 2) 2.1. Umsetzung von 1 mit 4-Carboxyphenylsulfonylhydrazin

0,2 g (0,28 mmol) 1 und 74 mg (0,34 mmol) 4-Carboxyphenylsulfonylhydrazin werden in 20 ml Methanol gelöst, mit 5 µl Trifluoressigsäure versetzt und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft, der Rückstand mehrfach mit Dichlormethan gewaschen und das Produkt getrocknet. Ausbeute: 0,21 g 4.

2.2. Umsetzung von 1 mit 4-Aminobenzoesäurehydrazid

0,2 g (0,28 mmol) 1 und 51 mg (0,34 mmol) 4-Aminobenzoesäurehydrazid werden analog 2.1 umgesetzt. Ausbeute: 0,20 g 5.

2.3. Umsetzung von 1 mit 4-(Aminomethyl)benzoesäurehydrazid

0,2 g (0,28 mmol) 1 und 56 mg (0,34 mmol) 4-Aminomethylbenzoesäurehydrazid werden analog 2.1 umgesetzt. Ausbeute: 0,22 g 6.

3. Erzeugung reaktiver funktioneller Gruppen (N-Hydroxysuccinimidester und Isothiocyanat) (Fig. 2)

Zur Darstellung der entsprechenden N-Hydroxysuccinimidylesterverbindung 7 werden 0,1 g (0,1 mmol) 4 mit 14 mg (0,12 mmol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) in 12 ml Dimethylformamid (DMF) vorgelegt und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 23 mg (0,11 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml DMF versetzt. Nach 72 h Rühren wird das Produkt durch mit Diethylether ausgefällt, abfiltriert und erneut aus DMF/Diethylether umgefällt. Das nach Vakuumtrocknung erhaltene Produkt (12 mg) wird ohne weitere Reinigung verwendet.

Zur Darstellung der säurelabilen Isothiocyanatverbindung 8 werden 0,1 g (0,11 mmol) 5, 33 mg (0,14 mmol) N,N'-Thiocarbonyldi-2(1H)-pyridon und 15 mg (0,15 mmol) Triethylamin in 15 ml Chloroform 60 min. bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird mit Diethylether ausgefällt, abfiltriert und mittels HPLC gereinigt (Rp Select B, Merck, Laufmittel 10 mM Phosphatpuffer pH 8/Methanol). Man erhält 40 mg (40%) 8 nach Gefriertrocknung, Abtrennung der Salze mit Dichlormethan/Methanol und Trocknung im Vakuum.

4. Labeling von mAK 9.2.27 (Anti-Melanom-Antikörper) 4.1. Labeling mit säurelabilem NHS-Ester 7

1 mg Antikörper in 0,5 ml 50 mM Boratpuffer (pH 9,2) wird mit 33 µl 7 (Stammlösung 5 mmol/l in DMF) versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Ungebundener Farbstoff wird über NAp-5-Säulen abgetrennt (Elution mit 25 mM Phosphatpuffer pH 7,8, +0,01% NaN3). Das Produkt mAK 9.2.27/4-Konjugat wird in Lösung bei 4°C aufbewahrt.





Fluoreszenzquantenausbeute Q=0,1% (5 µmol/l in Phosphatpuffer pH 7,8; bezogen auf Indocyaningrün als Standard mit Q=13% in DMSO nach R. C. Benson und H. A. Kues, J. of Chemical and Engineering Data 22 (1977) 379).

4.2. Labeling mit säurelabilem Isothiocyanat 8

1 mg Antikörper in 0,5 ml 50 mM Boratpuffer (pH 9,2) wird mit 6 µl 8 (Stammlösung 5 mmol/l in DMF) versetzt und 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Ungebundener Farbstoff wird über NAP-5-Säulen abgetrennt (Elution mit 25 mM Phosphatpuffer pH 7,4, +0,01% NaN3). Das Produkt mAK 9.2.27/5-Konjugat wird in Lösung bei 4°C aufbewahrt.

5. Synthese von dimeren Indotricarbocyaninfarbstoffen 5.1. Darstellung des symmetrischen Spirodimers 10 (Fig. 3)

0,1 g (0,47 mmol) 3,9-Diethyliden-2,4,8,10-tetraoxaspiro-[5.5]undecan (nach M. Crivello et al., J. Polymer Sci. . Part A: Polymer Chem. 34 (1996) 3091-3102 synthetisiert) und 0,11 g (0,94 mmol) 6-Amino-1-hexanol werden in 15 ml Diethylether 24 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird an der Ölpumpe getrocknet und ohne weitere Reinigung umgesetzt.

0,2 g (0,28 mmol) 5-Carboxy-bis-1,1'-(4-sulfobutyl)-indotricarbocyanin-natriumsalz 9 werden in 15 ml Dichlormethan zusammen mit 0,09 g (0,28 mmol) TBTU und 30 mg Triethylamin 30 min gerührt und mit 0,06 g (0,14 mmol) o. g. Spiroverbindung in 2 ml Dichlormethan versetzt. Nach 18 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und chromatographisch gereinigt (RP C-18, Laufmittel Methanol/10 mM Phosphatpuffer pH 8). Nach Gefriertrocknung werden die Salze mit Methanol/Dichlormethan ausgefällt. Man erhält 68 mg (26%) Produkt 10.





Fluoreszenzquantenausbeute Q=0,2% (5 µmol/l in Phophatpuffer pH 8; bezogen auf Indocyaningrün als Standard, siehe Beispiel 4.1.)

5.2. Darstellung eines Farbstoffdimers (11) mit säurelabilem Hydrazonlinker aus 6 (Fig. 4)

0,1 g (0,14 mmol) 5-Carboxy-bis-1,1'-(4-sulfobutyl)-indotricarbocyanin-natriumsalz 9 werden in 10 ml DMF zusammen mit 45 mg (0,14 mmol) TBTU und 15 mg Triethylamin 30 min gerührt und mit 0,14 g (0,16 mmol) 6 in 2 ml DMF versetzt. Nach 5 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether auskristallisiert, abfiltriert und chromatographisch gereinigt (RP C-18, Laufmittel Methanol/10 mM Phosphatpuffer pH 8). Nach Gefriertrocknung werden die Salze mit Methanol/Dichlormethan ausgefällt. Man erhält 0,13 g (59%) 11.





6. Messung der Fluoreszenzquantenausbeute von 11 bei verschiedenen pH-Werten in Abhängigkeit von der Zeit

Lösungen der Konzentrationen 4 µmol/l in 50 mM Phosphatpuffer der pH-Werte 7,4; 7,0; 6,6; 6,0 und 5,0 werden bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots entnommen und die Fluoreszenzquantenausbeuten bestimmt (SPEX Fluorolog Spektralfluorometer, 400 W Xe-Lampe, PM958-Detektor, kalibriert auf wellenlängenabhängige Empfindlichkeit des Detektors, Werte bezogen auf Indocyaningrün, siehe Beispiel 4.1.).





7. Synthese eines Doxorubicin-Indotricarbocyanin-Konjugates (13) mit säurelabilem Hydrazonlinker (Fig. 4)

20 mg (34 µmol) Doxorubicin-hydrochlorid und 11 mg (68 µmol) 4-(Aminomethyl)benzoesäurehydrazid werden in 3 ml wasserfreiem Methanol nach Zugabe von 2 µl Trifluoressigsäure 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt 12 wird mit Acetonitril auskristalliert, abzentrifugiert, mit Acetonitril gewaschen und getrocknet, Ausbeute 18 mg (24 µmol) Rohprodukt. 14 mg (20 µmol) 5-Carboxy-bis-1,1'-(4-sulfobutyl)-indotricarbocyanin-natriumsalz 9 werden in 0,5 ml DMF zusammen mit 7 mg (22 µmol) TBTU und 20 µl Triethylamin 30 min gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wird tropfenweise bei 0°C zu einer Lösung von o. g. 12 (18 mg in 0,2 ml DMF) gegeben und 3 h bei 0°C gerührt. Das Produkt wird durch Zugabe von Diethylether ausgefällt und analog Beispiel 5 chromatographisch gereinigt. Man erhält 12 mg (47%) 13.


Anspruch[de]
  1. 1. Verbindungen der allgemeinen Formel I



    (F-L)m-A (I)



    worin

    F für ein Farbstoffmolekül mit mindestens einem Absorptionsmaximum zwischen 600 und 1200 nm steht,

    L für eine Linkerstruktur, welche eine säurelabile und/oder enzymatisch spaltbare Bindung enthält, steht,

    m eine Zahl zwischen 1 und 80 ist,

    wobei für den Fall, daß m eine Zahl zwischen 1 und 3 ist,

    A ein Farbstoffmolekül mit mindestens einem Absorptionsmaximum zwischen 600 und 1200 nm, ein antibiotisch oder antizytostatisch wirksames Molekül, ein Biomolekül, ein nicht biologisches Makromolekül oder eine Verbindung B-(L-W)0 oder D-(L-W)0 darstellt, wobei

    D ein nicht biologisches Makromolekül ist,

    B ein Biomolekül ist,

    L die oben genannte Bedeutung hat,

    W ein antibiotisch oder antizytostatisch wirksames Molekül darstellt,

    o eine Zahl zwischen 1 und 20 ist,

    und wobei für den Fall, daß m eine Zahl zwischen 4 und 80 ist,

    A ein Biomolekül, ein nicht biologisches Makromolekül oder eine Verbindung B-(L-W)0 oder D-(L-W)0 darstellt, wobei

    D, B, L, W und o die oben genannten Bedeutungen haben.
  2. 2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den allgemeinen Formeln (I) F und/oder A für einen Polymethinfarbstoff, Tetrapyrrolfarbstoff, Tetraazapyrrolfarbstoff, Xanthinfarbstoff, Phenoxazinfarbstoff oder Phenothiazinfarbstoff stehen.
  3. 3. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) F und/oder A für einen Cyanin-, Squarilium-, Croconium-, Merocyanin- oder Oxonolfarbstoff stehen.
  4. 4. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) F und/oder A für einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel (II)





    stehen,

    worin

    R1 bis R4 und R7 bis R10 unabhängig voneinander für ein Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitrogruppe oder für einen Rest -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, -E1,

    wobei E1 und E2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige C1-C50 -Alkylkette, wobei die Kette oder Teile dieser Kette gegebenenfalls eine oder mehrere aromatische oder gesättigte zyklische C5-C6- oder bizyklische C10-Einheiten formen können, steht, und wobei die C1-C50-Alkylkette von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen, 0 bis 5 Estergruppen, 0 bis 3 Carboxygruppen bzw. 0 bis 3 Aminogruppen substituiert ist,

    und wobei jeweils benachbarte Reste R1-R4 und/oder R7-R10 unter Bildung eines sechsgliedrigen aromatischen Kohlenstoffringes miteinander verknüpft sein können,

    R5 und R6 unabhängig voneinander für einen Rest -E1 mit der oben angegebenen Bedeutung oder für eine C1-C4-Sulfoalkylkette stehen,

    und/oder R1 bis R10 für eine Verknüpfung mit L stehen,

    Q ein Fragment





    ist,

    worin

    R11 für ein Wasserstoff-, Fluor-, Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitrogruppe oder einen Rest -NE1E21 -OE1 oder -E1, wobei E1 und E2 die oben angegebene Bedeutung haben oder für eine Verknüpfung mit L steht,

    R12 für ein Wasserstoffatom oder einen Rest E1 mit der oben angegebenen Bedeutung steht,

    b eine Zahl 0, 2 oder 3 bedeutet,

    X und Y unabhängig voneinander Reste O, S, -CH=CH- oder ein Fragment





    darstellen,

    worin

    R13 und R14 unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige C1-C10-Alkylkette, die durch bis zu 5 Sauerstoffatome unterbrochen und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, stehen, und wobei die Reste R13 und R14 unter Ausbildung eines 5- oder 6-gliedrigen Ringes miteinander verknüpft sein können.
  5. 5. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) W oder A für Antibiotika, Folsäure-Analoga, Pyrimidin-Analoga, Purin-Analoga, hormonell wirksame Substanzen sowie weitere cytostatisch wirksame Substanzen stehen.
  6. 6. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) L für eine Struktur steht, welche ein säurelabiles Fragment





    worin p für eine Zahl zwischen 2 und 4 steht, enthält.
  7. 7. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) L für eine Struktur steht, welche eine enzymatisch spaltbare chemische Bindung enthält.
  8. 8. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) L für eine Struktur steht, die durch Kathepsine, Peptidasen, Carboxypeptidasen, α- und β-Glykosidasen, Lipasen, Phospholipasen, Phosphatasen, Phosphodiesterasen, Proteasen, Elastasen, Sulfatasen, Reduktasen und bakterielle Enzyme gespalten wird.
  9. 9. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I)

    A und/oder B für einen Antikörper, deren Konjugate und Fragmente, spezifische Peptide und Proteine, Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, Nukleotide, natürliche oder synthetische Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren oder deren chemische Modifikationen, wie Aptamere oder Antisenseoligonukleotide, Lipoproteine, Lectine, Kohlenhydrate, Mono-, Di- oder Trisaccharide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysaccharide oder -saccharidderivate oder für ein Dextran steht.
  10. 10. Verbindungen nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) D für Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polylysin oder Polylysin-Dendrimere oder deren Derivate steht.
  11. 11. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 zur In-vivo-Diagnostik erkrankter Gewebebereiche mittels NIR-Strahlung sowie zur Therapie erkrankter Gewebebereiche.
  12. 12. Optisches Diagnostikum zur In-vivo-Diagnostik erkrankter Gewebebereiche mittels NIR-Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit den üblichen Hilfs- und /oder Trägerstoffen sowie Verdünnungsmitteln enthält.






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