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Dokumentenidentifikation DE69226064T2 29.10.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0542314
Titel Herstellung von Eiweissmikropartikeln durch Niederschlag ein einem Anti-Lösungsmittel
Anmelder The Trustees of Princeton University, Princeton, N.J., US
Erfinder Debenedetti, Pablo G., Princeton, New Jersey 08544, US;
Lim, Gio-Bin, Kangnam-gu, Seoul, KR;
Prud'Homme, Robert K., Princeton Junction, New Jersey 08550, US
Vertreter LOUIS, PÖHLAU, LOHRENTZ & SEGETH, 90409 Nürnberg
DE-Aktenzeichen 69226064
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 13.11.1992
EP-Aktenzeichen 921194981
EP-Offenlegungsdatum 19.05.1993
EP date of grant 01.07.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.10.1998
IPC-Hauptklasse C07K 1/00
IPC-Nebenklasse A61K 9/16   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung von Proteinmikropartikeln unter Verwendung einer Ausfällung mit gasförmigem Antisolvens, und Zusammensetzungen solcher Proteine.

Konventionelle Mittel zur Verabreichung von Drogen (z.B. Pillen und Tabletten) ergeben einen einzigen Stoß oder Peak der Droge im Blut. Auf diese anfängliche Spitze folgt ein Abfall in der Blutkonzentration. Weil jeder Wirkstoff einen Konzentrationsbereich besitzt, unter dem seine therapeutische Wirkung beschränkt ist, und oberhalb dem toxische Nebenwirkungen auftreten, ist es wünschenswert, den Wirkstoff mit einer kontrollierten Geschwindigkeit abzugeben und die Veränderungen zu minimieren. Bei einer kontrollierten Freisetzung wird dies erreicht, indem man einen die Geschwindigkeit begrenzenden Schritt in das Verabreichungssystem einbaut. Unter den vielen Arten von kontrollierten Abgabesystemen befinden sich bioerodierbare Polymer-Mikrokugeln im Bereich von 1 bis 50 Mikrometer (um) Solche kleinen Mikrokugeln können subkutan oder intramuskulär injiziert werden. Bioerodierbare Polymere sind Materialien, die durch Körperflüssigkeiten in nicht-toxische Produkte abgebaut werden. Die Polymerteilchen enthalten den interessierenden Wirkstoff in dispergierter Form. Die Wirkstofffreigabe tritt teilweise als Ergebnis des Polymerabbaus innerhalb des Körpers auf. Systeme, die auf eine räumliche oder zeitliche Kontrolle der Wirkstofffreigabe im Körper gerichtet sind, werden allgemein als kontrollierte Wirkstoff-abgebende Systeme bezeichnet.

Eine kontrollierte Freisetzung von Proteinen, wie z.B. von therapeutischen Enzymen, erfordert die Bildung kleiner Teilchen, die in der Polymermatrix gleichmäßig dispergiert werden können. Verfahren zur Herstellung von Proteinteilchen umfassen Sprühtrocknen, Lyophilisieren, Mahlen, Pulverisieren und Proteinmikronisierung; WO/90/132. Nur das letztere Verfahren führt zu kleinen Teilchen.

John W. Tom und Pablo G. Debenedetti, "Formation of Bioerodible Microspheres and Microparticles by Rapid Expansion of Supercritical Solutions", Department of Chemical Engineering, Princeton University, 1991, beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen und bioerodierbaren Polymermikrokügeln, hauptsächlich von Polyhydroxysäuren einschließlich Poly(L-Milchsäure) (L-PLA), Poly(D,L-Milchsäure), (DL-PLA) und Poly(Glykolsäure) (PGA). Mikropartikel und Mikrokugeln dieser Polymeren wurden mit dem Ziel hergestellt, um für die kontrollierte Freisetzung von Pharmazeutika verwendet zu werden. Eine Kristallisationskernbildung von Poly(L-Milchsäure) aus CO&sub2; und CO&sub2;-Aceton-Mischungen ergab Mikropartikel und Mikrokugeln im Bereich von 4 bis 25 Mikrometer (um). Mikrokugeln (2 bis 20 um) wurden auch unter Verwendung von Chlortrifluormethan als Lösungsmittel erhalten.

Das von Tom und Debenedetti verwendete Verfahren zur Herstellung von Mikrokugeln und Mikropartikeln umfaßte die rasche Expansion superkritischer Lösungen. Dies war aus Matson et al., "Expansion of Supercritical Fluid Solutions: Solute Formation of Powders, Thin Films and Fibers" bekannt; md. Eng. Chem. Res. 26 (1987) 2298-2306. Im Verfahren der raschen Expansion superkritischer Lösungen wird ein nichtflüchtiger gelöster Stoff in einer superkritischen Flüssigkeit gelöst. Die resultierenden Lösung ist in Nachbarschaft des kritischen Punktes der Lösungsmittel hoch komprimierbar. Eine Kristallisationskernbildung des gelösten Stoffes wird mechanisch ausgelöst durch Verringerung der Dichte der Lösung durch rasche Expansion, wodurch seine Lösungskapazität verringert wird; Kumar et al., "Modelling the Solubility of Solids in Supercritical Fluids with Density as the Independent Variable", J. Supercrit. Fluids 1 (1988) 15-22. Die Kombination einer sich rasch ausbreitenden mechanischen Perturbation und hoher Übersättigungsverhältnisse führt zu gleichmäßigen Bedingungen innerhalb des Trägerfluids, und damit im Prinzip zu kleinen Teilchen mit einer engen Teilchengrößenverteilung.

Chang et al., "Solvent Expansion and Solute Solubility Predictions in Gas-Expandes Liguids", AIChE Journal 36, Nr. 6 (1990) 939-942, beschreibt den Zusatz eines gasförmigen Antisolvens zur Flüssigphasen-Ausfällung von Feststoffen. Siehe auch Gallagher et al., "Gas (Gas Anti-Solvent) Recrystallization: A New Process to Recrystallize Compounds Insoluble in Supercritical Fluids", Am. Chem. Soc. Symp. Ser., Nr. 406 (1989).

Chang et al. beschreiben die Umkristallisation von Acetaminophen aus Butanol und von β-Carotin aus Toluol unter Verwendung von CO&sub2;. Das CO&sub2; wurde an der Oberseite der Säule oder des Behälters, die/der die mit Gas zu expandierende Lösung enthielt, aufgegeben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine schematische Darstellung einer experimentellen Vorrichtung zur Antisolvensgas- Umkristallisaton und Flüssigexpansion, die erfindungsgemäß brauchbar ist. In Figur 1 bedeutet "V" Ventile, "PI" Drucksensoren, "TI" Temperatursensoren. Gegendruckregulatoren, Rotameter, Filter, Absperrventile, Dosierventile, Startventile, Bruchplatten und Wärmeaustauscher werden mit konventionellen Symbolen bezeichnet.

Die Figur 2 ist eine Mikrophotographie in 8000-facher Vergrößerung, die in Beispiel 1 hergestellte Catalase- Teilchen zeigt, wobei die Teilchen auf der Oberseite des Objektträgers gesammelt wurden.

Figur 3 ist eine Mikrophotographie des gleichen Materials der Figur 2 in einer 15000-fachen Vergrößerung.

Figur 4 ist eine Mikrophotographie des gleichen Materials der Figur 3, wobei die Teilchen auf einem Filter gesammelt wurden und 10000-fach vergrößert sind.

Figur 5 ist eine der Figur 4 entsprechende Mikrophotographie bei 15000-facher Vergrößerung.

Figur 6 ist eine Mikrophotographie der nach Beispiel 2 hergestellten Insulinteilchen bei 10000-facher Vergrößerung, und auf einem Filter gesammelt.

Figur 7 ist eine Mikrophotographie der in Beispiel 2 hergestellten Insulin-Teilchen bei 5500-facher Vergrößerung und auf einem Filter gesammelt.

Beschreibung

Nach Figur 1 wird eine Lösung von gelöstem Protein aus dem Lösungsbehälter 14 (in dem die Lösung hergestellt und/oder gelagert werden kann) einem Kristallisationsgefäß 10 zugeführt. Die Lösung wird durch geeignete Durchflußmesser zugeführt, wie z.B. dem Rotameter 30 und der Hochdruck- Flüssigkeitspumpe 32. Der Druck kann unter Verwendung eines Rückdruckregulators 34 kontrolliert werden. Die Lösung kann mittels geeigneter Heizeinrichtungen, wie z.B. den Rohrschlangen 36, die durch zirkulierende Luft auf der gewünschten Temperatur gehalten werden, auf die gewünschte Temperatur gebracht werden. Die Erwärmung kann durch Heizbänder und Luftzirkulation bewirkt werden.

Die mit Druck beaufschlagte Lösung wird einer Kristallisationskammer 20 zugeführt. Vorzugsweise wird sie auf der Oberseite des Kristallisationsgefäßes durch eine Platinscheibe 53 mit einem Laser-Bohrloch injiziert, um einen feinen Sprühnebel von Lösungströpfchen in der Kristallisationskammer 20 auszubilden. Die Scheibe 53 weist deshalb mindestens eine Öffnung auf, um einen feinen Sprühnebel auszubilden. Typischerweise liegt der Durchmesser der Öffnung im Bereich von 5 bis 50, vorzugsweise von 10 bis 30, und insbesondere von 15 bis 20 um. Vorzugsweise wird die Lösung in eine Vielzahl von Tröpfchen mit einem Durchmesser von 10 bis 500 um, mindestens einen kontinuierlichen feinen Strom mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm, oder einen dünnen Film mit einer Dicke von weniger als 1 mm überführt.

Vom Antisolvensgas-Behälter 18 wird ein Antisolvensgas zur Antisolvensgas-Kompressionspumpe 40 geführt. Der Gasdruck kann durch einen Rückdruck-Regulator 42 kontrolliert werden. Die Temperatur des Antisolvens im Behälter 18 liegt im Bereich von 10 bis 40 ºC, und vorzugsweise von 20 bis 30 ºC, wie z.B. flüssiges Kohlendioxid bei 25 ºC. Das Antisolvens wird im Wärmeaustauscher 44 gekühlt, wobei die Lösungsmittelpumpe 40 das flüssige Antisolvens auf einen überkritischen Druck bringt. Überschüssiges Lösungsmittel im Gasstrom kann zum Flüssigkeitseinlaß der Pumpe 40 zurückgeführt werden.

Typische Bedingungen am Auslaß der Pumpe 40 sind 25 bis 45 ºC, und insbesondere 30 bis 40 ºC, und 60 bis 200 Atmosphären Druck, und insbesondere 100 bis 150 Atmosphären Druck. Das komprimierte Antisolvens wird durch geeignete Feinmeßeinrichtungen, wie z.B. das Feindosierventil 46, zugeführt. Zwischen der Lösungsmittelpumpe 40 und dem Kristallisationsgefäß 10 können gegebenenfalls zusätzliche Thermostateinrichtungen, wie z.B. Rohrschlangen 48, vorhanden sein. Das superkritische Antisolvensgas wird dann mit einer kontrollierten Geschwindigkeit in die Kristallisationskammer 20 geführt, damit diese ein superkritisches Gaskontinuum enthält

In der Kristallisationskammer 20 löst sich das superkritische Antisolvensgas in der Proteinlösung mit einer kontrollierten Geschwindigkeit, die von der Strömungs- oder Tröpfchengeometrie, der Temperatur und der Konzentration abhängt. Wenn die Lösung expandiert fällt das gelöste Material aus. Die Verwendung eines Kontinuums des superkritischen Fluids und die Hindurchführung eines feinen Stroms, Films oder von Tröpfchen durch das superkritische Gas ergibt eine rasche Expansion der flüssigen Lösung und Ausfällung des gelösten Materials in Form von extrem feinen Teilchen von weniger als 5, vorzugsweise von weniger als 2, und insbesondere von weniger als 1 um Durchmesser, insbesondere für gelöstes Material, das in Kugelform ausfällt. Nadelförmige Präzipitate haben einen Durchmesser von weniger als ca. 3, und insbesondere von weniger als 1 um, bei einer Länge von weniger als 5, und vorzugsweise von weniger als 3 um. Die rasche Ausfällung ergibt eine enge Teilchengrößenverteilung, wie dies in den Figuren 2 bis 7 beispielhaft dargestellt wird.

Die verarmte Lösung und verbrauchtes superkritisches Antisolvensgas werden zum Entspannungsbehälter 22 geführt, um wieder auf Umgebungsbedingungen zurückgebracht zu werden. Die ausgefällten Kristalle werden aus dem Kristallisationsgefäß 10 an der Kristallsammelöffnung 26 gesammelt. Die Kristalle können auf irgendeine geeignete Weise, z.B. auf einem Filter und/oder einer Glasplatte, gesammelt werden.

Eine Fluidmischung aus verbrauchtem Lösungsmittel und superkritischem Fluid kann am Boden der Kristallisationskammer 20 über die Leitung 50 abgenommen werden. Die Fluidmischung strömt durch das Ventil V7 zum Sammelbehälter 52, über das Ventil V4 zum Entspannungsbehälter 22, wo die Mischung entspannt und auf Atmosphärendruck expandiert wird.

Das System sollte eine Größe besitzen, um Drucke bis zu 6000 psi, und vorzugsweise im Bereich von Atmosphärendruck bis 6000 psi, bei Temperaturen im Bereich von 20 ºC bis 60 ºC, und vorzugsweise von 30 ºC bis 50 ºC, handhaben zu können.

Im Kristallisationsgefäß 10 können verschiedene Durchflußmuster verwendet werden. Die Richtung des superkritischen Antisolvensgasflußes im Kristallisationsgefäß (aufwärts oder abwärts) kann durch die Ventile vor und nach dem Kristallisationsgefäß bestimmt werden. Für eine Aufwärtsströmung im Kristallisationsgefäß sind das Ventil V2 und das Ventil V3 offen, und das Ventil V1 und das Ventil V4 sind geschlossen. Wenn das Antisolvensfluid nach unten strömen soll, werden die Ventile umgekehrt. Der Fluß der Proteinlösung kann im Gleichstrom oder Gegenstrom zur Antisolvensfluidströmung sein. In einer bevorzugten Ausführungsform mit kontinuierlichem Betrieb wird die Proteinlösung in das Kristallisationsgefäß durch die Hochdruckflüssigkeitspumpe 32 gepumpt, und ihre momentane Strömungsgeschwindigkeit wird durch das Flüssigkeitsrotameter 30 gemessen. Der Druck wird unter Verwendung eines Rückdruckregulators 34 kontrolliert, und eine mit Druck beaufschlagte Proteinlösung wird in den obersten Teil des Kristallisationsgefäßes injiziert. Das Antisolvensgas wird ebenfalls in den obersten Teil des Kristallisationsgefäß injiziert, damit sowohl das superkritische Solvensfluidkontinuum und die Proteinlösung durch das Kristallisationsgefäß vom obersten Teil zum Boden im Gleichstrom fließen. Das Kristallisationsgefäß kann diskontinuierlich, halbkontinuierlich oder kontinuierlich betrieben werden. Die Lösung des gelösten Materials kann im Gleichstrom oder im Gegenstrom in Bezug auf den Strom des superkritischen Antisolvensgaskontinuums im Gleichstrom oder im Gegenstrom geführt werden.

Geeignete lösliche Materialien sind Protein, insbesondere hydrophobe Enzyme, wie z.B. Insulin, Catalase, Adrenocorticotrophinhormon und Peroxidase. Das Verfahren kann jedoch im wesentlichen auf irgendein Protein angewendet werden, und ist nicht von der chemischen Struktur oder der biologischen Aktivität abhängig.

Brauchbare Lösungsmittel für das Protein umfassen mindestens ein nicht-wässeriges Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol, Formamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Essigsäure, Dimethylformamid, Ethylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und Dimethylanilin.

Superkritische Gase, die verwendet werden können, umfassen (wobei ihre kritischen Temperaturen (ºC) und kritischen Drucke (atm) angegeben sind) Ethan (32,2 ºC, 48,1 atm), Ethylen (9,21 ºC, 39,7 atm), Schwefelhexafluorid (45,5 ºC, 37,1 atm), Distickstoffoxid (36,5 ºC, 71,7 atm), Chlortrifluormethan (28 00, 38,7 atm) und Monofluormethan (44,5 ºC, 58 atm). Es wurde eine Lösung in Wasser und Ethanol verwendet. Es wurde jedoch gefunden, daß die Gegenwart von Wasser in solchen Lösungen die Bildung von Proteinen mit kleiner Teilchengröße verringert.

Erfindungsgemäß wird eine Proteinzusammensetzung mit Proteinteilchen erhalten, worin im wesentlichen alle Proteinteilchen für sich isoliert sind und einen Durchmesser von weniger als 5, vorzugsweise von weniger als 3, und insbesondere von weniger als 1 um besitzen. Die Proteinzusammensetzung besitzt, wie in den Figuren 2 bis 7 gezeigt, eine enge Teilchengrößenverteilung. Diese Proteine haben eine gleichmäßige oder kontrollierte chemische Zusammensetzung. Deshalb können Proben aus einer Zusammensetzung, die im wesentlichen aus einem gewünschten Protein besteht, isoliert und hergestellt werden.

Die isolierten erfindungsgemäßen Proteine können verwendet werden, um Zusammensetzungen für eine zeitliche Wirkstofffreisetzung herzustellen. Solche Zusammensetzungen können eine bioerodierbare polymere Matrix und mindestens ein Protein mit einem entsprechenden Durchmesser von weniger als 3 um umfassen. Bevorzugte Polymere sind Polyhydroxysäuren, wie z.B. solche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(L-Milchsäure), Poly(D,L-Milchsäure) und Poly(Glykolsäure). Die Zusammensetzung kann 0,1 bis 50 Gew.-% Protein umfassen.

Vorzugsweise enthalten die Zusammensetzungen zur Wirkstofffreisetzung eine Polymermatrix mit einem Kontinuum aus einer bioerodierbaren Polymermatrix, in der die Proteinteilchen dispergiert sind. Solche Teilchen können wie vorstehend beschrieben, auf auf diesem Gebiet allgemein bekannte Weise hergestellt werden.

Nachfolgend werden einige Beispiele angegeben, die die Erfindung und die Art ihrer Durchführung veranschaulichen.

Nach Figur 1 wurde flüssiges Kohlendioxid in Lösungsmittelbehälter 18 durch die Hochdruckflüssigkeitspumpe 40, eine American Lewa Plunger Metering Pump, Model EL-1, eingestellt auf 6000 psi und 2 Gallonen pro Stunde, komprimiert. Der Druck wurde mittels des Rückdruckregulators 42, einen Tescom, Model 54-2100 Series, eingestellt auf 6000 psi, kontrolliert. Das komprimierte Kohlendioxid wurde in ein durchsichtiges Kristallisationsgefäß 20, ein Jerguson Gauge, Model 19T40, 316 Stainless Steel, 5000 psi, 1,3 cm x 1,3 cm, 31,8 cm lang, mit 50 cm³, durch das Feindosierventil 46, ein Autodave Engineering Micrometering Valve 6OVRMM, eingeführt. Das mit Druck beaufschlagte Kohlendioxid wurde in den Rohrschlangen 48 vorerhitzt.

Der Druck im Kristallisationsgefäß wurde durch ein Kristallisationsgefäß-Druckanzeigegerät, ein Bourdon Gauge, Omega Model PGJ-45B-5000, eingestellt auf 5000 psi, angezeigt, und mittels des Rückdruck-Regulators 59, ein Tescom 26-1700 Series, eingestellt auf 6000 psi, kontrolliert.

Die Proteinlösung aus dem Proteinlösungsbehälter 14 wurde kontinuierlich mittels einer Hochdruckpumpe, einer Milton Roy LDC Duplex Metering Pump, gepumpt. Die momentane Strömung wurde mittels eines Flüssigkeitsrotameters 30, ein Fischer und Porter, Model 10A6132, 0-14 cm³ Wasser pro Minute, gemessen. Der Druck der Proteinlösung wurde unter Verwendung eines Rückdruckregulators 34, ein Tescom, 26-1700 Series, auf 10000 psi eingestellt, kontrolliert. Die Proteinlösung wurde in den Rohrschlangen 36 vorerhitzt.

Die mit Druck beaufschlagte Proteinlösung wurde in den obersten Teil des Kristallisationsgefäßes 10 durch eine Platinscheibe 53 mit einer Laserbohrung, einer Ted Pella, 3 mm OD x 0,24 mm Dicke, 20 mm Durchmesser, injiziert.

Am Boden des Kristallisationsgefäßes wurden die Proteinpartikel ausgefällt und nach der Kristallisation auf einem schräggestellten Objektträger abgelagert. Die Ebene des Objektträgers 55 besaß einen Winkel von 10 º zur Richtung der Proteinlösungsstromes. Zusätzlich wurde unterhalb des Objektträgers ein Filter 57, Mott Metallurgical, 316 Stainless Steel, 1,6 cm Durchmesser, 0,5-2 mm Porengröße, angebracht, um alle Proteinteilchen zu sammeln. Ein Thermoelement 56, Omega Engineering Type J, wurde in der Mitte des Kristallisationsgefäßes vorgesehen, um die Temperatur anzuzeigen.

Die auf dem Objektträger gesammelten Proteinteilchen wurden mittels eines optischen Universalmikroskops von Carl Zeiss und einem Rasterelektronenmikroskop JEOL JSM-840A untersucht, wobei die Proben mit Gold-Palladium beschichtet waren. Die auf dem Mikrofilter befindlichen Teilchen wurden ebenfalls mit dem Rasterelektronenmikroskop untersucht.

Die aus dem Kristallisationsgefäß kommende Fluidmischung aus Kohlendioxid, Ethanol und Wasser wurde entspannt und auf Atmosphärendruck expandiert, indem man sie durch einen zylindrischen Entspannungsbehälter 22, ein Swagelok, 150 ml, 5000 psi, und den Rückdruck-Regulator 58, ein Tescom, 26-1700 Series, eingestellt auf 6000 psi, hindurchführte.

Die momentanen und gesamten Strömungsgeschwindigkeiten des gelösten freien CO&sub2;-Gases wurden mit einem Rotameter 60 (Fischer und Porter, Model 10A4555) bzw. einem 0-3,35 SCFM AIR und Trockenprobenmeßgerät 62 American Meter, Model DTM200A) gemessen.

Während des Versuches betrugen die normalen Strömungsgeschwindigkeiten der Proteinlösung und des Antisolvensgases 0,35 cm³/min bzw. 35 g/min, und die typische Betriebszeit betrug für den kontinuierlichen Betrieb 4 Stunden. Das gesamte System war in einer Luftkammer eingeschlossen, wo die Temperatur unter Verwendung eines PID- Temperaturkontrollgerätes, einem Omega Engineering Model CN9000, und von Banderhitzern, kontrolliert wurde.

Zur Messung des Expansionsverhaltens der CO&sub2;/Ethanol-Lösung wurden 20 ml Ethanollösung vorher in das Kristallisationsgefäß eingebracht und der Druck in 200 psi- Schritten über die Ventile V2 und V7 erhöht. Solvensgas wurde dann durch das Ventil V8, das Kristallisationsgefäß 20 und das Ventil V5 unter Verwendung eines Hochdruckkompressors (Haskell; Double Acting Single Stage Model ACD-62) zirkulieren gelassen, wobei die Ventile V6 und V7 geschlossen waren, bis das System den Gleichgewichtszustand erreichte und der Flüssigkeitsspiegel konstant blieb.

Beispiel 1

Es wurden Catalasepartikel (Figuren 2 bis 5) mit einem entsprechenden Durchmesser von weniger als 1 um hergestellt.

Es wurde eine Lösung von 20 mg Catalase (aus Rinderleber) [Sigma Chemicals C-40] in 200 ml 90 % Ethanol (Pharmco Products Co., 200 proof) und 10 % Wasser (mit einer Umkehrosmosevorrichtung, Hydro Picosystem, deionisiert) verwendet. Der pH-Wert der Lösung wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 3,22 eingestellt.

Flüssiges Kohlendioxid (MG Industries; Bone-dry grade, > 99,8 %) wurde mittels einer Hochdruckflüssigkeitspumpe 40 komprimiert. Der Abgabedruck (1600 psi) wurde mittels eines Rückdruck-Regulators 42 kontrolliert. Die mit Druck beaufschlagte Flüssigkeit wurde auf eine superkritische Temperatur (35 ºC) vorerhitzt und vor dem Eintritt in das Kristallisationsgefäß 10 durch die Rohrschlangen 48 hindurchfließen gelassen. Das System war verschlossen und die Thermostatierung wurde erreicht, indem man heiße Luft unter Temperaturkontrolle (Omega Engineering Model CN9000) zirkulieren ließ, wobei die Wärme durch Banderhitzer bereitgestellt wurde. Die durchsichtige Kristallisationskammer 20 wurde bei 35 ºC gehalten.

Das superkritische Fluid wurde dem Kristallisationsgefäß durch ein Feindosierventil 46 zugeführt, wobei die Ventile V1 und V4 offen waren, und V2 und V3 geschlossen. Der Druck innerhalb des Kristallisationsgefäßes wurde mittels des Rückdruckregulators 59 bei 1300 psi gehalten. Die momentanen und gesamten Strömungsgeschwindigkeiten des superkritischen Fluids wurden mit dem Rotameter 60 bzw. dem Trockenprobenmeßgerät 62 gemessen. Die Strömungsgeschwindigkeit des superkritischen Fluids betrug 33 g/min.

Die das Enzym enthaltende flüssige Lösung wurde mit Druck beaufschlagt und mittels der Flüssigkeitspumpe 32 und der Rückdruck-Regulatorkontrolle (1430-1530 psi) zirkulieren gelassen. Die Lösung zirkulierte durch die Rohrschlangen 36 und wurde auf 35 ºC vorerwärmt. Sie trat in den obersten Teil des Kristallisationsgefäßes durch eine Platinscheibe mit Laserbohrung (Ted Pella: 3 mm OD x 0,24 mm Dicke; 20 um) ein, und verteilte sich in sehr kleinen Tröpfchen. Die Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit betrug 0,35 cc/min. Die Flüssigkeit und die superkritischen Strömungen zirkulierten im Gleichstrom nach unten.

Die aus dem Kristallisationsgefäß austretende Fluidmischung aus Kohlendioxid, Ethanol und Wasser wurde entspannt und auf Atmosphärendruck expandiert, indem man sie durch den zylindrischen Entspannungsbehälter 22 und den Rückdruck- Regulator 58 hindurchfließen ließ.

Das superkritische Fluid expandierte und löste schließlich den Großteil des flüssigen Lösungsmittels, wodurch die Ausfällung der Enzymteilchen verursacht wurde. Die Teilchen wurden auf einem geneigten Objektträger, der am Boden des Kristallisationsgefäßes in einem Winkel von ca. 10º zur Richtung der Strömung der Proteinlösung angebracht war, gesammelt. Die Teilchen wurden auch auf einem Filter (Mott Metallurgical; 316 Stainless Steel, 1,6 cm Durchmesser, 0,5 um Porengröße) gesammelt. Der Kohlendioxid-Auslaß befand sich ca. 8 cm oberhalb des Filters. Die Dauer des Versuches betrug 260 Minuten.

Die Figuren 2 und 3 zeigen auf der Oberseite des Objektträgers (zur Düse gerichtet) gesammelte Teilchen. Die Figuren 4 und 5 zeigen auf dem Filter gesammelte Teilchen.

Beispiel 2

Der pH-Wert einer Lösung aus 20 mg Zinkinsulin [Miles; low endotoxin 86-003] in 200 ml 90 % Ethanol (Pharmco Products Co., 200 proof)-10 % Wasser (mittels einer Umkehrosmosevorrichtung, Hydro Picosystem, deionisiert) wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 2,56 eingestellt.

Flüssiges Kohlendioxid (MG-Industries; Bone-dry grade, > 99,8 %) wurde mittels einer Hochdruckflüssigkeitspumpe 40 komprimiert. Der Abgabedruck (2000 psi) wurde mittels eines Rückdruckregulators 42 kontrolliert. Die mit Druck beaufschlagte Flüssigkeit wurde, bevor sie in das Kristallisationsgefäß 10 eintrat, auf superkritische Temperatur (35 ºC) vorerhitzt, als sie durch die Rohrschlangen 48 strömte. Das System war geschlossen und das Thermostatieren wurde erreicht, indem man heiße Luft unter Temperaturkontrolle (Omega Engineering Model CN9000) zirkulieren ließ, wobei das Erwärmen durch Banderhitzer erfolgte. Die durchsichtige Kristallisationskammer 20 wurde bei 35 ºC gehalten.

Das superkritische Fluid wurde dem Kristallisationsgefäß durch ein Feindosierventil 46 zugeführt, wobei die Ventile 1 und 4 offen waren, und die Ventile 2 und 3 geschlossen. Der Druck innerhalb des Kristallisationsgefäß wurde mittels des Rückdruckregulators 59 bei 1300 psi gehalten. Die momentanen und gesamten Strömungsgeschwindigkeiten des superkritischen Fluids wurden mit einem Rotameter 60 bzw. einem Trockenprobenmeßgerät 62 gemessen. Die Strömungsgeschwindigkeit des superkritischen Fluids betrug 35,6 g/min.

Die das Enzym enthaltende flüssige Lösung wurde mit Druck beaufschlagt und mittels der Flüssigkeitspumpe 32 unter Kontrolle mit dem Rückdruckregulator 34 (1450 psi) zirkulieren gelassen. Die Lösung zirkulierte durch die Rohrschlange 36 und wurde auf 35 ºC vorerwärmt. Sie betrat den obersten Teil des Kristallisationsgefäßes durch eine Platinscheibe mit Laserbohrung (Ted Pella; 3 mm OD x 0,24 mm Dicke; 20 um) traf in sehr kleinen Tröpfchen aus. Die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsdurchflußes betrug 0,39 cc/min. Die Flüssigkeit und die superkritischen Ströme zirkulierten im Gleichstrom nach unten.

Die das Kristallisationsgefäß verlassende Fluidmischung aus Kohlendioxid und Wasser wurde entspannt und auf Atmosphärendruck expandiert, indem man sie durch den zylindrischen Entspannungsbehälter 22 und einen Rückdruckregulator 58 hindurchfließen ließ.

Das superkritische Fluid expandierte und löste schließlich den Großteil des flüssigen Lösungsmittels, wodurch eine Ausfällung der Enzymteilchen verursacht wurde. Die Teilchen wurden auf einem geneigten Objektträger, der sich in einem Winkel von ca. 10 º zur Richtung der Strömung der Proteinlösung auf dem Boden des Kristallisationsgefäßes befand, gesammelt. Teilchen wurden auch auf einem Filter (Mott Metallurgical; 316 Stainless Steel, 1,6 cm Durchmesser, 0,5 um Porengröße) gesammelt. Der Kohlendioxidauslaß befand sich ca. 60 mm unterhalb des Filters.

Die Dauer des Versuches betrug für den Kohlendioxid-Input 296 Minuten, und für den Flüssigkeits-Input 237 Minuten, und 17 Minuten für die Strömung der flüssigen Lösung ohne gelöstes Enzym.

Die Figur 6 veranschaulicht auf dem Filter gesammelte nadelförmige Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 1 um und einer Länge von weniger als 3 um. Die Figur 7 veranschaulicht gesammelte kugelförmige Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als ca. 1 um.

Obwohl beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, wird der Rahmen der Erfindung nur durch die nachfolgenden Ansprüche bestimmt.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Bildung trockener Mikropartikel eines Proteins mit einem entsprechenden Durchmesser von weniger als ungefähr 5 um mit einer engen Korngrößenverteilung, umfassend: in Kontakt bringen eines Überschusses eines superkritischen Antisolvens mit geringer Solventationskraft für das Protein mit Tröpfchen einer flüssigen Lösung des Proteins in einem Solvens für das Protein, wobei die Tröpfchen Durchmesser von ungefähr 10 um bis ungefähr 500 um besitzen, mit einer zum Lösen in und Expandieren der flüssigen Lösung und Präzipitieren der trockenen Proteinpartikel geeigneten Geschwindigkeit ohne den Druck des superkritischen Antisolvens im wesentlichen zu ändern.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Protein eine geringe Wasserlöslichkeit besitzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Protein ein hydrophobes Enzym ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Protein aus der Gruppe bestehend aus Insulin, Katalase, Adrenocorticotrophinhormon und Peroxidase ausgewählt ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das superkritische Antisolvens aus der Gruppe bestehend aus Kohlendioxid, Ethan, Ethylen, Schwefelhexafluorid, Distickstoffoxid, Chlortrifluormethan, Monofluormethan und Mischungen davon ausgewählt ist.

5 6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das superkritische Antisolvens Kohlendioxid ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Lösungsmittel für das Protein aus der Gruppe aus Ethanol, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Essigsäure, Formamid, N,N-Dimethylformamid, Ethylenglycol, flüssigem Polyethylenglycol und N,N- Dimethylanilin ausgewählt ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem das Lösungsmittel für das Protein wässriges Ethanol ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Lösung des Proteins in ein Kontinuum des superkritischen Antisolvens gesprüht wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das Protein allgemein kugelförmige. Partikel mit einem entsprechenden Durchmesser von weniger als 1 um bildet.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das Protein nadelähnliche Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 3 um bildet.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Tröpfchen der Lösung des Proteins kontinuierlich im Gleichstrom mit einem Strom des Antisolvensgases gefördert werden.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Tröpfchen der Lösung des Proteins kontinuierlich im Gegenstrom mit einem Strom des Antisolvensgases gefördert werden.







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