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Verfahren zur Herstellung von Epsilon-poly-L-Lysin - Dokument DE69322893T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69322893T2 27.05.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0557954
Titel Verfahren zur Herstellung von Epsilon-poly-L-Lysin
Anmelder Chisso Corp., Osaka, JP
Erfinder Hiraki, Jun, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, JP;
Suzuki, Eriko, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, JP
Vertreter W. Kraus und Kollegen, 80539 München
DE-Aktenzeichen 69322893
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 24.02.1993
EP-Aktenzeichen 931028518
EP-Offenlegungsdatum 01.09.1993
EP date of grant 07.01.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.05.1999
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C12N 11/02   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin unter Verwendung i!!iiuiiobilisierter Bakterienzellen.

Beschreibung des Standes der Technik

Es ist bereits bekannt, ε-Poly-L-lysin durch Kultivierung von beispielsweise Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346 zu erhalten (JP 53-72896).

Die obige Substanz ist ein Homopolymer von L-Lysin, das heißt eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht, die durch Bindung einer Aminogruppe in der ε-Stellung von L- Lysin an die Carboxyl-Gruppe, von L-Lysin benachbart, dazu an der linearen Kette über Peptidbindung erhalten wird.

Da die obige Substanz ein Polymer von L-Lysin ist, welches eine essentielle Aminosäure ist, besitzt es eine hohe Sicherheit und da es einen hohen Kationengehalt aufweist, besitzt es spezifische physikalische Eigenschaften. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaften wurden verschiedene Anwendungsverfahren, beispielsweise bei Toilettenartikeln, kosmetischen Präparaten, Futterzusatzstoffen, Pestiziden, Nahrungsmittelzusatzstoffen, elektronischen Materialien usw., entwickelt.

Das bekannte Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin wird wie folgt durchgeführt:

Bakterienzellen, die zum Streptomyces-Genus gehören, mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität, werden bei aeroben Bedingungen kultiviert und anschließend wird der pH, nachdem das Wachstum der Bakterienzellen bestätigt wurde, auf einen Wert in der Nachbarschaft von 4 eingestellt. Danach wird die Kultivierung weitergeführt, die Bakterienzellen werden von der Kulturlösung, die ε-Poly-L-lysin enthält, durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, und die Bakterienzellen werden mittels z. B. basischer anionischer Austausch-Harzbehandlung (JP 02-020295) oder kationischer Austausch-Harzbehandlung (JP 02-092927) gereinigt.

Jedoch wird bei dem bekannten Verfahren für die Kultivierung von Bakterienzellen vom Streptomyces-Genus mit 8- Poly-L-lysin-Produktivität bei aeroben Bedingungen und Akkumulation des ε-Poly-L-lysins in der Kulturlösung die Viskosität der Kulturlösung hoch, und die Zellen erleiden eine Bakteriolyse, und es ist daher unmöglich, die Bakterienzellen wieder zu verwenden. Wenn eine Zentrifugentrennung oder eine Filtration durchgeführt wird, um die Bakterienzellen abzutrennen, haben die Bakterienzellen eine Bakteriolyse erlitten, und daher ist eine lange Zeit erforderlich.

Beispielsweise sind zur Entfernung von Bakterienzellen aus einer Kulturlösung von 10 m³ unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung mit einer Filtrationsfläche von 10 m² ungefähr 32 h erforderlich. Eine solch lange Zeit ist für die Produktion ein ernstes Hindernis. Da die Bakterienzellen Bakteriolyse erleiden, ist die Wiedergewinnung von nur der Kulturlösung schwierig um eine semikontinuierliche Kultivation zu erreichen, beispielsweise, wenn ein frisches Medium zugegeben wird. Die obigen Faktoren behindern die Verringerung der Produktionskosten von ε-Poly-L-lysin. Wenn es somit möglich wäre, die höhere Viskosität der Kulturlösung, die auf die Bakterienzellen zurückzuführen ist, und die Bakteriolyse der Bakterienzellen zu inhibieren, wäre es möglich, die Herstellungskosten von ε-Poly-L-lysin zu verringern. Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen bei einem Verfahren zur Lösung der obigen Aufgabe durchgeführt. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, daß wenn ein Mikroorganismus mit Produktivität für ε-Poly- L-lysin immobilisiert wird, die obigen Schwierigkeiten auf einen Streich gelöst werden, und so wurde die vorliegende Erfindung gemacht.

Wie aus dem obigen folgt, liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues und effizientes Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin zur Verfügung zu stellen, bei dem ε-Poly-L-lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus gebildet wird, immobilisierte Bakterienzellen verwendet werden, wodurch eine höhere Viskosität der Kulturlösung und eine Bakteriolyse der Bakterienzellen inhibiert werden, die Gewinnung der Kulturlösung, die c-Poly- L-lysin enthält, und die Reinigung von ε-Poly-L-lysin aus der wiedergewonnenen Kulturlösung leicht wird und die abgetrennten, immobilisierten Bakterienzellen wiederholt verwendet werden können und semikontinuierlich oder kontinuierlich als Katalysator für die Herstellung von ε-Poly- L-lysin verwendet werden können. Die semikontinuierliche Produktion, die hier beschrieben wird, bedeutet eine Produktion, bei der ein Medium, das ein Substrat enthält oder das Materialien enthält, in den Reaktor, der die immobilisierten Bakterienzellen enthält, gegeben wird, und daß die Gesamtmenge dieses Mediums durch ein frisches Medium je zu einer definierten Zeit ausgetauscht wird, wobei ε-Poly-Llysin wiederholt gebildet wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt die folgenden Merkmale (1), (2), (3) und (4):

(1) Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin, welches die Kultivation eines Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin- Produktivität bei aeroben Bedingungen umfaßt, wobei (i) der Mikroorganismus gemäß einem Verfahren immobilisiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Adsorptionsverfahren, einem Vernetzungsverfahren und einem Einschluß-/Einfangverfahren, im Folgenden als Trappingverfahren bezeichnet, (ii) der Immobilisierungsträger anders ist als saure Gele mit hohem Molekulargewicht und (iii) der pH zum Zeitpunkt der Kultivation des Mikroorganismus 4 bis 7 beträgt.

(2) Ein Verfahren zur Herstellung von c-Poly-L-lysin nach Ausführungsform (1), wobei das Verfahren semikontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt wird.

(3) Ein Verfahren zur Herstellung von s-Poly-L-lysin nach den Ausführungsformen (1) oder (2), wobei der Mikroorganismus mit ε-Poly-L-Lysin-Produktivität ein Bakterium ist, das zum Streptomyces-Genus gehört.

(4) Ein Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin nach der Ausführungsform (1) oder (2), wobei der Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität gemäß einer Kombination von Adsorptionsverfahren mit dem Vernetzungsverfahren oder eine Kombination aus Adsorptionsverfahren mit dem Einschluß- bzw. Einfangverfahren immobilisiert ist.

GENAUE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Als Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können irgendwelche Mikroorganismen mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität verwendet werden. Als solche Mikroorganismen können beispielsweise erwähnt werden:

Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346 (JP 53-72896); als Varianten, die ε-Poly-L-lysin in bemerkenswert großer Menge bilden, sind Nr. 11011A-1 (JP 63-49075), Streptomyces noursei (JP 1-187090), usw. bekannt.

Die Immobilisierung des erzeugenden Bakteriums, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann gemäß einem allgemeinen Verfahren oder durch Anwendung eines allgemeinen Verfahrens erfolgen. Beispielsweise kann ein Adsorptionsverfahren, ein Vernetzungsverfahren, ein Trappingverfahren, ein covalentes Bindungsverfahren verwendet werden.

Die immobilisierten Bakterienzellen werden gemäß einem einfachen Immobilisierungsverfahren hergestellt. Das Immobilisierungsverfahren kann als Kombination der obigen beiden Verfahren durchgeführt werden. Unter den obigen Verfahren werden das Adsorptionsverfahren und das Trappingverfahren bevorzugt verwendet, da gemäß diesen Verfahren die Immobilisierung leicht ist und eine stabilisierte Aktivität erhalten wird, und wenn die Aktivität erniedrigt wird, kann eine Reaktivierung durchgeführt werden. Das Trappingverfahren wird im allgemeinen durchgeführt, indem die Bakterienzellen in einem Polymer-Gel mit hohem Molekulargewicht, wie einem Polyacrylamid-Gel, Polyurethan-Gel, photovernetzbarem Harz, eingeschlossen bzw. eingefangen werden. Da jedoch bei der vorliegenden Erfindung s-Poly-Llysin als basische Substanz gebildet wird, ist es bevorzugt, nicht ein saures Gel mit hohem Molekulargewicht, welches die Substanz absorbiert, wie Carrageenan-Gel, Alginsäure-Gel, zu verwenden.

Als Adsorptionsverfahren ist ein Verfahren für die Immobilisierung auf einer porösen Substanz oder einem nicht gewebten Tuch bzw. Textilmaterial besonders bevorzugt. Als poröse Substanz können beispielsweise poröse Keramika, poröses Glas, Zelluloseschwamm, gesinterte poröse Metallkör per, solche Materialien, die aus Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyurethan usw. hergestellt sind, ebenfalls verwendet werden.

Für das obige Trappen in Polyacrylamid-Gel werden beispielsweise Acrylamidmonomer, N,N'-Methylenbisacrylamid als Vernetzungsmittel und lebende Bakterienzellen in einem Puffer suspendiert, anschließend werden Ammoniumpersulfat als Polymerisationsinitiator und β-Dimethylaminopropionitril als Polymerisationsaktivator zu dem Puffer gegeben und das Gemisch der Polymerisationsreaktion bei Raumtemperatur etwa 30 min unterworfen, wobei immobilisierte Bakterienzellen erhalten werden.

Allgemein werden, wenn thermoplastische Harze auf eine Temperatur von 150º bis 250ºC während 0,5 bis 5 h erhitzt werden, gesinterte Körper erhalten, und wenn zum Zeitpunkt des Erhitzens eine geeignete Form verwendet wird, werden gesinterte poröse Körper mit verschiedenen Formen erhalten. Hinsichtlich der Poren, der Porengröße, der Festigkeit usw., werden bevorzugte poröse Körper erhalten, wenn die Bedingungen der Sintertemperatur, der Sinterzeit, das Packen des Harzes, das Verdickungsmittel und die Menge an Wasser, die zugegeben wird, variiert werden. Als andere poröse Substanzen außer den obigen, können irgendwelche allgemein im Handel erhältlichen Produkte und behandelte Produkte verwendet werden, solange sie die erfindungsgemä- ßen produzierenden Bakterien adsorbieren.

Die porösen Substanzen werden in einen Puffer eingetaucht, der lebende Bakterienzellen enthält, um den Mikroorganismus zu adsorbieren oder die poröse Substanz wird mit dem Mikroorganismus behandelt, wobei die Zeit für den Beginn der Kultur und die Adhäsion mit dem Fortschreiten der Kultur erfolgen, wobei immobilisierte Bakterienzellen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.

Die immobilisierten Bakterienzellen mit ε-Poly-L-lysin- Produktivität, die gemäß dem obigen Verfahren erhalten werden, werden in einem üblichen ε-Poly-L-lysin-erzeugenden Medium oder in einem Medium, zu dem Glucose und Ammoniumsulfat oder L-Lysin zu einer Pufferlösung, eingestellt auf den geeigneten pH-Wert bei aeroben Bedingungen, kultiviert, wobei eine Kulturlösung, die ε-Poly-L-lysin enthält, erhalten wird. Die immobilisierten Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung entfernt und ε-Poly-Llysin wird mit einem Ionenaustauschharz gereinigt.

Der pH zum Zeitpunkt der Kultur kann innerhalb eines Bereiches fallen, bei dem der verwendete Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität ε-Poly-L-lysin bildet. Bevorzugt beträgt er 4 bis 7.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren findet keine Bakteriolyse der Bakterienzellen während der Kultivierung statt, die immobilisierten Bakterienzellen können leicht entfernt werden und eine ε-Poly-L-lysin-Lösung, die keine Bakterienzellen enthält, kann in kurzer Zeit gewonnen werden, wodurch eine wirksame Herstellung von ε-Poly-L-lysin möglich wird. Da es leicht ist, die immobilisierten Bakterienzellen aus der Kulturlösung abzutrennen, wird die Kulturlösung nach der Bildung von ε-Poly-L-lysin wiedergewonnen und frisches Medium wird zu den iminobilisierten Bakterienzellen zugegeben, wodurch eine semikontinuierliche Herstellung von ε-Poly-L-lysin durchgeführt werden kann oder ein frisches Medium wird zugegeben, während kontinuierlich Kulturlösung entnommen wird, wodurch eine kontinuierliche Herstellung von ε-Poly-L-lysin durchgeführt werden kann. Die Erfindung ist somit sehr nützlich, da ε- Poly-L-lysin wirksam und kommerziell mit niedrigen Kosten und während langer Zeiten hergestellt werden kann und auf den Gebieten der Nahrungsmittelzusatzstoffe, der Pestizide, der Pharmazeutika etc. verwendet werden kann.

Beispiel 1

In einen Schüttelkolben mit 500 ml Kapazität wurde eingefüllt ein Medium (pH 6,8, 50 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), Anmoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), anschließend wurde das Medium auf bekannte Weise sterilisiert, Streptomyces albulus wurde eingepflanzt, dann wurde unter Schütteln bei 30ºC während 36 h kultiviert, wobei eine Präkulturlösung erhalten wurde, die nach der Kultivierung der Zentrifugentrennung zum Sammeln der Bakterienzellen unterworfen wurden. Die Bakterienzellen (Naßgewicht der Bakterienzellen: 4,2 g) wurden mit sterilisiertem Wasser 2 x gewaschen und die entstehenden Zellen wurden für die Immobilisierung verwendet.

Die Herstellung der immobilisierten Bakterienzellen erfolgte wie folgt:

Acrylamid (1,68 g), N,N'-Methylenbisacrylamid (0,09 g), Lysinhydrochlorid (0,67 g) und die Bakterienzellen, erhalten gemäß dem obigen Verfahren, wurden in Tris- Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 7,2, 4,8 ml) (Tris: 2- Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) suspendiert und anschließend wurden zu der Mischlösung eine 5%ige wäßrige Lösung aus β-Dimethylaminopropionitril (1,1 ml) und eine 1%ige wäßrige Lösung von Kaliumpersulfat (1,1 ml) zugegeben. Danach wurde das Gemisch bei N&sub2;-gesättigten Bedingungen bei Raumtemperatur während 30 min stehen gelassen, um eine Gelbildung zu bewirken. Das Gel wurde in 5 mm Würfel verformt und das entstehende Gel wurde ausreichend mit Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer gewaschen, wobei Bakterienzellen, immobilisiert in Polyacrylamid-Gel, erhalten wurden (11,2 g). Die entstehenden Bakterienzellen, immobi lisiert in dem Polyacrylamid-Gel, wurden in ein Medium (pH 4, 40 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20 g/l) gegeben und anschließend wurde unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach 2 Tagen wurde der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung bestimmt, er betrug 0,23 mg/ml.

Beispiel 2

Bakterienzellen, immobilisiert an Polyacrylamid-Gel (75 g), hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurden zu einem bekannten Medium für die Kultivierung von einem ε-Poly-L-lysin-erzeugenden Bakterium (pH 4,2, 50 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), gegeben und anschließend wurde unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach 2 Tagen betrug der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung 0,20 mg/ml.

Beispiel 3

Bakterienzellen, immobilisiert an Polyacrylamid-Gel (100 g), hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurden zu einem Medium (pH 4,1 l), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20 g/l), gegeben, anschließend wurde eine Kultivierung bei 30ºC unter Strömungsrühren, mittels eines Fermenters mit einer 1,5 l Kapazität mit kleinem Kolben, durchgeführt, wobei der pH auf 4 eingestellt wurde. Der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung nach der Kultivierung während 48 h betrug 1,5 g/l.

Danach wurde die Kultivierung weitergeführt, während nacheinander Glucose und L-Lysin zugegeben wurden. Der Gehalt an ε-Poly-L-lysin nach 125 h betrug 10 g/l. Die Kulturlösung wurde der Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min) zur Entfernung der Bakterienzellen unterworfen, anschließend wurde die Absorption des Überstands nach der Zentrifugentrennung bei 660 nm gemessen. Die Absorption betrug 0,008 und die Bakterienzellen waren vollständig entfernt.

Vergleichsbeispiel 1

In einen Schüttelkolben mit 500 ml Kapazität wurde ein Medium (pH 6,8, 50 ml) gegeben, bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), anschließend wurde das Gemisch in an sich bekannter Weise sterilisiert, mit Streptomyces albulus inokuliert und dann unter Schütteln bei 30ºC während 36 h unter Herstellung einer Präkulturlösung kultiviert.

Die Präkulturlösung wurde in einen Minikolben-Fermenter mit einer Kapazität von 1,5 l gegeben, der das gleiche Medium wie oben (1 l) enthielt, und anschließend erfolgte eine Kultivierung bei 30ºC mittels Rührendurchströmen. Nach der Kultivierung wurde, nachdem der pH der Kulturlösung auf etwa 4,2 erniedrigt wurde, Glucose portionsweise zugegeben, so daß eine Konzentration von 50 g/l erhalten wurde, wobei der pH auf 4,2 durch wäßrige NaOH-Lösung eingestellt wurde, und die Kultivierung weitergeführt wurde.

Der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung nach 125 h betrug 12 g/l. Diese Kulturlösung wurde der Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min) zur Entfernung der Bakterienzellen unterworfen und dann wurde die Absorption des Überstands bei 660 nm gemessen. Die Absorption betrug 0,282, so daß die Entfernung der Bakterienzellen ungenügend war.

Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, daß es möglich ist, die Bakterienzellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen immobilisierten Bakterienzellen leicht zu entfernen.

Beispiel 4

Bakterienzellen (Naßgewicht 2,0 g), auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und wiedergewonnen, wurden in 0,1 M Phosphorsäurepuffer (2 ml) suspendiert und anschlie- Bend wurde ein Urethanpräpolymer (3 g, M. G.: ca. 3.000) mit der in der Formel 1 dargestellten Struktur zugegeben und unter Rühren vermischt, um eine Gelbildung zu erhalten, wobei inimobilisierte Bakterienzellen an einem Polyurethan-Gel erhalten wurden, das zu 5 mm Würfel verformt wurde.

Die an dem Polyurethan-Gel immobilisierten Bakterienzellen wurden zu einem Medium (pH 4, 40 ml) gegeben, welches Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20 g/l) enthielt. Anschließend wurde das Gemisch unter Schütteln bei 30ºC kultiviert und die Menge an s-Poly-L-lysin in der Kulturlösung wurde nach 2 Tagen und nach 3 Tagen bestimmt. Die Menge an ε-Poly-L-lysin betrug in der Kulturlösung nach 2 Tagen 0,31 g/l und nach 3 Tagen 0,47 g/l.

Beispiel 5

Es erfolgte eine gleiche Kultivierung wie bei Beispiel 4 während 3 Tagen und anschließend wurde der erhaltene Über stand durch Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min) entfernt. Es wurde frisches Medium (pH 4, 40 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Citronensäure (20 g/l) zugegeben und dann wurde das Gemisch unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach dem Verlauf von 2 Tagen nach der Zugabe von frischem Medium betrug die Menge an s- Poly-L-lysin in der Kulturlösung 0,75 mg/ml.

Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäßen immobilisierten Bakterienzellen für die semikontinuierliche Kultivierung verwendet werden konnten.

Beispiel 6

Bakterienzellen (Naßgewicht 2,0 g), kultiviert und wiedergewonnen auf gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurden in sterilisiertem Wasser (5 ml) suspendiert und anschließend wurde eine 15%ige wäßrige Lösung (40 ml) aus photovernetzbarem Harz ENT-2000 (Warenzeichen eines Produkts, hergestellt von Kansai Paint Co., Ltd.) zugegeben und vermischt. Dann wurde in einem Autoklaven sterilisiert und ein Polymerisationsinitiator (0,008 g) wurde zugegeben. Es erfolgte eine Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen (365 nm) der entstehenden Suspension unter Rühren während 30 min. wobei ein Gel mit immobilisierten Bakterienzellen erhalten wurde. Dieses Gel wurde zu 5 mm Würfeln verformt, wobei fixierte Bakterienzellen erhalten wurden (53 g). Die immobilisierten Bakterienzellen in dem photovernetzbaren Harz wurden zu einem Medium (pH 4, 100 ml) gegeben, welches Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Citronensäure (20 g/l) enthielt. Anschließend wurden die Zellen unter Schütteln bei 30ºC kultiviert und die Mengen an ε- Poly-L-lysin in der Kulturlösung wurde nach 2 und 3 Tagen gemessen, wobei 0,44 g/l nach 2 Tagen und 0,57 g/l nach 3 Tagen erhalten wurden.

Beispiel 7

Bakterienzellen, präkultiviert auf gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurden mittels Zentrifugentrennung gewonnen und mit sterilisiertem Wasser (Naßbakteriengewicht: 4,0 g) gewaschen. In ein Medium (pH 6,8, 30 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), Anmoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat 0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), wurden die obigen Bakterienzellen gegeben und dann wurden gesinterte poröse Polyurethanperlen (Größe: 5 mm, 2 g) zugegeben und anschließend wurde unter langsamen Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach 30 h wurden Bakterienzellen immobilisiert an porösem, gesinterten Poly- urethankörper gewonnen. Die immobilisierten Bakterienzellen wurden in einem Medium (pH 4, 50 ml), enthaltend Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20 g/l), suspendiert und anschließend erfolgte eine Kultivierung unter Schütteln bei 30ºC. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung nach 2 Tagen der Kultivierung betrug 0,62 mg/ml. Die Kulturlösung wurde der Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min) unterworfen und die Absorption des entstehenden Überstandes wurde bei 660 nm gemessen. Die Absorption betrug 0,009 und die Bakterienzellen waren vollständig entfernt.

Beispiel 8

In einen Reaktor mit einer Kapazität von 400 ml, durch den Luftblasen geblasen werden konnten, wurde ein Medium (pH 6,8, 100 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), gegeben, dann wurde ein Kera mikmaterial in Blockform (hergestellt von Nihon Gaishi Co., Ltd.) (30 g) zugegeben. Anschließend wurde in an sich bekannter Weise sterilisiert, dann wurde mit Streptomyces albulus, entnommen aus einer Schrägkultur für die Konservierung von Bakterienzellen, in einer Menge von einer Platinschleife inkubiert, und es erfolgte eine Belüftungskultivierung mit einer Belüftungsmenge von 0,5 l/min bei 30ºC während 50 Stunden. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 50 Stunden 0,3 g/l. Danach wurde nur die Kulturlösung gewonnen und anschließend wurde zu den immobilisierten Bakterienzellen in dem Reaktor ein frisches Medium (pH 4, 100 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysinhydrochlorid (10 g/l), Citronensäure (20 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), zugegeben und es erfolgte eine Belüftungskultivierung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an e-Poly-Llysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 3, 7 g/l. Die Kulturlösung wurde gewonnen und anschließend wurde frisches Medium zugegeben. Das Verfahren zur Durchführung der Belüftungskultivierung bei 30ºC während 48 Stunden wurde 3 x wiederholt. Als Ergebnis wurden die folgenden Mengen an ε-Poly-L-lysin zu den entsprechenden wiederholten Zeiten wie folgt erhalten:

4,5 g/l (zum ersten Mal), 4,0 g/l (zum zweiten Mal) und 5,2 g/l (zum dritten Mal).

Aus dem Vorhergehenden wurde bestätigt, daß wenn ein Mediumaustausch wiederholt wurde, unter Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Bakterienzellen, die semikontinuierliche Herstellung von ε-Poly-L-lysin erfolgte.

Beispiel 9

In einen Reaktor mit 400 ml Kapazität des Luftblasen-Typs wurde ein Medium (pH 6,8, 100 ml) gegeben, bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat 0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l). Es wurde ein Celluloseschwamm (Mikrocube FN-SO&sub3; (Warenzeichen für ein Produkt, hergestellt von Sakai Engineering Co., Ltd.)) zugegeben und dann wurde das Medium in an sich bekannter Weise sterilisiert. Es wurde mit Streptomyces albulus, entnommen aus einem Schrägmedium für die Konservierung von Bakterienzellen, in einer Menge von einer Platinschleife, inkubiert, und dann wurde eine Belüftungskultivierung bei 30ºC während 50 Stunden mit einer Belüftungsmenge von 0,5 l/min durchgeführt. Die Menge an ε-Poly-Llysin in der Kulturlösung betrug nach 50 Stunden 0,33 g/l. Danach wurde nur die Kulturlösung wiedergewonnen und es wurden fixierte Bakterienzellen in den Reaktor zugegeben. Es wurde weiterhin ein frisches Medium (pH 4, 100 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysinhydro--chlorid (10 g/l), Citronensäure (20 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)- sulfat (0,03 g/l), zugegeben und dann erfolgte die Belüftung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an s-Poly-Llysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 2,9 g/l). Die Kulturlösung wurde wiedergewonnen und anschließend wurde frisches Medium zugegeben und das Verfahren zur Durchführung der Belüftungskultivierung bei 30ºC während 48 Stunden wurde 3 x wiederholt. Die Mengen an gebildetem ε-Poly-L-lysin bei den entsprechenden Wiederholungszeiten waren wie folgt:

3,0 g/l (zum ersten Mal), 2,5 g/l (zum zweiten Mal) und 2,0 g/l (zum dritten Mal).

Aus dem Obigen wurde bestätigt, daß wenn der Mediumaustausch wiederholt unter Verwendung immobilisierter Bakterienzellen gemäß der Erfindung durchgeführt wurde, eine semikontinuierliche Herstellung von s-Poly-L-lysin möglich war.

Vergleichsbeispiel 2

Bakterienzellen wurden kultiviert, ohne daß der Keramikträger wie im Beispiel 8 zugegeben wurde. In einen Reaktor mit 400 ml Kapazität des Luftblasen-Typs wurde ein Medium (pH 6,8, 100 ml) gegeben, bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l). Danach wurde das Medium in an sich bekannter Weise sterilisiert. Es wurde mit Streptomyces albulus, entnommen aus einer Schrägkultur, für die Konservierung von Bakterienzellen in einer Menge von einer Platinschleife inokuliert, und dann erfolgte eine Belüftungskultivierung bei 30ºC mit einer Belüftungsmenge von 0,5 l/min während 50 Stunden. Die Menge an s- Poly-L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 50 Stunden 0,25 g/l, Danach wurden die Bakterienzellen aus der Kulturlösung durch Zentrifugieren wiedergewonnen (6.000 G, 15 min), dann wurde zu den wiedergewonnenen Bakterienzellen frisches Medium (pH 4, 100 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysinhydrochlorid (10 g/l), Citronensäure (20 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0, 04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0, 03 g/l), zugegeben und es erfolgte die Belüftung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 1,3 g/l. Bakterienzellen wurden aus der Kulturlösung durch Zentrifugieren (6.000 G, 15 min) wiedergewonnen und anschließend wurde das obige frische Medium hinzugegeben und es erfolgte eine Belüftungskulti vierung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an ε-Poly- L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 0,7 g/l.

Aus den obigen Ergebnissen wird bestätigt, daß gemäß der semikontinuierlichen Herstellung von ε-Poly-L-lysin, wobei Bakterienzellen ohne Verwendung immobilisierter Bakterienzellen wiedergewonnen und kultiviert wurden, die Produktivität an ε-Poly-L-lysin bei jedem wiederholten Mal erniedrigt wurde. Somit ist eine semikontinuierliche Herstellung schwierig.

Beispiel 10

In einen Reaktor mit 400 ml Kapazität des Luftblasen-Typs wurde ein Medium (pH 6,8, 100 ml) zugegeben, bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l). Es wurde ein Keramikmaterial in Blockform (hergestellt von Nihon Gaishi Co., Ltd.) (30 g) zugegeben, und anschließend wurde in an sich bekannter Weise sterilisiert. Es wurde dann mit Streptomyces albulus, entnommen aus einer Schrägkultur, in einer Menge von einer Platinschleife inokuliert, und dann erfolgte eine Belüftungskultivierung bei 30ºC mit einer Belüftungsmenge von 0,5 l/min für 50 Stunden. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 50 h 0, 3 g/ 1. Danach wurde eine kontinuierliche Herstellung von s-Poly-L-lysin im Verlauf von 300 Stunden durchgeführt, wobei in den Reaktor jeweils ein frisches Medium (pH 4), bestehend aus Glucose (50 g/l), L- Lysinhydrochlorid (10 g/l), Citronensäure (20 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), zugegeben wurde und die Entnahme der Kulturlösung aus dem Reaktor in einer Rate von 2 ml/h erfolgte. Die Gesamtmenge an im Verlauf von 300 Stunden gebildetem ε-Poly-L-lysin betrug 2,2 g.

Aus dem Vorhergehenden wird bestätigt, daß wenn ein Mediumaustausch kontinuierlich unter Verwendung immobilisierter Bakterienzellen durchgeführt wird, es möglich ist, eine kontinuierliche Herstellung von g-Poly-L-lysin leicht durchzuführen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin durch Kultivieren eines Mikroorganismus mit g-Poly-L-lysin-Produktivität bei aeroben Bedingungen, wobei (i) der Mikroorganismus gemäß einem Verfahren immobilisiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Adsorptionsverfahren, einem Vernetzungsverfahren und einem Einschluß- bzw. Einfangverfahren, (ii) der Immobilisierungsträger ein anderer ist als saure Gele mit hohem Molekulargewicht und (iii) der pH zum Zeitpunkt der Kultivierung des Mikroorganismus 4 bis 7 beträgt.

2. Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren semikontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt wird.

3. Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

daß der Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität ein Bakterium ist, das zum Streptomyces-Genus gehört.

4. Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

daß der Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität gemäß einer Kombination eines Adsorptionsverfahrens mit einem Vernetzungsverfahren oder einer Kombination des Adsorptionsverfahrens mit dem Einschluß- bzw. Einfangverfahren immobilisiert ist.







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