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Dokumentenidentifikation DE69227519T2 02.06.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0602144
Titel DNA-SEQUENZEN KODIEREND FÜR DAS POLYPEPTID GELONIN
Anmelder Research Development Foundation, Carson City, Nev., US
Erfinder ROSENBLUM, Michael, G., Houston, TX 77071, US;
BEATTIE, Kenneth, L., The Woodlands, TX 77381, US
Vertreter Meissner, Bolte & Partner, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69227519
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 21.08.1992
EP-Aktenzeichen 929192649
WO-Anmeldetag 21.08.1992
PCT-Aktenzeichen US9207066
WO-Veröffentlichungsnummer 9305168
WO-Veröffentlichungsdatum 18.03.1993
EP-Offenlegungsdatum 22.06.1994
EP date of grant 04.11.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.06.1999
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse A61K 39/44   C07H 21/00   C12N 1/00   C12N 1/21   C12N 5/10   C12N 15/10   C12N 15/63   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Immuntoxin Gelonin und insbesondere eine Nucleotidsequenz für ein synthetisches Gen für Gelonin und Verfahren zu seiner Herstellung.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Ein Grund für das derzeitige Interesse an cytotoxischen Substanzen ist ihre potentielle Verwendung zum spezifischen Anziehen von Tumorzellen (Chaudhary et al., Nature 339 (1989), 394-397). Dazu wurde das Pflanzentoxin Gelonin in Betracht gezogen. Gelonin ist ein aus dem Samen von Gelonium multiforum gereinigtes Glycoprotein (Molekulargewicht ca. 29-30000 Kd). Gelonin gehört zu einer Klasse potenter ribosomalinaktivierender Pflanzentoxine. Andere Mitglieder dieser Klasse der ribosomal-inaktivierenden Pflanzentoxine sind die Ketten von Abrin, Ricin und Modeccin. Ähnlich wie Abrin und Ricin inhibiert Gelonin die Proteinsynthese durch Beschädigung der 60S-Untereinheit von Säuger-Ribosomen (Montecucchi et al., Int. J. Peptide Protein Res. 33 (1989) 263-267). Obgleich die A- Kette von Ricin (RTA) zur Verwendung in Immuntoxinen gebräuchlich war, scheint Gelonin gegenüber einer chemischen und physikalischen Behandlung stabiler als RTA zu sein (Barbiere et al., Cancer Surv. 1 (1.982) 489-520). Gelonin selbt bindet außerdem nicht an Zellen und ist deshalb nicht toxisch (ausgenommen in hoher Konzentration) und ist im Laboratorium sicher zu handhaben. Die Inaktivierung von Ribosomen ist irreversibel, scheint keine Co-Faktoren einzubeziehen und tritt mit einer Effizienz auf, die nahelegt, daß Gelonin enzymatisch wirkt.

Gelonin und Ricin gehören zu den aktivsten Toxinen, die die Proteinsynthese auf Basis des Proteingewichts inhibieren. Im Hinblick auf die Inhibierung der Proteinsynthese ist Gelonin 10 bis 1000-mal wirksamer als die Ricin A-Kette. Peptide wie Ricin und Abrin sind aus zwei Ketten aufgebaut, einer A-Kette, die die toxische Einheit ist, und einer B-Kette, die durch Anbindung an Zellen wirkt. Zum Unterschied von Ricin und Abrin ist Gelonin aus einer einzigen Kette aufgebaut, und weil es keine B-Kette zur Anbindung an Zellen aufweist, ist es selbst gegenüber intakten Zellen relativ nicht toxisch (Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 6947-6953). Säuger-Zellen fehlt offensichtlich die Fähigkeit, das native Gelonin-Molekül zu binden oder zu internalisieren. Konjugate von Gelonin mit einem Tumor-anzielenden monoklonalen Antikörper, wie z. B. dem auf ein in bestimmten Tumorzellen, wie z. B. Melanom-Zellen, vorhandenes Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper ZME, stellen sowohl eine spezifische Methode zur Anbindung des Gelonins an die Zelle als auch einen Weg zur Internalisierung des Gelonin- Antikörper-Komplexes dar. Einer der Vorteile der Verwendung des Toxins Gelonin gegenüber der Verwendung von Toxinen, wie z. B. der Ricin A-Kette, ist seine im Vergleich zu Ricin A-Kette verringerte Toxizität gegenüber normalen Geweben. Mit einem gegen ein anti-Tumor-assoziertes Antigen gerichteten Antikörper gekuppeltes Gelonin ist ein wirksames und selektives immuntoxisches Mittel für die Tumortherapie.

Verschiedene Forscher haben Gelonin als chemisch an monoklonale Antikörper oder an Peptidhormonzellliganden gebundenes Gelonin als cytotoxisches Mittel verwendet - siehe z. B. US-A-4888415. Die chemische Modifikation von Gelonin und anvisierenden Zelleinheiten kann jedoch die Anvisiereffizienz und das cytotoxische Potential von Gelonin selbst verringern. Außerdem unterliegen natürliche Quellen von Gelonin einer Variabilität bei der Gewinnung und dem Pflanzenwachstum, die die cytotoxische Wirkung von Gelonin beeinträchtigen kann. Die Möglichkeit, chemisch oder unter Verwendung rekombinanter Verfahren ein synthetisches Gelonin-Toxin herzustellen, ist eine ergiebige reproduzierbare Quelle für das Toxin. Die Herstellung eines synthetischen Gens für Gelonin und Verfahren zur Herstellung des synthetischen Gens unter Verwendung rekombinanter Verfahren sind deshalb in hohem Maße wünschenswert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Nucleotidsequenz für ein synthetisches Gen für Gelonin und Verfahren zu ihrer Herstellung bereit. Die DNA-Sequenz: für ein synthetisches Gen für Gelonin ist in der SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die vorliegende Erfindung stellt auch Expressionsvektoren bereit, die diese DNA-Sequenzen enthalten, und mit diesen Vektoren transformierte Zellen.

Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung, Klonierung und Exprimierung eines Gelonin-codierenden synthetischen Gens bereitgestellt. Zunächst wurde ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das die von gereinigtem Gelonin-Protein bestimmte primäre Aminosäuresequenz codiert, konstruiert. Dieses DNA-Fragment wurde zur Erleichterung der Synthese, des Klonierens, der Expression oder biochemischen Manipulation des Gens manipuliert. Als nächstes wurde eine Garnitur synthetischer Oligonucleotide, die dazu fähig sind, zur Ausbildung des gewünschten Gens verbunden zu werden, konstruiert, synthetisiert, gereinigt und 5'- phosphoryliert. Danach wurden diese Oligonucleotide aneliert und ligiert, um das intakte Gen auszubilden. Das synthetische Gen wurde zusammen mit einem geeigneten Klonierungsvektor ligiert und dann die Nucleotidsequenz des klonierten Gens bestimmt. Nach Durchführung einer Site-directed-Mutagenese zur Korrektur unerwünschter Mutationen im klonierten Gen wurde das Gen in einen geeigneten Expressionsvektor subkloniert. Der das synthetische Gen tragende Expressionsvektor wurde in einen geeigneten Expressions-Wirt eingeführt. Danach wurde der Expressions-Wirt unter Bedingungen gehalten, die zur Produktion des Gelonin-Genproduktes geeignet sind, und Gelonin-Protein aus den das Gen exprimierenden Zellen isoliert und gereinigt.

Nach einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine synthetische DNA bereitgestellt, die die Sequenz von Nucleotiden und Fragmenten und Derivaten davon enthält, die für das Protein Gelonin oder für ein Polypeptid codiert, das die Zellproteinsynthese inhibiert, aber nicht an einen Zelloberflächenrezeptor bindet, mit der Nucleotidsequenz mit der Formel der Sequenz ID NO: 1. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Expressionsvektor, der die synthetische Gelonin-DNA und Wirtszellen enthält, die das synthetische Gelonin-Gen enthalten und exprimieren.

Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Immuntoxin bereitgestellt, das einen mit dem Pflanzentoxinprotein Gelonin konjugierten Antikörper umfaßt.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Fragment" irgendeinen Teil von SEQ ID NO: 1, der ein Protein produzieren würde, das die Zellproteinsynthese inhibiert, aber nicht an einen Oberflächenrezeptor bindet. "Derivat" bedeutet, daß eine oder mehrere individuelle Nucleinsäure so substituiert sind, daß das gleiche Protein oder Polypeptid gebildet wird.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem und richtet sich auf das vorstehend genannte lange bestehende Bedürfnis und stellt eine zufriedenstellende Lösung dieser Bedürfnisse und seiner verschiedenen Ausführungsformen bereit. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet, der die Lehre und Offenbarung der vorliegenden Erfindung kennt, sind andere und weitere Aufgabenstellungen und Vorteile erkenntlich, sowie andere damit inhärente Merkmale. Die nachfolgende Beschreibung von zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den anliegenden Zeichnungen wird zum Zwecke der Offenbarung angegeben. Obwohl diese Beschreibung detailliert ist, um die Adäquatheit sicherzustellen und das Verständnis zu unterstützen, soll dies nicht den Zweck eines Patentes prejudizieren, der es ist, eine Erfindung zu beanspruchen, unabhängig davon, wie sie andere später durch Variationen und Zusätze oder weitere Verbesserungen maskieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Damit die Art, mit der die vorstehend genannten Merkmale, Vorteile und Aufgabenstellungen der Erfindung, sowie andere Merkmale, die ersichtlich werden, erzielt werden, detailliert verständlich werden, wird eine genauere Beschreibung der vorstehend kurz zusammengefaßten Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen davon, die in den anliegenden Zeichnungen veranschaulicht werden, gegeben. Diese Zeichnungen bilden einen Bestandteil dieser Beschreibung. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die anliegenden Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen und deshalb ihren Rahmen keinesfalls beschränken. Die Erfindung kann auf andere gleichermaßen effektive äquivalente Ausführungsformen angewendet werden.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden.

Fig. 2 veranschaulicht ein Festphasenverfahren zur Ausbildung eines Gens.

Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm des Verfahrens zum Aufbau des Gelonin-Gens.

Fig. 4 ist eine schematische Darstellung der Oligonucleotid- Anordnung im Gelonin-Gen.

Fig. 5 zeigt die zum Aufbau des Gelonin-Gens verwendeten Oligonucleotidsequenzen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Jüngste Entwicklungen in der Molekularbiologie haben das Klonieren, Exprimieren und die gentechnische Behandlung zahlreicher Gene, die Proteine, die biomedizinisch und landwirtschaftlich wichtig sind, ermöglicht. Ein signifikanter neuerer Fortschritt auf diesem Gebiet ist die Fähigkeit, synthetische Gene zu konstruieren und herzustellen. Die synthetischen Gene können Proteine mit bekannter Aminosäuresequenz kodieren, sowie neue Proteine, die in der Natur nicht existieren. Dies ist insbesondere für Proteine, mit einer therapeutischen Bedeutung, wie z. B. Gelonin, nützlich. Es ist möglich, ein Gen auf der Basis einer Aminosäuresequenz eines Proteins zu konstruieren, synthetisieren, klonieren und exprimieren. Die Konstruktion, Sequenz, Klonierung und Expression ist auch dann möglich, wenn eine spezifische Information über das natürliche Gen nicht verfügbar ist, z. B. wenn das Gen noch nicht kloniert wurde. Eine Gensynthese erleichtert außerdem die gentechnische Ausarbeitung verschiedener Genprodukte, die Eigenschaften besitzen, die im natürlich vorkommenden Protein nicht gefunden wurden. Ein ein Protein, das normalerweise nur in Pflanzen oder Tieren aufgefunden wird, kodierendes Gen kann z. B. konstruiert, synthetisiert und in einen Vektor kloniert werden, der große Mengen des Proteins in mikrobiellen Wirtszellen liefert.

Ein Vorteil synthetischer Gene liegt in der Redundanz des genetischen Codes. Viele Aminosäuren können durch mehr als ein Dreibasen-"Codon" innerhalb eines Gens codiert werden. Verschiedene Organismen tendieren dazu, verschiedene Garnituren von Codons für ihre Proteine zu verwenden (S. Aota et al., Nucleic Acids Res. 16, Supplement, Seiten r315-r391 (1987)). Mit anderen Worten sind die Codons, die von einem Organismus "bevorzugt" sind, von solchen, die von einem anderen Organismus bevorzugt werden, verschieden. Es wird angenommen, daß dieses Phänomen mit Differenzen in der relativ großen Anzahl spezifischer iso-akzeptierender Transfer-RNA-Moleküle für eine bestimmte Aminosäure in Beziehung steht. Synthetische Gene können konstruiert werden, um bevorzugte Codons für ein bestimmtes Expressionssystem einzubauen, auch wenn das Genprodukt von einem "heterologen"-Wirtsorganismus stammt, der eine verschiedene Garnitur bevorzugter Codons für einige Aminosäuren verwendet. Es wurde gezeigt, daß synthetische Gene, die Säuger-Proteine codieren, ein beträchtlich größeres Proteinprodukt in einem mikrobiellen Wirt ergeben können, wenn die im Genkonstrukt ausgewählten Codons denen entsprechen, die vom mikrobiellen Wirt am meisten verwendet werden. Dieses Phänomen wurde bei der Konstruktion des Gelonin-Gens (ursprünglich aus Pflanzen) zur Einführung in den Escherichia coli-Expressionswirt berücksichtigt. Zur Expression in einem verschiedenen Wirtssystem könnte das Gelonin-Gen durch einen Fachmann auf diesem Gebiet leicht umkonstruiert werden, um Codons einzubauen, die für den anderen Wirt optimal sind.

Ein anderer Vorteil synthetischer Gene, der in diesem Fall durch die Redundanz des genetischen Codes möglich ist, ist es, daß die DNA-Sequenz, die das interessierende Gen codiert, modifiziert werden kann (ohne die codierte Aminosäuresequenz zu ändern), um eine maximale Zahl ausschließlich auftretender Restriktionsenzym-Erkennungsstellen im Gen zu enthalten. Die Existenz zahlreicher einfach-schneidender Restriktionsstellen entlang des Gens erleichtert die biochemische Manipulation des Gens sehr. Die Fähigkeit, ein Segment eins Gens auszuschneiden und durch eine unterschiedliche DNA-Sequenz zu ersetzen (was durch in einem geringen Abstand angeordnete unikale Restriktionsstellen möglich ist) erleichtert die Einführung neuer genetischer Information in das Gen durch rekombinante DNA-Methoden. Durch diesen Weg ermöglichte nützliche Manipulationen umfassen die Einführung von Mutationen in definierten Regionen eines Gens, die Korrektur von während einer Gensynthese, Anordnung und Klonierung auftretenden Mutationen, und Ausbildung von Chimären oder Fusionsgenen, die Proteine codieren, die funktionelle Domänen einzelner Proteine in Kombination enthalten.

Die Konstruktion eines synthetischen Gens kann auch nicht- codierende "flankierende" DNA-Sequenzen unterbringen, die das Klonieren und die Expression des Gens erleichtern können. Z. B. können Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenzen in flankierende Regionen des Gens eingebaut werden, um die spezifische Ligation des Gens in den gewünschten Klonierungsvektor zu ermöglichen. Zusätzlich können genetische Signale in ein synthetisches Gen eingebaut werden, die zur Kontrolle der Genexpression in vivo dienen.

Zusätzlich kann die de novo-Genkonstruktion das in vivo- Anzielen eines bestimmten Gewebes oder einer Organelle durch ein Genprodukt ermöglichen, was die therapeutische Wirkung des Genprodukts erhöhen kann. Es ist z. B. möglich, ein therapeutisches Mittel auf einen bestimmten Zelltyp zu richten, indem man in das relevante Gen eine Sequenz einbaut, die eine Polypeptiddomäne codiert, die spezifisch an einen Rezeptor an der Oberfläche der Zielzellen bindet.

Bei synthetischen Genkonstrukten können außerdem Überlegungen berücksichtigt werden, die mit der chemischen Synthese kurzer DNA-Stränge und dem Zusammenfügen von Oligonucleotiden zu längeren Duplex-DNA-Segmenten in Beziehung stehen. Bei der chemischen Synthese von DNA ist es vorteilhaft, die schlechte Kupplungseffizienz, die mit einer aufeinanderfolgenden Zugabe zahlreicher G- oder C-Reste zu einer Kette verbunden ist, zu vermeiden. Es ist außerdem wünschenswert, DNA-Sequenzen zu vermeiden, die intrasträngige sekundäre Strukturen (Haarnadelstrukturen) oder eine intermolekulare Komplementarität enthalten, zu vermeiden, die die korrekte Ausbildung eines Gens während des Anelierens der Oligonucleotidkomponenten beeinträchtigen können. Diese Aufgabenstellungen können normalerweise erreicht werden, indem man bei der Genkonstruktion alternative Codons auswählt.

Das Verfahren zur Genausbildung umfaßt die folgenden Stufen. Zuerst wird die Nucleotidsequenz, die den zwei Strängen der gewünschten kodierenden Region entspricht, niedergeschrieben, wodurch eine perfekte komplementäre Basenpaarung zwischen den zwei Strängen ermöglicht wird. Dann werden gewünschte Flankierungssequenzen zugefügt. Flankierungssequenzen können z. B. zugefügt werden, um der kodierenden Sequenz benachbarte Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen einzubauen. Das Gen wird dann in überlappende Garnituren einzelsträngiger Fragmente geteilt. Die einzelsträngigen Fragmente werden durch automatische DNA-Synthesizer chemisch synthetisiert. Das Ausmaß der komplementären Überlappung zwischen aufeinanderfolgenden Oligonucleotiden entlang des synthetischen Gens ist eine Sache der Auswahl, beträgt typischerweise aber 6 bis 20 Basen. Nachdem alle für das synthetische Gen benötigten Oligonucleotide chemisch synthetisiert wurden, werden sie vorzugsweise durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. Die gereinigten Oligonucleotide werden dann durch Einwirkung von Polynucleotidkinase und Adenosin-5'-triphosphat 5'- phosphoryliert. Die Stränge werden dann aneliert, entweder in einer einzigen Mischung, in Blöcken von 3 bis 10 überlappenden Oligonucleotiden, oder durch stufenweise Zugabe von Oligonucleotiden zu einem Festphasenträger. Die Enden des ausgebildeten Gens werden mit Restriktionsstellen versehen, die zum Klonieren des Gens verwendet werden. Das ausgebildete Gen wird für eine zweckmäßige DNA-Sequenzierung typischerweise zuerst in den einzelsträngigen Vektor M13 kloniert. Wenn notwendig, werden Mutationen durch Oligonucleotid-directed- Mutagenese korrigiert.

Gewünschte Merkmale des synthetischen Gens (Verwendung des optimalen Codons, Auftreten von unikalen Restriktionsstellen, Eliminierung der Sekundärstruktur, usw.) können mit Hilfe irgendeiner der kommerziell erhältlichen DNA- Sequenzanalysenprogramme für Mikrocomputer konstruiert werden.

Zwei neuere Entwicklungen, die beide in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, erlauben es, Gene rascher und wirtschaftlicher zu synthetisieren, und schaffen neue Möglichkeiten für ein Protein-Engineering (K.L. Beattie et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 10 (1988) 510-521; K.L. Beattie und R.F. Fowler, Nature 352 (1991) 548-549; Wosnick et al., Gene 60 (1987) 115-127). Die erste Entwicklung, die in Fig. 1 veranschaulicht ist, ist eine Technologie zur raschen wirtschaftlichen Synthese einer Vielzahl von Oligonucleotiden. Diese Technologie ermöglicht die Herstellung der gesamten synthetischen DNA, die zur Ausbildung eines Gens benötigt wird, in einem einzigen Tag. Nach Fig. 1 wird Nucleosidderivatisiertes kontrolliertes Porenglas (controlled pore glass (CPG)) in einzelne Synthesewafer gegeben, die aus Teflonzylindern mit porösen Enden bestehen, damit Flüssigkeit durch einen Stapel der Wafer hindurchfließen kann. Die gleichzeitige Addition von A, G, C oder T an DNA-Ketten, die an das CPG angefügt und innerhalb der Wafer gehalten werden, wird durch einen aufeinanderfolgenden Durchfluß von Reagentien durch die Säulen mittels der Phosphoramidit-Methode bewerkstelligt (L.J. McBride und M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 24 (1983) 245-248). Nach Vervollständigung jedes chemischen Reaktionszyklus werden die Wafer zur Synthese einer verschiedenen Nucleotidsequenz innerhalb jedes Wafers in verschiedene Säulen sortiert. Es wird aufeinanderfolgende Position eines Wafers (dunkel dargestellt) während vier Zyklen dargestellt, die zu einer Addition von AGCT in der darin enthaltenen wachsenden DNA-Kette führen würde.

Eine zweite Technologieentwicklung, die die Gensynthese erleichtert, sieht zur Ausbildung eines Gens Mittel zur stufenweisen Anbindung synthetischer Oligonucleotide an einen Festphasenträger vor (Hostomsky et al., Nucleic Acids Research 015 (1987) 4849-4856). Nach Fig. 2 wird das aus einer Garnitur überlappender komplementärer Oligonucleotide auszubildende gewünschte Gen konstruiert. Die Ausbildung wird mit einem Oligonucleotid, das an einem Ende an einen Festphasenträger gebunden ist, begonnen. Aufeinanderfolgend werden 5'- phosphorlyierte Oligonucleotide (mit molarem Überschuß) an den Trägergebundenen Strang addiert. Bei jeder Stufe der Genausbildung wird ungebundene DNA weggewaschen, bevor die nächste Anelierungsreaktion durchgeführt wird. Die vollständige Anordnung wird mit DNA-Ligase behandelt, um die nick-Stellen aufzufüllen, dann wird das Gen vom Träger durch Spaltung an einer unikalen Restriktionsstelle, die innerhalb des Trägergebundenen Oligonucleotids enthalten ist, freigesetzt. Die freigesetzte DNA wird zur Sequenzierung und Expression in einen geeigneten Vektor ligiert.

Für die Expression des synthetischen Gens, die zur Produktion des codierten Proteins führt, gibt es zahlreiche Optionen für die Vektor-Wirt-Umgebung. Sie werden detailliert in Methods in Enzymology, Band 152, 1987, Academic Press, beschrieben. Spezielle Expressionsvektoren zur Insertion in bakterielle, fungale, tierische oder pflanzliche Wirte sind erhältlich. Das Bakterium Escherichia coli wird zur Expression von "fremden" Genen am meisten verwendet. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein anderer üblicher Expressionswirt. Wie vorstehend angegeben, wird, wenn das klonierte interessierende Gen chemisch synthetisiert wird, für die Genkonstruktion die Verwendung eines optimalen Codons für den gewünschten Expressionswirt vorgesehen, um den Expressionsgrad zu erhöhen. Die meisten Expressionvektoren enthalten genetische Kontrollelemente, die benachbart zur Klonierungsstelle positioniert sind, und eine hohe Genexpression ergeben. Induzierbare Promotoren für Expressionsvektoren sind typischerweise von Bakterien (z. B. tac, trp) oder Viren (z. B. lambda, SV40) abgeleitet. Im Vektor sind manchmal "Signalsequenzen" enthalten, um den Transport des Genproduktes aus der Wirtszelle zu steuern. Die Signalsequenz-Elemente können die Reinigung erleichtern und den proteolytischen Abbau verringern. Im Falle synthetischer Gene kann innerhalb der auszubildenden Duplex-DNA irgendein gewünschtes genetisches Kontrollelement enthalten sein. Einige Expressionsvektoren enthalten eine Kodiersequenz unmittelbar benachbart zur Klonierungsstelle, wodurch eine im--Rahmen-Insertion der fremden Codiersequenz die Produktion eines Fusionsproteins ergibt. Im Falle synthetischer Gene kann die zusätzliche Codiersequenz innerhalb der ausgebildeten Sequenz vorgesehen sein. Die Produktion eines Gens als Fusionsprotein kann verschiedene Vorteile mit sich bringen, einschließlich einer erhöhten Expression, größerer Stabilität, schnellerer Affinitätsreinigung unter Verwendung eines trägergebundenen Ligandens, der an die zusätzliche Polypeptid-Komponente bindet, und den Vorteil, daß das Genprodukt eine Zelle anzielt (z. B. einen Zelltyp, der einen Zelloberflächerezeptor für die zusätzliche Polypeptid-Komponente besitzt). Gentechnische Verfahren, die dieses letztere Merkmal einbauen, könnten bei der weiteren Entwicklung von Therapeutika auf Gelonin-Basis verwendet werden.

Beim Klonieren und Exprimieren von DNA-Sequenzen, die das Pflanzentoxin Gelonin codieren, ist eine Vielzahl von Vektoren brauchbar. Diese umfassen z. B. Vektoren, die aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA- Sequenzen bestehen, wie z. B. verschiedene bekannte Derivate von SV40, bekannte Bakterienplasmide (z. B. Plasmide von E. coli, einschließlich col E1, pCRl, pBR322, pMB9 und ihre Derivate), Plasmide mit breiterem Wirtebereich (z. B. RP4), Phagen-DNAs (z. B. die zahlreichen Derivate von Phage-lambda, z. B. NM 989, und andere DNA-Phagen, z. B. M13, und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen), Hefeplasmide, wie z. B. das 2 mu- Plasmid oder Derivate davon, und von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitete Vektoren, wie z. B. Plasmide, die unter Verwendung von Phagen-DNA oder anderer Expressionskontrollsequenzen modifiziert wurden.

Innerhalb jedes spezifischen Klonier- oder Expressions-Trägers können zur Insertion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verschiedene Stellen ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise durch die Restriktionsendonuclease, die sie spaltet, bezeichnet, und sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt. Verschiedene Methoden zur Insertion von DNA-Sequenzen in diesen Stellen unter Ausbildung rekombinanter DNA-Moleküle sind ebenfalls allgemein bekannt. Diese umfassen z. B. dG-dC oder dA-dT-Tailing, direkte Ligation, synthetische Linker, Exonuclease und Polymerase-verbundene Repair-Reaktionen mit nachfolgender Ligation, oder Extension des DNA-Stranges mit DNA-Polymerase und einem geeigneten einzelsträngigen Templat, und nachfolgende Ligation. Natürlich ist es klar, daß ein erfindungsgemäß brauchbarer Klonierungs- oder Expressions-Träger zur Insertion des ausgewählten DNA- Fragments keine Restriktionsendonuclease-Stelle benötigt. Stattdessen könnte der Träger an das Fragment durch andere Mittel gebunden werden.

Zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen werden diese DNA-Sequenzen operativ an eine oder mehrere Expressionkontrollsequenzen im Expressionsvektor gebunden. Eine solche operative Bindung, die vor oder nachdem die ausgewählte DNA-Sequenz in einen Klonier-Träger eingeführt wird, durchgeführt werden kann, ermöglicht es den Expressionskontrollsequenzen, die Expression der insertierten DNA-Sequenz zu kontrollieren und zu fördern.

Eine Vielzahl von Expressionskontrollsequenzen, die die Expression einer DNA-Sequenz kontrollieren, können in diesen Vektoren verwendet werden, um die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zu exprimieren. Solche brauchbare Expressionkontrollsequenzen umfassen z. B. die frühen und späten Promotoren von SV40, das lac-System, das trp-System, das TAC oder TRC-System, Operator- und Promotor-Hauptregionen von Phage-lambda, die Kontrollregionen von fd-Coatprotein, den Promotor für 3- Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzymen, die Promotoren für saure Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren für Hefe-alpha-mating-Faktoren, und andere Sequenzen, von denen es bekannt ist, daß sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder ihrer Viren kontrollieren, und verschiedene Kombinationen davon. In Säuger-Zellen ist es zusätzlich möglich, die Expressionseinheiten zu amplifizieren, indem man das Gen mit einem solchen verbindet, daß für Dehydrofolat-Reduktase codiert, und eine Auswahl gegenüber Chinese hamster ovary-Zellen verwendet.

Der Vektor oder Expressions-Träger, und insbesondere die Stellen, die darin zur Insertion des selektierten DNA-Fragments ausgewählt wurden, und die erfindungsgemäß verwendete Expressionskontrollsequenz werden von einer Vielzahl von Faktoren bestimmt. Diese Faktoren umfassen z. B. die Stellen, die gegenüber einem bestimmten Restriktionsenzym empfindlich sind, die Größe des zur exprimierenden Proteins, die Expressionscharakteristika, wie z. B. die Lokalisierung der Start- und Stopcodons relativ zu den Vektorsequenzen. Andere Faktoren sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar. Die Auswahl eines Vektors, der Expressionskontrollsequenz, und der Insertionsstelle für eine bestimmte Phospholipase- Inhibitor-Proteinsequenz wird durch eine Ausgewogenheit dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht alle Selektionen für einen gegebenen Fall gleich wirksam sind.

Das rekombinante DNA-Molekül, das das gewünschte, operativ an eine Expressionkontrollsequenz gebundene Gen enthält, kann dann verwendet werden, um eine Vielzahl geeigneter Wirte zu transformieren, um es solchen Wirten (Transformanten) zu ermöglichen, das Gen, oder ein Fragment davon, zu exprimieren, und das Polypeptid oder einen Teil davon, für das die Hybrid- DNA kodiert, zu produzieren.

Zur Produktion der Antigene und DNA-Sequenzen dieser Erfindung ist ebenfalls eine große Zahl von Wirten brauchbar. Diese Wirte umfassen z. B. Bakterien, wie z. B. E. coli, Bacillen und Streptomyces, Pilze, wie z. B. Hefen, und tierische Zellen, wie z. B. CHO-Zellen, und Pflanzenzellen in Gewebekulturen. Die Auswahl eines geeigneten Wirts wird durch eine Anzahl von Faktoren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, gesteuert. Diese umfassen z. B. die Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, die Toxizität von Nebenprodukten, die Leichtigkeit der Gewinnung des gewünschten Polypeptids, die Expressioncharakteristika, die Biosicherheit und die Kosten. Für ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül oder Polypeptid kann aus irgendeinem dieser Faktoren allein keine absolute Wahl des Wirtes durchgeführt werden. Stattdessen muß eine ausgewogene Auswahl dieser Faktoren mit der Kenntnis getroffen werden, daß nicht alle Wirte zur Expression eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls gleich wirksam sind.

Wie dies vorstehend gezeigt wurde, sollte es verständlich sein, daß die DNA-Sequenzen, die an der ausgewählten Stelle eines Klonierungs- oder Expressions-Trägers insertiert werden, Nucleotide umfassen können, die nicht Teil des tatsächlichen Gens, das für das gewünschte Polypeptid codiert, sind, oder nur ein Fragment des gesamten Gens für dieses Protein umfassen können. Es ist nur erforderlich, daß, welche DNA-Sequenz auch immer verwendet wird, der transformierte Wirt das Protein Gelonin erzeugt, oder ein Polypeptid, das im wesentlichen die gleiche funktionelle Aktivität in Gelonin besitzt. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können z. B. im gleichen Leserahmen in einem Expressionsvektor mit einem Teil einer DNA- Sequenz fusioniert werden, die für mindestens ein eukaryotisches oder prokaryotisches Trägerprotein codiert, oder mit einer DNA-Sequenz, die für mindtestens eine eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenz codiert, oder mit Kombinationen davon. Solche Konstruktionen können die Expression der gewünschten DNA-Sequenz unterstützen, die Reinigung verbessern oder eine Sekretion, und vorzugsweise Reifung, des gewünschten Polypeptids aus der Wirtzelle ermöglichen. Die DNA-Sequenz kann alternativ ein ATG-Startcodon allein oder zusammen mit anderen Codons, direkt an die die erste Aminosäure eines gewünschten Polypeptids codierende Sequenz fusioniert, umfassen. Solche Konstruktionen ermöglichen die Produktion von z. B. einem Methionyl- oder anderen Peptidyl- Polypeptid, was Teil dieser Erfindung ist. Dieses N-terminale Methionin oder Peptid kann dann intra- oder extrazellular durch eine Vielzahl bekannter Verfahren gespalten werden, oder das Polypeptid kann zusammen mit dem Methionin oder einer anderen angefügten Fusion in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden.

Beispiele Synthese & Aufbau von Gelonin-Gen Beispiel 1 Binden von 5'-biotinyliertem Oligonucleotid an Streptavidinbeschichtete Latex-Mikrokugeln

Eine Probe von 0,2 ml DYNABEADS M280 Streptavidin (Dynal Corp.) wurde in ein 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß gegeben. Das Gefäß wurde einige Minuten gegen eine Magnetplatte (Advanced Magnetics, Inc.) gehalten, damit die paramagneaischen Latex-Mikrokugeln an die Seite des Gefäßes gezogen wurden, und dann die Flüssigkeit abgezogen. Die Perlen wurden zweimal mit 0,2 ml Anelierungspuffer (die Zusammensetzung wird nachfolgend angegeben) bei Raumtemperatur gewaschen, und dann in 0,2 ml Anelierungspuffer resuspendiert.

Zur Perlensuspension wurden 1nmol 5'-biotinyliertes Oligonucleotid zugegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Perlen zweimal mit 0,2 ml Anelierungspuffer gewaschen und in 0,2 ml Anelierungspuffer resuspendiert.

Die spektrophotometrische Analyse des ungebundenen Oligonucleotids in der Waschflüssigkeit zeigte, daß ca. 300 umol Oligonucleotid an die Perlen gebunden wurden.

Beispiel 2 Anelierungs/Wasch-Zyklus, wiederholt zur Addition jedes nachfolgenden Oligonucleotids:

Vor der Verwendung zum Genaufbau wurden die Oligonucleotide durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase enzymatisch 5'- phosphoryliert.

Zu 150 umol Träger-gebundenem Oligonucleotid wurden 750 umol überlappendes komplementäres Oligonucleotid zugegeben, und die Anelierung dann in 0,10 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,5, 1M NaCl (Anelierungspuffer) während 5 Minuten bei 45ºC durchgeführt, dann wurde die Mischung während eines Zeitraums von 7 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Perlen wurden dann zweimal mit 0,2 ml des gleichen Puffers bei Raumtemperatur gewaschen. Dieser Zyklus wurde wiederholt, bis das letzte Oligonucleotid der Anordnung zugefügt war.

Beispiel 3 Ligation des Produktes und Freisetzung vom Träger durch Restriktionsenzym-Digestion

Nach Vervollständigung des Aufbaus wurden die Perlen gewaschen und in 0,04 ml Ligasepuffer resuspendiert. Nach Zugabe von 0,005 ml DNA-Ligase (New England Biolabs, mit hochspezifischer Aktivität) wurde die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert und dann gewaschen und in. 0,04 ml Restriktionsdigestionspuffer resuspendiert. Durch Zugabe von 10 Einheiten Restriktionsendonuclease EcoRI wurde die Mischung bei 37ºC 90 Minuten lang inkubiert. Die Flüssigkeit wurde abgezogen und die freigesetzte DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und mit 0,01 ml Ligasepuffer resuspendiert.

Beispiel 4 Aufbau des Gelonin-Gens.

Das Gen wurde, wie in Fig. 3 und 4 dargestellt, aus beiden Richtungen aufgebaut. Die Oligonucleotidsequenzen sind in Fig. 5 identifiziert. Der Aufbau des 5'-Endes des Gens (ca. 500 bp N-terminale codierende Region) begann mit Träger-gebundenem Btgell und die Oligonucleotide wurden in der folgenden Reihenfolge zugefügt (wobei jeweils ein Anelierungs/Wasch- Zyklus durchgeführt wurde): ge139, ge11, ge138, ge12, ge137, ge13, ge136, ge14, ge135, ge15, ge134, ge16, ge133, ge17, ge132, ge18, ge131, ge19, ge130, ge110, ge129, ge111, ge128, ge112, ge127.

Der Aufbau des 3'-Endes des Gens (ca. 300 bp C-terminale codierende Region) begann mit Träger-gebundenem Btge12, und die Oligonucleotide wurden in der folgenden Reihenfolge zugefügt: ge120, ge119 ge121, ge118, ge122, ge117, ge123, ge116, ge124, ge115, ge125, ge114, ge126, ge113.

Nach Fig. 3 wurde das 5'-Ende des Gens (N-terminale codierende Region) vom Träger durch Digestion mit Restriktionsendonuclease EcoRI freigesetzt, und das 3'-Ende des Gens (C-terminale codierende Region) wurde aus dem Träger durch Digestion mit Restriktionsendonuclease HindIII freigesetzt. Nach Fig. 4 wurden die zwei Genfragmente, die komplementäre 20-Basen-Tails innerhalb der Oligonucleotide ge127 und ge113 enthielten, zusammen aneliert und dann unter Ausbildung des intakten Gens ligiert.

Beispiel 5 Klonieren des synthetischen Gelonin-Gens:

Das vollständige DNA-Produkt wurde mit M13mp19RFDNA, die mit EcoRI und HindIII gespalten worden war, nach Standardmethoden, die in Molecular Cloning: A laboratory manual, E.F. Sambrook et al., 1989, beschrieben sind, ligiert.

Beispiel 6 Sequenzieren des synthetischen Gelonin-Gens:

Die Sequenz des synthetischen Gens in M13mp19 wurde durch Dideoxy-Sequenzieren bestätigt. Im geklonten synthetischen Gen wurden zwei Mutationen gefunden, beide im 5'-Ende (N-terminale codierende Region).

Beispiel 7 Site-directed Mutagenese, um Mutationen im klonierten synthetischen Gen zu korrigieren:

Um die zwei Mutationen im Gelonin-Gen zu korrigieren, wurde eine Oligonucleotid-directed Mutagenese durchgeführt nach dem Verfahren des in vitro-Mutagenese-Reagenskits (Amersham Corp.)

Beispiel 8 Subklonieren des synthetischen Gens in einen Expressionsvektor:

Das synthetische Gelonin-Gen wurde vom M13mp19-Vektor durch Einwirkung von EcoRI und HindIII abgespalten und das Genenthaltende Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in EcoRI/HindIII-gespaltenen Expressionsvektor pKK223-3 (Pharmacia) ligiert.

Beispiel 9 Analyse der Expression von synthetischem Gelonin-Gen in E. coli:

Eine 50 ml-Kultur von E. coli JM105, das das in pKK223-3 geklonte synthetische Gelonin-Gen trägt, wird wachsengelassen, mit IPTG induziert und lysiert, und ein roher Extrakt erhalten. Der Extrakt wird durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (mit einem aus Wirtszellen, die den Expressionsvektor ohne Insert tragen, hergestellten Extrakt als Kontrolle) analysiert. Western-Blot-Analyse und funktionelle Gelonin-Tests werden ebenfalls durchgeführt, um zu bestätigen, das das Protein exprimiert und aktiv ist.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Angaben:

(i) Anmelder: Rosenblum, Michael Beattie, Kenneth L.

(ii) Bezeichnung der Erfindung: DNA-Sequenzen codierend für das Polypeptid Gelonin

(iii) Anzahl der Sequenzen: 1

(iv) Korrespondenzadresse:

(A) Empfänger: James F. Weiler, Rechtsanwalt

(B) Straße: One Riverway, Suite 1560

(C) Stadt: Houston

(D) Staat: Texas

(E) Land: USA

(F) ZIP: 77056

(v) Computer-lesbare Fassung:

(A) Datenträger: Floppy disk

(B) Computer: IBM PC-kompatibel

(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS

(D) Software: WordPerfect 5.1

(vi) Daten der jetzigen Anmeldung:

(A) Anmeldenummer: US 07/755949

(B) Anmeldetag. 06.09.1991

(C) Klassifikation:

(viii) Angaben zum Attorney/Agent:

(A) Name: Weiler, James F.

(B) Registration Number: 16040

(C) Referenz/Docket-Number: D-5385

(ix) Angabe zur Telekommunikation

(A) Telefon: (713) 626-8646

(B) Telefax: (713) 963-5853

(2) Angabe zum SEQ ID NO: 1:

(i) Sequenzkennzeichen:

(A) Länge: 783 Basenpaare

(B) Art: Nucleinsäure

(C) Strangform: Doppelstrang

(D) Topologie: unbekannt

(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)

(iii) Hypothetisch: ja

(vi) ursprüngliche Herkunft:

(A) Organismus: Gelonium multiforum

(D) Entwicklungszustand: Samen

(F) Gewebetyp: Nuß

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:


Anspruch[de]

1. DNA-Sequenz der Formel

2. Verfahren zur Herstellung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfassend:

(a) Konstruieren eines doppelsträngigen DNA-Fragments, das eine Sequenz von drei Basencodons enthält, die der von gereinigtem Gelonin-Protein bestimmten primären Aminosäuresequenz entspricht, wodurch die DNA-Sequenz Merkmale aufweist, die die Synthese, das Klonieren, die Expression oder die biochemische Manipulation eines Gens, das sie enthält, erleichtert;

(b) Konstruieren, Synthetisieren und Reinigen, und 5'- Phosphorylieren einer Garnitur synthetischer Oligonucleotide, die dazu fähig sind, miteinander verbunden zu werden, um die Sequenz auszubilden;

(c) Anelieren und Ligieren der Oligonucleotide um die Sequenz auszubilden.

3. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Gens, das Gelonin codiert, das die DNA-Sequenz des Anspruch 1 enthält, umfassend die Stufen: Konstruieren eines ersten DNA-Fragments, das die für Gelonin codierende Sequenz enthält, wobei die Sequenz drei Basencodontripletts für jede Aminosäure in der Gelonin-Sequenz enthält, und das Triplett ausgewählt ist aus der Gruppe von Tripletts, die für jede Aminosäure codieren, um die Expression, Manipulation oder Stabilität des DNA-Fragments in einem Expressionsvektor, der das erste DNA-Fragment synthetisiert, zu maximieren; Synthetisieren eines für das erste DNA-Fragment komplementären DNA-Fragments und Ausbilden eines DNA-Doppels durch Anelieren des ersten DNA-Fragments und des komplementären DNA-Fragments.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthesestufen umfassen:

Teilen des DNA-Fragments in überlappende Garnituren einzelsträngiger Oligonucleotidfragmente, wobei diese Fragmente chemisch synthetisiert werden;

Reinigen dieser Oligonucleotide;

Phosphorylieren dieser Oligonucleotide am 5'-Ende; und

Anelieren der Oligonucleotidstränge.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß an die Duplex-DNA flankierende Sequenzen angefügt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem den Einbau von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen in das synthetische Gen oder in die flankierende Sequenz umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Triplettcodons für eine Expression in einem bakteriellen Wirt ausgewählt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt Escherichia coli ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Triplettcodons für eine Expression in einem fungalen Wirt ausgewählt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt Hefe ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Codons ausgewählt werden für eine Expression in Säuger-Zellen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Codons ausgewählt werden für eine Expression in Insektenzellen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Codons ausgewählt werden für eine Expression in Pflanzenzellen.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß alle Oligonucleotide in einer Reaktionsmischung aneliert werden, um das Gen auszubilden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonucleotide in Blöcken aneliert werden, und die Blöcke nachfolgend aneliert und ligiert werden, um das vollständige Gen auszubilden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen durch ein Festphasenverfahren aufgebaut wird, das die Stufen umfaßt:

(a) Anbringen eines synthetischen Oligonucleotids an oder nahe an einem seiner Enden an ein Festphasen- Trägermaterial;

(b) Wegwaschen von überschüssigem ungebundenem Oligonucleotid;

(c) Zugeben eines molaren Überschußes an Oligonucleotid, das über einen Teil oder seine ganze Länge die perfekte Basensequenz-Komplementarität für das Träger-gebundene Oligonucleotid besitzt, und Anelieren der Stränge unter Bildung einer Duplex-DNA-Struktur, dann Wegwaschen des überschüssigen ungebundenen Oligonucleotids;

(d) Wiederholen von Stufe (c), bis das gesamte Gen ausgebildet ist,

(e) Behandeln des ausgebildeten Gens mit DNA-Ligase um eine intakte Duplex-DNA auszubilden; und

(f) Freisetzen des synthetischen Gens aus dem Träger mit einem Restriktionsenzym oder anderen geeigneten Mitteln.

17. Verfahren zum Klonieren des durch das in einem der Ansprüche 3 bis 16 beanspruchten Verfahren erhaltenen synthetischen Gens in einen Expressionsvektor, umfassend die Stufen:

(a) Isolieren der das Gen codierenden doppelsträngigen DNA in linearer Duplexform;

(b) Spalten eines Expressionsvektors mit einer Restriktionsendonuclease;

(c) Verbinden der das Gen enthaltenden linearen Duplex- DNA mit dem Expressionsvektor;

(d) Transformieren des DNA der Stufe (c) in eine Wirtzelle.

18. Verfahren zur Expression und Reinigung von Gelonin, umfassend die Stufen:

(a) Klonieren des Gens in einen. Expressionsvektor gemäß Anspruch 17;

(b) Wachsenlassen der Wirtzellen, die das in den Expressionsvektor klonierte Gen enthalten, unter Bedingungen, die die Synthese des Genprodukts in brauchbaren Mengen induzieren;

(c) Reinigen des Proteins aus den Zellen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner umfaßt die Stufe des Bestimmens des Proteins mittels SDS-Gelelektrophorese, Western-Blot-Analyse und Aktivitätstest.

20. Synthetisches Gen, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Sequenz des Anspruchs 1 enthält und erhältlich ist durch das im Anspruch 3 beanspruchte Verfahren.

21. Synthetisches Gen nach Anspruch. 20, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein codiert, das die Zellproteinsynthese inhibiert, aber nicht an einen Zelloberflächenrezeptor bindet.

22. Synthetisches Gen nach Anspruch. 20, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder ihrer Viren kontrolliert.

23. Synthetisches Gen nach Anspruch. 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus frühem Promotor SV40, spätem Promotor SV40, einem loc-System, einem TAC-System, einem TRC- System, einem TRP-System, Operator- und Promotor- Hauptregionen von Phage-lambda und Kontrollregionen von fd-coat Protein.

24. Synthetisches Gen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, das es ferner umfaßt das Fusionieren des Gen an eine DNA-Sequenz, die eine Polypeptid-Domäne codiert, die spezifisch an einen in ausgewählten Zielzellen vorhandenen Zelloberflächenrezeptor bindet.

25. Expressionsvektor enthaltend ein synthetisches Gen nach einem der Ansprüche 20 bis 24.

26. Expressionsvektor nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor pKK223-3 ist.

27. Expressionsvektor nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor pKC30 oder eines seiner Derivate ist.

28. Wirtzelle enthaltend und exprimierend ein rekombinantes DNA-Molekül, das die Sequenz des Anspruchs 1 enthält, wobei die Wirtzelle einen Vektor umfaßt, der die folgenden in geeigneten Abständen hintereinander gebundenen Elemente zur Ermöglichung einer funktionellen Expression von DNA umfaßt: einen Promotor; Signalsequenzelemente; und die DNA-Sequenz des Anspruchs 1.

29. Wirtzelle nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtzelle ausgewählt ist aus den Zellen abgeleitet von Bakterien, Pilzen, Insekten, Säuger oder Pflanzen.

30. Wirtzelle nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Gewebezellen von Maus, Schwein oder Mensch.

31. Wirtzelle nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Stämmen von E. coli, Pseudomonas, Bacillus und Hefe.

32. Wirtzelle nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie E. coli JM105 ist.

33. Verfahren zum Herstellen, Klonieren und Exprimieren eines synthetischen Gens, das die Sequenz des Anspruchs 1 enthält, und für Gelonin codiert, umfassend die Stufen:

(a) Konstruieren eines doppelsträngigen DNA-Fragments, das eine Sequenz von drei Basencodons enthält, die der von gereinigtem Gelonin-Protein bestimmten primären Aminosäuresequenz entspricht, damit die DNA-Sequenz Merkmale aufweist, die die Synthese, das Klonieren, die Expression oder die biochemische Manipulation des Gens erleichtert;

(b) Konstruieren, Synthetisieren, Reinigen und 5'- Phosphorylieren einer Garnitur synthetischer Oligonucleotide, die dazu fähig sind, miteinander verbunden zu werden, um das synthetische Gen aufzubauen,

(c) Anelieren und Ligieren der Oligonucleotide, um das synthetische Gen aufzubauen;

(d) Ligieren des synthetischen Gens mit einem geeigneten Klonierungsvektor;

(e) Bestimmen der Nucleotidsequenz des geklonten Gen, um die Richtigkeit des Gens zu bestätigen;

(f) Durchführen einer site-directed-Mutagenese um irgendwelche unerwünschte Modifikationen im klonierten Gen zu korrigieren;

(g) Subklonieren des Gens in einen Expressionsvektor;

(h) Einführen des Expressionsvektors, der das synthetische Gelonin-Gen trägt, in einen Expressionswirt, wobei die Wirtzelle einen Vektor umfaßt, der die folgenden in geeigneten Abständen hintereinander gebundenen Elemente zur Ermöglichung einer funktionellen Expression von DNA umfaßt: einen Promotor; Signalsequenzelemente; und eine DNA-Sequenz, die Gelonin codiert; und

(i) Wachsenlassen des Expressionswirts, der den Gelonin- Expressionsvektor trägt, unter Bedingungen, die zur Herstellung des Geloninproduktes geeignet sind.

34. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden zusätzliche Stufen nach Stufe (c) und vor Stufe (d) umfaßt:

(1) Isolieren der das synthetische Gen tragenden Vektor- DNA;

(2) Sequenzieren der das Gen tragende Vektor-DNA; und

(3) Wiederholen der Stufen (1) und (2) mit einer Vielzahl von Klonen, bis ein Klon identifiziert wurde, der die gewünschte DNA-Sequenz enthält, und die Richtigkeit des zusammengefügten und klonierten Gens bestätigt ist.

35. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Mutationen, die in dem klonierten Gen durch Site- directed-Mutagenese auftreten, korrigiert werden, indem man die folgenden zusätzlichen Stufen nach Stufe (c) und vor Stufe (d) durchführt:

(1) Isolieren der DNA eines eine Mutation enthaltenden Gens;

(2) Anelieren des die Mutation enthaltenden DNA-Stranges mit einem synthetischen korrigiesrenden Oligonucleotid- Primer, der eine Stelle der Mutation umspannt und eine richtige DNA-Sequenz enthält;

(3) Verlängern des an den die Mutation enthaltenden Templatstranges anelierten korrektiven Oligonucleotid- Primers durch Einwirken einer DNA-Polymerase;

(4) Einführen des DNA-Produktes von Stufe (3) in eine geeignete Wirtzelle durch Transfektion oder Transformation;

(5) Isolieren der Vektor-DNA; und

(6) Subklonieren des korrigierten Gens in einen Expressionsvektor.







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