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Dokumentenidentifikation DE69416166T2 19.08.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0734450
Titel VERFAHREN ZUR REGULIERUNG VON SIALINSAEUREDERIVATEN IN REKOMBINANTEN GLYKOPROTEINEN
Anmelder Amgen Inc., Thousand Oaks, Calif., US
Erfinder BLUMEN, Tracy, Kaye, Thousand Oaks, CA 91360, US;
GRAMPP, Gustavo, E., Thousand Oaks, CA 91360, US;
HETTWER, David, Joseph, Thousand Oaks, CA 91362, US
Vertreter Dr. Volker Vossius, Corinna Vossius, Tilman Vossius, Dr. Holger Adam, Dr. Martin Grund, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69416166
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 28.10.1994
EP-Aktenzeichen 949321053
WO-Anmeldetag 28.10.1994
PCT-Aktenzeichen US9412420
WO-Veröffentlichungsnummer 9512684
WO-Veröffentlichungsdatum 11.05.1995
EP-Offenlegungsdatum 02.10.1996
EP date of grant 20.01.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.08.1999
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C07K 14/505   

Beschreibung[de]
VERFAHREN ZUR KONTROLLE VON SIALINSÄURE-DERIVATEN IN REKOMBINANTEN GLYKOPROTEINEN Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Glykoproteins, wobei bestimmte Zellkultur und/oder Produktionsparameter überwacht und eingestellt werden, um den Einbau von Sialinsäuregruppen im rekombinanten Glykoprotein zu steuern. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem der CO&sub2;-Spiegel überwacht und eingestellt wird und dadurch der Anteil an N-Glykolylneuraminsäure (NGNA)- Resten in den Oligosaccharidgruppen des rekombinanten Glykoproteins gesteuert wird.

Die meisten Zelloberflächen und sekretierten Proteine, die von eukaryotischen Zellen produziert werden, sind mit einer oder mehreren Oligosaccharid-Gruppen modifiziert. Diese Modifikation, bezeichnet als Glykosylierung, findet an bestimmten Stellen entlang des Polypeptid- Rückgrats statt und umfaßt normalerweise zwei Arten: O-gebundene Oligosaccharide werden an Serin oder Threonin-Reste angeheftet, während N-gebundene Oligosaccharide an Asparagin-Reste angeheftet werden, die Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind; in der X jegliche Aminosäure außer Prolin sein kann. Glykosylierung kann grundlegend die physikalischen Eigenschaften eines Proteins verändern und kann ebenfalls wichtig für Proteinstabilität, Sekretion und zelluläre Lokalisation sein. Richtige Glykosylierung kann für biologische Aktivität essentiell sein. In der Tat führen manche Gene aus eukaryotischen Organismen, sobald sie in Bakterien (wie E. coli) exprimiert werden, die keine Glykosylierung von Proteinen durchführen können, zu Proteinen, die wenig oder keine Aktivität aufgrund des Fehlens der Glykosylierung besitzen.

Die Strukturen von N-gebundenen und O-gebundenen Oligosacchariden und die Zuckerreste, die in jedem Typ vorkommen, sind verschieden. Eine Zuckerart, die gewöhnlich sowohl in N- gebundenen als auch in O-gebundenen Oligosacchariden vorkommt, ist Sialinsäure. Sialinsäure ist ein Gattungsname für eine Gruppe von etwa 30 natürlich vorkommenden sauren Kohlenhydraten, die essentielle Komponenten einer großen Zahl von Glykokonjugaten sind; vgl. Schauer, Biochem. Society Transactions 11, 270-271 (1983). Sialinsäuren bilden gewöhnlich den äußersten Rest der Oligosaccharide. Einbau von Sialinsäuregruppen in rekombinante Glykoproteine ist sehr wichtig und kann den Glykoproteinen viele grundlegende Eigenschaften verleihen, einschließlich der folgenden: (1) Ladung, (2) antigene Wirkung, (3) Widerstand gegen Proteaseverdau, (4) immunogene Wirkung, (5) Plasma Clearance- Stärke und (6) Bioaktivität.

N-Acetylneuraminsäure (NANA) ist die am häufigsten auftretende Sialinsäureform und N- Glykolylneuraminsäure (NGNA) ist die zweithäufigste Form; vgl. Schauer, Glycobiology 1, 449-452 (1991). NGNA unterscheidet sich von NANA durch das Vorkommen einer Hydroxylgruppe am Acetylrest und entsteht formal aus der enzymatischen Hydroxylierung des Zuckernukleotids CMP-NANA zur Bildung von CMP-NGNA, gefolgt von einer Übertragung von NGNA aus CMP-NGNA auf das Glykoprotein durch Sialyltransferase. Alternativ dazu kann NGNA durch den biosynthetischen Weg frr NANA produziert werden durch einen Austausch von N-Acetylmannosamin (ein Bestandteil der NANA-Biosynthese) durch N-Glykolylmannosamin. N-Glykolylmannosamin ist ein natürliches Abbauprodukt von NGNA.

NGNA ist im Tierreich weit verbreitet und stellt abhängig von der Art und dem Gewebe oft einen merklichen Teil der in einem Glykokonjugat gebundenen Sialinsäuren dar. Bestimmte Arten, wie Hühner und Menschen, bilden eine Ausnahmen, da sie kein NGNA in normalen Geweben besitzen; vgl. Corfield et al., Cell Biology Monographs 10, 5-50 (1982). In menschlichen Serumproben beträgt der prozentuale Anteil an Sialinsäure in Form von NGNA 0,01% der Gesamtsialinsäure; vgl. Schauer, "Sialic Acids as Antigenic Deteminants of Complex Carbohydrates" aus The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates, Plenum Press, New York, 1988. NGNA wurde als onkofetales Antigen beschrieben, da es in fetalen Geweben entdeckt wurde und auf der Zelloberfläche einiger Tumorzellen gefunden wird; vgl. Hirabayashi et al., Japan Journal of Cancer Research 78, 251-260 (1987).

Rekombinante Glykoproteine, produziert in Säugerzellinien, wie Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), enthalten NGNA als untergeordnete Form einer Sialinsäure; vgl. Hokke et al., FEBS 275, 9-14 (1990). Bisher wurden keine Antikörper gegen NGNA auf diesen rekombinanten Glykoproteinen beschrieben. Die Fähigkeit, den NGNA-Gehalt in rekombinanten Glykoproteinen zu begrenzen oder zu steuern, könnte für die Abwägung von rekombinanten Glykoproteinen für eine therapeutische Verwendung nützlich sein.

Ein Glykoprotein, das in eukaryotischen Zellen produziert werden kann, ist Erythropoetin (EPO). Erythropoetin ist ein Glykoproteinhormon, das in CHO-Zellen produziert wird, und das an der Reifung von erythroiden Vorläuferzellen zu Erythrozyten beteiligt ist. Es ist ein essentieller Faktor bei der Regulierung von roten Blutkörperchen im Blutkreislauf. Natürlich vorkommendes Erythropoetin wird von der Leber während der fetalen Phase und durch die Niere in Erwachsenen produziert, zirkuliert im Blut und stimuliert die Produktion von roten Blutzellen im Knochenmark. Anämie ist meistens eine Folge von Nierenversagen aufgrund erniedrigter Produktion von Erythropoetin in der Niere. Rekombinantes Erythropoetin, produziert durch genetische Verfahren, umfassend die Expression eines Proteins in einer Wirtszelle, die mit dem für Erythropoetin kodierenden Gen transformiert worden war, ist in einer Behandlung von Anämie aufgrund eines chronischen Nierenversagens wirksam.

Rekombinantes Erythropoetin aus CHO-Zellen besitzt die Aminosäuresequenz 1-165 von menschlichem Erythropoetin und enthält drei N-gebundene und eine O-gebundene Oligosaccharidkette, die zusammen etwa 40% des Gesamtmolekulargewichts des Glykoproteins ausmachen. N-gebundene Glykosylierung findet an den Asparagin-Resten an den Positionen 24, 38 und 83 statt, während O-gebundene Glykosylierung an einem Serin-Rest an der Position 126 stattfindet (Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)).

Der Prozeß der Glykosylierung und die beteiligten Faktoren sind wenig verstanden. Von den Faktoren, von denen man weiß, daß sie die Struktur von Protein-gebundenen Oligosacchariden beeinflussen, ist der zelluläre Metabolismus der am schwierigsten zu steuernde. In einer Studie von Tsao, E. et al. in Annals New York Academy of Sciences 665, 127-136 (1992) wurden die Einflüsse von verschiedenen Verfahrensparametern, einschließlich Wachstums- und Produktionskinetiken, Inkubationstemperatur, Rotationsgeschwindigkeit, CO&sub2;-Begasung, Animpfdichte und Generationszahl des Animpfmaterials sowohl auf das Wachstum von rekombinanten CHO-Zellen als auch auf die Produktion von EPO in Rollerflaschen getestet.

Diese Studien erlaubten Tsao et al. ein Rollerflaschen-Verfahren zu optimieren und besser mit verschiedenen Verfahrensstörungen umzugehen.

Es gibt viele Arbeiten über die Effekte der Zellkultur-Parameter auf die Kohlenhydratstruktur im allgemeinen. Man zeigte z. B., daß N-gebundene Glykosylierung durch die Zellkulturbedingungen, wie Glucosekonzentration, Ammoniumionenkonzentration und Hormongehalt des Mediums beeinflußt wird; vgl. Goochee et al., Biotechnology 8, 421-427 (1990). Zusätzlich wurde beschrieben, daß die Heterogenität von Glykoprotein-Oligosacchariden durch endogene CHO-Zellen-Sialidase, die in das extrazelluläre Medium abgegeben wird, beeinflußt werden kann; vgl. Gramer et al., Biotechnology Prog. 9, 366-373 (1993).

Jedoch kann der Literatur nichts über den Effekt von verschiedenen Zellkultur- und/oder Produktionsparametern auf die NGNA-Zusammensetzung eines aus einer Zellkultur stammenden rekombinanten Glykoproteins entnommen werden. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß die Überwachung und Einstellung eines solchen Parameters, wie CO&sub2;, während der Biosynthese zu einer Steuerung der NGNA-Zusammensetzung eines sekretierten rekombinanten Glykoproteins verhelfen kann. Dieses ist sehr wichtig für das Gebiet, da es zeigt, daß Verfahrensänderungen, selbst falls sie als geringfügig erachtet werden, zu signifikanten Veränderungen in der Produktglykosylierung fuhren können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von rekombinanten Glykoproteinen, wobei bestimmte Zellkultur- und/oder Produktionsparameter überwacht und gesteuert werden und dadurch die Kohlenhydratzusammensetzung des Glykoproteins kontrolliert wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, wobei der pCO&sub2;-Druck in der Flüssigphase überwacht und eingestellt wird, und so der NGNA-Spiegel im Kohlenhydratrest des Glykoproteins gesteuert wird. Überraschenderweise kann die relative und/oder absolute Menge von NGNA in den kovalent gebundenen Sialinsäureresten auf den nativen oder rekombinanten Glykoproteinen durch Veränderung des Kultivierungsmilieus verringert werden, dadurch daß die Menge an gelöstem Kohlendioxid und/oder Carbonaten erhöht wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Überwachung des pCO&sub2;- Drucks in der Flüssigphase wie folgt überwacht: 1) Entnahme und Analyse von Medium des Bioprozessierungssystems; oder 2) Zugabe einer Meßgröße zum Bioprozessierungssystem zur Messung des pCO&sub2;-Drucks in der Flüssigphase.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Einstellung des gelösten Kohlendioxids und/oder Carbonats ausgewählt aus: 1) Dosieren gesteuerter Gemische von Gasen in die Gasphase; 2) Änderung der Austauschgeschwindigkeit von Gasen zwischen der flüssigen und Gasphase des Reaktors; 3) Änderung der Austauschgeschwindigkeit der unmittelbaren Zellkultur-Gasphase mit dem Gas in einem äußeren Reservoir. Die Erfindung umfaßt weiterhin die Steuerung des Kohlendioxids und/oder des Carbonats durch ein Erhöhen der Menge an gelösten Bicarbonat in den Produktionsmedien.

Zusätzliche Bestandteile bevorzugter erfindungsgemäßer Ausführungsformen beinhalten die Steuerung eines oder mehrerer der folgenden Zellkultur- und/oder Produktionsparameter: O&sub2;; pH; Lactat; und Glucose. Es ist ersichtlich, daß die Erfindung Verfahren zur Steuerung des NGNA-Spiegels in verschiedenen Kombinationen dieser zusätzlichen Elemente umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung des Belüftungs/Probenentnahme-Pfropfensystems zum Austausch des fest-belüfteten Schraubdeckels auf den Falcon 3113 300 cm² Gewebekulturflaschen (T-Flaschen). Dieses System wurde zur Entwicklung der experimentellen T-Flaschen der Erfindung verwendet.

Fig. 2 ist eine schematische Zeichnung der Begasungs- und Befeuchtungsvorrichtung zur Abgabe von dosierten Gasgemischen an die Belüftungs-/Probenentnahme-T-Flaschen-Vorrichtung, die detailliert in Fig. 1 gezeigt ist. Diese Vorrichtung wurde zur Untersuchung der Effekte von Milieuparametern auf die NGNA-Zusammensetzung verwendet.

Fig. 3 zeigt Glucoseprofile aus Läufen 1.1-1.6, die darlegen, daß der Glucosemetabolismus während der Biosynthese aufrechterhalten wurde. Aufgezeichnet sind die gemessenen täglichen Glucosekonzentrationen in der Probe (der niedrigere von jedem Paar) und die berechne ten Glucosekonzentrationen nach Ergänzen des Mediums für die tägliche Probe (das höhere von jedem Paar) in [g/l] gegen die Gesamtdauer des Experiments. Läufe 1.1-1.5 enthielten zu Beginn 3,1 g/l Glucose. Lauf 1.6 enthielt 2,7 g/l Glucose, da das Medium leicht verdünnt worden war, um die Osmolarität unter 350 mmolal zu halten.

Fig. 4 zeigt Lactat-Profile aus Läufen 1.1-1.6, die eine Anhäufung von Säuren während der Biosynthese zeigen: Dargestellt sind die gemessenen täglichen Lactatkonzentrationen in der Probe (das höhere von jedem Paar) und die berechneten Lactatkonzentrationen nach Verdünnen durch ein Ergänzendes Mediums für jede tägliche Probe (das niedrigere von jedem Paar) in [g/l] gegen die Gesamtdauer des Experiments. Tägliche Veränderungen in dem molaren Lactatgehalt in jeder Flasche wurden berechnet und eine äquimolare Menge an 1 N NaOH wurde hinzugegeben, um gegen die Säuren zu titrieren.

Fig. 5 zeigt die Profile an gelösten Sauerstoff in sechs experimentellen T-Flaschen. Dargestellt sind die gemessenen täglichen pO&sub2;-Spiegel [mm Hg] gegen die Gesamtdauer des Experiments.

Fig. 6 zeigt die Profile an gelösten Kohlendioxid in zwölf experimentellen T-Flaschen. Dargestellt sind die gemessenen täglichen pCO&sub2;-Spiegel [mm Hg] gegen die Gesamtdauer der Experimente.

Fig. 7 zeigt pH-Profile aus zwölf experimentellen T-Flaschen. Dargestellt sind die gemessenen täglichen pH-Werte (das niedrigere von jedem Paar) und der berechnete pH nach Titration mit NaOH für jede Tagesprobe (das höhere von jedem Paar) gegen die Gesamtdauer des Experiments für das erste (Fig. 7a) und zweite Experiment (Fig. 7b). Die Berechnungen basieren auf bekannten Titrationsgefällen (δ-pH/δmM NaOH) für die experimentellen Medien.

Fig. 8 zeigt eine Auftragung der molaren Sialinsäurezusammensetzung gegen den Kohlendioxid-Spiegel. Dargestellt sind der endgültige molare Prozentsatz an NGNA gegen die durchschnittlichen pO&sub2;-Spiegel für jeden der zwölf Läufe.

Detaillierte Beschreibung

Die Verfahren, wodurch bestimmte Zellkultur- und/oder Produktionsparameter überwacht und eingestellt werden, um den NGNA-Anteil in einem Produktionsverfahren zu steuern, sind detaillierter in der nachstehenden Beschreibung beschrieben und werden durch nachstehendes Beispiel veranschaulicht. Das Beispiel zeigt verschiedene Aspekte der Erfindung und beinhaltet die Resultate der NGNA-Steuerung durch Veränderung der Milieuparameter. Die Resultate waren überraschend, da die relative und/oder absolute Menge an NGNA in den kovalent gebundenen Sialinsäureresten auf dem rekombinanten Glykoprotein aufgrund einer Erhöhung des pCO&sub2;-Drucks in der Flüssigphase reduziert war.

Im allgemeinen umfaßt die Steuerung von gelösten Kohlendioxid- und/oder Carbonat-Spiegeln in den erfindungsgemäßen Bioprozessierungssystem eine Steuerung eines oder beider folgender Faktoren: 1) die Austauschgeschwindigkeit des Kohlendioxids zwischen der flüssigen Phasen und der Gasphase oder 2) der mittlere pCO&sub2;-Druck in der Gasphase. Erfindungsgemäß wird Gasphase als der sich über einem Rührwerk-Bioreaktor, einer Rollerflasche oder einer T-Flasche befindliche Raum definiert; 2) das Sprinklergas eines Rührwerk-, Airlift- oder immoblisierten Biomassen-Bioreaktors; 3) die Gasphase in Fasern eines Hohlfaser-Bioreaktors oder 4) die Gasphase von Leitungen eines Rührwerk-Bioreaktors, angeschlossen an gasdurchlässigen Leitungen, die in die Flüssigphase eintauchen.

Erfindungsgemäß beinhalten die Verfahren zur Steuerung der Austauschgeschwindigkeit von Kohlendioxid zwischen der Flüssig- und Gasphase eine Veränderung der Rührgeschwindigkeit, der Sprinkelgeschwindigkeit, Änderung des Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen oder eine Änderung der Permeabilität einer Gas-Austauschmembran.

Verfahren zur Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase, die für eine erfindungsgemäße Verwendung in Bewacht kommen, beinhalten 1) Dosierung gesteuerter Gemische von Gasen in die Gasphase oder 2) Änderung der Austauschgeschwindigkeit der unmittelbaren Zellkultur-Gasphase mit dem Gas in einem äußeren Reservoir, z.B. der Atmosphäre in einem Inkubator.

Erfindungsgemäß umfaßt ist auch eine Steuerung des gelösten Kohlendioxids und/oder Carbonats durch eine Erhöhung der Menge an gelöstem Bicarbonat.

Umfaßt für eine erfindungsgemäße Verwendung sind Produktionsverfahren für verschiedene rekombinante Glykoproteine. Beispielhafte Proteine sind Glykoproteine mit N-gebundenen und/oder O-gebundenen Oligosacchariden, einschließlich EPO und Stammzellfaktor (SCF). Verfahren zur Produktion dieser Glykoproteine sind bekannt (US-PS 4,703,008, Lin, bzw. WO 91/05795, Zsebo et al., 1990). Umfaßt sind auch membrangebundene Glykoproteine, wie die, die in einem Vaccin oder einem therapeutischen Mittel vorkommen können, genauso wie Immunglobuline mit N-gebundenen und/oder O-gebundenen Oligosacchariden.

Im allgemeinen besitzt das erfindungsgemäß verwendete EPO die Sequenz von menschlichem Erythropoetin oder nahe verwandten Analoga. Das EPO kann von Säugerzellen außerhalb des Körpers produziert oder kann aus natürlichen Quellen isoliert werden. Vorzugsweise ist das EPO rekombinant hergestellt (rEPO), wie in US-PS 4,703,008 (Lin) beschrieben. Die bevorzugten Wirtszellen sind Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), wie in Beispiel 10 des Lin-Patents beschrieben. Andere bekannte Wirtszellen, wie Baby-Hamster-Nierenzellen können ebenfalls zur Produktion eines erfindungsgemäß verwendbaren EPO verwendet werden. Zwar sind die Verfahren in Beispiel 10 des Lin-Patents der bevorzugte Weg zur Produktion von rEPO, das Verfahren könnte jedoch, wie bekannt, modifiziert und verändert werden.

Rekombinantes menschliches Erythropoetin enthält drei N-gebundene und eine O-gebundene Oligosaccharidkette, die zusammen etwa 40% des Gesamtmolekulargewichts des Glykoproteins ausmachen. Es wurde gezeigt, daß die Oligosaccharidketten mit terminalen Sialinsäurereste, einschließlich NGNA, modifiziert werden. Bisher waren keine menschlichen Serumproben positiv in Bezug auf Antikörper gegen EPO.

Das erfindungsgemäß verwendete Bioprozessierungssystem umfaßt ruhende Gewebekulturflaschen (T-Flaschen) mit einem flachen Boden, Rollerflaschen, Rührwerk-Bioreaktoren für Mikrocarrier oder Suspensionskulturen; Fließ-Betten, Spinner-Flaschen und immobilisierte Bett-Bioreaktoren, einschließlich Hohlfaser-Bioreaktoren.

Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen auch die Steuerung anderer Zellkultur- und/oder Produktionsparameter, einschließlich pH, pO&sub2;, Lactat und Glucose.

Nachstehendes Beispiel wird die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung detaillierter veranschaulichen:

BEISPIEL 1

Kontrollierte Experimente unter Verwendung modifizierter T-Flaschen-Systeme wurden durchgeführt, um die Wirkung verschiedener chemischer und biochemischer Parameter auf die Sialinsäure-Zusammensetzung in dem sekretierten rekombinanten EPO aus CHO-Zellen zu untersuchen. EPO exprimierende CHO-Zellen, wie in US-PS 4,703,008 (Lin) beschrieben, wurden verwendet.

1. System zur Abschätzung der Auswirkungen von Parametern

Anfänglich wurde daran gearbeitet, ein T-Flaschensystem zu entwickeln, das zur Kontrolle der CO&sub2;-Spiegel verwendet werden kann. Ein modifiziertes System war nötig, um die Beschränkungen (sie betreffen die Steuerung der experimentellen Parameter) zu umgehen, die der Verwendung von mit Belüftungs- oder festen Deckeln verschlossenen T-Flaschensystem unterliegen. Ein modifiziertes T-Flaschensystem wurde durch Austausch eines Belüftungsdeckels mit einem #9-Pfropfen, durchbohrt mit drei Löchern, entwickelt. Drei korrosionsbeständige Stahlrohre durchdringen den Pfropfen. Zwei sind an der Außenseite mit aseptischen Belüftungsfiltern verbunden (0,2 um). Das dritte Rohr taucht im Medium der Flasche ein und ist mit Probenöffnungen aus korrosionsbeständigem Stahl mit Luer-Verschlüssen verbunden. Letztgenannte tauchen in 70% Ethanol ein, um sie steril zu halten. Eine Öffnung wird zum Durchspülen der anderen nach der Probenentnahme verwendet. Die gesamte Vorrichtung kann vor dem Anschließen an die T-Flasche autoklaviert werden. Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der T-Flaschen-Vorrichtung.

Eine Begasungs- und Befeuchtungsvorrichtung (vgl. Fig. 2) wird dann verwendet, um dosierte Gasgemische an die belüftete T-Flaschen-Vorrichtung abzugeben. In dieser Vorrichtung wird Luft oder Kohlendioxid bei 96,11 · 10³ Pa (14 psig) auf Rotameter-Paare (Cole Parmer) (angedeutet als vertikale Rechtecke mit graduierter Darstellung) verteilt. Kontroll- Nadelventile (Brooks 8500 Serien #1 oder #3 Nadelventile) (angedeutet als Zylinder mit nummerierter Darstellung) liegen stromaufwärts von den Rotametern. Diese Ventile werden für eine genaue Steuerung des Gasflusses durch die Rotameter-Paare verwendet. Die Gasströme aus den Rotameter-Paaren werden gemischt und durch Wasser in Behälter gesprinkelt. Die Behälter sind mit magnetischen Rührstäbchen versehen, die über eine Rührplatte bewegt werden, um den Gas-Flüssigkeitsmassenaustausch zu verstärken. Das Gas aus den Befeuchtungsbehältern wird direkt an die Einlaßfilter der T-Flasche gesandt, wie in Fig. 2 angedeutet.

2. Herstellung der Suspensionskulturen

CHO-Zellen, transfiziert mit einer DNA-Sequenz, kodierend für menschliches EPO, wie beschrieben in der US-PS 4,703,008 (Lin), wurden kontinuierlich in Suspensionskultur mit Wachstumsmedien versorgt. Wachstumsmedien bestanden aus DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagles Medium/Ham's F-12 50%/50% composition mixture, Gibco), gepuffert mit 2,4 g/l Natriumbicarbonat und supplementiert mit 5% fetalem Rinderserum und 100 nM Methotrexat. Kulturen wurden in 1 1-Spinner-Flaschen gehalten, anfangs mit 10 Mol-% CO&sub2; begast und bei 37ºC inkubiert. Zellen wurden bei etwa 1 und 2 · 10&sup5; Zellen/ml angeimpft, bis zu 0,5 bis 1 · 10 Zellen/nil vermehrt und durch Verdünnung wie nötig aufgeteilt.

3. Herstellung der Medien

Das Behandlungsmedium umfaßte DMEM/F-12, anfangs mit 15 mM HEPES (Sigma) gepuffert und mit 1 · Penicillin/Streptomycin (Sigma) und 1 · L-Glutamin (Gibco) supplementiert. Diese basalen Medien wurden dann auf die gewünschten Anfangsbedingungen in Bezug auf pH und pCO&sub2; eingestellt, durch Zugabe von Natriumbicarbonat und anschließender Einstellung des pH und pCO&sub2;-Drucks mit 1 N HCl und/oder 1 N NaOH, alternierend mit Sprinkelung von CO&sub2; und/oder Preßluft. pH und pCO&sub2;-Druck wurden mit einem Blutgas-Analysegerät (Corning Modell 178 pH/Blood Gas Analyzer) gemessen. Schließlich wurde die Osmolarität gemessen und auf den gewünschten Bereich (300 bis 350 mMolal) durch Zugabe von NaCl oder durch leichtes Verdünnen mit gereinigtem Wasser eingestellt. Osmolarität wurde mit einem Dampfdruck-Osmometer (Wescor) gemessen. Tabelle 1 zeigt die Mediumzusammen- setzung und die Anfangsbedingungen für einen Bereich, wie hier beschrieben.

Tabelle 1

4. Animpfung der Flaschen

Zur Durchführung der Experimente wurden Suspensionkulturen, wie oben vorbereitet, in T- Flaschen zu 10&sup7; Zellen pro Flasche mit einem Gesamtvolumen von 200 ml an frischem Wachstumsmedium übergeimpft. Die Flaschen waren Becton-Dickenson Falcon® T-Flaschen (Teilenummer 3113) mit einem Volumen von 1,9 1, 300 cm² Oberfläche und einer Öffnung mit einem Durchmesser von 4 cm und einem Belüftungsverschluß. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer 5 oder 10%igen CO&sub2;-Atmosphäre für 4 bis 6 Tage inkubiert. Die Zelldichte erreichte in dieser Zeit 1 bis 2 · 10&sup8; Zellen pro T-Flasche. Nach dieser Wachstumsperiode wurden die Kulturen zweimal mit Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) (50 ml) gewaschen, um das Serum zu beseitigen und 150 bis 200 ml des Behandlungsmediums, wie in Tabelle 1 beschrieben, wurde hinzugefügt.

5. Begasung und Belüftung der experimentellen Flaschen

Nach dem Befüllen der T-Flaschen mit dem Medium wurden die Deckel der belüfteten Flaschen durch die in Beispiel 1 beschriebenen angefertigten Pfropfen ersetzt. Die Flaschen wurden dann in einen 37ºC-Inkubator gestellt, wo eine der Belüftungsverbindungen einer jeden Flasche an die Begasungs- und Befeuchtungsvorrichtung, beschrieben in Beispiel 1, angeschlossen wurde. Das Gas stammte aus Hochdruckquellen (komprimiertes CO&sub2; oder Preßluft), eingestellt auf 96,11 · 10³ Pa (14 psig) und verzweigt auf die Paare an Reduzierventilen. Druckreduzierte Preßluft wurde durch Rotameter gesteuert, die auf eine Maximum-Flußrate von 90 Standard-ml Luft/Minute kalibriert waren. Im allgemeinen war der Fluß eingestellt auf den Bereich von 60 bis 100% des Maximalwertes, gemäß dem Wert zur Erreichung des gewünschten pCO&sub2;. Kohlendioxid wurde mittels Rotametern gesteuert, die auf eine Maximal- Flußrate von 12 Standard-ml Luft/Minute kalibriert waren. Kohlendioxidfluß wurde auf den Bereich von 15 bis 100% des Maximums eingestellt, gemäß dem gewünschten pCO&sub2;-Druck. Luft und Kohlendioxid aus den Rotameter-Paaren wurden zusammengeleitet und durch eine gerührte Befeuchtungskammer mit Wasser bei 37ºC gesprinkelt. Befeuchtetes Gas wurde dann an die T-Flaschenpaare verteilt. Gaszusammensetzungen wurden an den Ausgangsbelüftungsfitern an jeder T-Flasche mit einem Blutgas-Analysiergerät (Corning Modell 178 pH/Blood Gas Analyzer) überprüft und Einstellungen an den Rotameter-Flüssen wurden entsprechend durchgeführt.

6. Probenentnahme an den Flaschen für eine Analyse

Täglich wurden Proben aus den T-Flaschen entnommen (8 bis 10 Tage), um die Abgaszusammensetzung, und den pH-, pCO&sub2;-, pO&sub2;-, Glucose- und Lactat-Wert zu überprüften. Da die Pfropfenvorrichtung während der Probenentnahme nicht einfach entfernt und wiedereingesetzt werden konnte, wurden Mediumproben über die mit Luer-Verschlüssen versehenen Öffnungen entnommen, die mit einem in das Medium eintauchenden Siphonrohr verbunden waren. Im allgemeinen wurden Proben von 3 bis 5 ml entnommen und verworfen, anschließend wurde ein 5 bis 10 ml Probe für eine Analyse entnommen. Ergänzungsmedium wurde über einen sterilen Filter (0,45 um Ausschlußgröße) hinzugefügt, um das durch die Probenentnahme verlorene Medium zu ersetzen. Genauso wurde der pH durch Zugabe von 1 N NaOH eingestellt, um gegen die Anhäufung von Lactat zu titrieren (vgl. Fig. 4). Dieses Verfahren hielt den pH in der Nähe des Wertes des Ausgangsmediums. Schließlich wurde die Probenentnahmeöffnung mit 70% Ethanol gespült und in 70% Ethanol aufbewahrt, um sie steril zu halten. Nach unmittelbarer metabolischer Analyse wurden die Proben bei -20ºC für eine darauffolgende Bestimmung der EPO-Titer aufbewahrt. Die EPO-Titer (gemessen durch ELISA) variierten zwischen 1500 und 2400 U/ml unter den 12 Bedingungen.

7. Parameterprofile a. Glucose-, Lactat- und pO&sub2;-Profile

Fig. 3, 4 und 5 zeigen die Glucose-, Lactat- bzw. pO&sub2;-Profile unter den ersten 6 Bedingungen (1.1 bis 1.6 in Tabelle 1). Da diese Variablen prinzipiell nicht kontrolliert waren und da ihre Variationsbreite wahrscheinlich keinen Effekt auf die NGNA-Zusammensetzung hat, sind die vergleichbaren Daten der anderen 6 Bedingungen nicht gezeigt.

Fig. 3 und 4 zeigen die Glucose- und Lactatprofile für Läufe 1.1 bis 1.6. Glucose- und Lactat-Konzentration wurde mit einem YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer gemessen. Glucose und Lactat werden zur Messung der metabolischen Aktivität und zur Steuerung des pHs überwacht. Obwohl die Profile systematisch zwischen den Läufen variieren, gibt es keinen funktionellen Zusammenhang zwischen metabolischer Rate und NGNA.

Fig. 5 zeigt das pO&sub2;-Profil für Läufe 1.1 bis 1.6. Die Flaschen wurden auf die gelöste Sauerstoffkonzentration mit einem Corning Modell 178 pH/Blood Gas Analyzer getestet. Die Daten zeigen, daß der pO&sub2;-Druck in einem für eine metabolische Aktivität nötigen Bereich gehalten wurde. Unabhängige Untersuchungen zeigten keinen Effekt des pO&sub2;-Drucks in der Gasphase auf den NGNA-Gehalt von EPO.

b. pCO&sub2;- und pH-Profile

Die pCO&sub2;- und pH-Profile für Läufe 1.1 bis 1.6 und 2.1 bis 2.6 sind in Fig. 6, 7a bzw. 7b gezeigt. Diese Experimente waren dazu gedacht, den pCO&sub2; bei oder in der Nähe von sechs statistisch verschiedenen Werten zu halten. Proben wurden auf den pCO&sub2; in der Flüssigphase und pH mit einem Corning Modell 178 pH/Blood Gas Analyzer getestet. Der pCO&sub2; der Flüs sigphase wurde innerhalb akzeptabler Abweichungen während den Experimenten gehalten. Der pH wurde ebenfalls zweckgerichtet bei zwei statistisch verschiedenen Werten gehalten. Eine zweifache Überprüfung eines jeden Laufs mit ähnlichen pCO&sub2;-Spiegeln zeigt keine signifikante Wirkung des pHs auf die NGNA-Zusammensetzung für diese Experimente (vgl. Fig. 8).

8. Ernten von Medium für eine Analyse

Nachdem genügend EPO in den Flaschen für die Bestimmung der Sialinsäure-Zusammensetzung (im allgemeinen 4 · 10&sup5; Units) angehäuft war, wurde das Medium geerntet, filtriert und bei -20ºC aufbewahrt. Mehrere Flaschen wurden trypsinisiert und zur Bestimmung der Endzelldichte ausgezählt.

9. Analytisches Verfahren zur Bestimmung der NGNA-Zusammensetzung

Zellkulturmedium mit glykosyliertem EPO wurde etwa 3 bis 5fach mit einem Centriprep-10 (Amicon, Kat.-# 4304) einkonzentriert. Dieses Konzentrat wurde dann durch Anionenaustauschchromatographie partiell gereinigt. Ein 600 ul Bettvolumen von DEAE-Bio-Gel-Agarose (Bio-Rad, Kat.-# 153-0740) wurde in eine Poly-prep-Chromatographiesäule (Bio-Rad, Kat.-# 731-1550) gegeben. Das Material wurde mit 4 Säulenvolumen 10 mM Tris, pH 7,0, equilibriert. Das konzentrierte Medium wurde 1 : 10 mit dH&sub2;O (d. h. 2 ml Medium/18 ml dH&sub2;O) verdünnt, damit die Leitfähigkeit gleich oder geringer als die von 10 mM Tris-Puffer war. Dieses verdünnte Material wurde zu dem Säulenmaterial gegeben und die nicht-gebundene Fraktion (der Durchfluß) wurde gesammelt. Nach dem Laden wurde die Säule mit 4 Säulenvolumina Tris-Puffer gewaschen, und diese Waschlösung wurde mit dem Durchfluß vereinigt. Das adsorbierte EPO wurde aus der Säule mit 10 mM Tris + 75 mM NaCl + 20 uM CuSO&sub4;, pH 7,0, eluiert.

Dieses eluierte Material wurde dann einkonzentriert und in dH&sub2;O diafiltriert. Etwa 1800 ul der eluierten EPO-Lösung wurden etwa 10fach mit einem Centricon-10 (Amicon, Kat.-# 4205) unter Verwendung einer Beckman J6B-Zentrifuge bei 5000 Upm einkonzentriert. Sodann wurde der Probenpuffer gegen Wasser ausgetauscht durch Zugabe von 1000 ul dH&sub2;O zu dem Centricon und durch 90minütiges, wie vorstehend beschriebenes Zentrifugieren. Die EPO- Konzentration dieses diafiltrierten Materials wird durch ELISA bestimmt.

Die an das EPO-Molekül gebundenen Sialinsäuregruppen wurden dann durch Verdau mit Neuraminidase aus Arthrobacter ureafaciens (Calbiochem, Kat.-# 480714) abgespalten. Die BPO-Probe wurde auf eine Endproteinkonzentration von 0,25 mg/ml eingestellt. Etwa 0,1 Units Neuraminidase verdauen 0,45 mg EPO. So wurden 10 ul der Neuraminidase-Lösung mit 10 Units/ml zu der EPO-Probe gegeben. Ebenfalls wurde Natriumacid zu dieser Lösung bis zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzugefügt, durch Zugabe einer 1 M Natriumacidlösung. Diese Lösung wurde gemischt und über Nacht bei 37ºC (18 Stunden) für einen Verdau inkubiert. Die verdaute Probe wurde in Centricon-10-Röhrchen bei 5000 Upm 45 Minuten zentrifugiert. Das Filtrat mit den Sialinsäuren eines niedrigeren Molekulargewichts wurde einer Kohlenhydratanalyse auf einem Dionex HPAE-PAD-System (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) unterzogen. Ein gewöhnlicher analytischer Lauf enthält etwa 50 ug der Proteinprobe in 200 ul. Molare Zusammensetzungen der Sialinsäuren wurden aus den relativen Peak-Flächen des Dionex für die NGNA- und NANA-Spezies abgeschätzt, wobei die relative Detektorantwort für jede Spezies auf einen Wert eingestellt war, der aus einer Standardkurve von Mischungen mit bekannter molarer Zusammensetzung bestimmt worden war.

10. Zusammenfassung der experimentellen Parameter und der resultierenden NGNA- Zusammensetzung

Mittelwerte und Standardabweichungen für pCO&sub2; und PH während den Inkubationsperioden in Kombination mit den geschätzten molaren Zusammensetzungen der Sialinsäure (Molprozent NGNA) sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Der funktionelle Zusammenhang zwischen pCO&sub2; und NGNA ist in Fig. 8 gezeigt. Die zeitlich gemittelten pCO&sub2;-Spiegel und Standardabweichungen für pCO&sub2; wurden aus den täglichen Proben für jeden der 12 Läufe berechnet (vgl. Fig. 6). Standardabweichungen im NGNA- Gehalt werden unter Verwendung einer vorherigen Messung der Testgenauigkeit (9% Abweichung) bestimmt. Obwohl die Daten mit einer einzigen funktionellen Abhängigkeit übereinstimmen, werden die Werte von unabhängigen Experimenten und pH-Behandlungen wie in der Figurenlegende angedeutet, gezeigt. Fig. 8 zeigt auch, daß die pH-Abweichungen, wie in Fig. 7a und 7b beobachtet, keine signifikante Wirkung auf die NGNA-Zusammensetzung hatten.

Diese Daten zeigen, daß der pCO&sub2;-Spiegel der flüssigen Phase eine deutliche Wirkung auf die molare Sialinsäure-Zusammensetzung des rekombinant in einer CHO-Zellkultur-produzierten EPO hat. In zwei unabhängigen Experimenten, umfassend 12 unabhängige Läufe, wurde gezeigt, daß der molare Prozentsatz an NGNA im Bereich von 4,0% bis 1,6% durch Einstellen des Kohlendioxid-Spiegels im Bereich von 12 mm Hg bis 162 mm Hg gesteuert wird. Eine quadratische Regression der Daten zeigt, daß 94% der beobachteten Variation durch die Wirkung von Kohlendioxid erklärt werden kann. Die Veränderung in der NGNA-Zusammenset zung ist bei niedrigen pCO&sub2;-Werten am stärksten. Die Wirkung des schrittweisen Zusatzes von pCO&sub2; auf die NGNA-Zusammensetzung nimmt ab mit steigendem pCO&sub2;-Druck.

Die Bereiche des pCO&sub2;, wie untersucht, sind typisch für die in vielen großtechnischen Bioprozessierungssystemen vorkommenden. Es ist technisch nicht schwierig, eine signifikante Erhöhung des gelösten pCO&sub2; innerhalb dieser Bereiche zu erreichen. Für pCO&sub2;-Spiegel über 120 mm Hg bei einem neutralen pH kann die zusätzliche Osmolarität durch das Bicarbonat- Anion signifikant sein (> 32 mmolal Überschuß im Verhältnis zum Medium im Gleichgewicht mit 10% CO&sub2;), jedoch kann dies durch Verringerung des Natriumchlorid-Spiegels in dem Grundmedium kompensiert werden. Daher zeigen die hier dargelegten Resultate ein praktikables Verfahren zur Steuerung der Sialinsäurezusammensetzung von sekretierten rekombinanten Glykoproteinen, das für verschiedene Bioprozessierungssysteme geeignet ist.


Anspruch[de]

1. Ein Verfahren zur Steuerung des NGNA (N-Glykolylneuraminsäure)-Spiegels eines in einem Reaktionsgemisch gebildeten Glykoproteins, umfassend das Überwachen der CO&sub2;- Spiegel im Reaktionsgemisch während der Biosynthese des Glykoproteins und Einstellen der CO&sub2;-Spiegel im Reaktionsgemisch während der Biosynthese des Glykoproteins.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das CO&sub2; im Reaktionsgemisch vorliegt in Form einer gelösten Kohlendioxid-Spezies, Carbonat-Spezies oder deren Gemischen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reaktionsgemisch eine flüssige Phase und eine Gasphase umfaßt, und die Einstellung der CO&sub2;-Spiegel eine Steuerung der Austauschgeschwindigkeit von Kohlendioxid zwischen der flüssigen Phase und der Gasphase umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Steuerung der Austauschgeschwindigkeit von Kohlendioxid zwischen der flüssigen Phase und der Gasphase bewirkt wird durch Änderung der Rührgeschwindigkeit, Änderung der Sprinkelgeschwindigkeit, Änderung des Verhältnisses von Oberflächen zu Volumen oder Änderung der Permeabilität einer Gas-Austauschmembran.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reaktionsgemisch eine flüssige Phase und eine Gasphase umfaßt und die Einstellung der CO&sub2;-Spiegel die Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase ein Dosieren gesteuerter Gemische von Gasen in die Gasphase umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase eine Änderung der Austauschgeschwindigkeit der unmittelbaren Zellkultur-Gasphase mit dem Gas in einem äußeren Reservoir, z. B. der Atmosphäre in einem Inkubator, umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Einstellung der CO&sub2;-Spiegel ein Erhöhen der Menge an gelöstem Bicarbonat im Reaktionsgemisch umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren in einem der folgenden Biosynthesesysteme durchgeführt wird: Gewebekulturflaschen, Rollerflaschen, Rührwerk-Bioreaktoren für Mikroträger- oder Suspensionskulturen, Hohlfaser-Bioreaktoren, Fließbetten, Spinner-Flaschen oder immobilisierten Bett-Bioreaktoren.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glykoprotein N-gebundene und/oder O-gebundene Oligosaccharide enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Glykoprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EPO, Stammzellfaktor, Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor, Immunoglobulin und Membran-gebundenem Glykoprotein, intrinsic einem Impfstoff oder einem anderen Therapeutikum.

12. Ein Verfahren zum Erniedrigen des NGNA-Spiegels eines in einem Reaktionsgemisch gebildeten Glykoproteins, umfassend ein Erhöhen der CO&sub2;-Spiegel im Reaktionsgemisch während der Biosynthese des Glykoproteins.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das CO&sub2; im Reaktionsgemisch vorliegt in Form einer gelösten Kohlendioxid-Spezies, Carbonat-Spezies oder deren Gemischen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reaktionsgemisch eine flüssige Phase und eine Gasphase umfaßt und die Einstellung der CO&sub2;-Spiegel eine Steuerung der Austauschgeschwindigkeit von Kohlendioxid zwischen der flüssigen Phase und der Gasphase umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Steuerung der Austauschgeschwindigkeit des Kohlendioxids zwischen der flüssigen Phase und der Gasphase bewirkt wird durch Änderung der Rührgeschwindigkeit, Änderung der Sprinkelgeschwindigkeit, Änderung des Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen oder einer Änderung der Permeabilität einer Gas-Austauschmembran.

16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reaktionsgemisch eine flüssige Phase und eine Gasphase umfaßt und die Einstellung der CO&sub2;-Spiegel eine Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase ein Dosieren gesteuerter Gemische von Gasen in die Gasphase umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Steuerung des pCO&sub2; in der Gasphase eine Änderung der Austauschgeschwindigkeit der unmittelbaren Zellkultur-Gasphase mit dem Gas in einem äußeren Reservoir, z. B. der Atmosphäre in einem Inkubator, umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Einstellung der CO&sub2;-Spiegel ein Erhöhen der Menge an gelöstem Bicarbonat im Reaktionsgemisch umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Verfahren in einem der folgenden Biosynthesesysteme durchgeführt wird: Gewebekulturflaschen, Rollerflaschen, Rührwerk-Bioreaktoren für Mikroträger- oder Suspensionskulturen, Hohlfaser-Bioreaktoren; Fließbetten, Spinner-Flaschen oder immobilisierten Bett-Bioreaktoren.

21. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Glykoprotein N-gebundene und/oder O- gebundene Oligosaccharide enthält.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Glykoprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EPO, Stammzellfaktor, Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor, Immunoglobulin und Membran-gebundenem Glykoprotein, intrinsic einem Impfstoff oder einem anderen Therapeutikum.







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