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Dokumentenidentifikation DE19916773A1 21.10.1999
Titel Verfahren und Vorrichtung zur Blitzlichtphotolyse
Anmelder Noran Instruments, Inc., Middleton, Wis., US
Erfinder Bouzid, Ahmed, Madison, Wis., US
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Anmeldedatum 14.04.1999
DE-Aktenzeichen 19916773
Offenlegungstag 21.10.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.10.1999
IPC-Hauptklasse G01N 21/17
IPC-Nebenklasse G01N 21/64   G02B 21/00   
Zusammenfassung Eine Blitzlichtphotolyse wird in einem Mikroskop-Bilderzeugungssystem ausgeführt, wobei ein kontinuierliches überlagertes Bild des Targetgebiets, auf das das Blitzlicht gerichtet ist, und auch die zugehörige Umgebung dargestellt werden. Bei Abtastbilderzeugungssystemen empfängt ein Anregungsoptokoppler den Blitzlichtanregungsstrahl und richtet diesen auf einen optischen Weg durch einen Öffnungsraumfilter zu einem Hauptoptokoppler, der den Anregungsstrahl in das Mikroskop richtet. Der Abtaststrahl von dem Abtastsystem wird ebenfalls durch den Hauptoptokoppler zu dem Mikroskop durchgelassen, und das reflektierte Licht von der Probe wird von dem Mikroskop zurück durch den Hauptoptokoppler zu dem Abtastsystem auf normale Art und Weise durchgelassen, um eine Bilderzeugung der Probe zu ermöglichen, wenn der Abtaststrahl nicht zur Verfügung gestellt wird. Die Position des Anregungsstrahls wird bestimmt, indem ein Teil des Abtaststrahls in Richtung auf die gleiche Öffnung gerichtet wird, durch die der Anregungsstrahl durchgelassen wird, und indem erfaßt wird, wann der Abtastlichstrahl durch die Öffnung gelassen wird, was dem Zeitpunkt entspricht, zu dem sich der Abtaststrahl an einer Position auf der Probe befindet, auf die der Anregungsstrahl auftrifft. Das erfaßte Signal kann dann mit dem angezeigten Bild der Probe in Beziehung gesetzt werden, um die Targetposition in dem Bilde anzugeben. Bei Ganzbildaufnahmesystemen, die keine Abtastung verwenden, kann ein ...

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Biologie und Mikroskopie und insbesondere die mikroskopische Bilderzeugung von Verbindungen in Proben mit Hilfe von Blitzlichtphotolyse.

Blitzlichtphotolyse ist eine Technik, die verwendet wird, um Oxidations/Reduktions-Reaktionen in Geweben zu studieren, und zwar auf der Basis der Fluoreszenz-Charakteristiken von den Verbindungen der zu untersuchenden Probe. Bei dieser Technik wird ein kurzer Lichtimpuls oder Lichtblitz auf eine Position in einer Probe fokussiert; oxidationsgehinderte Verbindungen werden durch den Lichtblitz photolysiert und oxidiert, zusammen mit einer zeitgleichen Fluoreszenzemission. Photoaktivierbare Käfigverbindungen, die biologisch inaktiv sind, bis sie Ultraviolett- Licht (UV-Licht) ausgesetzt werden, können durch Blitzlichtphotolyse aktiviert werden. Blitzlichtphotolyse-Techniken können in konfokalen Laserabtastmikroskopen verwendet werden, um eine Bilderzeugung sowie eine lokale Photolyse von Käfigverbindungen zu bewirken. Siehe hierzu Samuel S.H. Wang, George J. Augustine, "Confocal Imaging and Local Photolysis of Caged Compounds: Dual Probes of Synaptic Function", Neuron, Vol. 15, Oktober 1995, Seiten 755-760. Das konfokale Epifluoreszenz-Mikroskop kann dann verwendet werden, um ein Bild von der Fluoreszenz zu erzeugen, die von der Probe in Reaktion auf den UV-Lichtimpuls emittiert wird, der auf ein kleines Gebiet in der Probe fokussiert ist.

Eine Schwierigkeit, die bei der Verwendung der Blitzlichtphotolyse zusammen mit einem konfokalen Mikroskop besteht, ist das Problem der genauen Vorbestimmung der Position von einer Probe, auf der der Anregungslichtimpuls fokussiert wird. Um die Targetposition für das Anregungslicht von einer Position zur anderen auf der Probe innerhalb des Sichtfeldes des konfokalen Mikroskopes zu verändern, kann der Proben-Objektträger von dem Bediener in eine Position verlagert werden, in der das Anregungslicht auf die neue Targetposition fokussiert wird. Jedoch ist eine Verlagerung der Probe aus Gründen der Stabilität allgemein nicht gewünscht. Auch können das Mikroskop und/oder die Blitzlichtphotolyse-Einrichtungen eingestellt werden, und zwar auf Grundlage der Abschätzung des Bedieners von der Targetposition, bei der das Anregungslicht fokussiert wird. Diese abgeschätzte Position entspricht aber möglicherweise nicht genau der tatsächlichen Position des Auftreffens des Anregungslichts auf der Probe. Außerdem haben übliche Mikroskop-Objektivlinsen für das UV-Licht, das für die Blitzlichtphotolyse-Anregung verwendet wird, einen Brechungsindex, der von dem Brechungsindex für sichtbare Lichtwellenlängen etwas abweicht, so daß die tatsächliche Auftreffposition, die bei sichtbarem Licht geschätzt wird, nicht genau mit der Position übereinstimmt, bei der das UV-Anregungslicht durch das Objektiv fokussiert wird.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Durchführung von Blitzlichtphotolyse-Operationen mit einer kontinuierlichen und überlagerten Bilderzeugung von dem Targetgebiet, auf das der Blitz gerichtet wird, und von dem zugehörigen Umgebungsbereich.

Die Erfindung kann auf einfache Weise auf Laserabtastbilderzeugungssysteme angepaßt werden, die eine dreidimensionale Lokalisierung der blitzlichtphotolysierten Gebiete und eine Visualisierung der Effekte der Photolyse ermöglichen. Die vorliegende Erfindung kann außerdem bei einem Ganzbildmikroskopsystem verwendet werden, um eine kontinuierliche Bilderzeugung des anvisierten Gebietes während des Anvisierens, den Einsatz des Anregungsblitzstrahls und die anschließende Emissionen von dem Target zu ermöglichen. In jedem Fall ist eine kontinuierliche Direkt-Bilderzeugung von dem gesamten zu untersuchenden Gebiet möglich, und zwar mit nur minimalen Modifikationen der vorhandenen Abtastbilderzeugungssysteme oder Ganzbilderzeugungssysteme.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Verwendung bei Abtastbilderzeugungssystemen umfaßt einen Anregungsoptokoppler, der den Anregungsblitzlichtstrahl von einer geeigneten Quelle, wie beispielsweise ein UV-Laser, empfängt und dieses Licht auf einen optischen Weg durch einen Öffnungsraumfilter zu einem Hauptoptokoppler leitet. Der Hauptoptokoppler leitet den Anregungsstrahl zu einem optischen Bilderzeugungssystem, wie beispielsweise ein Mikroskop, das den Strahl auf die gewünschte Position in einer Probe fokussiert. Der Hauptoptokoppler ist außerdem so positioniert, um einen Abtaststrahl von einem Abtastsystem zu empfangen, wie beispielsweise ein konfokales Laserabtastsystem, und dieses Licht zu dem optischen Bilderzeugungssystem zu leiten, und um das Licht, das von der Probe reflektiert wird, durch das optische Bilderzeugungssystem zum Abtastsystem zurückzuführen. Der Hauptoptokoppler leitet außerdem einen Teil des Lichts von dem Abtaststrahl, der von der Probe reflektiert wird, zurück durch den Öffnungsraumfilter zu dem Anregungsoptokoppler, der dieses reflektierte Licht zu einem Targetdetektor leitet. Das Ausgangssignal von diesem Photodetektor wird mit dem Ausgangssignal von dem Abtastsystem in Beziehung gesetzt, so daß das abgetastete Bild, das auf einer Anzeigeeinrichtung angezeigt wird, die Position des Abtaststrahls zeigt, wenn das reflektierte Licht des Abtaststrahls durch den Öffnungsfilter geht, wie zum Beispiel durch Addition der Ausgangssignale von dem Abtastsystemdetektor und dem Targetdetektor, um ein Ausgangssignal zur Verfügung zu stellen, das, wenn es auf einem Anzeigebildschirm dargestellt wird, an der Position des Targets eine größere Intensität hat. Wenn Blitzlichtphotolyse durchgeführt werden soll, wird die Blitzlichtquelle aktiviert, um den Anregungsstrahl durch den Anregungskoppler und den Öffnungsfilter zu dem Hauptkoppler zur Verfügung zu stellen, wo der Strahl durch das Mikroskop geleitet wird, um auf der Position in der Probe fokussiert zu werden, die als die Targetposition erkannt wurde. Das Licht, das in Reaktion auf die Blitzlichtphotolyse-Anregung von der Probe ausgeht, d. h. Fluoreszenz, wird durch das Mikroskop und durch den Hauptkoppler zurück zu dem Abtastsystem geleitet, wo es erfaßt und gespeichert und/oder angezeigt wird, und zwar auf für solche Abtastsysteme herkömmliche Weise.

Die vorliegende Erfindung kann auch mit Ganzbildmikroskopsystemen verwendet werden, zum Beispiel in Fällen, bei denen eine Videokamera zusammen mit einem Mikroskop verwendet wird, um eine Bildschirmanzeige des ganzen Bildes von dem Mikroskop zur Verfügung zu stellen. Der Hauptkoppler ist zwischen der Kamera und dem Mikroskop vorgesehen. Eine Targetbeleuchtungslichtquelle ist, zusätzlich zu der Impulsanregungsquelle, mit dem Anregungsoptokoppler verbunden. Die Targetbeleuchtungslichtquelle liefert Licht durch den Anregungsoptokoppler auf dem optischen Weg und durch den Öffnungsfilter zu dem Hauptoptokoppler, wo dieses Beleuchtungslicht durch das Mikroskop geleitet wird, um auf eine Position in der Probe fokussiert zu werden. Das Targetbeleuchtungslicht, das von der Probe reflektiert wird, wird durch das Mikroskop und den Hauptoptokoppler zurück zur Kamera geführt, die den Targetlichtfleck als ein Gebiet mit hellerer Beleuchtung erfaßt. Die Ausgabe von der Kamera kann auf einer Bildschirmanzeige dargestellt werden, um sowohl die Probe als auch den heller beleuchteten Targetfleck zu zeigen. Wenn eine Blitzlichtphotolyse durchgeführt wird, dann wird die Anregungsquelle aktiviert, um den Anregungsstrahl zu dem Anregungsoptokoppler zur Verfügung zu stellen, der den Anregungsstrahl auf den optischen Weg durch die Öffnung zu dem Hauptoptokoppler lenkt. Der Hauptoptokoppler lenkt den Anregungsstrahl zu und durch das Mikroskop, um auf die gleiche Position in der Probe fokussiert zu werden, auf der auch das Targetbeleuchtungslicht fokussiert war. Die Reaktion der Probe auf den Anregungsstrahl wird dann von der Kamera erfaßt, während die Kamera außerdem die gesamte Probe erfaßt, wodurch ermöglicht wird, die Reaktion der Blitzlichtphotolyse-Anregung gleichzeitig mit dem gesamten Bild der Probe darzustellen,.

Der Hauptoptokoppler zwischen dem Abtastsystem und dem Mikroskop kann außerdem ein Reflektorsystem umfassen, das einen Teil des Abtaststrahles abtrennt und den abgetrennten Teil des Abtaststrahls direkt zu dem Öffnungsfilters reflektiert, und zwar zusätzlich oder als eine Alternative zu dem Abtaststahllicht, das von der Probe durch das Mikroskop zurück reflektiert wird. Die Verwendung eines solchen Reflektorsystems verbessert die Intensität des Signals, das von den Targetdetektor empfangen wird. Der Hauptkoppler kann einen dichroitischen Spiegel aufweisen, der relativ zu der Abtaststrahlrichtung geneigt ist, um den Abtaststrahl teilweise durchzulassen und teilweise zu reflektieren. Der teilweise reflektierte Teil des Abtaststrahls wird auf eine Linse zu einem Retoreflektorspiegel gelenkt, der es zu der Linse und dem dichroitischen Spiegel zurück reflektiert, was wie ein Strahlenteiler funktioniert, um durch den dichroitischen Spiegel in Richtung auf die Öffnung durchgelassen zu werden. Das Reflektorsystem dient dazu, um eine konjugierte Bildebene zu schaffen, und die Reflexion zurück zur Raumöffnung zu übertragen und die Pupillenebenen abzustimmen, d. h. die Größe der Rastergebiete. Der Beleuchtungsstrahl von dem Abtastsystem durchläuft ein Rasterabtastmuster, wobei die Öffnung so positioniert ist, daß Licht von dem Beleuchtungsstrahl durch die Öffnung geht, wenn der Abtaststrahl über die Öffnung läuft; das ist die gleiche Position in dem Rasterabtastmuster, bei der der Anregungsstrahl durch die Öffnung in der entgegengesetzten Richtung zu dem dichroitischen Spiegel durchgelassen wird, wo es in das Mikroskop und somit auf die Probe reflektiert wird. Der dichroitische Spiegel in dem Hauptkoppler dient daher sowohl als ein Strahlenteiler für das Beleuchtungslicht, das von der Abtasteinheit zur Verfügung gestellt wird, wobei vorzugsweise der größte Teil des Lichts bei der Beleuchtungslichtwellenlänge durchgelassen wird, als auch als ein dichroitischer Spiegel, um im wesentlichen das Licht zu reflektieren, das die (normalerweise kürzere) Wellenlänge des Anregungsstrahls hat.

Der optische Weg zwischen dem Anregungskoppler und dem Hauptkoppler enthält vorzugsweise ein Lichtwellenleiterkabel, um sowohl den reflektierten Beleuchtungsstrahl zu dem Targetdetektor zu richten als auch den Anregungsstrahl zu dem Hauptkoppler zu richten. Der optische Weg kann außerdem einen reflektierenden Spiegel enthalten, der an einer konjugierten Pupillenebene montiert ist, und zwar zur Einstellung in orthogonalen Richtungen, um eine genaue Positionierung des Anregungsstrahls und der reflektierten Lichtstrahlen bezüglich des Hauptkopplers und/oder bezüglich der Öffnung zu ermöglichen. Auf diese Weise kann die Targetposition auf der Probe von dem Bediener eingestellt werden, ohne daß die Probe selbst bewegt werden muß. Wenn die Erfindung mit einem Ganzbildmikroskop und mit einer Kamera verwendet wird, dann kann das Lichtwellenleiterkabel verwendet werden, um den Anregungsstrahl und auch den Targetbeleuchtungsstrahl aus sichtbarem Licht von dem Anregungsoptokoppler zu dem Hauptoptokoppler zu übertragen.

Weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend anhand der Beschreibung und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert, in denen:

Fig. 1 ein schematisches Blockdiagramm ist, das das Prinzip der vorliegenden Erfindung darstellt;

Fig. 2 eine schematische Ansicht der Blitzlichtphotolyse-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist, zusammen mit einem Laserabtastsystem und einem optischen Mikroskop;

Fig. 3 eine schematische Ansicht von einem abgewandelten Ausführungsbeispiel der Vorrichtung aus Fig. 2 ist;

Fig. 4 eine vereinfachte schematische Ansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, bei der für den gesamten optischen Weg zwischen der Blitzlichtanregungsquelle und dem Hauptoptokoppler sowie zwischen dem Hauptoptokoppler und dem Targetdetektor Lichtwellenleiterkabel verwendet werden; und

Fig. 5 ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist, zusammen mit einem Mikroskopsystem, das eine Ganzbildkamera verwendet.

Die erfindungsgemäße Blitzlichtphotolyse-Vorrichtung ist in Fig. 1 allgemein mit 10 bezeichnet. Die Vorrichtung 10 ist zur Verwendung mit einem Abtastsystem 11 ausgestaltet, wie beispielsweise ein konfokales Mikroskoplaserabtastsystem, das einen Rasterabtastbeleuchtungsstrahl 12 zur Verfügung stellt, der zu einem Mikroskop 13 übertragen wird, das den Abtaststrahl auf eine Probe fokussiert. Das Abtastsystem 11 und das Mikroskop 13 können im Handel erhältliche Systeme sein. Ein Beispiel von einem geeigneten konfokalen Laserabtastsystem ist im US-Patent Nr. 4,863,226 gezeigt. Die Vorrichtung 10 der vorliegenden Erfindung enthält einen Hauptoptokoppler 14, der den Abtaststrahl 12 empfängt und diesen zu dem Mikroskop 13 durchläßt. Eine Impulsbeleuchtungsquelle 20 (zum Beispiel ein Quecksilber- Blitzlicht, ein Ultraviolett-Dauerstrichlaser mit Verschlußblende oder ein Impulslaser) stellt zu ausgewählten Zeitpunkten einen Anregungsstrahl 21 aus Lichtimpulsen zur Verfügung, durch den in der Probe eine Photolyse bewirkt wird. Der Anregungsstrahl 21 wird zu einem Anregungsoptokoppler 23 geleitet. Der Optokoppler 23 empfängt den Anregungsstrahl 21 von der Quelle und lenkt den Anregungsstrahl auf einen optischen Weg 26 durch einen Öffnungsraumfilter 27 (aperture spatial filter) zu dem Hauptoptokoppler 14. Wenn kein Anregungsstrahl vorhanden ist, überträgt der Hauptoptokoppler 14 den Abtastbeleuchtungsstrahl 12 zu dem Mikroskop 13 und leitet das reflektierte (und fluoreszierende) Licht von dem Mikroskop zu dem Abtastsystem 11 zurück, so daß auf die übliche Art und Weise von der Probe Bilder aus reflektiertem Licht und fluoreszierendem Licht erhalten werden. Wenn die Impulsquelle 20 aktiviert ist, leitet der Hauptoptokoppler 14 den Anregungsstrahl 21, der durch den Öffnungsraumfilter 27 gelassen wird, zu dem Mikroskop 13, wo er auf die Probe fokussiert wird. Das Licht, das in Reaktion auf den Anregungsstrahl von der Probe abgestrahlt wird, wird von dem Mikroskop durch den Hauptoptokoppler 14 zum Abtastsystem 11 übertragen, wo es zusammen mit dem reflektierten und dem fluoreszierenden Licht von dem Rest der Probe im Sichtfeld des Mikroskops erfaßt wird. Das Abtastsystem 11 enthält einen internen Photodetektor (in Fig. 1 nicht gezeigt), der ein Ausgangssignal zur Verfügung stellt, das dem erfaßten Bild entspricht; dieses Signal wird zu einem Summenpunkt 16 und dann zu einer Anzeigeeinrichtung 18 geleitet, wie zum Beispiel ein Bildschirmanzeigegerät. Folglich zeigt die Anzeigeeinrichtung 18 gleichzeitig das gesamte Bild der Probe und auch das Licht, das von dem Targetlichtfleck auf der Probe ausgeht, auf den der Anregungsstrahl aufgetroffen ist. Wenn die Impulsquelle 20 nicht aktiviert ist und der Anregungsstrahl nicht auf die Probe gerichtet ist, dann lenkt der Hauptoptokoppler 14 einen Teil des Abtaststrahls (zum Beispiel von dem Abtaststrahllicht, das von der Probe reflektiert wird) in Richtung auf den Öffnungsraumfilter 27. Die Position des Abtaststrahls, bei der der Abtaststrahl durch die Öffnung 27 tritt, entspricht der Position auf der Probe, bei der der Anregungsstrahl auf die Probe auftrifft. Das Abtaststrahllicht, das durch den Öffnungsraumfilter gelassen wird, wird zurück auf den optischen Weg 26 zu dem Anregungsoptokoppler 23 gesendet und durch diesen zu einem Targetdetektor 15geführt. Das Ausgangssignal vom Targetdetektor 15 kann an dem Summenpunkt 16 mit dem Ausgangssignal von dem Abtastsystem 11 addiert werden, und das addierte Signal kann dann zur Anzeigeeinrichtung 18 geführt werden. Da das Signal von dem Abtastsystem 11 einer Rasterabtastung über das Mikroskopfeld entspricht, entspricht der Zeitpunkt, an dem der Detektor 15 ein Ausgangssignal zur Verfügung stellt, dem Zeitpunkt, an dem sich der Abtaststrahl an der Targetposition befindet. Das addierte Signal von dem Summenpunkt 16 führt somit zu diesem Zeitpunkt zu einem Ausgangssignal mit größerer Intensität und zu einem hellen Punkt auf dem Bildschirmanzeigegerät an der Targetposition auf der Probe.

Eine Ausführungsform der Blitzlichtphotolyse-Vorrichtung 10 zusammen mit einem herkömmlichen konfokalen Laserabtastsystem 11 ist in Fig. 2 gezeigt. Beispielsweise kann die Blitzanregungsquelle 20 einen Ultraviolett-Dauerstrichlaser 22 und eine wahlweise zu öffnenden Impuls-Verschlußblende 28 enthalten. Die Verschlußblende 28 ist normalerweise geschlossen, um den Laserstrahl zu blockieren. Wenn die Blitzlichtphotolyse durchgeführt werden soll, steuert der Bediener die Verschlußblende 28 so an, daß sie sich zu ausgewählten Zeitpunkten öffnet, um einen Anregungsstrahl 21 zur Verfügung zu stellen, der aus Anregungslichtimpulsen mit einer ausgewählten Impulsbreite (zum Beispiel 1 bis 2 Millisekunden) und einem ausgewählten Impulsabstand (zum Beispiel 1 Sekunde) besteht. Der Anregungsoptokoppler 23 kann auf verschiedene herkömmliche Weise implementiert werden, um die Kopplung des reflektierten Abtaststrahls und des Anregungsstrahls zu bewirken. Zum Beispiel kann der Koppler 23 einen dichroitischen Spiegel 24 aufweisen, der die kurzen Wellenlänge(n) des Anregungsstrahls (zum Beispiel bei 337 nm für einen Stickstoff-Impulslaser oder die 351 um CW-Linie von einem Argon- Laser in Verbindung mit einer pulsierenden Verschlußblende 28) reflektiert, während die längeren Wellenlängen des reflektierten Abtaststrahls durchgelassen werden.

Der Anregungsoptokoppler 23 kann direkt benachbart zu dem Hauptoptokoppler 14 vorgesehen sein, so daß das optische Übertragungselement, durch das der optische Weg 26 gebildet ist, lediglich durch den Luftspalt zwischen dem Anregungsoptokoppler 23, dem Öffnungsraumfilter 27 und dem Hauptoptokoppler 14 gebildet sein kann. Wegen des einfacheren Aufbaus und der besseren Einstellbarkeit enthalten die optischen Elemente in dem optischen Weg 26, der in Fig. 2 gezeigt ist, ein biegsames Lichtwellenleiterkopplungskabel 29 (zum Beispiel einen Multimoden-UV-Lichtwellenleiter) mit einem Eingangskoppler 30, der den Anregungsstrahl 21 empfängt, der durch den dichroitischen Spiegel 24 auf einen Weg 25 abgelenkt wird. Der Anregungsstrahl 21 tritt an einem Ausgangskoppler 31 aus dem Kabel 29 aus, wobei der Ausgangskoppler 31 ein Ausgangsende hat, das als der Öffnungsraumfilter 27 dient. Der Anregungsstrahl 21 wird dann durch eine Linse 33 parallel ausgerichtet und auf einen Spiegel 32 gerichtet, der den Strahl zu einer Linse 34 und zu einer Vorsatzlinse 35 reflektiert. Der 45°-Winkel-Spiegel 32 ist vorzugsweise auf einem Schlitten montiert, um in drei orthogonale Richtungen (x, y und z) verlagert werden zu können, vorzugsweise mit Hilfe von Präzisionseinstelleinrichtungen, zum Beispiel Mikrometerschrauben. Durch die Vorsatzlinse 35 wird die Pupille des Blitzlichtphotolyse-Systems an die des Mikroskops 13 angepaßt, so daß die Größe des Rastergebietes auf der Probe die gleiche ist wie an dem Ende 31 des Wellenleiterkabels 29. Die Linsen 33, 34 und 35 bilden an dem Spiegel 32 eine Pupillenebene. Alle Strahlen in dem Raster durchlaufen die Mitte dieser Ebene. Der Strahl 21 geht durch die Vorsatzlinse 35 in den Hauptkanal-Optokoppler 14 und wird von einem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler empfangen, der eine Spiegelfläche 39 hat, die relativ zu den eingehenden Strahlen 12 und 21 schräg geneigt ist, vorzugsweise mit einem Winkel von 45°. Die Spiegelfläche 39 ist vorzugsweise so ausgestaltet, um im wesentlichen alle Lichtwellenlängen des Anregungsstrahls 21 zu reflektieren (zum Beispiel UV-Wellenlängen) und um das Licht der (normalerweise längeren) Wellenlängen des Abtaststrahls 12 teilweise zu reflektieren und teilweise durchzulassen. Der Teil des Strahls 12, der von dem Spiegel 39 reflektiert wird, wie in Fig. 1 durch den mit 40 bezeichneten Strahl angedeutet, wird durch eine Linse 41 auf einen Retroreflektorspiegel 42 fokussiert (der vorzugsweise konkav ist, wie gezeigt), der einen Strahl 44 zur Linse 44 zurückreflektiert. Das Reflektorsystem bildet eine zweite konjugierte Bildebene und setzt die Rückreflexion zu der Raumfilteröffnung in Beziehung und bringt die Pupillenebenen (die Größe des Rastergebietes) zur Anpassung. Der Strahl 44, der einen reflektierten Teil des Abtaststrahls bildet, wird von der Linse 34 empfangen und als ein parallel gerichteter Strahl zu dem Spiegel 32 geleitet, wo er reflektiert wird, um durch die Linse 33 zu gehen, die den Strahl auf die Öffnung 27 an dem Ausgangsende 31 des Lichtwellenkabels 29 fokussiert. Auf ähnliche Weise wird der Teil des Abtaststrahls 12, der durch die Strahlenteilerspiegelfläche 39 geht und von dem Mikroskop 13 empfangen wird, durch die Objektivlinse 45 des Mikroskops auf einen Fleck auf der Probe 46 fokussiert. Das Licht, das von der Probe reflektiert wird, wird durch die Objektivlinse 45 des Mikroskops zurückgeführt, um so einen konvergierenden reflektierten Strahl 47 zu bilden, von dem ein Teil durch die Spiegelfläche 39 in das Abtastsystem 11 geht, um auf herkömmliche Weise erfaßt zu werden. Ein Teil des reflektierten Strahls wird ebenfalls durch die Strahlenteilerspiegelfläche 39 reflektiert, um auf der Ebene der Öffnung 27 fokussiert zu werden. Wenn das Abtaststrahllicht, das durch den Spiegel 39 reflektiert wird, eine Position erreicht, in der es durch die Öffnung 27 geht, wird es durch die optischen Elemente in dem optischen Weg 26 zurück zu dem Anregungsoptokoppler 23 geleitet und dann zu dem Licht addiert, das durch den retroreflektierenden Spiegel 42 auf den Weg 26 zurückgeleitet wurde. Das kombinierte reflektierte Licht tritt auf dem Weg 25 aus dem Lichtwellenleiterkabel 29 aus und geht durch den dichroitischen Spiegel 26, der dazu ausgestaltet ist, um im wesentlichen die längeren Wellenlängen des Abtaststrahls durchzulassen. Das Licht, das durch den dichroitischen Spiegel 24 durchgelassen wird, ist in Fig. 2 durch die Linie 50 dargestellt. Das Licht, das entlang der mit 50 bezeichneten Linie durchgelassen wird, wird am Eintrittsende 51 von einem Lichtwellenleiterkabel 52 empfangen. Das Kabel 52 leitet das Licht zu dem Ausgangsende 53 des Kabels, wo das Licht von einem Targetdetektor 15, zum Beispiel eine Photovervielfachungsröhre, empfangen wird. Der Detektor 15 stellt auf einer Leitung 55 ein Ausgangssignal für die Steuerungs- und Detektor-Elektronik 56 zur Verfügung, wobei es sich dabei um eine herkömmliche Elektronikschaltungen handelt, die bei dem Abtastsystem 11 in Beziehung stehen (zum Beispiel ein konfokales Laserabtastsystem von Noran Instruments, Inc. Oz™). Außerdem stellt die Steuerungs- und Detektor-Elektronik 56 auf Leitung 57 ein Signal für die pulsierende Verschlußblende 22 zur Verfügung, um das Öffnen und Schließen der Verschlußblende 22 und damit den Durchgang des Anregungsstrahls 21 zu steuern.

Die Verschlußblende 22 ist anfangs geschlossen (oder der Laser 20 ist inaktiv, wenn als eine Quelle ein Impulslaser verwendet wird), wenn das Abtastsystem 11 auf normale Weise ohne Blitzlichtphotolyse-Experimente betrieben werden soll. Der Abtaststrahl 12 von dem Abtastsystem durchläuft ein Rasterabtastmuster auf der Probe 46. Das reflektierte Licht von der Probe, das zurück zu der Optik des Mikroskops 13 reflektiert wird, wird von dem Abtastsystem 11 empfangen und erfaßt, um ein Ausgangssignal zur Verfügung zu stellen, das zu der erfaßten Lichtintensität proportional ist, und das Ausgangssignal wird zu der Position des Abtaststrahls in Beziehung gesetzt, um ein sichtbares Bild von der Probe zu erzeugen, das auf einer Anzeigeeinrichtung 18 angezeigt wird, wie zum Beispiel ein Bildschirmanzeigegerät 61, das einen Bildschirm 62 hat, auf dem ein Bereich 63 der Probe gezeigt wird. Das Licht von dem Abtaststrahl, das von dem Retroreflektor 42 reflektiert und dann durch die Spiegelfläche 39 geleitet wird, und das Licht von der Probe, das durch den Strahlenteilerspiegel 39 zurück auf den optischen Weg 26 zu der Öffnung 27 reflektiert wird, werden addiert und folgen außerdem einem Rasterabtastmuster, wenn dieses Licht auf die Ebene der Öffnung 27 auftrifft. Der Retroreflektor 42 kann auf einer verlagerbaren Halterung 64 angebracht sein, um zu ermöglichen, daß die Position des Retroreflektors so eingestellt werden kann, daß das Licht von dem Retroreflektor auf die Ebene der Öffnung 27 fokussiert wird. Die Öffnung 27 befindet sich in einer Position innerhalb des Rasterabtastmusters, das auf die Öffnungsebene projiziert wird. Daher geht das Licht nur dann durch die Öffnung 27, wenn der Abtaststrahl über die offene Öffnung 27 geht. Zu diesem Zeitpunkt geht ein Lichtimpuls zurück durch die optischen Elemente auf dem optischen Weg 26 zum Anregungskanalkoppler 23 und somit auf das Lichtwellenleiterkabel 52 zum Targetdetektor 15. Das Ausgangssignal, das der Steuerungs- und Detektor- Elektronik 56 auf der Leitung 55 zur Verfügung gestellt wird, wird durch die Detektor-Elektronik mit der Position des Abtaststrahls in Beziehung gesetzt, und zwar zu dem Zeitpunkt, an dem das Signal auf der Leitung 55 empfangen wird, wodurch es möglich ist, daß die Steuerungs- und Detektor-Elektronik die Position in dem Rasterabtastmuster erfassen kann, bei der der Strahl durch die Öffnung 35 tritt. Diese Position kann auf der Bildschirmanzeige durch einen Marker, zum Beispiel einen helleren Punkt, wie in Fig. 2 bei 65 dargesellt, angezeigt werden.

Wenn sich der Benutzer dazu entscheidet, eine Blitzlichtphotolyse durchzuführen, und von einer Interface-Einheit 67 an die Steuerungs- und Detektor-Elektronik 56 ein Befehlssignal gibt, dann stellt die Steuerungs-Elektronik 56 auf der Leitung 57 ein Signal zur Verfügung, um die pulsierende Verschlußblende 22 zu bestimmten Zeitpunkten zu öffnen, um zu ermöglichen, daß Lichtimpulse in dem Anregungsstrahl 21 für ausgewählte Impulszeitdauern durchgelassen werden. Die Anregungsstrahlimpulse werden dann von dem dichroitischen Spiegel 24 auf den optischen Weg 26 reflektiert und durch die Öffnung 27 durchgelassen. Die Anregungsstrahllichtimpulse werden dann von der dichroitische Spiegelfläche 39 in das Mikroskop 13 reflektiert, wo sie durch die Objektivlinse 45 auf die Probe 46 fokussiert werden. Da der Anregungsstrahl durch die gleiche Öffnung 27 tritt wie der reflektierte Abtastlichtstrahl, wenn der Abtaststrahl den Punkt in dem Rastermuster erreicht, bei dem er über die Öffnung 27 geht, wird der Anregungslichtstrahl auf die gleiche Position 65 auf der Probe fokussiert, wie durch den erfaßten Abtastlichtstrahl angezeigt ist. Wenn die Objektivlinse oder andere Linsen in dem Mikroskop 13 für ultraviolettes Licht und für sichtbares Licht einen unterschiedlichen Brechungsindex haben, dann findet eine vorhersagbare Verlagerung der tatsächlichen Position des Auftreffpunktes des ultravioletten Anregungslichts statt. Da die Verlagerung vorhersagbar ist, kann die Steuerungs- und Detektor- Elektronik 56 so programmiert werden, um eine geeignete Korrektur vorzunehmen, so daß die Position 65, die auf dem Bildschirm 62 dargestellt wird, tatsächlich die Position ist, an der die Anregungsstrahlimpulse fokussiert werden.

Die Anregungsstrahlimpulse stimulieren die Photolyse in der Probe und die Aussendung von fluoreszierendem Licht von der Probe. Dieses fluoreszierende Licht, das eine längere Wellenlänge hat als das Anregungslicht, geht zurück durch die Mikroskop-Objektivlinse 45 (und andere üblicherweise vorhandene Linsen des Mikroskops) zu der Strahlenteilerfläche 39 des dichroitischen Spiegels und tritt durch diese hindurch, um in dem Abtastsystem 11 erfaßt zu werden. Wenn gewünscht, kann das fluoreszierende Licht auch teilweise von der Strahlenteilerfläche 39 reflektiert und dann über den optischen Weg 26 zu dem Koppler 23 geleitet werden, wo es durch den dichroitischen Spiegel 24 hindurchtritt, da die Wellenlänge des fluoreszierenden Lichts länger ist als die des Anregungsstrahls 21. Das fluoreszierende Licht wird dann von dem Lichtwellenleiterkabel 52 empfangen und durch dieses hindurch zu dem Detektor 15 geleitet, um der Steuerungs- und Detektor-Elektronik ein Ausgangssignal 55 zur Verfügung zu stellen, das zu der Intensität des Fluoreszenzsignals proportional ist. Auf diese Weise kann die Intensität der Blitzlichtphotolyse-Fluoreszenz an der präzisen Position 65 auf der Probe bestimmt werden.

Um die Position des Targets auf der Probe zu verändern, kann der Benutzer die x-, y- und z-Positions-Einstelleinrichtungen für den Spiegel 32 verändern, bis der hellere Targetfleck an der richtigen Position auf dem Bildschirm 62 erscheint. Der Spiegel 32 kann auch durch einen reflektierenden Diffusor ersetzt werden, um die Einstellung der Targetfleckgröße zu ermöglichen. Die Linsen 33, 34 und 35 bilden an dem Spiegel 32 eine Pupillenebene. Alle Strahlen in dem Raster durchlaufen diese Ebene in der Mitte. Daher führt ein Neigen des Spiegels 32 an dieser Ebene zu einer Veränderung der Richtung des Anregungsstrahls und bewirkt gleichzeitig, daß die Lichtwellenleiter-Öffnung 27 den Rasterstrahl sieht, der in der gleichen Richtung kommt. Die Folge ist, daß gesehen werden kann, wie sich der Targetpunkt über das Sichtfeld bewegt und der Anregungsstrahl ebenfalls auf diese neue Fleckposition gerichtet wird. Aus den gleichen Gründen wird durch das Plazieren eines reflektierenden Diffusors an der Pupillenebene das Anregungslicht in einen Konus mit Winkelrichtungen zerstreut, wodurch bewirkt wird, daß das Licht, das auf die Probe fokussiert ist, aufgeweitet wird, wodurch eine Veränderung der Fleckgröße der Anregung erfolgt. Wegen dieses Diffusors kann die Lichtwellenleiter-Öffnung gleichzeitig das Rasterlaserlicht "sehen", das aus einem breiteren Winkelbereich kommt, und das angezeigte Targetsignal wird größer. Wegen der Grundsätze optischer Symmetrie hat das angezeigte Target die gleiche Größe (und Form) wie das Target des fokussierten Anregungslichts auf der Probe. Somit ermöglicht es der neigbare Streuspiegel 32, die Fleckmitte irgendwo auf der Probe zu positionieren, und zwar ohne Verlust an Helligkeit an dem Ende des Sichtfeldes, und ermöglicht eine Vergrößerung der Größe des Fleckes durch Umschalten (unter Verwendung eines linearen Schlittens oder eines Rades) auf einen anderen Reflektor mit einer Reflexionsfläche, die ein größeres Streuvermögen hat.

Wie zum Beispiel in Fig. 3 gezeigt, kann die Vorrichtung der Erfindung modifiziert werden, um zu ermöglichen, daß die Quelle 20 auch dazu verwendet werden kann, um den Abtaststrahl für das Abtastsystem 11 zur Verfügung zu stellen, wobei das System für die Fluoreszenz-Bilderzeugung verwendet wird. Zum Beispiel kann die Quelle 20 ein UV-Laser sein, der mehrere Ausgangslinien hat, einschließlich zum Beispiel der 351 nm-Linie und der 364 nm-Linie. Eine Wellenlängen-Auswahleinrichtung 70 (zum Beispiel ein Spektrometer-Prisma oder ein Diffraktions- Gitter) ist vorgesehen, um die Mehrzahl der Ausgangslinien des Lasers 20 zu empfangen und um die Laserlinien voneinander zu trennen, um so den Strahl 21 (zum Beispiel bei 351 nm) auf die pulsierende Verschlußblende 22 zu richten (und somit zu dem Rest der Vorrichtung 10), um auf die gleiche Weise verwendet zu werden, wie vorstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben und dargestellt. Die Wellenlängen-Auswahleinrichtung 70 leitet außerdem die anderen Laserlinien (zum Beispiel die 364 nm-Linie) zu dem Eingangsende 71 von einem Lichtwellenleiterkabel 72, das das Laserlicht zu dem Abtastsystem 11 lenkt, wo es auf herkömmliche Weise verwendet werden kann, wenn das Abtastsystem dazu verwendet wird, um eine Epifluoreszenz-Bilderzeugung durchzuführen. Wenn eine solche Bilderzeugung durchgeführt wird, ist die Verschlußblende 28 geschlossen, so daß der Anregungsstrahl 21 nicht durch das System zu der Probe geleitet werden kann. Wenn Blitzlichtphotolyse-Experimente durchgeführt werden sollen, dann kann das Abtastsystem 11 das Licht verwenden, das auf dem Lichtwellenleiterkabel 72 übertragen wird, oder es kann eine andere Quelle für allgemeines Beleuchtungslicht verwendet werden, und das Licht des Strahls 21 wird auf die Probe aufgebracht, indem die pulsierende Verschlußblende in der oben beschriebenen Art und Weise betätigt wird.

Wie in Fig. 4 dargestellt, kann die vorliegende Erfindung durch Verwendung von Lichtwellenleitern für den gesamten optischen Weg von der Anregungsstrahlquelle 20 bis hin zu dem Hauptoptokoppler 14 realisiert werden. Der Anregungsoptokoppler 23kann einen bidirektionalen Lichtwellenleiteroptokoppler von üblicher Konstruktion verwenden, wobei der Anregungsstrahl von der Quelle über ein Lichtwellenleiterkabel 75 zu dem Koppler 23 gelenkt wird. Das Ausgangsende 31 des Kabels 29 kann als die Raumfilteröffnung 27 verwendet werden, und, wenn gewünscht, kann das Ausgangsende 31 des Kabels so angebracht sein, um in eine Position eingestellt zu werden, um die Position der Targetposition auf der Probe einzustellen.

Die vorliegende Erfindung kann außerdem mit einem Ganzbildaufnahmemikroskop-System (full image capture microscope system) sowie mit Abtastsystemen verwendet werden. Eine Darstellung der Anwendung der Vorrichtung 10 der Erfindung bezüglich eines Ganzbildmikroskop-Systems ist in Fig. 5 gezeigt, in der ein Ganzbild-Detektor 80, zum Beispiel eine CCD-Kamera (charge coupled device), vorgesehen ist, um das Licht von dem Mikroskop 13 zu empfangen, das auf die Probe projiziert und von der Probe reflektiert wird, oder das durch die Probe hindurch übertragen wird, und zwar bei einer herkömmlichen Ganzbild-Beleuchtung. Für diese Anwendung ist eine Targetbeleuchtungsquelle 81 mit sichtbarem Licht, zum Beispiel eine lichtemittierende Diode (anstelle des Lichtwellenleiterkabels 52 aus Fig. 2) mit dem Koppler 23 verbunden, um ein Eingangssignal mit sichtbarem Licht zur Verfügung zu stellen, das durch den Koppler 23 in das Lichtwellenleiterkabel 29 geht, und zwar entlang des gleichen optischen Weges 26, dem auch der Anregungsstrahl von der Anregungsquelle 20 folgen würde. Das Licht von der Targetbeleuchtungsquelle 81 wird durch den Hauptoptokoppler 14 in das Mikroskop 13 geleitet, das das sichtbare Licht auf die Targetposition in der Probe fokussiert. Das Licht, das von der Probe reflektiert wird, wird zurück durch das Mikroskop 13 und durch den Koppler zu der Kamera 80 geleitet und dann als ein heller Punkt 83 auf dem Bildschirm 84 einer Anzeigeeinrichtung 85 dargestellt. Da das Licht von der Quelle 81 auf die gleiche Targetposition auf der Probe 46 fokussiert ist wie der Anregungsstrahl von der Anregungsquelle 20, weiß der Bediener sehr genau, wo die Blitzlichtphotolyse in der zu untersuchenden Probe stattfindet. Um die Blitzlichtphotolyse durchzuführen, wird die Lichtquelle 81 dann ausgeschaltet, und die pulsierende Verschlußblende 22 wird betätigt, um den pulsierenden Anregungsstrahl 21 durch das optische System und dann auf die Probe zu senden, und das fluoreszierende Licht, das von der Probe ausgeht, kann von der Kamera 80 erfaßt und auf dem Bildschirm 84 angezeigt werden.


Anspruch[de]
  1. 1. Blitzlichtphotolyse-Vorrichtung zur Verwendung mit einem Mikroskop und einem Abtastsystem, das einen Abtaststrahl zum Beleuchten einer Probe erzeugt, mit:
    1. (a) einer Impulsbeleuchtungsquelle, durch die zu auswählbaren Zeitpunkten ein Anregungsstrahl aus Lichtimpulsen mit einer ausgewählten Wellenlänge zur Verfügung gestellt wird, die eine Photolyse bewirkt können;
    2. (b) einem Anregungskoppler, der den Anregungsstrahl von der Quelle empfängt und den Anregungsstrahl auf einen Weg richtet, wobei der Anregungskoppler das Licht mit einer Wellenlänge durchläßt, die länger ist als die Wellenlänge des Anregungsstrahls, der von dem Weg empfangen wird, auf den der Anregungsstrahl gerichtet wird;
    3. (c) einem Hauptkoppler, der einen dichroitischen Spiegelstrahlenteiler aufweist;
    4. (d) optischen Übertragungselementen, durch die ein optischer Weg gebildet wird, auf dem der Anregungsstrahl von dem Anregungskoppler zum dichroitischen Spiegelstrahlenteiler gerichtet wird, wobei der dichroitische Spiegelstrahlenteiler den Anregungsstrahl auf einen Weg richtet, auf dem der Strahl durch die Optiken von einem Mikroskop auf eine Probe fokussiert werden kann, wobei der dichroitische Spiegelstrahlenteiler auch einen Abtaststrahl von einem Abtastsystem akzeptiert und einen Teil des Abtaststrahls durchläßt, so daß er zu dem Mikroskop gerichtet werden kann, wobei der dichroitische Spiegelstrahlenteiler außerdem einen Teil des Abtaststrahls zurück auf den optischen Weg zu dem Anregungskoppler durch eine Öffnung richtet, die so positioniert ist, daß der Teil des so gerichteten Abtaststrahls durch die Öffnung auf den optischen Weg gelassen wird, wenn der Abtaststrahl über die Öffnung läuft; und
    5. (e) einem Targetdetektor, der den Teil des Abtaststrahls von dem optischen Weg empfängt, der durch die Öffnung getreten ist, wobei der Detektor ein Ausgangssignal zur Verfügung stellt, wenn er das Abtaststrahllicht empfängt, wobei das Detektorausgangssignal mit dem Abtaststrahl in Beziehung gesetzt werden kann, um die relative Position in der Probe zu bestimmen, bei der der Abtaststrahl durch die Öffnung tritt, und um somit auch die Position in der Probe zu bestimmen, bei der ein Lichtimpuls in dem Anregungsstrahl von der Impulsbeleuchtungsquelle auftrifft.
  2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Hauptkoppler einen retroreflektierenden Spiegel aufweist und bei der der dichroitische Spiegelstrahlenteiler positioniert ist, um den Anregungsstrahl von der Quelle zu empfangen und zu dem Mikroskop zu reflektieren, um auf der Probe fokussiert zu werden, und positioniert ist, um einen Teil des Abtaststrahls durch den dichroitischen Spiegelstrahlenteiler in das Mikroskop durchzulassen, um auf der Probe fokussiert zu werden, und positioniert ist, um einen Teil des Abtaststrahls zu dem retroreflektierenden Spiegel zu reflektieren, der positioniert ist, um den Abtaststrahl zurück zu dem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler zu reflektieren, um teilweise durch den Spiegelstrahlenteiler hindurch und somit durch die Öffnung auf den optischen Weg zu dem Anregungsoptokoppler und somit zu dem Targetdetektor geleitet zu werden.
  3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Impulsbeleuchtungsquelle einen Laser enthält, der einen kontinuierlichen Ausgangsstrahl zur Verfügung stellt, und eine pulsierende Verschlußblende aufweist, die den Ausgangsstrahl von dem Laser unterbricht und wahlweise Lichtimpulse durchläßt.
  4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der optische Weg ein Lichtwellenleiterkabel enthält.
  5. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, bei der sich das Lichtwellenleiterkabel von dem Anregungsoptokoppler zu einer Position erstreckt, wo es einen reflektierten Abtastlichtstrahl empfängt, der durch eine Öffnung an dem Ausgangsende des Lichtwellenleiterkabels gelassen wird.
  6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, die außerdem ein zweites Lichtwellenleiterkabel, aufweist, das sich von dem Anregungsoptokoppler zum Targetdetektor erstreckt und angeordnet ist, um den Abtastlichtstrahl zu empfangen, der durch die Öffnung gelassen und auf dem Lichtwellenleiterkabel zum Anregungsoptokoppler übertragen wird, und um dieses Licht zu dem Targetdetektor zu übertragen.
  7. 7. Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der der retroreflektierende Spiegel ein konkaver Spiegel ist und eine Linse zwischen dem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler und dem konkaven, retroreflektierenden Spiegel vorgesehen ist, um das Licht von dem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler zu fokussieren, das durch die Linse auf den Retrospiegel durchgelassen wird, und um reflektiertes Licht, das vom Retrospiegel empfangen wird, zu fokussieren, das durch den dichroitischen Spiegelstrahlenteiler auf die Öffnung durchgelassen wird.
  8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Impulsbeleuchtungsquelle einen Impulslaser aufweist, der zu auswählbaren Zeitpunkten Ausgangslichtimpulse zur Verfügung stellt.
  9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der optische Weg einen Spiegel mit einer reflektierenden Fläche enthält, die den Anregungsstrahl empfängt und den Strahl auf einen Weg zu dem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler reflektiert, wobei der Spiegel zur Einstellung der Position der Fläche des Spiegels angebracht ist, um eine Einstellung der Position zu ermöglichen, bei der der Anregungsstrahl auf der Probe auftrifft.
  10. 10. Blitzlichtphotolyse-Vorrichtung zur Verwendung mit einem Mikroskop und einem Abtastsystem, das einen Abtastbeleuchtungsstrahl zur Verfügung stellt, mit:
    1. (a) einer Impulsbeleuchtungsquelle, durch die zu auswählbaren Zeitpunkten ein Anregungsstrahl aus Lichtimpulsen mit einer ausgewählten Wellenlänge zur Verfügung gestellt wird, die eine Photolyse bewirkt können;
    2. (b) einem Targetdetektor, der ein Ausgangssignal zur Verfügung stellt, wenn er Beleuchtungslicht empfängt, das mit der Intensität des Lichts in Beziehung steht;
    3. (c) einer Anregungsoptokopplereinrichtung, um den Anregungsstrahl von der Quelle zu empfangen und den Anregungsstrahl auf einen optischen Weg zu richten, und um Licht mit einer Wellenlänge auf dem gleichen optischen Weg zu empfangen, die verschieden ist von der des Anregungsstrahls, und um dieses Licht auf einem Weg zu dem Targetdetektor durchzulassen; und
    4. (d) einer Hauptoptokopplereinrichtung, die dazu ausgestaltet ist, um zwischen einem Abtastsystem und einem Mikroskop angebracht zu sein, um den Abtaststrahl von dem Abtastsystem zu empfangen und diesen Abtaststrahl zu einem Mikroskop durchzulassen, um reflektiertes Licht von dem Mikroskop zu empfangen und dieses reflektierte Licht zu dem Abtastsystem zu richten, um den Anregungsstrahl von der Anregungsoptokopplereinrichtung zu empfangen, der auf dem optischen Weg durchgelassen wird, und den Anregungsstrahl zu dem Mikroskop zu leiten, um Fluoreszenzlicht von dem Mikroskop zu empfangen, das in Reaktion auf den Anregungsstrahl ausgestrahlt wird, und um das ausgestrahlte Licht zu dem Abtastsystem zu lenken, und um einen reflektierten Teil des Abtaststrahls zu einer Öffnung zu richten, die sich mit dem optischen Weg zu der Anregungsoptokopplereinrichtung in Ausrichtung befindet, so daß der Abtaststrahl über die Öffnung geführt wird, um Licht zur Verfügung zu stellen, das auf dem optischen Weg zu und durch die Anregungsoptokopplereinrichtung zu dem Detektor durchgelassen wird, wenn sich der Abtaststrahl in einer Position befindet, in der der Anregungsstrahl von der Quelle, der auf dem optischen Weg durch die Öffnung geführt wird, durch die Hauptoptokopplereinrichtung zu dem Mikroskop geleitet und auf der Probe fokussiert wird.
  11. 11. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die Anregungsoptokopplereinrichtung einen dichroitischen Spiegel enthält, der den Anregungsstrahl von der Quelle empfängt und den Anregungsstrahl reflektiert, wobei er dazu ausgestaltet ist, um Licht mit bestimmten Wellenlängen durchzulassen, die kleiner sind als die Wellenlänge des Anregungsstrahls.
  12. 12. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der der optische Weg zwischen der Anregungsoptokopplereinrichtung und der Hauptoptokopplereinrichtung ein Lichtwellenleiterkabel enthält und bei der die Anregungsoptokopplereinrichtung eine bidirektionale Lichtwellenleiterkopplung aufweist.
  13. 13. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die Hauptoptokopplereinrichtung einen dichroitischen Spiegelstrahlenteiler aufweist, der positioniert ist, um den Anregungsstrahl von der Quelle zu empfangen und zu dem Mikroskop zu reflektieren, um auf der Probe fokussiert zu werden, und positioniert ist, um einem Teil des Abtaststrahls durch den dichroitischen Spiegelstrahlenteiler in das Mikroskop durchzulassen, um auf die Probe fokussiert zu werden, und positioniert ist, um einen Teil des Abtaststrahls zu einem retroreflektierenden Spiegel zu reflektieren, der den Abtaststrahl zurück zu dem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler reflektiert, um teilweise durch den Spiegelstrahlenteiler hindurch und somit durch die Öffnung auf den optischen Weg zu der Anregungsoptokopplereinrichtung und somit zu dem Detektor geleitet zu werden.
  14. 14. Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der der retroreflektierende Spiegel eine konkave Fläche hat und außerdem ein fokussierender Spiegel zwischen dem retroreflektierenden Spiegel und dem dichroitischen Spiegelstrahlenteiler vorgesehen ist.
  15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der der optische Weg ein Lichtwellenleiterkabel enthält.
  16. 16. Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der sich das Lichtwellenleiterkabel von der Anregungsoptokopplereinrichtung zu einer Position erstreckt, wo es Licht empfängt, das durch eine Öffnung an dem Ausgangsende des Lichtwellenleiterkabels gelassen wird.
  17. 17. Vorrichtung nach Anspruch 16, die außerdem ein zweites Lichtwellenleiterkabel aufweist, das sich von der Anregungsoptokopplereinrichtung zum Targetdetektor erstreckt und positioniert ist, um den Abtastlichtstrahl zu empfangen, der durch die Öffnung gelassen und auf dem Lichtwellenleiterkabel zu der Anregungsoptokopplereinrichtung übertragen wird, und um dieses Licht zu dem Detektor zu übertragen.
  18. 18. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die Impulsbeleuchtungsquelle einen Laser aufweist, der einen kontinuierlichen Ausgangsstrahl zur Verfügung stellt, und eine pulsierende Verschlußblende enthält, die den Ausgangsstrahl von dem Laser unterbricht und wahlweise Lichtimpulse durchläßt.
  19. 19. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die Impulsbeleuchtungsquelle einen Impulslaser aufweist, der zu auswählbaren Zeitpunkten Ausgangslichtimpulse zur Verfügung stellt.
  20. 20. Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der der optische Weg einen Spiegel enthält, der den Anregungsstrahl empfängt und den Strahl auf einen Weg zu der Hauptoptokopplungseinrichtung reflektiert, wobei der Spiegel angebracht ist, um die Position der Fläche des Spiegels einzustellen, um eine Einstellung der Position zu ermöglichen, bei der der Anregungsstrahl auf eine Probe auftrifft.
  21. 21. Blitzlichtphotolyse-Vorrichtung zur Verwendung mit einem Mikroskop und einem Bildaufnahmesystem, das eine Ganzbilddarstellung des Mikroskopbildes zur Verfügung stellt, mit:
    1. (a) einer Impulsbeleuchtungsquelle, durch die zu auswählbaren Zeitpunkten ein Anregungsstrahl aus Lichtimpulsen mit einer ausgewählten Wellenlänge zur Verfügung gestellt wird, die eine Photolyse bewirken können;
    2. (b) einer Targetlichtquelle, die einen Targetbeleuchtungsstrahl aus Targetbeleuchtungslicht zur Verfügung stellt;
    3. (c) einer Anregungsoptokopplereinrichtung, um den Anregungsstrahl von der Impulsbeleuchtungsquelle und den Targetbeleuchtungsstrahl von der Targetbeleuchtungsquelle zu empfangen und um den Anregungsstrahl und den Targetbeleuchtungsstrahl auf den gleichen optischen Weg zu richten;
    4. (d) einer Hauptoptokopplereinrichtung, die dazu ausgestaltet ist, um zwischen einem Bildaufnahmesystem und einem Mikroskop angebracht zu sein, um Licht von dem Mikroskop zu empfangen und dieses Licht zu dem Bildaufnahmesystem zu leiten, um den Anregungsstrahl von der Anregungsoptokopplereinrichtung zu empfangen, der auf dem optischen Weg durchgelassen wird, und um diesen Anregungsstrahl zu dem Mikroskop zu richten, um den Targetbeleuchtungsstrahl von dem optischen Weg zu empfangen und diesen Targetbeleuchtungsstrahl zu dem Mikroskop zu richten, und um das Fluoreszenzlicht von dem Mikroskop zu empfangen, das in Reaktion auf den Anregungsstrahl emittiert wird, und um das emittierte Licht zu dem Bildaufnahmesystem zu richten.
  22. 22. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der die Anregungsoptokopplereinrichtung einen dichroitischen Spiegel aufweist, der den Anregungsstrahl von der Quelle empfängt und den Anregungsstrahl reflektiert, wobei der dichroitische Spiegel dazu ausgestaltet ist, um den Targetbeleuchtungslichtstrahl bei Wellenlängen durchzulassen, die kleiner sind als die Wellenlängen des Anregungsstrahls.
  23. 23. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der der optische Weg zwischen der Anregungsoptokopplereinrichtung und der Hauptoptokopplereinrichtung ein Lichtwellenleiterkabel enthält und bei der die Anregungsoptokopplereinrichtung einen bidirektionalen Lichtwellenleiterkoppler aufweist.
  24. 24. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der die Hauptoptokopplereinrichtung einen dichroitischen Spiegelstrahlenteiler enthält, der angeordnet ist, um den Anregungsstrahl zu empfangen und um den Anregungsstrahl und den Targetbeleuchtungsstrahl zu dem Mikroskop zu reflektieren, um auf eine Probe fokussiert zu werden.
  25. 25. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der der optische Weg ein Lichtwellenleiterkabel enthält.
  26. 26. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der die Impulsbeleuchtungsquelle einen Laser aufweist, einen kontinuierlichen Ausgangsstrahl zur Verfügung stellt, und eine pulsierende Verschlußblende aufweist, die den Ausgangsstrahl von dem Laser unterbricht und wahlweise Lichtimpulse durchläßt.
  27. 27. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der die Impulsbeleuchtungsquelle einen Impulslaser enthält, der zu auswählbaren Zeitpunkten Ausgangslichtimpulse zur Verfügung stellt.
  28. 28. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der der optische Weg einen Spiegel enthält, um den Anregungsstrahl und den Targetbeleuchtungsstrahl zu empfangen und um die Strahlen auf einen Weg zur Hauptoptokopplereinrichtung zu reflektieren, wobei der Spiegel zur Einstellung der Position der Fläche des Spiegels angebracht ist, um eine Einstellung der Position zu ermöglichen, bei der der Anregungsstrahl und der Targetbeleuchtungsstrahl auf eine Probe auftreffen.
  29. 29. Verfahren zum Durchführen einer Blitzlichtphotolyse, mit einem Mikroskop und einem Abtastsystem, das einen Abtastbeleuchtungsstrahl zu dem Mikroskop zur Verfügung stellt, mit den Schritten:
    1. (a) Richten des Abtastbeleuchtungsstrahls in einem Rastermuster in das Mikroskop, um auf einer Probe fokussiert zu werden, und Erfassen des reflektierten Lichts von der Probe, das zu dem Abtastsystem zurückgeführt wird, und Anzeigen des erfaßten Bildes von der Probe;
    2. (b) Ablenken des Abtaststrahllichts in Richtung auf eine Öffnung, so daß das Abtaststrahllicht durch die Öffnung an einer ausgewählten Position in dem Rasterabtastmuster des Abtaststrahls durchgelassen wird;
    3. (c) Erfassen des Abtaststrahllichts, das durch die Öffnung durchgelassen wird, und Anzeigen der Position in dem Bild von der Probe, bei der der Abtaststrahl durch die Öffnung gelassen wird;
    4. (d) wenn eine Blitzlichtphotolyse durchgeführt werden soll, dann Durchlassen eines Anregungsstrahls aus Lichtimpulsen mit einer ausgewählten Wellenlänge, die eine Photolyse bewirken können, durch die Öffnung auf den gleichen Weg wie das Abtaststrahllicht, das durch die Öffnung gelassen und erfaßt wird, und Richten des Anregungsstrahls, der durch die Öffnung gelassen wird, in das Mikroskop, und Fokussieren dieses Anregungsstrahls auf die Probe.
  30. 30. Verfahren nach Anspruch 29, mit dem Schritt des Erfassens von Fluoreszenzemissionen von der Probe in Reaktion auf den Anregungsstrahl und Anzeigen des Bildes der erfaßten
  31. Fluoreszenz, überlagert auf dem angezeigten Bild der Probe, die aus dem reflektierten Abtaststrahl erhalten wird.
  32. 31. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem der Schritt des Ablenkens des Lichts von dem Abtaststrahl in Richtung auf eine Öffnung mit einem Strahlenteiler auf dem Weg des Abtaststrahls durchgeführt wird, der den Abtaststrahl zu dem Mikroskop durchläßt und das Abtaststrahllicht, das von der Probe reflektiert wird, teilweise in Richtung auf die Öffnung reflektiert.
  33. 32. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem der Schritt des Ablenkens von Licht von dem Abtaststrahl in Richtung auf eine Öffnung durchgeführt wird, indem der Abtaststrahl durch einen Strahlenteiler teilweise zu einem retroreflektierenden Spiegel reflektiert wird, um das Licht zurück durch den Strahlenteiler in Richtung auf die Öffnung zu reflektieren.
  34. 33. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem der Anregungsstrahl aus Lichtimpulsen mit ultravioletten Wellenlängen zusammengesetzt ist.
  35. 34. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem der Schritt des Erfassens des Abtaststrahllichts durchgeführt wird, indem das Licht, das durch die Öffnung gelassen wird, auf einen optischen Weg gerichtet wird, von dem zumindest ein Teil durch ein Lichtwellenleiterkabel gebildet ist.
  36. 35. Verfahren zum Durchführen einer Blitzlichtphotolyse, mit einem Mikroskop und einem Bildaufnahmesystem, das eine Ganzbildanzeige des Mikroskopbildes zur Verfügung stellt, mit den Schritten:
    1. (a) Erfassen des reflektierenden Lichts von einer Probe, das durch ein Mikroskop zu dem Bildaufnahmesystem durchgelassen wird, und Anzeigen des erfaßten Bildes der Probe;
    2. (b) Richten eines Targetbeleuchtungslichtstrahls auf einem optischen Weg in das Mikroskop, um an einer ausgewählten Position in der Probe fokussiert zu werden; und
    3. (c) wenn die Photolyse-Anregung durchgeführt werden soll, Durchlassen eines Anregungsstrahls aus Lichtimpulsen mit einer ausgewählten Wellenlänge zu ausgewählten Zeitpunkten, die eine Photolyse bewirken können, in das Mikroskop auf dem gleichen optischen Weg wie der Targetbeleuchtungsstrahl, und Fokussieren des Anregungsstrahls auf einer Position in der Probe, die der Targetposition entspricht.
  37. 36. Verfahren nach Anspruch 35, mit dem Schritt des Erfassens von Fluoreszenzemissionen von der Probe in Reaktion auf den Anregungsstrahl und Anzeigen des Bildes der erfaßten Fluoreszenz, überlagert auf dem angezeigten Bild der Probe.
  38. 37. Verfahren nach Anspruch 35, bei dem der Anregungsstrahl aus Lichtimpulsen mit ultravioletten Wellenlängen gebildet ist.






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