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Dokumentenidentifikation DE68929013T2 21.10.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0357127
Titel Genaustausch als Mittel zur Konstruktion von Aspergillus-Stämmen
Anmelder DSM N.V., Heerlen, NL
Erfinder Van Hartingsveldt, Wim, NL-2613 DL Delft, NL;
Van den Hondel, Cees A.M.J.J., NL-2804 PZ Gouda, NL;
Veenstra, Annemarie Eveline, NL-2151 XH Nieuw Vennep, NL;
Van den Berg, Johannes A., NL-2811 AD Reeuwijk, NL
Vertreter Diehl, Glaeser, Hiltl & Partner, 80333 München
DE-Aktenzeichen 68929013
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 16.08.1989
EP-Aktenzeichen 892021064
EP-Offenlegungsdatum 07.03.1990
EP date of grant 09.06.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.10.1999
IPC-Hauptklasse C12N 15/80
IPC-Nebenklasse C12N 15/90   C12P 21/02   C12N 1/15   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Transformation und Expression unter Verwendung von filamentösen Pilztransformanten.

Hintergrund

Die Möglichkeit zur Transformation von lebensfähigen Zellen mit DNA, die zur Expression befähigt ist, hat zahlreiche Wege zu neuen und verbesserten Produkten eröffnet. Diese Fähigkeit ermöglicht die Erzeugung einer großen Anzahl von Säugetierproteinen, die ansonsten nicht leicht zugänglich wären. In anderen Fällen, insbesondere bei Blutproteinen, war die Notwendigkeit zur Verwendung von natürlichen Quellen zur Erzeugung derartiger Proteine aufgrund der verbreiteten Schwierigkeiten mit Hepatitis und AIDS in zunehmendem Maße inakzeptabel. Neben Säugetierproteinen zur Verwendung als Arzneistoffe gibt es eine Anzahl von weiteren Proteinen, insbesondere Enzymen, die in einer Reihe von gewerblichen Verfahren eingesetzt werden. Chymosin kann bei der Herstellung von Käse verwendet werden, Lipasen werden unter anderem bei Umesterungsreaktionen eingesetzt, Proteasen finden unter anderem Verwendung auf dem Gebiet der Nahrungsmittel und für medizinische Einsätze und dergl.

Bei der Herstellung dieser verschiedenartigen Produkte besteht ein starkes Interesse ander Wirtschaftlichkeit der Herstellung des Produkts. Der erste wichtige Aspekt liegt auf dem Niveau der Expression des gewünschten Produkts. Ein zweiter Aspekt ist die Stabilität des Produkts im speziellen Wirt. Ein dritter Aspekt ist die Isolierung und Reinigung des Produkts, insbesondere wenn es sich bei dem Produkt um einen Arzneistoff oder um ein Nahrungsmitteladditiv handelt.

Bei der Herstellung des Proteinprodukts kann je nach einer funktionellen Signalsequenz das Produkt im Cytoplasma zurückgehalten oder in das Nährmedium sezerniert werden. Unterschiedliche Wirte weisen unterschiedliche Sekretionsprodukte sowie unterschiedliche Sekretionsgrade auf, wobei die Sekretion induzierbar oder nicht-induzierbar sein kann. In den meisten Fällen bietet die Sekretion zahlreiche Vorteile, da das Produkt aus dem Nährmedium in einer Form, die im wesentlichen frei von intrazellulären Proteinen und Zellbruchstücken ist, isoliert werden kann. Somit besteht bei der Trennung nur die Aufgabe, eine Abtrennung von anderen, vom Wirt sezernierten Proteinen und von geringen Proteinmengen, die sich durch Zellysis oder Abbau ergeben, vorzunehmen. Es besteht daher ein erhebliches Interesse an der Bereitstellung von Systemen, die zu einer wirksamen Expression und Sekretion von Produkten von Interesse unter Bedingungen, die eine leichte Isolierung und Reinigung ermöglichen, führen.

Einschlägige Literatur

Die Transformation von filamentösen Pilzen wird von mehreren Autoren beschrieben (Tilburn et al., Gene, Bd. 26 (1983), S. 205-221; John und Peberdy, Enzyme Microb., Technol., Bd. 6 (1984), S. 386-389; Ballance und Turner, Gene, Bd. 36 (1985), S. 321-331; Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 206 (1987), S. 71-75; Goosen et al., Curr. Genet., Bd. 11 (1987), S. 499-503; EP-A-0 134 438, EP-A-0 238 023; und die internationale Patentanmeldung (PCT) WO-86/06097).

Pilzspezies, wie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, und Trichoderma reesei, werden in breitem Umfang bei der großtechnischen Herstellung von Enzymen verwendet, z. B. in der Nahrungsmittelindustrie (vergl. beispielsweise Strijkert, Antonie von Leeuwenhoek, Bd. 53 (1987), S. 357-362). Ihre Verwendung beruht auf der Sekretionskapazität dieser Mikroorganismen. A. niger und A. oryzae werden in großen Mengen und in gewerblichem Maßstab für die großtechnische Herstellung verwendet und stellen daher Mikroorganismen dar, die in bezug auf ihr Fermentationsverhalten gut charakterisiert sind. Gentechnische Möglichkeiten wurden auf Aspergilli angewandt. Dabei wurden Transformanten erhalten, die weitere wertvolle Produkte synthetisieren (Cullen et al., Bio/technology, Bd. 5 (1987); S. 369-376; Gwynne et al., Bio/technology, Bd. 5 (1987), S. 713-719; Upshall et al., Bio/technology, Bd. 5 (1987), S. 1301-1304). In diesen Fällen wird das gewählte Protein zusätzlich zu den Proteinen, die normalerweise vom Wirt sezerniert werden, exprimiert, so daß das gewählte Protein von diesen anderen Proteinen abgetrennt werden muß.

Ein Genaustausch wurde für Aspergilli dokumentiert (z. B. Miller et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5 (1985), S. 1721; Van Hartingsveldt et al., a. a. O.; Goosen et al., Curr. Genet., Bd. 11 (1987), S. 499-503; Wernars et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 209 (1987), S. 71-77). Für A. nidulans wurden für Gene, die für Enzyme kodieren, die Bestandteile von Biosynthesewegen, z. B. für Aminosäuren und Nucleotide, darstellen, verschiedene Methoden herangezogen. Miller et al. (a. a. O.) wenden entweder einen ein stufigen Genaustausch des TrpC-Gens durch ein Restriktionsfragment, das nur ein modifiziertes, homologes Gen enthält, an, oder sie bedienen sich eines zweistufigen Verfahrens unter Verwendung eines zirkulären Plasmids. Der "einstufige" Genaustausch erfordert das Auftreten von zwei Crossingover-Ereignissen bei einem einzigen Genaustausch (vergl. Fig. 7). In einem zweistufigen Verfahren handelt es sich bei der ersten Stufe um ein einzelnes Integrationsereignis, wonach sich eine Rekombination anschließt, die die integrierte Genkopie zurückläßt und das native Gen entfernt (zweite Stufe). Das Auftreten der zweiten Stufe wird durch Absuchen auf den Phänotyp der integrierten Genkopie selektiert.

Es ist bekannt, daß es sich beim natürlichen Expressionsgrad von zahlreichen Genen im Aminosäure-Stoffwechsel, z. B. TrpC und ArgB, nur um einen mäßigen Grad handelt. Die durch diese Gene kodierten Enzyme bilden nur eine sehr geringe Fraktion des gesamten Zellproteins. Jedoch sind diese Gene wesentlich, da ihr Verlust zur Auxotrophie und zur Notwendigkeit der Zufuhr des Metaboliten oder der Aminosäure zum Wachstumsmedium führt. Somit können sowohl diese Genaustauschvorgänge als auch der Genaustausch von analogen Genen leicht erreicht und Transformanten leicht isoliert werden. (Esser und Mohr, Process Biochemistry, (1986), S. 153- 159).

Für A. niger berichten Van Hartingsveldt et al. (a. a. O.) und Goosen et al. (a. a. O.) über ähnliche Ergebnisse für den pyrG-Locus. Das pyrG-Gen kodiert für ein Enzym des zu Uridin führenden Biosynthesewegs. In diesen Beispielen erfolgte der Genaustausch erneut in einem leicht selektierbaren Gen, d. h. dem Gen, das als Selektionsmarker bei der Transformation verwendet wurde.

Es ist darauf hinzuweisen, daß keines der erhaltenen Proteine, die in den vorstehenden Druckschriften beschrieben wurden, durch A. nidulans oder durch A. niger sezerniert wurden.

EP-A-244234 beschreibt die Inaktivierung des T. reesei-cbh1-Gens, das für ein aktiv sezerniertes Enzym kodiert. Die Inaktivierung wird durch Insertion eines Plasmids, das eine geschnittene Version der cbh1cDNA enthält, in das cbh1-Gen erreicht, jedoch ohne gleichzeitige Expression eines sekretorischen Gens im inaktivierten cbh1-Locus.

Es besteht daher ein Bedürfnis zur Bereitstellung von Genaustauschsystemen für genetische Loci, die aktiv exprimiert werden und für Proteine kodieren, die einen Großteil des gesamten Zellproteins bilden, so wie für genetische Loci, die für Proteine kodieren, die aktiv von der Zelle sezerniert werden.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Expressionssysteme für filamentöse Pilze werden bereitgestellt, indem man sekretorisch wirksame Wirte verwendet, die Kassetten aufweisen, die für eine homologe Rekombination an einem Locus an einer Sequenz, die für ein in starkem Maße exprimiertes und sezerniertes Protein kodiert, konzipiert sind.

Zweckmäßigerweise kann eine Integration ein Markerprotein umfassen, wobei die Expressionskassette durch die 5'- und 3'-nicht-kodierenden Regionen des Zielgens begrenzt ist. Die Transformante sorgt für eine hochgradige Expression und eine wirksame Sekretion. Gegebenenfalls wird ein Protease-Inhibitor im Nährmedium gehalten, um eine Proteolyse des gewünschten Produkts zu verhindern.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die zur Isolierung des A. niger-Glucoamylase (AG)-Gens verwendeten Oligonucleotide;

Fig. 2 ist eine Karte des A. niger-Glucoamylase (AG)-Gens, von Subklonen, die konstruiert worden sind, und einer in den Experimenten verwendeten Hybridisierungssonde;

Fig. 3 stellt die Konstruktion von pAB64-40 dar;

Fig. 4 ist eine schematische Darstellung von pAN76-1;

Fig. 5 ist eine schematische Darstellung von mAB64-0;

Fig. 6 zeigt schematische Darstellungen von pAB64-72, pAB64-73 und pAB64-75; und

Fig. 7 ist eine schematische Darstellung des Genaustausches am Glucoamylase-Locus.

Beschreibung der speziellen Ausführungsformen

Es werden wirksame Expressionssysteme unter Verwendung von filamentösen Pilzen bereitgestellt. Diese Systeme bedienen sich sekretorischer Wirte für die Integration von Expressionskonstrukten. Die Expressionskonstrukte umfassen das in Frage stehende Gen und sind für eine homologe Rekombination durch 5'- und 3'-nicht-kodierende Regionen des Ziellocus begrenzt, um eine Integration zu erzielen. Der Ziellocus umfaßt ein Gen, das für ein sekretorisches Protein kodiert. Wachstum und Induktion des transformanten Wirtes führen zu einer wirksamen Expression und Sekretion des gewünschten Produkts sowie zu einer einfachen Isolierung, und zwar in Anbetracht der Abwesenheit des Expressionsprodukts des Ziellocus im Nährmedium.

Bei den in Frage stehenden Wirten handelt es sich um filamentöse Pilze, die wirksame Sekretionsgrade ihrer endogenen Proteine aufweisen. Für eine großtechnische Herstellung geeignete Stämme von Aspergillus, insbesondere niger, awamori oder oryzae, sind von besonderem Interesse. Alternativ können Trichoderma reesei, M. miehei und Aspergilli, wie A. ficuum, verwendet werden.

Das Expressionskonstrukt umfaßt das in Frage stehende Gen und weist üblicherweise eine Signalsequenz auf, die im Wirt funktionsfähig ist und für die Sekretion des Expressionsprodukts sorgt. Für den Großteil der homologen Rekombination ist die Signalsequenz homolog oder im wesentlichen homolog zur Signalsequenz des Gens am Ziellocus. Jedoch können Signalsequenzen so konzipiert werden, daß sie für eine Sekretion sorgen; vergl. beispielsweise Von Heijne, Eur. J. Biochem., Bd. 133 (1983), S. 17-21; und Perlman und Halvorson, J. Mol. Biol., Bd. 167 (1983), S. 391- 409. Das Expressionsprodukt oder das Gen von Interesse können zum Wirt homolog oder heterolog sein. Unter "homolog" ist ein Protein zu verstehen, das für den Wildtypwirt nativ ist, während "heterolog" ein Protein bedeutet, das für den Wirt fremd ist und Mutanten umfaßt, die in der Natur nicht auftreten.

Das in Frage stehende Gen kann je nach Zweckmäßigkeit seine eigene Signalsequenz aufweisen oder mit einer Signalsequenz des Wirtes oder einer synthetischen Signalsequenz verknüpft sein. Die gewählte spezielle Signalsequenz kann je nach dem in Frage stehenden Gen und dem Ziellocus variieren. Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Signalsequenz des Ziellocus, die für eine zusätzliche Homologieregion für die Integration an dieser Stelle sorgt und von der bekannt ist, daß sie eine wirksame Sekretion ermöglicht. Die für die Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz kann direkt über die für das Prozessierungssignal kodierende Sequenz (Spaltungserkennungsstelle) mit der für das reife Protein kodierenden Sequenz oder über eine kurze Brücke, üblicherweise weniger als 10 Codons, verknüpft sein.

Die Region in 5'-Stellung zum offenen Leseraster für das in Frage stehende Gen umfaßt die transkriptionale Initiationsregulationsregion. Es kann eine beliebige Region, die im Wirt funktionsfähig ist, verwendet werden. Jedoch ist in den meisten Fällen die verwendete Region homolog zu der Region des Ziellocus. Dies hat die Wirkung eines Ersatzes des Expres sionsprodukts des Ziellocus durch das in Frage stehende Expressionsprodukt. In dem Ausmaß, wie der Grad der Expression und der Sekretion des endogenen Proteins eine wirksame Produktion ermöglicht, erweist sich diese transkriptionale Initiationsregulationsregion normalerweise als zufriedenstellend. In einigen Fällen kann jedoch ein höherer Grad der Transkription als beim Wildtypgen oder die Erzielung einer induzierbaren Expression unter Verwendung eines speziellen Induktionsmittels erwünscht sein. In diesen Fällen wird eine transkriptionale Initiationsregulationsregion verwendet, die sich von der Region am Ziellocus unterscheidet. Eine große Anzahl von transkriptionalen Initiationsregulationsregionen, die in filamentösen Pilzen funktionsfähig sind, ist bekannt. Diese Regionen umfassen die Gene, die für Glucoamylase, Pilzamylase, saure Phosphatase, GAPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AldA, Histon-H2A, Pyr4, PyrG, Isopenicillin N-synthetase, PGK, saure Protease, Acyltransferase und dergl. kodieren.

Der Ziellocus kodiert vorzugsweise für ein stark exprimiertes Proteingen, d. h. ein Gen, dessen Expressionsprodukt am Ende des Fermentationsvorgangs in einer Konzentration von mindestens etwa 0,1 g/Liter sezerniert ist. Die Dauer dieses Vorgangs hängt unter anderem vom gewünschten Proteinprodukt ab. Als ein Beispiel für ein derartiges Gen dient das für Glucoamylase (AG) kodierende Gen. Zu weiteren Genen von Interesse gehören Pilz-α-Amylase, saure Phosphatase, Protease, saure Protease, Lipase, Phytase und Cellobiohydrolase.

Bei dem in Frage stehenden Gen kann es sich um ein beliebiges Gen handeln, das einem vorgesehenen Anwendungszweck dienen kann. Ausgewählte Proteine, die für Aspergillus heterolog sind, sind beispielsweise Chymosin, einschließlich seiner Vorläuferformen (wie Prochymosin, Preprochymosin und Pseudochymosin), Interleukine, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor VIII oder IX, Phospholipasen, Lipasen und zellwandabbauende Enzyme (Enzyme, die zur Spaltung von in pflanzlichen Zellwänden vorhandenen Polysacchariden befähigt sind). Beispiele für Proteine, die zu Aspergillus homolog sind, sind Phytasen, Phosphatasen, Xylanasen, β-Galactosidasen, Rennine, Glucose-oxidasen und Amylasen.

Die transkriptionale Terminationsregulationsregion kann aus dem in Frage stehenden Gen, dem Ziellocus oder einer anderen geeigneten Sequenz stammen. Sofern das Konstrukt ferner Sequenzen von Interesse umfaßt, die in Transkriptionsrichtung stromabwärts von dem in Frage stehenden Gen liegen, sollte die transkriptionale Terminationsregulationsregion, wenn sie zum Ziellocus homolog ist, wesentlich kleiner als die homologe Flankierungsregion sein.

Ein Selektionsmarker wird normalerweise verwendet, der ein Bestandteil des Expressionskonstrukts sein kann oder getrennt vom Expressionskonstrukt vorliegt, so daß er an einer Stelle, die sich vom in Frage stehenden Gen unterscheidet, integriert werden kann. Da die erfindungsgemäßen rekombinanten Moleküle vorzugsweise in einen Wirtstamm transformiert werden, der für die großtechnische Herstellung verwendet werden kann, handelt es sich bei den Selektionsmarkern zur Überwachung der Transformation vorzugsweise um dominante Selektionsmarker, d. h. es müssen keine Mutationen in den Wirtsstamm eingeführt werden, um diese Selektionsmarker verwenden zu können. Beispiele hierfür sind Marker, die den Transformanten ein Wachstum auf definierten Nährstoffquellen ermöglichen (z. H. das A. nidulans-amdS-Gen, das A. niger-Transformanten ein Wachstum auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle ermöglicht), oder Marker, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen (z. B. verleiht das ble-Gen eine Resistenz gegenüber Phleomycin oder das hph-Gen eine Resistenz gegenüber Hygromycin B).

Das Selektionsgen weist seine eigenen transkriptionalen und translationalen Initiations- und Terminationsregulationsregionen auf, die eine unabhängige Expression des Markers ermöglichen. Eine große Anzahl von transkriptionalen Initiationsregulationsregionen ist, wie vorstehend beschrieben, bekannt und kann in Verbindung mit dem Markergen verwendet werden. Sofern eine antibiotische Resistenz verwendet wird, hängt die Konzentration des Antibiotikums für die Selektion vom Antibiotikum ab und beträgt im allgemeinen etwa 30 bis 300 ug/ml Antibiotikum.

Die verschiedenen Sequenzen können nach bekannten Techniken verknüpft werden, z. H. durch Restriktion, Verknüpfung von komplementären Restriktionsstellen und Ligation, Stumpfendigmachen durch Auffüllen von überhängenden Bereichen und stumpfendige Ligation, Bal31-Resektion, Primerreparatur, in vitro-Mutagenese oder dergl. Polylinker und Adapter können je nach Zweckmäßigkeit verwendet werden und nach bekannten Techniken eingeführt oder entfernt werden, um einen einfachen Zusammenbau des Expressionskonstrukts zu ermöglichen. Bei jeder Synthesestufe des Konstrukts kann das Fragment einer Klonierung, einer Analyse durch Restriktionsenzymverdau, Sequenzierung oder Hybridisierung oder dergl. unterzogen werden. Eine große Anzahl von Vektoren ist für die Klonierung verfüg bar. Die spezielle Wahl ist für die Erfindung nicht kritisch. Normalerweise erfolgt die Klonierung in E. coli.

Die Flankierungsregionen können mindestens einen Teil des offenen Leserasters des Ziellocus umfassen, insbesondere die Signalsequenz und die Regulationsregionen in 5'- und 3'-Stellung des Gens des Ziellocus oder sie können sich über diese Regulationsregionen hinaus erstrecken. Die Proteine der Flankierungsregion, die den offenen Leseraster umfassen, werden normalerweise nicht durch ein intaktes Gen, das zur Expression eines funktionsfähigen Produkts befähigt ist, kodiert. Normalerweise umfaßt eine Flankierungsregion mindestens 100 bp und im allgemeinen mindestens 200 bp und kann bis zu 500 bp oder mehr gehen. Die Flankierungsregionen werden so gewählt, daß sie das Zielgen unterbrechen und dessen Expression verhindern. Dies kann durch Insertion der Expressionskassette in den offenen Leseraster in proximaler Stellung zur 5'-Region erreicht werden, indem man die Gesamtheit oder einen Teil des Zielgens durch das Expressionskonstrukt ersetzt oder indem man dafür sorgt, daß das Expressionskonstrukt zwischen die transkriptionale Initiationsregulationsregion am Ziellocus und den offenen Leseraster eingeschoben wird. Wie bereits erwähnt, sollte dann, wenn die Terminationsregulationsregion homolog zur Region am Ziellocus ist, die 3'-flankierende Region wesentlich größer als die im Konstrukt vorhandene Terminationsregulationsregion sein.

Das Konstrukt kann je nach Wunsch in den Wirt als Klonierungsvektor, entweder in linearer oder zirkulärer Form, transformiert oder aus dem Klonierungsvektor entfernt werden. Das Plasmid wird üblicherweise innerhalb von etwa 1 kbp vom Ende des Expressionskonstrukts linearisiert. Für die Transformation von filamentösen Pilzen stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Protoplastenfusion oder - transformation, die Elektroporation und das Beschießen der Zellen mit Mikroprojektilen. Eine Protoplastentransformation hat sich als erfolgreich erwiesen und kann vorteilhafterweise eingesetzt werden. Zunächst wird das Myzel des in Frage stehenden Pilzstammes durch enzymatischen Verdau der Zellwand in Gegenwart eines osmotischen Stabilisators, wie KCl oder Sorbit, in Protoplasten umgewandelt. Eine DNA-Aufnahme durch die Protoplasten wird durch die Zugabe von CaCl&sub2; und einer konzentrierten Lösung von Polyethylenglykol unterstützt. Die letztgenannte Substanz bewirkt eine Aggregation der Protoplasten, wobei durch dieses Verfahren die transformierende DNA in den Aggregaten eingeschlossen und durch die Protoplasten aufgenommen wird. Man läßt die Protoplasten anschließend auf einem festen Medium, das einen osmotischen Stabilisator und gegebenenfalls ein selektives Mittel, für das eine Resistenz durch die transformierende DNA kodiert wird, enthält, regenerieren.

Nach Selektion auf Transformanten kann das Vorliegen des in Frage stehenden Gens auf verschiedenen Wegen bestimmt werden. Durch Verwendung von Antikörpern, deren Expressionsprodukt zum Wirt heterolog ist, kann man das Vorliegen der Expression des in Frage stehenden Gens nachweisen. Alternativ kann man Southern- oder Northern-Blots anwenden, um die Anwesenheit des integrierten Gens oder von dessen Transkriptionsprodukt nachzuweisen.

Die Zellen können sodann in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden. Geringe Konzentrationen eines Protease-Inhibitors, wie Phenylmethylsulfonylfluorid, α2-Macroglobuline, Pepstatin oder dergl., können verwendet werden. Üblicherweise liegt deren Konzentration im Bereich von etwa 1 ug/ml bis 1 mg/ml. Das oder die Proteasegene können inaktiviert werden, um einen Abbau des gewünschten Proteins zu vermeiden oder zu verringern.

Zielloci, die in vorteilhafter Weise verwendet werden können, sind das Glucoamylase-Gen von A. niger oder von A. awamori, das Pilz-Amylase- Gen von A. oryzae, die Cellobiohydrolase-Gene von T. reesei oder das saure Protease-Gen von Mucor miehei.

Die Transformanten können in absatzweiser oder kontinuierlich arbeitenden Reaktoren gezüchtet werden, wobei das Nährmedium isoliert und das gewünschte Produkt extrahiert wird. Gegebenenfalls können verschiedene Verfahren zur Reinigung des Produkts verwendet werden, beispielsweise eine Chromatographie, z. B. HPLC oder eine präparative Dünnschichtchromatographie, eine Lösungsmittel-Lösungsmittel-Extraktion, eine Elektrophorese, Kombinationen davon oder dergl.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und stellen keinesfalls eine Beschränkung dar.

Experimenteller Teil Beispiel 1 Konstruktion von verschiedenen Expressionskassetten A. Methodik

Sämtliche Konstrukte wurden unter Anwendung standardmäßiger molekularbiologischer Verfahrensweisen, wie sie beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), N. Y., beschrieben sind, hergestellt.

Plasmide pAB6-1, pAB6-2A, pAB6-3 und pAB6-4

Das Glucoamylase-Gen von A. niger wurde aus Plasmidbanken, die 3-4 kb EcoRI-Fragmente oder 13-15 kb HindIII-Fragmente in pUC19 (Yanisch- Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119, erhältlich beispielsweise von Boehringer Mannheim, Deutschland) enthielten, unter Verwendung von Oligonucleotidsonden (Fig. 1) auf der Basis der für A. niger veröffentlichten Nucleotidsequenz (Boel et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1097- 1102; Boel et al., Mol. and Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 2306-2315) isoliert. Die Oligonucleotidsonden wurden von der das Intron 2 umgebenden Sequenz abgeleitet. Das 42-mere befindet sich in 3'-Position zum Intron und weist eine mit der Ag-mRNA identische Polarität auf. Das 24-mere findet sich stromaufwärts vom Intron 2 und wird antiparallel zur mRNA gewählt. Das Plasmid pAB6-1 enthält das AG-Gen an einem 14,5 kb HindIII- Fragment. Im Plasmid pAB6-2A ist das gesamte AG-Gen an einem 3,4 kb- EcoRI-Fragment vorhanden. Das Plasmid pAB6-3 enthält das 1,8 kb EcoRI- Fragment, das unmittelbar stromaufwärts vom AG-Gen vorhanden ist. Dieses Fragment enthält vermutlich regulatorische Sequenzen und wurde aus pAB6-1 subkloniert. Das Plasmid pAB6-4, ein weiterer Subklon von pAB6-1, enthält ein 4,6 kb HindIII-BglII-Fragment, das die Region stromaufwärts vom AG- Gen und einen Teil des 5'-Endes des Gens umfaßt (vergl. die Karte in Fig. 2). Sämtliche Fragmente wurden in pUC19 kloniert.

Plasmid pAB64-40

Das Plasmid pAB6-2A (Fig. 2) wurde mit AccI und T4-Polymerase behandelt, um AccI-Fragmente mit stumpfen Enden zu erzeugen. Das 1,2 kb-Fragment, das die 3'-flankierenden Sequenzen des AG-Gens einschließlich des Terminators enthält, wurde isoliert. Das Plasmid pUR1524, das Rinder-Chymosin-cDNA enthält (vergl. EP-A-077109) wurde partiell mit SalI und EcoRI verdaut. Das die Chymosin-cDNA enthaltende Fragment wurde isoliert. Klebrige Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt. Das stumpfendige Fragment wurde mit SalI-Linkern ligiert. Das Fragment wurde mit SalI plus HindIII verdaut und in pPA153-209 (Van Putten et al., J. Bacteriol., Bd. 168 (1986), S. 728-733), das mit SalI und HindIII verdaut worden war, ligiert. Das erhaltene Konstrukt, pRCH4, wurde mit BclI geschnitten und mit T4-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen. Anschließend wurde das AccI-Fragment, das den AG-Terminator enthielt, in diese Stelle ligiert, wodurch man pAB64-10 erhielt. In diesem Konstrukt ist die aufgefüllte BclI-Stelle in 3'-Position zum Chymosin-Gen wiederhergestellt.

Anschließend wurde das Plasmid pAB6-3 (Fig. 2) partiell mit EcoRI verdaut und mit T4-Polymerase behandelt. In diesen Vektor wurde das HindIII-plus-EcoRI-Fragment des Plasmids pAB6-4 ligiert, erneut nach Behandlung mit T4-Ppolymerase. Das erhaltene Konstrukt ist pAB6-31. Dieses Konstrukt enthält ein 3,6 kb-stromaufwärtiges Fragment des AG-Gens mit einer zerstörten EcoRI-Stelle in der Mitte und eine einzige EcoRI-Stelle nahe zum AG-Gen. In diese einzige EcoRI-Stelle wurde ein mit EcoRI partiell verdautes Fragment aus pAB64-10, das die Chymosin-cDNA plus den AG-Terminator enthielt, ligiert. Das erhaltene Konstrukt ist pAB64-20. Die zwischen dem Terminator und dem Vektor vorhandene EcoRI-Stelle wurde durch partiellen Verdau mit EcoRI zerstört, wonach sich eine Behandlung mit T4-Polymerase und eine Ligation anschloß. Das neue Konstrukt ist pAB64-40. Dieses Konstrukt enthält wieder eine einzige EcoRI-Stelle, die nunmehr an der Verbindung der AG-stromaufwärtigen Sequenzen mit der Chymosin-cDNA vorhanden ist (Fig. 3)

Plasmid pAN76-1

Das Plasmid pAN7-1 (Punt et al., Gene, Bd. 56 (1987), S. 117-124) wurde mit Hindill verdaut. In diese Stelle wurde das SalI-plus-HindIII- Fragment aus pAB-6-1 (Fig. 2), das in 3'-Position vom AG-Gen vorliegt, ligiert, nachdem die SalI-Stelle mit T4-Polymerase gefüllt war. Aus diesem Konstrukt wurde pAN76-1 (Fig. 4), das HygB-Gen plus das 3'-flankierende AG-Fragment als ein StuI-plus-HindIII-Fragment isoliert.

Phagen-mAB64-0

Das kleine EcoRI-plus-NruI-Fragment aus dem Plasmid pAB6-2A mit einem Gehalt an dem AG-Promotor und regulatorischen Sequenzen wurde isoliert und in Phagen-M13mp11 (Messing und Vieira, Gene, Bd. 19 (1982), S. 269-276, erhältlich beispielsweise von der Fa. Pharmacia Inc. Schweden), das mit EcoRI- und BamHI verdaut war, zusammen mit dem SalI plus-BclI- Fragment des Plasmids pRCH4, das Rinder-Chymosin-cDNA enthielt und an der SalI-Stelle mit T4-Polymerase behandelt war, ligiert. Das erhaltene Konstrukt, nämlich Phagen-mAB64-O, enthält eine Proteinfusion zwischen AG und Preprochymosin (Fig. 5). Dieses Konstrukt wurde einer in vitro-Mutagenese unterworfen.

B. Spezielle Expressionskassetten

Drei Expressionskassetten für Rinder-Chymosin wurden aus mAB-64-0 konstruiert, die jeweils eine unterschiedliche Fusionsstelle zwischen der AG-Regulationsregion und der Rinder-Chymosin-cDNA enthielten.

Zu diesem Zweck wurden die folgenden drei Oligonucleotide konstruiert:

#1 : 5'- AT TAC ACC TCA GCA ATG AGG TGT CTC GTG GTG 3'

#2 : 5'-TGC ACA GGG TTG GCA GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CT 3'

#3 : 5'-ACG GAT AAC CCG GAC GCT GAG ATC ACC AGG 3'

Diese Oligonucleotide wurden zur Verknüpfung des AG-Promotors mit Preprochymosin (#1) oder des AG-Promotors und des Signalpeptids mit Prochymosin (#2) verwendet. Unter Verwendung von Oligo-#3 wird eine Proteinfusion zwischen der Aminosäure 71 des reifen AG-Gens und Prochymosin hergestellt.

Die Identität der Konstrukte wurde durch Sequenzanalyse von ssDNA der erhaltenen Konstrukte (mAB64-2, mAB64-3 und mAB64-5) bestätigt. Aus diesen Konstrukten wurden die EcoRI-Fragmente mit einem Gehalt an den gewünschten Genfusionen isoliert und in pAB64-40 inseriert, wodurch man pAB64-42, pAB64-43 bzw. pAB64-45 erhielt. In diese Plasmide pAB64-42, pAB64-43 und pAB64-45 wurde ein aus pAN76-1 isoliertes StuI-plus-HindIII- Fragment inseriert, wobei dieses Fragment das HygB-Gen plus ein 3'-flankierendes Element des AG-Gens enthielt. Bei den endgültigen Konstrukten handelte es sich um pAB64-72, pAB64-73 und pAB64-75. Diese Konstrukte enthalten eine einzige HindIII-Stelle in 3'-Position zur Expressionskassette und eine 3'-flankierende Region (Fig. 6).

Beispiel 2 Transformation von Aspergillus niger zur Herbeiführung eines Genaustausches

Die erfindungsgemäße Transformation von A. niger wurde unter Anwendung der von Van Hartingsveldt et al. (a. a. O.) und Yelton et al. (a. a. O.) beschriebenen Techniken durchgeführt.

A. niger DS 2975 (eine Probe dieses Stammes wurde bei CBS am 10. August 1988 unter der Hinterlegungsnummer 513.88 hinterlegt) wurde 24 Stunden oder gegebenenfalls länger bei 34ºC gezüchtet. Das Myzel wurde mittels Filtration durch steriles Nylongewebe geerntet und mit 0,6 M MgSO&sub4; (maximal 12,5 ml pro 100 ml Kultur) gewaschen. Anschließend wurde das Myzel in ein steriles Röhrchen übertragen, gewogen und in 5 ml osmotischem Medium (1,2 M MgSO&sub4;, gepuffert mit 10 mM Phosphat, pH-Wert 5,8) pro Gramm Feuchtgewicht resuspendiert. Nach Zugabe von Novozym 234 (NOVO, Dänemark; 20 mg/ml in osmotischem Medium) in einer Menge von 1 ml pro Gramm Feuchtgewicht und BSA (Sigma, Niederlande; 12 mg/ml in osmotischem Medium) in einer Menge von 0,5 ml pro Gramm Feuchtgewicht erfolgte eine Bildung von Protoplasten unter mäßigem Schütteln (50 U/min) bei 25-27ºC. Die Protoplastenbildung wurde in regelmäßigen Abständen durch mikroskopische Betrachtung überwacht. Nachdem die Protoplastenbildung vollständig war, wurden 15 ml der Protoplastenlösung auf ein 30 ml fassendes, steriles Corex-Röhrchen übertragen. Die Protoplastensuspension wurde sodann vorsichtig mit 10 ml Abfangpuffer (0,6 M Sorbit, 100 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,0) überschichtet. Die Röhrchen wurden 15 Minuten bei 5000 U/min und 4ºC in einem Schwingrotor zentrifugiert. Protoplasten wurden sorgfältig aus der Zwischenphase mit einer sterilen Pasteur-Pipette mit weiter Öffnung zur Vermeidung einer Schereinwirkung auf die Protoplasten gewonnen. Die Phasentrennung wurde wiederholt, wenn nach Zentrifugation ein großes Pellet sichtbar war. In diesem Fall wurde das Pellet sorgfältig in osmotischem Medium resuspendiert, erneut mit Abfangpuffer überschichtet und nochmals zentrifugiert. Protoplasten wurden gewonnen und sorgfältig durch Resuspendieren in kaltem STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 50 mM CaCl&sub2;) und 10-minütiges Zentrifugieren bei 3000 U/min und 4ºC gewaschen. Der Waschvorgang wurde wiederholt, bis ein Protoplastenpräparat, das frei von verunreinigenden Teilchen war, erhalten wurde. Das Protoplastenpellet wurde in kaltem STC mit einer Endkonzentration von 1 · 10&sup8; Protoplasten (pps)/ml resuspendiert.

Die Protoplasten wurden entweder sofort verwendet oder über Nacht bei 4ºC aufbewahrt. Im Fall einer Aufbewahrung wurden die Protoplasten am nächsten Tag erneut in kaltem STC gewaschen.

Für die Transformation wurden 10&sup7; Protoplasten zu 10 ug DNA in 25 ul STC oder in 10 ul TE (TE enthält 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) gegeben. Zur Erzielung eines Genaustausches wurden die Plasmidkonstrukte pAB64-72, pAB64-73 und pAB64-75 linearisiert, indem man sie an der einzigen HindIII-Restriktionsstelle schnitt, die in sämtlichen drei Konstrukten unmittelbar stromabwärts vom Selektionsmarker und der 3'-flankierenden Region des AG-Gens (Fig. 6) vorhanden ist.

Das Gemisch aus Protoplasten und DNA wurde 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine PEG-Lösung (60% Polyethylenglykol 4000, Brocacef(BDH, 10 mM Tris/HCl, pH-Wert 5,7, 50 mM CaCl&sub2;) in Portionen von 200 ul, 200 ul und 850 ul zugegeben. Das Gemisch wurde nach Zugabe der einzelnen PEG-Portionen sorgfältig homogenisiert und nach Zugabe der letzten PEG-Portion 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gelegentlich trat eine Ausfällung von großen Plasmiden (> 18 kb) auf. Dies wurde verhindert, indem man die 60%ige PEG-Lösung durch eine 25%ige PEG- Lösung ersetzte.

Die transformierten Protoplasten wurden mit 10-15 ml kaltem STC durch mäßiges Vermischen und 10-minütiges Zentrifugieren bei 5000 U/min und 4ºC gewaschen. Sodann wurden die Protoplasten in 100 ul STC resuspendiert und sorgfältig auf selektiven Platten, die 200 ug/ml Hygromycin B (Sigma H 2638) enthielten, ausgestrichen. Hygromycin-resistente Kolonien wurden einer weiteren Analyse unterzogen, wobei man von einzelnen isolierten Sporen ausging.

Beispiel 3 Nachweis des Genaustausches A. Southern-Blotting

Um festzustellen, ob in den Transformanten tatsächlich ein Genaustausch stattgefunden hatte, wurde die Southern-Blotting-Technik dazu herangezogen, die Abwesenheit von für Glucoamylase spezifischer DNA in den Transformanten nachzuweisen. Ein DNA-Fragment, das zum Glucoamylase-Gen homolog ist, wurde radioaktiv gemacht und mit DNA der Transformanten nach Abtrennung der DNA durch Elektrophorese und Fixierung der chromosomalen DNA an einer Nylon-Membran hybridisiert. Es konnten sehr geringe Mengen an homologer DNA mit diesem Verfahren nachgewiesen werden. DNA wurde aus mehreren Transformanten der einzelnen drei Konstrukte, die für die Transformation verwendet wurden, isoliert. DNA wurde nach Mahlen des Myzels in flüssigem Stickstoff unter Anwendung standardmäßiger Verfahren isoliert. Genomische DNA wurde mit EcoRI verdaut, durch Elektrophorese abgetrennt und auf Gene Screen PlusR-Nylon-Membran (Dupont, USA) geblottet. Zunächst wurden die Blots mit einer radioaktiven AG-spezifischen Sonde hybridisiert: das AG-interne BamHI-plus-BgIII-Fragment (Fig. 2). Transformanten, die unter Verwendung dieser Sonde kein Hybridisierungssignal zeigten (ein 3,4 kb-EcoRI-Fragment wird erwartet, wenn das AG-Gen noch in den Transformanten enthalten ist) wurden einem Screening mit anderen Sonden unterzogen, um das Auftreten des Genaustausches zu bestätigen. Zu diesem Zweck wurden EcoRI-Verdauungsprodukte sowohl mit radioaktivem pAB64-75 (zur Bestätigung der Anwesenheit sämtlicher wesentlicher, plasmidabgeleiteter Fragmente) als auch mit radioaktivem pUC19 (zur Bestätigung der Abwesenheit von bakterieller DNA) hybridisiert. Die Ergebnisse dieser Experimente ergaben die Anwesenheit sämtlicher erwarteter plasmidabgeleiteter Fragmente, einschließlich Rinder-Chymosin-cDNA, und die Abwesenheit von bakterieller DNA in 7 der zunächst analysierten 36 Transformanten. Sämt liche ausgewählten Transformanten enthalten eine einzige Chymosin-Expressionskassette.

B. Western-Blotting

Die Abwesenheit eines selektierten Gens im Genom eines Organismus kann auf verschiedenen Wegen festgestellt werden. Eine Southern-Blot-Hybridisierung gemäß den Angaben im vorstehenden Abschnitt A stellt eine wirksame Maßnahme zur Bestätigung der Abwesenheit von genetischem Material, das zu der verwendeten Sonde homolog ist, dar. Eine andere Möglichkeit zur Bestätigung der Abwesenheit eines bestimmten Gens besteht in der Bestätigung der Abwesenheit des Produkts des in Frage stehenden Gens, in diesem Fall des Glucoamylase-Gens. Eine sehr empfindliche Technik zum Nachweis der Anwesenheit oder der Abwesenheit eines Proteins in einem Präparat stellt das Western-Blotting dar. Bei dieser Technik werden spezifische Antikörper, die gegen das in Frage stehende Protein erzeugt worden sind, verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit dieses spezifischen Proteins nachzuweisen. Diese Antikörper binden an das Protein, das auf einer Nitrocellulose-Membran fixiert worden ist. Anschließend wird ein zweites Antikörperpräparat, das gegen das erste Antikörperpräparat erzeugt worden ist, verwendet. Dieses zweite Antikörperpräparat ist mit einem Enzym konjugiert, das zur Verarbeitung eines farblosen Substrats unter Bildung eines gefärbten Produkts befähigt ist. Eine gefärbte Bande erscheint an den Flecken, wo immunogenes Material vorhanden ist, das mit dem ersten Antikörperpräparat reagieren kann.

Die aufgrund der Southern-Blotting-Ergebnisse ausgewählten Transformanten, bei denen das AG-Gen durch das Rinder-Chymosin-Gen ausgetauscht worden war, wurden in Anwesenheit von Stärke gezüchtet, um die AG-Regulationsregion zu induzieren. Die Fermentationsüberstände wurden durch Western-Blotting analysiert und mit einem Fermentationsüberstand des Wirtstammes verglichen. 20 ul eines jeden Überstands wurden auf 7,5% Polyacrylamid-SDS-Gel geschichtet. Die Proteinbanden wurden durch Elektrophorese aufgetrennt. Das Gel wurde elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran unter Anwendung standardmäßiger Verfahrensweisen geblottet. Die Nitrocellulose-Membran wurde nach mehreren Waschstufen mit einem polyklonalen Antiserum gegen Glucoamylase, das aus einem handelsüblichen Präparat unter Reinigung durch HPLC-Säulenchromatographie hergestellt worden war, inkubiert. Die Behandlung der Membran mit dem zweiten Antikörper-Konjugat-Präparat ergab keine gefärbten Banden in den Transformantenpräparaten, während im Wirtspräparat eine Bande, die etwa die Größe von Glucoamylase aufwies, vorhanden war. Dieses Experiment belegt, daß in den ausgewählten Transformanten kein Material synthetisiert wird, das mit dem anti-AG-Serum reagieren kann. Daraus wird geschlossen, daß das AG-Gen durch das Rinder-Chymosin-Gen ersetzt worden ist.

C. Einfluß des Genaustausches auf die Menge des sezernierten Proteins

Glucoamylase stellt einen wesentlichen Bestandteil der Menge des Gesamtproteins dar, das durch A. niger sezerniert wird (vgl. Cullen et al., a. a. O.). Daher kann der Austausch des Glucoamylase-Gens durch ein anderes Protein-Gen die Menge des durch A. niger-Transformanten sezernierten Proteins beeinflussen. Eine Abnahme des Proteingehalts der Fermentationsbrühe kann die Reinigung von anderen sezernierten Proteinen erleichtern. Wenn außerdem die Kapazität des sekretorischen Weges begrenzt ist, eröffnet die Entfernung von Glucoamylase aus der Zelle den sekretorischen Weg für andere Proteine.

Zur Untersuchung des Einflusses des Genaustausches auf die Menge an sezerniertem Protein wurde der Proteingehalt der Fermentationsüberstände durch standardmäßige Verfahren bestimmt und mit den Daten des Wirtes verglichen. In Tabelle 1 sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt.

Tabelle 1 Proteingehalt von Fermentationsbrühen (vergl. Beispiel 4)

Stamm Proteinkonzentration (mg/ml)

A. niger DS 2975 0,143

A. niger DS 2975 + pAB64-72 0,096

A. niger DS 2975 + pAB64-73 0,082

A. niger DS 2975 + pAB64-75 0,076

Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse stimmen mit der Abwesenheit des stark exprimierten Glucoamylase-Gens in den analysierten Transformanten überein.

Beispiel 4 Expression und Sekretion von Rinder-Chymosin durch A. niger unter Verwendung des Chymosin- und AG-Signalpeptids

A. niger wurde mit linearisiertem pAB64-72 und pAB64-73 gemäß Beispiel 2 transformiert. Das Auftreten des Genaustausches in den Transformanten wurde gemäß Beispiel 3 festgestellt. Ausgewählte Transformanten wurden in bezug auf die Bildung und Sekretion von Chymosin, ausgehend von einzelnen Sporenisolaten, analysiert. Chymosin wird normalerweise als Zymogen sezerniert: das sezernierte Enzym ist aufgrund der Anwesenheit eines kurzen N-terminalen Peptids (Prochymosin) inaktiv. Dieses Zymogen wird durch Entfernung des kurzkettigen N-terminalen Peptids aktiviert, z. B. durch enzymatische Spaltung oder im Fall von Chymosin durch Inkubation bei einem niederen pH-Wert. Daher wird zur genauen Messung der Aktivität des sezernierten Chymosins das gesamte sezernierte Prochymosin durch eine Behandlung bei einem niederen pH-Wert in die aktive Form umgewandelt.

A. Fermentierung von Transformanten von A. niger mit einem Genaustausch des AG-Gens

Etwa 10&sup7; Sporen ausgewählter Transformanten wurden in Schüttelkolben inokuliert, die 100 ml flüssiges Vorkulturmedium mit einem Gehalt an KH&sub2;PO&sub4; (1 g/Liter), Maltose (30 g/Liter), Hefeextrakt (5 g/Liter) hydrolysiertem Casein (10 g/Liter), MgSO&sub4;·7H&sub2;O (0,5 g/Liter) und Tween 80 (3 g/Liter) enthielten. Diese Kulturen wurden 48 Stunden bei 34ºC gezüchtet. Proben wurden zur Analyse auf Chymosin-Bildung und zur mRNA-Isolierung entnommen. 10 ml dieser Kultur wurden auf 100 ml Fermentationsmedium mit einem Gehalt an KH&sub2;PO&sub4; (1 g/Liter), Maisstärke (70 g/Liter), Hefeextrakt (12,5 g/Liter), hydrolysiertem Casein (25 g/Liter), K&sub2;SO&sub4; (2 g/Liter), MgSO&sub4;·7H&sub2;O (0,5 g/Liter), ZnCl&sub2; (0,03 g/Liter), CaCl&sub2; (0,02 g/Liter), MnSO&sub4;·4H&sub2;O (0,01 g/Liter) und FeSO&sub4; (0,3 g/Liter) überimpft. Diese Kulturen wurden 48 Stunden bei 34ºC inkubiert. Sodann wurden erneut Proben für die Analyse auf die Chymosin-Bildung und für die Isolierung von mRNA entnommen.

B. Bestimmung der mRNA-Konzentrationen in Myzelproben

Myzel wurde geerntet, mit destilliertem Wasser gewaschen und unter flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemahlen, wobei Mörser und Pistill frei von RNase waren. Das Pulver wurde in 2 ml/g Homogenisierungspuffer (4 M Guanidinisothiocyanat, 5 mM Na-citrat, pH-Wert 7,0, 0,1 M β-Mercaptoethanol, 0,5% (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sigma L-5125)) gelöst und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Der nach 15- minütiger Zentrifugation bei 5000 U/min erhaltene Überstand wurde mit 0,4 g/ml CsCl, das frei von RNase war, versetzt. Diese Lösung wurde sorgfältig auf ein 5,7 M CsCl-Kissen in 0,1 M EDTA geschichtet. Eine 17-stündige Zentrifugation bei 38 000 U/min und 20ºC wurde in einem Ti 42.1-Rotor durchgeführt. Das klare RNA-Pellet wurde in RNase-freiem Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA, 1% SDS) nach Entfernen der Guanidinisothiocyanat-Lösung gelöst. Nach Extraktion mit einem gleichen Volumen eines Chloroform/Butanol-Gemisches (4 : 1) wurde die RNA mit Na-Acetat und Ethanol ausgefällt und in RNase-freiem Wasser gelöst.

RNA-Proben wurden einer Elektrophorese unterzogen und auf Gene Screen PlusR unter Anwendung standardmäßiger Techniken geblottet. Die Blots wurden unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde, die sowohl zur AG- als auch zur Chymosin-mRNA homolog war, hybridisiert. Zu diesem Zweck wurde die Oligonucleotidsequenz aus dem AG-Leader, der sowohl in der AG-mRNA als auch in der Chymosin-AG-Fusions-mRNA vorhanden ist, ausgewählt. (In sämtlichen Konstrukten befindet sich die AG-Chymosin-Fusion an der Translationsstartstelle (pAB64-72) oder jenseits der Translationsstartstelle (pAB64-73 und -75). Somit enthalten sämtliche Transkripte den AG-Leader.)

Nach Züchtung des Myzels in stärkehaltigen Medien konnte eine Hybridisierung von RNA-Molekülen in sämtlichen Proben nachgewiesen werden. Die Ausbeuten waren für pAB64-73 am höchsten. Im Wirt wies die hybridisierende mRNA die für AG-mRNA erwartete Länge auf. Die hybridisierenden mRNAs in den Transformanten wiesen die für die verschiedenen Expressionskassetten erwartete Länge auf. Die mRNA-Konzentration für AG im Wirt entsprach der Chymosin-mRNA-Konzentration in pAB64-73-Transformanten, was darauf hinweist, daß das Hybridgen am AG-Locus in diesen Transformanten mit einem Wirkungsgrad transkribiert wird, der dem Wirkungsgrad des ursprünglichen AG-Gens entspricht.

C. Nachweis der Sekretion von Rinder-Chymosin durch A. niger

Proben von Fermentationsbrühen sowohl der Transformanten als auch des Wirtes wurden einer Elektrophorese in 12,5% Polyacrylamid-SDS-Gel unterworfen. Das Gel wurde anschließend nach standardmäßigen Verfahren auf Nitrocellulose geblottet. Ein gegen gereinigtes Chymosin erzeugter monoklonaler Antikörper wurde für den immunologischen Nachweis von Chymosin verwendet.

Als Kontrolle wurde auch gereinigtes Chymosin einer Elektrophorese unterworfen und im gleichen Experiment geblottet. Die Anwesenheit einer Bande der richtigen Länge in sämtlichen Transformantenproben, jedoch nicht in der Wirtsprobe zeigt die Expression und Sekretion von Rinder- Chymosin bei Verwendung jeder der beiden getesteten Konstrukte. Die höchste Chymosin-Ausbeute wurde unter Verwendung des Konstrukts pAB64-73 erzielt, wobei aber die Sekretion von Chymosin durch pAB64-72-Transformanten ebenfalls zeigt, daß das Chymosin-Signalpeptid in A. niger funktionsfähig ist.

Die Gerinnungsaktivitäten wurden durch standardmäßige Verfahren unter Verwendung von dehydratisiertem Magermilchpulver (DIFCO) als Substrat und unter Verwendung von Kälber-Rennin bekannter Wirkungsstärke als Standard bestimmt. Für pAB64-73 lagen die Ausbeuten zwischen 18 und 45 MCU/ml und für pAB64-72 zwischen 7 und 15 MCU/ml. (1 MCU ist die Menge an Chymosin, die innerhalb von 40 Minuten bei 35ºC die Gerinnung von 1 ml Milch verursacht).

Die Mengen an Chymosin, die in der Fermentationsbrühe erhalten wurden, betrugen bis zu 11,5 mg/Liter, was wesentlich über den für Transformanten von A. nidulans berichteten Werten liegt, die vermutlich eine größere Anzahl von Kopien von ähnlichen Chymosin-Expressionskassetten enthalten (0,5-2,5 mg/Liter: Cullen et al., (a. a. O.) und 0-7 mg/Liter EP-A- 0 215 594).

Beispiel 5 Expression und Sekretion eines AG-Prochymosin-Fusionsproteins aus A. niger

Linearisiertes pAB69-75 wurde in A. niger transformiert. Ausgewählte Transformanten wurden gemäß den Angaben in den vorstehenden Beispielen analysiert. Chymosin-spezifische mRNA wurde in den Transformanten nachgewiesen, wobei der Expressionsgrad zwischen pAB64-72 und pAB64-73 lag. Die Sekretion von Chymosin durch diese Transformanten wurde sowohl durch Western-Blotting als auch durch Gerinnungstests nachgewiesen. Die Aktivitäten lagen im Bereich von 17 bis 29 MCU/ml.

Beispiel 6 Regulierung der AG-Genexpression im Wirt und der Chymosin-Expression in Transformanten

Die Funktionalität des AG-Promotors wurde im Wirt und in den ausgewählten Transformanten getestet, indem man Myzel im Medium mit einem Gehalt an Xylose als einziger Kohlenstoffquelle züchtete. In diesem Fall wird der AG-Promotor nicht induziert (Nunberg et al., Mol. Cell Biol., Bd. 4 (1984), S. 2306-2315), und eine Expression wird weder vom AG-Gen noch vom Rinder-Chymosin-Gen, das unter die Kontrolle des AG-Promotors gestellt wird, erwartet. Anschließend wurde das Myzel auf stärkehaltiges Medium überimpft, worin bekanntlich eine Induktion des AG-Promotors abläuft (Nunberg et al., a. a. O.). Die vorhergesagte Induktion wurde in Northern-Blotting-Experimenten durch die Anwesenheit von AG-spezifischer mRNA im Wirt und von Chymosin-spezifischer mRNA in Transformanten bei Züchtung auf Stärke gezeigt, im Gegensatz zur Abwesenheit der spezifi schen mRNAs in mit Xylose gezüchtetem Myzel. Ferner wird die Sekretion von Chymosin unter induzierten Bedingungen entweder durch Immunoblotting von Fermentationsbrühen oder durch Messen der Gerinnungsaktivität der Fermentationsbrühe nachgewiesen. In mit Xylose gezüchteten Kulturen konnte durch den Gerinnungstest keine Chymosin-Aktivität nachgewiesen werden. Auch die Ergebnisse der Western-Blotting-Experimente waren in diesem Fall negativ. Diese Experimente belegen, daß die Regulierung der Expression des Rinder-Chymosin-Gens ähnlich der Expression des AG-Gens ist und mit den derzeitigen Kenntnissen über die Expression des Glucoamylase-Gens übereinstimmt.

Beispiel 7 Expression von Chymosin in Gegenwart von Protease-Inhibitoren

Die Empfindlichkeit von Chymosin gegenüber durch A. niger sezernierte Protease wurde durch Züchtung von Transformanten in Gegenwart und Abwesenheit von Protease-Inhibitoren festgestellt. Zu diesem Zweck wurden Transformanten des Wirtstammes DS 2975 mit dem Konstrukt pAB64-73 (Beispiel 3A) gemäß den Angaben in Beispiel 4 gezüchtet. Das Kulturmedium wurde entweder nicht mit Proteaseinhibitoren ("-") versetzt oder mit Pepstatin und α2-Makroglobulin versetzt ("+"), wobei die Endkonzentrationen 1 ug/ml bzw. 5 ug/ml betrugen. Proben wurden nach mehreren Zeitintervallen entnommen. Die Menge an sezerniertem Chymosin wurde durch Western- Blot gemäß den Angaben in Beispiel 3B getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2 Relative Mengen an Chymosin in Kulturen ohne ("-") und mit ("+") Protease-Inhibitoren

Die Daten zeigen, daß Chymosin gegenüber einem Abbau durch Protease, die in der Fermentationsbrühe vorhanden ist, empfindlich ist. Eine Inaktivierung dieser Proteasen, beispielsweise durch Zugabe von Protease-Inhibitoren, führte zu einer erhöhten Ausbeute an Chymosin und bei Beurtei lung der längeren Anwesenheit von Chymosin in der Fermentationsbrühe in Gegenwart von Protease auch zu einer erhöhten Stabilität.

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß das vorliegende Expressionssystem eine wirksame Produktion von Proteinen gewährleistet. Ferner kann man durch Einführung des in Frage stehenden Gens in einen Locus, der ein ein sekretorisches Protein exprimierendes Gen umfaßt (wobei dieses Protein in hohen Konzentrationen gebildet wird), für eine Produktion des in Frage stehenden Gens in hoher Konzentration sorgen. Auf diese Weise wird die Sekretionsbelastung der Wirtszelle vermindert, was eine wirksame Sekretion des gewünschten Produkts ermöglicht. Durch anfängliche Verwendung von Wirten, die eine wirksame Sekretion zeigen, lassen sich die vorliegenden Systeme für eine gewerbliche Herstellung von in Frage stehenden Produkten, wie Arzneistoffen, gewerblichen Enzymen und dergl., einsetzen.

Sämtliche Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der vorliegenden Beschreibung zitiert werden, werden durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Ausführungen gemacht und zwar so, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung speziell und individuell zum Gegenstand der Beschreibung gemacht würde.


Anspruch[de]

1. Transformierter filamentöser Pilzwirt, enthaltend eine durch in vitro-Rekombination erhaltene Expressionskassette, die eine transkriptionale Initiationsregulationsregion, einen offenen Leseraster, der für eine Signalsequenz zur Sekretion im Raster mit einem Strukturgen von Interesse kodiert, und eine transkriptionale Terminationsregulationsregion,

wobei der transformierte filamentöse Pilzwirt dadurch gekennzeichnet ist, daß die Expressionskassette in ein Chromosom des filamentösen Pilzwirtes an einem vorbestimmten Ziellocus integriert ist, der ein Gen umfaßt, dessen Expressionsprodukt in einer Konzentration von mindestens etwa 0,1 g/Liter sezerniert wird,

wobei das Gen des Ziellocus ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß es inaktiviert worden ist.

2. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach Anspruch 1, wobei das in starkem Maße exprimierte Gen im Ziellocus als eine Folge der Integration des Expressionskonstrukts inaktiviert worden ist.

3. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Integration des Expressionskonstrukts am Ziellocus durch ein Genaustauschereignis erfolgt ist.

4. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich beim Wirt um Aspergillus handelt.

5. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich beim Wirt um Aspergillus niger handelt.

6. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach Anspruch 5, wobei es sich beim in starkem Maße exprimierten Gen im Ziellocus um das Glucoamylase-Gen handelt.

7. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gen von Interesse für eine Form von Chymosin, ein Interleukin, eine Phospholipase, eine Lipase, eine Phytase, eine Phosphatase, eine Xylanase, eine Amylase, ein Rennin, eine β-Galactosidase oder ein zellwandabbauendes Enzym kodiert.

8. Transformierter filamentöser Pilzwirt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Expressionskonstrukt einen Marker für die Selektion von Wirten, die den Marker enthalten, umfaßt.

9. DNA-Konstrukt, umfassend:

a) eine Expressionskassette, umfassend eine transkriptionale Initiationsregulationsregion, stromabwärts gefolgt von einem Gen von Interesse, das unter der transkriptionalen Kontrolle der transkriptionalen Initiationsregulationsregion steht, stromabwärts gefolgt von einer transkriptionalen Terminationsregulationsregion, wobei das Gen von Interesse mit einer DNA-Sequenz, die für eine Signalsequenz zur Sekretion des durch das Gen von Interesse kodierten Produkts kodiert, versehen ist,

b) ein selektierbares Markergen für die Selektion von transformierten Wirten,

c) 5'- und 3'-flankierende Regionen, die homolog zu 5'- und 3'-Regionen eines vorbestimmten Ziellocus sind, umfassend ein Gen, dessen Expressionsprodukt in einer Konzentration von mindestens etwa 0,1 g/l sezerniert wird, wobei dieser Locus in einem filamentösen Wirt endogen ist,

wobei das DNA-Konstrukt ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß die unter a) und b) erwähnten Komponenten zusammen zwischen den 5'- und 3'- flankierenden Regionen positioniert sind.

10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, wobei ein Teil der 5'-flankierenden Regionen mit der transkriptionalen Initiationsregulationsregion, die die Transkription des Gens von Interesse kontrolliert, zusammenfällt.

11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei der zusammenfallende Teil der 5'-flankierenden Region eine DNA-Sequenz einschließt, die für eine Signalsequenz zur Sekretion des Produkts des Gens von Interesse kodiert.

12. DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, wobei ein Teil der 3'-flankierenden Region mit der transkriptionalen Terminationsregulationsregion des Gens von Interesse zusammenfällt.

13. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 9-12, wobei es sich beim endogenen Ziellocus um ein Glucoamylase-Gen handelt.

14. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 9-13, wobei das Gen von Interesse für eine Form von Chymosin, ein Interleukin, eine Phospholipase, eine Lipase, eine Phytase, eine Phosphatase, eine Xylanase, eine Amylase, ein Rennin, eine β-Galactosidase oder ein zellwandabbauendes Enzym kodiert.

15. Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse, umfassend die Züchtung eines transformierten filamentösen Pilzwirtes gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Nährmedium.







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