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Dokumentenidentifikation DE69324046T2 21.10.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0688226
Titel PROTEIN PRÄPARATE ZUR VERHÜTUNG UND BEHANDLUNG VAN PERIODONTITIS UND SONSTIGEN BAKTERIELLEN ERKRANKUNGEN DER MUNDHÖHLE
Anmelder Pfizer Italiana S.p.A., Rom/Roma, IT
Erfinder VALENTI, Piera, I-00153 Roma, IT;
ANTONINI, Giovanni, I-01032 Caprarola, IT
Vertreter Hagemann, Braun & Held, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69324046
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 15.12.1993
EP-Aktenzeichen 949038012
WO-Anmeldetag 15.12.1993
PCT-Aktenzeichen EP9303571
WO-Veröffentlichungsnummer 9413318
WO-Veröffentlichungsdatum 23.06.1994
EP-Offenlegungsdatum 27.12.1995
EP date of grant 17.03.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.10.1999
IPC-Hauptklasse A61K 38/55
IPC-Nebenklasse A61K 38/46   A61K 38/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Proteinzubereitung für die Vorbeugung und Heilung bakterieller Pathologien und Erkrankungen der Mundhöhle, insbesondere Periodontitis und Zahnkaries.

Eine periodontale Erkrankung umfaßt eine Gruppe von Erkrankungen, die die unterstützenden Strukturen der Zähne beeinflussen und zu ihrer fortschreitenden pathologischanatomischen Verschlechterung und schließlich zu einem möglichen vollständigen Verlust der Zahnelemente führen. Aus epidemiologischer Sicht wurde bereits hervorgehoben, daß eine periodontale Erkrankung in ihren verschiedenen Formen eine beträchtliche Anzahl an Personen beeinflußt (30-40% zwischen 25 und 40 Jahren und 60-70% von Personen über 40 Jahren).

Aus klinischer Sicht ist die Erkrankung gekennzeichnet durch Zahnfleischentzündung, Ödeme, ausgelöstes oder spontanes Bluten, apikale Migration des verbindenden Gewebes mit der Bildung periodontaler Taschen, Knochenreabsorption, merklicher Beweglichkeit der Zähne und in einigen Fällen Zahnfleischschwund.

Vor einigen Jahren wurde gezeigt, daß Periodontits in sämtlichen klinischen Formen eine bakterielle Äthiologie besitzt, und daß die diese Krankheit am häufigsten hervorrufenden Mikroorganismen zwangsläufig Gram-negative Anaerobe, wie Porphyromonas gingivalis sind.

Zahnkaries ist stattdessen eine Demineralisierungserkrankung, die Zähne in allen Stadien beeinflußt und ausgedehnte Zahnkronemutilationen, bakterielle Erkrankungen des periapikalen Gewebes oder sogar den Verlust der beeinflußten Zahnteile bewirken kann. Un gefähr 50% der Erwachsenen besitzen mindestens 4 auf Karies zurückzuführende behandelte oder zu behandelnde Schädigungen und ungefähr bei 30% der Erwachsenen sind über 50% ihrer Zähne von Karies beeinträchtigt.

Klinisch wird die Erkrankung durch Demineralisierung des Zahnschmelzes und des Dentins in verschiedenen fortgeschrittenen Stadien charakterisiert, bis sie die Pulpahöhle beeinträchtigt. Wenn die Schädigung über die Zahnschmelz-Dentin-Grenze hinausgeht, wird regelmäßig eine phlogistische Reaktion des Pulpagewebes beobachtet, in einigen Fällen mit der Bildung von Reaktionsdentin.

Es wurde gezeigt, daß Karies durch Säureangriff auf den Zahnoberflächen erzeugt wird, verknüpft mit dem fermentativen Metabolismus von Zuckern in der Nahrung seitens einiger bakterieller Stämme, die am Zahnschmelz haften können. Der am häufigsten für Karies verantwortliche Stamm ist Streptococcus mutans.

Es wurde eingehend gezeigt, daß die Fähigkeit von Mikroorganismen Infektionen zu erzeugen, mit der Möglichkeit verknüpft ist, spezifisch oder unspezifisch an den verschiedenen Geweben zu haften, was den Mikroorganismen ermöglicht, die Gewebe nachfolgend weitgehend zu kolonisieren. In der Pathogenese der meisten üblichen Infektionen der Mundhöhle ist die bakterielle Adhäsion und nachfolgende Kolonisierung der Zahnoberflächen und der weichen Gewebe unzweifelhaft von grundsätzlicher Bedeutung. Die Zahnoberfläche ist normalerweise von einem dünnen Film (erworbener Film) bedeckt, der durch Speichelglycoproteine gebildet wird, die selektiv auf der Zahnoberfläche adsorbieren, was die Kolonisierung durch spezifische Mikroorganismen ermöglicht, und sie vor anderen Organismen schützt. Weiterhin ist die Speichelflüssigkeit aus einer Reihe von Substanzen auf Proteinbasis mit antibakterieller Aktivität aufgebaut. Folglich spielt die Speichelflüssigkeit eine sehr bedeutende Rolle bei der qualitativen und quantitativen Steuerung der mikrobiellen Flora der Mundhöhle, indem sie antibakterielle Aktivität und antiadhäsive Aktivität kompetitiver Art gegen pathogene Spezies besitzt. Aus dem obi gen ist offensichtlich, daß die zu verabreichende optimale Verbindung, um mikrobiellen Beeinträchtigungen der Mundhöhle vorzubeugen und sie zu heilen, eine antibakterielle und antiadhäsive Aktivität wie die Proteinkomponenten der Speichelflüssigkeit besitzen muß.

Derzeit werden Periodontitis und Karies durch mechanische Entfernung des Zahnbelags und der geschädigten Gewebe und durch chirurgische Korrektur und Wiederaufbau der geschädigten Strukturen behandelt. Weiterhin ist die Wiederherstellung optimaler Mundhygienebedingungen durch Verwendung von Mundwäschen sehr wichtig, um diesen Beeinträchtigungen vorzubeugen und sie zu heilen. Jedoch ist die Behandlung mit Mundwäschen, die auf desinfizierenden Substanzen basieren, nicht die ideale Zusatzbehandlung bei der Vorbeugung und Heilung dieser Erkrankungen. Dieses Substanzen (z. B. Chlorhexidin) besitzen tatsächliche eine systemische Toxizität und ein merkliches Auftreten von Nebenwirkungen, die ihren Gebrauch begrenzen, weiterhin verhindern diese Substanzen nicht die Adhäsion von Mikroorganismen an Zahnoberflächen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Proteinformulierung oder Zubereitung für die Vorbeugung und Behandlung von Periodontits und Krankheiten der Zähne und der Gewebe der Mundhöhle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung von Proteinen umfaßt, die mindestens ein Transferrin, in Mischung mit mindestens einem zusätzlichen Protein, ausgewählt aus der Albumine. Lysozyme, Proteaseinhibitoren und deren Mischungen umfassenden Gruppe, aufweist, mit der Maßgabe, daß eine Zubereitung, enthaltend 0,1 Gew.-% Lactoferrin, 0,1 Gew.-% Lysozym zusammen mit einem auf neuen, weichen Zahnbelag wirkenden Enzym, einem auf unlöslichen, alten Zahnbelag wirkenden Enzym und eine Gruppe von Enzymen, die ein hochwirksames bakterizides Mittel erzeugen, ausgeschlossen ist.

Es wurde beobachtet, daß die erfindungsgemäße Zubereitung eine synergistische Aktivität und eine antibakterielle, antiadhäsive, antiinvasive und Antiproteaseaktivität ausübt, die nicht nur höher ist als die der die Mischung bildenden einzelnen Proteine, sondern auch höher als die der Speichelproteine.

Da es zur Zeit keine Tierspezies gibt, die generell für den Test von Substanzen zur Verhinderung und Heilung von Periodontitis als geeignet angesehen wird, werden die nachfolgenden Beispiele auf "in vitro"-Modelle angewendet, die im allgemeinen für den Test von Zusatzstoffen zur Verhinderung und Heilung von Periodontitis und anderen bakteriellen Erkrankungen der Mundhöhle anerkannt sind.

Eine antiadhäsive Aktivität wird durch die Verringerung der Bindung der Mikroorganismen an eine Substanz (Hydroxyapatit) gezeigt, die die Zahnoberfläche simuliert. Antibakterielle Aktivität wird durch eine bakteriostatische und/oder bakterizide Wirkung auf spezifische bakterielle Gattungen gezeigt. Antiproteaseaktivität wird durch eine höhere antiadhäsive und antibakterielle Aktivität der vollständigen Proteinformulierung bezüglich der Formulierung ohne Inhibitoren, die dem Angriff seitens mikrobieller Proteasen unterzogen werden, nachgewiesen. Die antiadhäsive und antibakterielle Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Proteinformulierung ist tatsächlich höher als die mit ihren einzelnen Komponenten erhaltene, was eine synergistische Aktivität aufgrund der gleichzeitigen Gegenwart der verschiedenen Proteine, die die hier beschriebene Formulierung charakterisieren, zeigt.

Es wurde beobachtet, daß das quantitative Verhältnis der Proteinverbindungen in den erfindungsgemäßen Zubereitungen innerhalb großer Bereiche variieren kann, da diese Verbindungen bereits bei geringen Konzentrationen in der Mischung eine synergistische Wirksamkeit zeigen.

Insbesondere in binären Mischungen von Transferrin mit einem Albumin oder einem Lysozym kann jede der Proteinverbindungen mit einer Konzentration von 5 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die Proteinmischung, vorliegen. Zum Beispiel können erfindungs gemäße Zubereitungen 10-40% Transferrin und 90-60% Albumin oder 90-60% Transferrin und 10-40% Lysozym enthalten. Die Mengen können auch durch ökonomische Faktoren, zum Beispiel durch die Kosten der verwendeten Proteine, bestimmt werden.

In binären Mischungen von Transferrin mit einem oder mehreren Proteaseinhibitoren können die Inhibitoren Konzentrationen von 1 bis 20 Gew.-%, zum Beispiel 2 bis 10 Gew.-%, besitzen.

In bevorzugten ternären Mischungen von Transferrin mit Albumin und Lysozym können die Gesamtkonzentrationen von Transferrinen und Albuminen von 5 bis 90 Gew. -% variieren, wohingegen Lysozyme mit Konzentrationen von 2 bis 90 Gew.-% vorliegen können. Zum Beispiel kann eine ternäre Mischung 10-40% Transferrin, 40-85% Albumin und 2-20% Lysozym umfassen. Unter Verwendung einer ternären Mischung von Transferrin mit Proteaseinhibitoren und mit einem zusätzlichen Protein, ausgewählt aus Albuminen und Lysozymen, liegen die Proteaseinhibitoren mit einer Konzentration von 1 bis 20 Gew.-%. zum Beispiel 2 bis 10 Gew.-% vor, wohingegen die Konzentrationen jeder der anderen Proteinverbindungen zwischen 5 und 94%, zum Beispiel von 20 bis 75%, bezogen auf die Mischung, variieren können.

Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Zubereitung ist eine Mischung sämtlicher vier Typen der oben erwähnten Proteinverbindungen, und somit eine Mischung aus mindestens einem Transferrin mit einer Konzentration von 5 bis 92%, mindestens einem Lysozym mit einer Konzentration von 2 bis 80%, mindestens einem Albumin mit einer Konzentration von 5 bis 92% und mindestens einem Proteaseinhibitor mit einer Konzentration von 1 bis 20%, wobei diese Konzentrationen als Gew.-%, bezogen auf die Proteinmischung, angegeben sind. Zum Beispiel kann eine derartige quarternäre Mischung ein oder mehrere Transferrine mit einer Gesamtkonzentration von 10-50 Gew.- %, zum Beispiel 15-25 Gew.-%, ein oder mehrere Albumine mit einer Gesamtkonzentration von 40-84 Gew.-%, zum Beispiel 60-75 Gew.-%, ein oder mehrere Lysozyme mit einer Gesamtkonzentration von 5-30 Gew.-%, zum Beispiel 5-10 Gew.-%, und ein oder mehrere Proteaseinhibitoren einer Gesamtkonzentration von 1-10 Gew.-%, zum Beispiel 2-5 Gew.-%, umfassen.

Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße Zubereitung 75% Albumin, I7% Transferrin. 5% Lysozym und 3% Proteaseinhibitoren umfassen.

Wenn die erfindungsgemäße Zubereitung mehr als eine Verbindung der Klassen Transferrine. Lysozyme, Albumine oder Proteaseinhibitoren umfaßt, beträgt die kombinierte Menge die oben für jede Klasse der Proteinverbindungen angegebene Konzentration.

Die oben aufgeführten Beispiele zeigen, daß die erfindungsgemäße Formulierung als optimal angesehen werden kann hinsichtlich der derzeit verwendeten Behandlungen zur Vorbeugung und Heilung von Periodontitis und anderen bakteriellen Erkrankungen der Mundhöhle. Weiterhin ist die extrem niedrige Toxizität der in der erfindungsgemäßen Formulierung enthaltenen Proteine wohlbekannt, da diese extrahierte "natürliche" Substanzen sind (aber auch chemisch synthetisierbar), die hinsichtlich ihrer Aminosäurezusammensetzung und ihrem strukturellen Aufbau sehr ähnlich sind zu homologen Proteinen, die normalerweise im menschlichen oder tierischen Körper vorhanden sind. Das ist ein zusätzlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Formulierung gegenüber den derzeit bei der Periodontitisbehandlung verwendeten Chemikalien.

Die Proteine, die in der erfindungsgemäßen Formulierung verwendet werden können, können daher Extrakte sein oder können durch rekombinante DNA-Technologie oder auch durch chemische Synthese erhalten werden.

Der Ausdruck Albumin bezeichnet in der vorliegenden Erfindung ein Glycoprotein oder ein deglycosyliertes Protein mit zu denen des Humanalbumins ähnlichen Charakteristika. Die erfindungsgemäße Formulierung kann mit jedem beliebigen Protein unterschiedlichen Ursprungs, das üblicherweise als "Albumin" bezeichnet wird und kommerziell erhältlich ist, hergestellt werden: Serumalbumin und Lactalbumin von Mensch, Rind, Katze, Hund, Kaninchen, Pferd, Schaf, Ziege, Serumalbumin und Ovalbumin von Truthahn, Huhn, Taube etc.

Der Ausdruck Transferrin bezeichnet ein Glycoprotein oder ein entsprechend deglycosyliertes Protein, das mit zwei Eisen(III)-Atomen pro Molekül einen Chelat bildet, hinsichtlich der strukturellen und funktionalen Charakteristika dem des Humanlactoferrins ähnlich ist und durch eine bekannte antibakterielle Aktivität charakterisiert wird. Die erfindungsgemäße Formulierung kann mit jedem beliebigen Protein unterschiedlichen Ursprungs, das üblicherweise als "Transferrin" bezeichnet wird und kommerziell erhältlich ist, hergestellt werden: Serumtransferrin und Lactoferrin von Mensch, Rind, Katze, Hund. Kaninchen, Pferd, Schaf, Ziege. Serumtransferrin und Ovotransferrin von Truthahn, Huhn, Taube etc.

Der Ausdruck Lysozym bezeichnet ein Protein mit strukturellen und funktionalen Charakteristika ähnlich dem von Humanlysozym, das durch eine bekannte enzymatische bakterizide Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien charakterisiert wird. Die erfindungsgemäße Formulierung kann mit jedem beliebigen Protein unterschiedlichen Ursprungs, das üblicherweise als "Lysozym" bezeichnet wird und kommerziell erhältlich ist, hergestellt werden: Lysozym von Mensch, Rind, Pferd, Truthahn, Huhn etc.

Der Ausdruck Proteaseinhibitoren bezeichnet eine Klasse von Proteinen mit Charakteristika ähnlich zu denen von Humantrypsin- und -chymotrypsin-Inhibitoren, die durch die Fähigkeit charakterisiert sind, die Proteaseaktivität von Trypsin und Chymotrypsin zu inhibieren. Die erfindungsgemäße Formulierung kann mit jedem beliebigen Protein unterschiedlichen Ursprungs, das üblicherweise als "Trypsin- und Chymotrypsin- Inhibitor" bezeichnet wird und kommerziell erhältlich ist, erhalten werden: Trypsin- und Chymotrypsin-Inhibitoren von Rind. Sojabohnensaaten, Huhn, Truthahn etc.

Es gibt viele Proteine, die zu den Klassen der Albumine, Transferrine, Lysozyme und Proteaseinhibitoren gehören, die auf dem Markt erhältlich sind, und die in der Zubereitung der Erfindung eingesetzt werden können. Als Veranschaulichung derartiger kommerzieller Proteine seien zum Beispiel die durch SIGMA Chemical Co., St. Louis, USA, vertriebenen genannt.

Die erfindungsgemäße Proteinformulierung kann in flüssiger Form, als Lösung einer Konzentration von 0,1 bis 10%, zum Beispiel 1 bis 5%, Gew/Vol (g/ml) der Proteinmischung in für den pharmazeutischen Gebrauch akzeptablen Lösungsmitteln, insbesondere Wasser oder wässerig-alkoholischen Lösungsmitteln, wie Wasser-Ethanol-Mischungen oder in fester Form (lyophilisiert, getrocknet, gefroren) und in anderen herkömmlich bekannten Lagerformen, zum Beispiel immobilisiert oder adsorbiert auf einem inerten, üblicherweise im pharmazeutischen Bereich verwendeten Träger, erhalten und gelagert werden.

Die erfindungsgemäße Proteinzubereitung kann somit in flüssiger Form als Spülung oder Mundwäsche, oder in fester Form, wie in Puder- oder Granularform, um für die Herstellung einer Mundwaschflüssigkeit unmittelbar vor Gebrauch mit den oben bezeichneten Konzentrationen in Wasser gelöst zu werden, eingesetzt werden. Alternativ ist es möglich, die Proteinmischung der Erfindung einer Zahnpasta oder einer Formulierung zum Kauen, wie Kaugummi, Tabletten, Pastillen, Hustenpastillen etc. in einer Konzentration von 1 bis 60 Gew.-% der Gesamtformulierung einzuverleiben.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann in gebrauchsfertiger Form auch weitere konventionelle antibakterielle und Antibelagverbindungen umfassen, ebenso wie Träger, Füllstoffe, Geschmacksstoffe, Konservierungsstoffe, oberflächenaktive Mittel, Färbemittel und andere Zusatzstoffe, ausgewählt aus den üblicherweise in verschiedenen Zubereitungen flüssiger oder fester Form für den oralen topischen Gebrauch verwendeten.

Somit können erfindungsgemäße Formulierungen für den oralen Gebrauch ferner antibakterielle und Antibelagverbindungen umfassen, wie quarternäre Ammoniumverbindungen mit einer langen Alkylkette am Stickstoffatom, Alkalimetallpyrophosphate und Orthophosphate, halogenierte Bisphenole und halogenierte Diphenylether, Natriumbenzoat, Natriumsalicylat etc.

Erfindungsgemäße flüssige Spülformulierungen können ferner umfassen Befeuchtungsmittel. z. B. Glycerin, Sorbitol, Xylitol, Propylenglycol etc., Geschmacksstoffe, z. B. Krauseminze-, Pfefferminz- oder Zimtöl, Menthol, Methylsalicylat etc., Süßstoffe, z. B. Aspartam, Saccharin, Dextrose, Cyclamat, Wintergrünöl etc., Verdickungsmittel, z. B. Xanthan-Gummi, Karrageenin, Carboxymethylcellulose etc., Gerüststoffe, z. B. Natriumcarbonat, -bicarbonat, -sulfat oder -borat etc., oberflächenaktive Mittel, entweder vom anionischen Typ, wie Salze höherer Fettsäuremonoglyceridmonosulfate, höherer Alkylsulfate, Alkylarylsulfonate, höhere Alkylsulfoacetate etc., oder vom nichtionischen Typ, wie Blockpolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen, Polyethylenoxidkondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit Propylenoxid und Ethylendiamin, langkettige tertiäre Aminoxide, langkettige Dialkylsulfoxide etc.

Die Zahnpastaformulierungen und Formulierungen zum Kauen durch die Verwender umfassen das entsprechende herkömmliche Basismaterial und herkömmliche Hilfsstoffe, wie Geschmacksstoffe, Süßstoffe, Färbemittel, Befeuchtungsmittel etc., wie die oben erwähnten, und Verdickungs- und Gelierungsmittel, wie verdickendes Siliciumoxid, natürliche oder synthetische Gummis, z. B. Tragantgummi, Guargummi, Hydroxyethyl- und Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Stärke etc.

Die erfindungsgemäße Proteinzubereitung, entweder in flüssiger oder in fester Form, sollte für die Vorbeugung von Periodontitis mindestens einmal, bevorzugt zweimal am Tag verwendet werden. Zur Behandlung von Periodontitis oder anderen bakteriellen Erkrankungen kann die Gebrauchshäufigkeit auf drei- bis viermal am Tag erhöht werden.

Eine erfindungsgemäße Proteinmischung wurde hergestellt, nachfolgend als FORMULIERUNG bezeichnet, umfassend 75% Rinderserumalbumin, 17% Lactoferrin, 5% Lysozym vom Hühnerei und 3% Trypsininhibitor vom Hühnerei, und wurde auf antibakterielle Aktivität getestet, indem sowohl die FORMULIERUNG selbst als auch einzelne sie aufbauende Proteine in Kontakt mit zwei Mikroorganismen gebracht wurden, die als repräsentativ für die mikrobielle Flora ausgewählt wurden, welche üblicherweise für die Pathogenese von Periodontitis oder anderen Zahnerkrankungen als verantwortlich angesehen werden. Die antibakterielle Aktivität wurde ebenfalls unter Verwendung der freien Proteine in Lösung oder gebunden an Hydroxyapatit, einer als Modell für die Zahnoberfläche eingesetzten Substanz, gemessen.

Die obige Protein-FORMULIERUNG wurde ebenfalls auf antiadhäsive Aktivität untersucht, indem ihre Fähigkeit gemessen wurde, die Bindung an Hydroxyapatit, einer als Modell für die Zahnoberfläche eingesetzten Substanz, von zwei Mikroorganismen zu verhindern, welche als repräsentativ für die mikrobielle Flora ausgewählt wurden, die üblicherweise für die Pathogenese von Periodontitis und anderen Zahnerkrankungen als verantwortlich angesehen werden.

Die nachfolgenden Mikroorganismen, die als repräsentativ für die mikrobielle Flora, welche üblicherweise für die Pathogenese von Periodontitis und anderen Zahnerkrankungen als verantwortlich angesehen werden, wurden verwendet:

Streptococcus mutans, ATTC 6715-13, gezüchtet in Todd Hewitt-Nährlösung (THB- BBL) bei 37ºC.

Porphyromonas gingivalis, gezüchtet bei 37ºC in Gehirn-Herz-Infusionsnährlösung (BHI-BBL) oder anderen bekannten Kulturmedien mit oder ohne die Zugabe von Hämin (10 ug/ml) und Vitamin K (1 ug/ml) unter Verwendung eines anaeroben Deckels (FORMA-Scientific, Marietta, Ohio).

BEISPIEL 1 - ANTIBAKTERIELLE AKTIVITÄT

Die antibakterielle Aktivität der nachfolgenden Proteinzubereitungen wurde bestimmt: Lactoferrin. Rinderserumalbumin, Speichelproteinen und der FORMULIERUNG der vorliegenden Erfindung. Die antibakterielle Aktivität der oben erwähnten Proteinzubereitungen wurde unter Verwendung dieser in freier Form oder adsorbiert an Hydroxyapatit bestimmt. Die Effizienz wurde durch mikrobielle Auszählung in für die Entwicklung der Teststämme geeigneten Medien mit oder ohne Zugabe der beschriebenen Substanzen beurteilt. Der Grad an antibakterieller Aktivität der einzelnen Proteine, genauso wie die der Formulierung selbst, können entsprechend der biochemischen und Kulturbedingungen der Medien, in denen die Untersuchung stattfindet, variieren. Bakteriostatische Aktivität kann tatsächlich in Kulturmedien während der mikrobiellen Multiplikation nachgewiesen werden, wohingegen bakterizide Aktivität in der ersten Kontaktstunde zwischen Bakterien und Proteinen in Salzlösung (PBS) nachgewiesen werden kann.

In einem ersten Test wurden 10&sup5; Zellen/ml Streptococcus mutans zum beschriebenen Kulturmedium zugegeben, das jeweils 1 mg/ml Lactoferrin (Lf) oder 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) oder 1 mg/ml Speichelproteine (PS) oder 6 mg/ml der erfindungsgemäßen FORMULIERUNG enthielt, die 1 mg/ml des jeweiligen Transferrins enthielt.

Nach 6 Stunden Inkubation unter Rühren bei 37ºC wurden die koloniebildenden Einheiten ausgezählt (siehe Tabelle 1a).

In einem zweiten Test wurden 10&sup5; Zellen/ml Streptococcus mutans zum beschriebenen Kulturmedium zugegeben, das jeweils 1 mg/ml Lactoferrin (Lf) oder 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) oder 1 mg/ml Speichelproteine (PS) oder 6 mg/ml der erfindungsgemäßen FORMULIERUNG enthielt, die 1 mg/ml des jeweiligen Transferrins enthielt. In diesem zweiten Experiment wurden die oben erwähnten Proteine zuvor mit 10 mg/ml Hydroxyapatit 30 Minuten bei 37ºC in Kontakt gebracht, um die Adsorption der Proteine an den Hydroxyapatit zu ermöglichen.

Nach 6 Stunden Inkubation unter Rühren bei 37ºC wurden die koloniebildenden Einheiten ausgezählt (siehe Tabelle 1a). Die Kontrolle, CTRL, bestand aus der oben erwähnten THB-BBL-Kulturnährlösung ohne Proteinzugaben.

In einem dritten Test wurden 10&sup5; Zellen/ml Porphyromonas gingivalis unter anaeroben Bedingungen zum beschriebenen Kulturmedium zugegeben, das jeweils 1 mg/ml Lactoferrin (Lf) oder 1 mg/ml Rindersenunalbumin (BSA) oder 1 mg/ml Speichelproteine (PS) oder 6 mg/ml der erfindungsgemäßen FORMULIERUNG enthielt, die 1 mg/ml Transferrin enthielt.

Nach 48 Stunden Inkubation unter anaeroben Bedingungen bei 37ºC wurden die koloniebildenden Einheiten ausgezählt (siehe Tabelle 1b).

In einem vierten Test wurden 105 Zellen/ml Porphyromonas gingivalis unter anaeroben Bedingungen zum beschriebenen Kulturmedium zugegeben, das jeweils 1 mg/ml Lactoferrin (Lf) oder 1 mg/ml Rindersenunalbumin (BSA) oder 1 mg/ml Speichelproteine (PS) oder 6 mg/ml der erfindungsgemäßen FORMULIERUNG enthielt, die 1 mg/nil Transferrin enthielt. In diesem vierten Experiment wurden die oben erwähnten Proteine zuvor mit 10 mg/ml Hydroxyapatit 30 Minuten bei 37ºC in Kontakt gebracht, um die Adsorption der Proteine an den Hydroxyapatit zu ermöglichen.

Nach 48 Stunden Inkubation unter anaeroben Bedingungen bei 37ºC wurden die koloniebildenden Einheiten ausgezählt (siehe Tabelle 1b). Die Kontrolle CTRL bestand aus der oben erwähnten BHI-BBL-Kulturnährlösung.

Tabelle 1a. Antibakterielle Aktivität nach 6 Stunden Inkubation bei 37ºC unter Rühren. Die Impfkultur bestand aus 10&sup5; Zellen/ml S. mutans.
Tabelle 1b. Antibakterielle Aktivität nach 48 Stunden Inkubation bei 37ºC unter anaeroben Bedingungen. Die Impfkultur bestand aus 10&sup5; Zellen/ml Porphyromonas gingivalis.

Natürlich ist die antibakterielle Aktivität umso höher, je niedriger die Zahl der nach der Inkubation nachgewiesenen Mikroorganismen ist. Das oben aufgeführte Beispiel zeigt deutlich, daß die erfindungsgemäße Formulierung die maximale antibakterielle Aktivität sowohl gegen Streptococcus mutans, als auch gegen Porphyromonas gingivalis besitzt.

BEISPIEL 2 - ANTIADHÄSIVE AKTIVITÄT

Die antiadhäsive Aktivität der nachfolgenden Proteine wurde bestimmt: Lactoferrin, Rinderserumalbumin, Speichelproteinen und der erfindungsgemäßen FORMULIERUNG.

Säulen für die Niederdruckflüssigkeitschromatographie mit einem Durchmesser von 0,8 cm, die 1 g Hydroxyapatit in einem Phosphatpuffer (PBS) enthielten, wurden hergestellt.

Nach Filtrierung der Proteinlösungen, enthaltend jeweils 100 mg/10 ml Lactoferrin (Lf) oder 100 mg/10 ml Rinderserumalbumin (BSA) oder 100 mg/10 ml Speichelproteine (PS) oder 100 mg/10 ml der erfindungsgemäßen FORMULIERUNG wurden die Proteine, die nicht anhafteten, durch Waschen mit 100 ml PBS entfernt. Geeignete Einsatzmengen der Proteine im Eluat der Auswaschung zeigten, daß 80% der gefilterten Proteine auf dem in der Chromatographiesäule enthaltenen Gramm Hydroxyapatit adsorbiert geblieben waren.

Die Chromatographiesäulen wurden anschließend unter aeroben oder anaeroben Bedingungen mit einer Suspension, enthaltend 108 Zellen der Stämme Streptococcus mutans oder Porphyromonas gingivalis in eine physiologische Lösung, eingeimpft. Durch Waschen mit PBS (1000 ml) wurden die Mikroorganismen, die an dem Hydroxyapatit nicht anhafteten, eluiert.

Ein zweites Waschen mit 100 ml 1 M NaCl ermöglichte die Elution der am Hydroxyapatit anhaftenden Mikroorganismen (Tabelle 2). Die Kontrollen in Tabelle 2 bestanden aus Säulen, hergestellt wie beschrieben, d. h. aus Hydroxyapatit, ohne Zugabe von Proteinen.

Tabelle 2. Antiadhäsive Aktivität

Je höher die antiadhäsive Aktivität einer Substanz, je niedriger ist die Zahl der mit 1 M NaCl eluierten Mikroorganismen, da die Mikroorganismen, die nicht anhafteten, zuvor mit PBS ausgewaschen wurden. Das obige Beispiel zeigt deutlich, daß die erfindungsgemäße Formulierung die höchste antiadhäsive Fähigkeit sowohl gegenüber Streptococcus mutans, als auch gegenüber Porphyromonas gingivalis besitzt.

BEISPIEL 3

Die antibakterielle Aktivität verschiedener erfindungsgemäßer Zubereitungen wurde hinsichtlich der einzelnen Komponenten und einer keine Proteinverbindungen enthaltenden Kontrollprobe beurteilt, getestet gemäß den oben beschriebenen experimentellen Bedingungen (erster und dritter Test von Beispiel 1).

Die Proteine wurden mit den nachfolgenden Konzentrationen zugegeben: Transferrin (TRF) 1 mg/ml; Lysozym (LYS) 0.3 mg/ml; Proteaseinhibitoren (INHIB) 0,20 mg/ml; Albumin (ALB) 4,5 mg/ml. Die Kontrolle (CTRL) bestand aus den im ersten und dritten Test von Beispiel 1 verwendeten Kulturlösungen, zu denen kein Protein zugegeben wurde.

Die nachfolgenden Beispiele zeigen verschiedene gebrauchsfertige Formen der erfindungsgemäßen Zubereitungen.

BEISPIEL 4 - Mundwäsche Zusammensetzung pro 100 ml Aktive Bestandteile:

Albumin. Serumalbumin vom Rinderserum, SIGMA A6793, 650 mg

Transferrin, Ovotransferrin vom Hühnerei, SIGMA C1130, 200 mg

Lysozym, vom Hühnerei, SIGMA L2879, 100 mg

Trypsininhibitor, von Sojabohnen, SIGMA T9128, 50 mg

Träger, Konservierungsstoffe und Geschmacksstoffe:

Natriumchlorid 1 g

Natriumbicarbonat 100 mg

Methyl-p-hydroxybenzoat 100 mg

Pfefferminzöl 50 mg

gereinigtes Wasser auf 100 ml

Verwendung:

Zwei Spülungen am Tag, eine am Morgen, eine am Abend.

BEISPIEL 5 - Zahnpasta Zusammensetzung pro 100 g Aktive Bestandteile:

Albumin. Serumalbumin vom Rinderserum, SIGMA A6793, 1,5 g

Transferrin. Lactoferrin von Rindermilch. SIGMA L9507, 0,5 g

Lysozym, vom Hühnerei, SIGMA L2879, 100 mg

Trypsininhibitor, vom Hühnerei, SIGMA T9253, 50 mg

Träger, Konservierungsstoffe und Geschmacksstoffe:

Gefällte Kieselsäure 15 g

Natriumbenzoat 4 g

Natriumlaurylsulfat 2 g

Calciumphosphat 1,2 g

Natriumkarrageenin 1,1 g

Titandioxid 1 g

Natrium-mono-fluorphosphat 0,3 g

Methyl-p-hydroxybenzoat 0,1 g

Pfefferminzöl 50 mg

gereinigtes Wasser auf 100 g

Verwendung:

Verwendung als normale Zahnpasta zweimal am Tag, morgens und abends.

BEISPIEL 6 - Einzelpackungsdosierungen Zusammensetzung für 1 Tütchen Aktive Bestandteile:

Albumin, Lactalbumin von Rindermilch, SIGMA L5385, 150 mg

Transferrin, Ovotransferrin vom Hühnerei, SIGMA C1130, 35 mg

Lysozym, vom Hühnerei, SIGMA L2879, 10 mg

Trypsininhibitor, vom Hühnerei, SIGMA T9253, 5 mg

Träger, Konservierungsstoffe und Geschmacksstoffe:

Natriumchlorid 20 mg

Natriumbicarbonat 10 mg

Methyl-p-hydroxybenzoat 20 mg

Pfefferminzöl 5 mg

Die Bestandteile werden zu feinverteiltem Pulver zerkleinert und kräftig mit herkömmlichem Mahl- und Mischgerät gemischt.

Verwendung:

Der Inhalt eines Tütchens wird in 20 ml Wasser für zwei Spülverwendungen gelöst, einmal am Morgen, und einmal am Abend.

BEISPIEL 7 - Kaugummi Zusammensetzung für einen Kaugummi Aktive Bestandteile:

Albumin, Ovoalbumin vom Hühnerei, SIGMA A5253, 150 mg

Transferrin, Serumtransferrin vom Rinderserum, SIGMA T5761, 35 mg

Lysozym, vom Hühnerei, SIGMA L2879, 10 mg

Trypsininhibitor, von Sojabohnen, SIGMA T9128, 5 mg

Träger, Konservierungsstoffe und Geschmacksstoffe:

Gummibasis (Paloya TX) 400 mg

Glucose 100 mg

Glycerol 10 mg

Natriumbicarbonat 10 mg

Methyl-p-hydroxybenzoat 20 mg

Pfefferminzöl 5 mg

Verwendung:

Ein Kaugummi nach den Hauptmahlzeiten.


Anspruch[de]

1. Topische Zubereitung für die Vorbeugung und Behandlung von Periodontitis und Krankheiten der Zähne und der Gewebe der Mundhöhle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung von Proteinen umfaßt, die mindestens ein Transferrin, zusammen mit mindestens einem zusätzlichen Protein, ausgewählt aus der Albumine, Lysozyme, Proteaseinhibitoren und deren Mischungen umfassenden Gruppe, aufweist, mit, der Maßgabe, daß eine Zubereitung, enthaltend 0,1 Gew.-% Lactoferrin, 0,1 Gew.-% Lysozym zusammen mit einem auf neuen, weichen Zahnbelag wirkenden Enzym, einem auf unlöslichen, alten Zahnbelag wirkenden Enzym und eine Gruppe von Enzymen, die ein hochwirksames bakterizides Mittel erzeugen, ausgeschlossen ist.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, umfassend eine Mischung aus mindestens einem Transferrin mit einer Konzentration von 5 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die Mischung, mit mindestens einem zusätzlichen Protein, ausgewählt aus der Albumine und Lysozyme umfassenden Gruppe mit einer entsprechenden Konzentration von 95 bis 5 Gew.-%.

3. Zubereitung nach Anspruch 1, umfassend eine Mischung aus mindestens einem Transferrin mit mindestens einem Lysozym und mindestens einem Albumin, worin das Lysozym mit einer Konzentration von 2 bis 90 Gew.-% und das Transferrin und das Albumin jeweils mit einer Konzentration von 5 bis 90 Gew.-% vorliegen.

4. Zubereitung nach Anspruch 1, umfassend eine Mischung mit mindestens einem Transferrin mit mindestens einem Proteaseinhibitor und mit mindestens einem Protein, ausgewählt aus Lysozymen und Albuminen, worin der Inhibitor in einer Konzentration von 1 bis 20 Gew.-% vorliegt, und mindestens ein Transferrin und mindestens ein Lysozym oder mindestens ein Albumin jeweils in einer Konzentration von 5 bis 94 Gew.-% vorliegen.

5. Zubereitung nach Anspruch 1, worin die Proteinmischung 5 bis 92% mindestens eines Transferrins, 5 bis 92% mindestens eines Albumins, 2 bis 80% mindestens eines Lysozyms und 1 bis 20% mindestens eines Proteaseinhibitors umfaßt, wobei die Prozentangaben in Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der Proteinmischung, ausgedrückt sind.

6. Zubereitung nach Anspruch 5, worin die Proteinmischung 10 bis 50% mindestens eines Transferrins, 40 bis 84% mindestens eines Albumins, 5 bis 30% mindestens eines Lysozyms und 1 bis 10% mindestens eines Proteaseinhibitors umfaßt.

7. Zubereitung nach Anspruch 5, worin die Proteinmischung 15 bis 25% mindestens eines Transferrins, 60 bis 75% mindestens eines Albumins, 5 bis 10% mindestens eines Lysozyms und 2 bis 5% mindestens eines Proteaseinhibitors umfaßt.

8. Zubereitung nach Anspruch 1, worin die Proteine ausgewählt sind aus der aus Proteinen natürlichen Ursprungs, umfassend Proteine menschlichen, tierischen und pflanzlichen Ursprungs, durch rekombinante DNA-Technologie erhal tenen Proteinen und chemisch synthetisierten Proteinen bestehenden Gruppe.

9. Zubereitung nach Anspruch 1 in einer Form, ausgewählt aus der eine flüssige Zubereitung, eine pastöse Zubereitung, eine feste Zubereitung und eine auf einem inerten Träger immobilisierte oder adsorbierte Zubereitung umfassenden Gruppe.

10. Zubereitung nach Anspruch 9 in Form einer Mundwäsche, umfassend 0,1 bis 10% w/v der Proteinmischung in einem Lösungsmittel, ausgewählt aus Wasser und Ethanol-Wasser- Mischungen.

11. Zubereitung nach Anspruch 10, ferner umfassend ein oder mehr Zusatzstoffe, ausgewählt aus Befeuchtungsmitteln, Süßstoffen, Geschmackstoffen, Verdickungsmitteln, Gerüststoffen, oberflächenaktiven Mitteln und antibakteriellen Mitteln und Mitteln gegen Zahnbelag, die für den topischen, oralen Gebrauch akzeptabel sind.

12. Zubereitung nach Anspruch 9 in einer Form, ausgewählt aus Zahnpasta und Zubereitungen zum Kauen, umfassend 1 bis 60 Gew.-% der Proteinmischung, einverleibt in eine herkömmliche Basis für Zahnpasta oder für eine Formulierung zum Kauen.

13. Zubereitung nach Anspruch 12, ferner umfassend ein oder mehr Zusatzstoffe, ausgewählt aus Verdickungsmitteln, Befeuchtungsmitteln, Süßstoffen, Geschmackstoffen und antibakteriellen Mitteln und Mitteln gegen Zahnbelag, die für den topischen, oralen Gebrauch akzeptabel sind.

14. Verwendung einer Zubereitung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung von Periodontitis oder anderen bakteriellen Störungen der Mundhöhle.







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