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Dokumentenidentifikation DE69325169T2 30.12.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0631631
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HÄM-PROTEINEN
Anmelder Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, DK
Erfinder JENSEN, Ejner, Bech, DK-2830 Virum, DK
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Bardehle, Pagenberg, Dost, Altenburg, Geissler, Isenbruck, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69325169
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 16.03.1993
EP-Aktenzeichen 939078150
WO-Anmeldetag 16.03.1993
PCT-Aktenzeichen DK9300094
WO-Veröffentlichungsnummer 9319195
WO-Veröffentlichungsdatum 30.09.1993
EP-Offenlegungsdatum 04.01.1995
EP date of grant 02.06.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.12.1999
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C12N 15/80   C12N 9/02   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Häm-Proteinen in erhöhten Ausbeuten.

Hintergrund der Erfindung

Das Klonieren und Exprimieren von verschiedenen Häm-Proteinen in Bakterien wurde beschrieben. So beschreiben S. A. Ortlepp et al., J. Biotechn., Bd. 11 (1989), S. 353-364, die Expression und die Charakterisierung von Meerrettich-peroxidase C in E, coli. Das Enzym wird intrazellulär als ein unlösliches Aggregat exprimiert, so daß es aus den lysierten Zellen gereinigt werden muß. Ferner wird das Enzym nicht in aktiver Form exprimiert und muß anschließend in Gegenwart von Häm und Ca²&spplus; getrennt gefaltet werden, um seine Funktion zu erhalten. In ähnlicher Weise beschreiben A. T. Smith et al., J. Biol. Chem., Bd. 265(22) (1990), S. 13335-13343, die Expression von Meerrettich-peroxidase C in E. coli. Das rekombinante Enzym weist eine geringere Aktivität als native Meerrettichperoxidase C auf und wird in einer Ausbeute von 2-3% (des gereinigten, aktiven Enzyms) gebildet. S. Loprasert et al., J. Bact., Bd. 171(9) (1989), S. 4871-4875, berichten über die Klonierung und Expression in E. coli von Peroxidase A aus Bacillus stearothermophilus. S. J. Hoffman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87, S. 8521-8525, beschreiben die Expression von funktionellem humanem Hämoglobin in E. coli, Z. Wang et al., J. Biotechn., Bd. 13 (1990), S. 131-144, beschreiben die Klonierung und Expression von Lignin-peroxidase aus Streptomyces viridosporus in Streptomyces lividans.

Die Expression von humanen Hämoglobinen in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) wurde von M. Wagenbach et al., Bio/Technology, Bd. 9 (1991), S. 57-61, beschrieben. In Hefe wird Hämoglobin als ein vollständig zusammengesetztes, hämhaltiges Tetrameres exprimiert. Jedoch wird das Protein nicht aus den Hefezellen sezerniert, sondern verbleibt im zytoplasmatischen Raum und muß daraus gereinigt werden. Es wäre daher vorteilhaft, einen Wirtsorganismus, z. B. einen filamentösen Pilz, auszuwählen, der dazu befähigt ist, nicht nur Häm-Proteine zu erzeugen, sondern sie auch durch die Zellmembran in aktiver Form zu exportieren, um dadurch die Reinigungsverfahren zu vereinfachen.

In den letzten Jahren wurden Verfahren zur Transformation von filamentösen Pilzen, unter Einschluß von Aspergillus niger und Aspergillus nidulans, entwickelt. US-4 885 249 (Allelix) beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Transformation von A. niger, das als Beispiel anhand der Einführung von Plasmiden, die für selektierbare Marker kodierende Gene tragen, erläutert wird. EP-215 594 (Genencor) beschreibt die Expression und Sekretion von verschiedenen Proteinen in A. nidulans, wobei die Signalsequenzen von verschiedenen Aspergillus-Proteinen zur Gewährleistung der Sekretion herangezogen werden.

Keine dieser Druckschriften gibt einen Hinweis auf die Möglichkeit zur Erzeugung von Häm-Proteinen in filamentösen Pilzen. Ganz im Gegenteil beschreiben M. Saloheimo et al., Gene, Bd. 85 (1989), S. 343-351, die Klonierung und Expression einer Lignin-peroxidase aus Phlebia radiata in Trichoderma reesei. Die Autoren berichten, daß zwar Lignin-peroxidasemRNA in T. reesei exprimiert wird, daß aber kein Proteinprodukt nachgewiesen werden konnte. Sie stellen die Vermutung an, daß dies auf einen intrazellulären Abbau durch Proteasen aufgrund einer nicht richtigen Faltung des Proteins in Abwesenheit von Häm oder auf eine unterschiedliche Struktur der RNA, die deren Translation stört, zurückzuführen ist.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß bei Zugabe von Hämin oder eines anderen Materials mit einem Gehalt an Häm-Gruppen zu einem Fermentationsmedium für die Züchtung von Mikroorganismen, die eine Überproduktion des Apoproteins eines Häm-Proteins bewirken, die Häm-Gruppe an das Protein gebunden wird, wodurch das Apoprotein aktiviert wird und eine Konformation annimmt, bei der es gegen einen proteolytischen Abbau stabiler ist. Die Gesamtausbeute an Häm-Protein wird erheblich erhöht. Auf diese Weise kann die endogene Häm-Synthese im Wirtsorganismus, die häufig einen Engpaß bei der Expression von Häm-Proteinen darstellt, überwunden werden.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Häm-Proteins in erhöhten Ausbeuten, wobei das Verfahren die Züchtung eines Häm-Apoprotein bildenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium, das Häm oder ein hämhaltiges Material enthält, unter Bedingungen, die die Bildung eines aktiven, rekombinierten Häm-Proteins ermöglichen, und die Gewinnung des erhaltenen Häm-Proteins aus dem Medium umfaßt.

Der hier verwendete Ausdruck "Häm-Protein" soll ein beliebiges Mitglied aus einer Gruppe von Proteinen, die Häm (z. B. Protoporphyrin IX) als eine prosthetische Gruppe enthalten, umfassen. Der Ausdruck "Apoprotein" soll auf eine Form des Häm-Proteins hinweisen, dem die prosthetische Gruppe fehlt. Der Ausdruck "extrazelluläres Häm-Protein" ist so zu verstehen, daß im Gegensatz zu den Häm-Proteinen, die gemäß dem Stand der Technik durch Erzeugung in Bakterien oder Hefe bereitgestellt werden, die Aproprotein-Form des Häm-Proteins aus der Wirtszelle in das Kulturmedium sezerniert wird, wo es (zum Gesamtprotein) rekombiniert wird, wobei die prosthetische Häm-Gruppe durch Zugabe von Häm oder eines hämhaltigen Materials zum Medium bereitgestellt wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem das Häm-Protein erzeugenden Mikroorganismus um einen Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der eine für das Häm-Protein kodierende DNA-Sequenz umfaßt, transformiert worden ist.

Diese DNA-Sequenz kann synthetisch nach anerkannten standardmäßigen Verfahren hergestellt werden, z. B. gemäß dem von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859-1869, beschriebenen Phosphoamidit-Verfahren oder gemäß dem von Matthes et al., EMBO Journal, Bd. 3 (1984), S. 801-805, beschriebenen Verfahren. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonucleotide synthetisiert, z. B. in einem automatisierten DNA-Synthesegerät, gereinigt, anelliert, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.

Die DNA-Sequenz kann auch genomischen Ursprungs sein oder einen cDNA-Ursprung aufweisen, wobei es sich beispielsweise um eine Sequenz handeln kann, die durch Herstellung einer genomischen oder cDNA-Bank und Screening auf DNA-Sequenzen, die für die Gesamtheit oder einen Teil des Häm-Proteins kodieren, durch Hybridisieren unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotidsonden gemäß standardmäßigen Techniken erhalten worden sind (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor, 1989). In diesem Fall kann eine genomische oder cDNA-Sequenz, die für das Häm-Protein kodiert, an einer Stelle modifiziert werden, die der oder den Stellen entspricht, an denen es erwünscht ist, Aminosäuresubstitutionen einzuführen, beispielsweise durch positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von synthetischen Oligo nucleotiden, die für die gewünschte Aminosäuresequenz kodieren, eine homologe Rekombination nach bekannten Verfahren vorzunehmen.

Schließlich kann die DNA-Sequenz gemischten synthetischen und genomischen Ursprungs, gemischten synthetischen und cDNA-Ursprungs oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, die durch Ligation von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (je nachdem, was zutrifft) nach standardmäßigen Techniken hergestellt worden sind, wobei die Fragmente den verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz entsprechen. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von speziellen Primern hergestellt werden, beispielsweise gemäß den Angaben in US-4 683 202 oder gemäß R. K. Saiki et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 487-491.

Nach Durchführung der Konstruktion wird die für das Häm-Protein kodierende DNA-Sequenz in einen rekombinanten Expressionsvektor inseriert. Dabei kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der in zweckmäßiger Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen werden kann. Die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in die der Vektor einzuführen ist. Somit kann es sich bei dem Vektor um einen autonom replizierenden Vektor handeln, d. h. einen Vektor, der in einer extrachromosomalen Einheit vorliegt, wobei die Replikation des Vektors unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, wobei ein Beispiel hierfür ein Plasmid ist. Alternativ kann es sich um einen Vektor handeln, der bei Einführung in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert wird und zusammen mit dem oder den Chromosomen, in die er integriert worden ist, repliziert wird.

Im Vektor soll die für das Häm-Protein kodierende DNA-Sequenz in funktioneller Weise mit einer geeigneten Promotor- und Terminatorsequenz verbunden sein. Beim Promotor kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln, die in der Wirtszelle der Wahl eine transkriptionelle Aktivität zeigt, wobei diese Sequenz von Genen abgeleitet sein kann, die für Proteine, die für die Wirtszelle homolog oder heterolog sind, kodieren. Wenn es sich bei der Wirtszelle um einen filamentösen Pilz handelt, kann der Promotor von einem Gen abgeleitet sein, das für ein extrazelluläres oder intrazelluläres Protein kodiert, beispielsweise für eine Amylase, eine Glucoamylase, eine Protease, eine Lipase, eine Cellulase oder ein glykolytisches Enzym. Beispiele für geeignete Promotoren sind solche, die von einem Gen abgeleitet sind, das für A. oryzae-TAKA-Amylase, für Rhizomucor miehei-Aspartat-proteinase, A. niger-neutrale α-Amylase, A. niger-säure stabile α-Amylase, A. niger-Glucoamylase, Rhizomucor miehei-Lipase, A. oryzae-alkalische Protease oder A. oryzae-Triosephosphat-isomerase kodiert. Die Terminatorsequenzen können von den gleichen Quellen wie der Promotor abgeleitet sein.

Für die extrazelluläre Expression geht der DNA-Sequenz, die für das Häm-Protein kodiert, vorzugsweise eine Signalsequenz voraus, die von einem für ein sezerniertes Protein kodierenden Gen abgeleitet sein kann. Somit kann die Signalsequenz zweckmäßigerweise von dem Gen abgeleitet sein, das für A. oryzae-TAKA-Amylase, A. niger-neutrale α-Amylase, A. niger-säurestabile α-Amylase, A. niger-Glucoamylase oder eine Coprinus macrorhizus- oder cinerius-Peroxidase kodiert.

Die Verfahren, die dazu herangezogen werden, um die DNA-Sequenzen, die für das Häm-Protein, den Promotor, den Terminator bzw. gegebenenfalls für die Signalsequenz kodieren, zu ligieren und sie in geeignete Vektoren zu inserieren, sind dem Fachmann geläufig (vgl. beispielsweise Sambrook et al., a. a. O.).

Der mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformierte Mikroorganismus kann in bezug zum Häm-Protein homolog (d. h. das Gen wird in den Organismus, aus dem es ursprünglich abgeleitet ist, zurücktransformiert) oder heterolog sein. Vorzugsweise handelt es sich um einen Pilz, insbesondere um einen filamentösen Pilz, z. B. einen Pilz der Gruppen Phycomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes oder Fungi imperfecti, einschließlich Hyphomycetes, z. B. solche der Gattungen Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium oder Humicola. Beim filamentösen Pilzwirtsorganismus kann es sich zweckmäßigerweise um einen Organismus handeln, der vorher als Wirt zur Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet worden ist, z. B. um einen Stamm von Aspergillus sp., wie A. niger, A. nidulans oder A. oryzae. Die Verwendung von A. oryzae bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen ist ausführlich beispielsweise in EP-238 023 beschrieben.

Bei dem durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Häm-Protein handelt es sich vorzugsweise um eine Oxidoreduktase, insbesondere um eine Peroxidase, unter Einschluß einer Lignin-peroxidase oder Mn-Peroxidase oder Halogenperoxidase. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist die für die Peroxidase kodierende Sequenz von einem Coprinus sp., insbesondere von Coprinus macrorhizus oder cinereus, oder von Arthromyces ramosus abgeleitet. Beim Häm-Protein kann es sich auch um eine Katalase handeln, z. B. um eine von Aspergillus niger abgeleitete Katalase.

Bei dem für die Züchtung der transformierten Wirtszellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium handeln, das für die Züchtung des in Frage stehenden Wirtsorganismus geeignet ist. Das dem Medium zugesetzte Häm oder hämhaltige Material, um die Rekombination des sezernierten Apoproteins mit der Häm-Gruppe zu erreichen, kann in geeigneter Weise durch die Zugabe von Hämin oder vorzugsweise von Hämoglobin oder roten Blutkörperchen bereitgestellt werden, da die Häm-Gruppe beim Erwärmen funktionell bleibt, was das Autoklavisieren von Medien, die eine dieser Substanzen enthalten, erlaubt. Wenn Hämin zum Fermentationsmedium gegeben wird, kann es geeigneterweise in einer Menge von 1- 1000 mg/Liter und insbesondere von 10-100 mg/Liter vorliegen. Bei Zusatz von Hämoglobin zum Medium kann dieses geeigneterweise in einer Menge von 0,5-50 g/Liter und insbesondere von 1-25 g/Liter vorliegen. Bei Zugabe von roten Blutkörperchen zum Medium, können diese geeigneterweise in einer Menge von 0,5-50 g/Liter und insbesondere von 1-25 g/Liter vorliegen.

Es wurde festgestellt, daß die Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels im Fermentationsmedium zu einer erhöhten Ausbeute an Häm-Protein führt, was derzeit der Fähigkeit von oberflächenaktiven Mitteln, das Protein zu stabilisieren, zugeschrieben wird. Infolgedessen ist es bevorzugt, ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X-100R (ein Polyoxyethylen-Polymeres), Polyethylenglykol oder GlanaponR (ein Polymeres von Polyethylenoxid mit Fettsäure-Seitenketten), dem Medium z. B. in einer Menge von 1-100 ml/Liter zuzusetzen.

Nachstehend wird die Erfindung durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die aber keinesfalls eine Beschränkung des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung darstellen sollen.

Beispiel 1 Klonierung von für Coprinus cinereus-Peroxidase kodierender cDNA Konstruktion einer Sonde durch PCR

Peroxidase-cDNA-Fragmente wurden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von speziellen Oligonucleotid-Primern (R. K. Saiki et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 487-491), die auf der Basis der Aminosäuresequenz von Coprinus macrorhizus-Peroxidase konstruiert worden waren, hergestellt. Die PCR wurde unter Verwendung des Gene Amp-Kits und der entsprechenden Vorrichtung (erhältlich von der Fa. Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Umsetzung für die ersten drei Zyklen bei 28ºC durchgeführt wurde, um eine bessere Hybridisierung mit dem ersten cDNA- Strang (hergestellt aus mRNA aus Coprinus cinereus, IFO 8371) zu erreichen. Anschließend wurden 30 PCR-Zyklen bei 65ºC durchgeführt.

Für die PCR wurden die folgenden speziellen Primer verwendet:

"N" bedeutet ein Gemisch sämtlicher vier Nucleotide.

Die Primer wurden folgendermaßen kombiniert: 1 mit 2, 3 mit 4, 5 mit 7, 6 mit 7, 1 mit 4, 1 mit 7 und 3 mit 7. Die PCR-Fragmente wurden auf diese Weise mit einer EcoRI-Stelle am 5-Ende und mit einer BamHI-Stelle am 3'-Ende erweitert. Die PCR-Reaktionen wurden an einem 1%-Agarosegel analysiert. Banden der erwarteten Größe fanden sich bei sämtlichen Reaktionen. Um zu bestätigen, daß die Banden den für Peroxidase spezifischen Sequenzen entsprachen, wurde das Gel einem Southern-Blotting unterworfen und mit einer Oligonucleotidsonde der folgenden Sequenz hybridisiert

die zwischen den PCR-Primern 3 und 4 positioniert wird. Es wurde festgestellt, daß die Sonde mit Banden von etwa 130 bp, 420 bp, 540 bp und 240 bp hybridisiert, was bestätigt, daß die beobachteten DNA-Banden den Peroxidase-Sequenzen entsprachen.

DNA aus verschiedenen PCR-Reaktionen wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und in das Plasmid pUC19 kloniert (C. Yanisch-Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119). Kolonien, die die richtigen PCR-Fragmente enthielten, wurden durch Hybridisierung unter Verwendung der vorstehend angegebenen Oligonucleotidsonde identifiziert. DNA aus positiven Kolonien wurde durch Restriktionsenzymkartierung und partielle DNA-Se quenzanalyse gemäß den Angaben von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467, analysiert. Ein 430 bp-Fragment aus einem der Klone, das unter Verwendung der Primer 1 und 4 erhalten worden war, wurde zum Screening einer Coprinus cinereus-cDNA-Bank gemäß den nachstehenden Angaben verwendet.

Konstruktion einer Coprinus cinereus-cDNA-Bank in E. coli

Gesamt-RNA wurde aus homogenisiertem Coprinus cinereus (IFO 8371)- Myzel, das zum Zeitpunkt der maximalen Aktivität der Peroxidase gemäß den von Boel et al. (EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1097-1102) und Chirgwin et al., (Biochemistry (Wash), Bd. 18 (1979), S. 5294-5299) beschriebenen Verfahren gewonnen worden war, homogenisiert. Poly(A)-enthaltende RNA wurde durch zwei Affinitätschromatographiezyklen an oligo(dT)-Cellulose gemäß den Angaben von Aviv und Leder (PNAS, USA, Bd. 69 (1972), S. 1408- 1412) erhalten. cDNA wurde mittels eines cDNA-Synthesekits der Fa. Invitrogen gemäß den Angaben des Herstellers synthetisiert. Etwa 50 000 E. coli-Rekombinanten aus der Coprinus cinereus-cDNA-Bank wurden auf Whatman 540-Papierfilter übertragen. Die Kolonien wurden gemäß den Angaben von Gergen et al. (Nucleic Acids Res., Bd. 7 (1979), S. 2115-2135) lysiert und immobilisiert. Die Filter wurden mit der ³²P-markierten 430 bp-Peroxidase-spezifischen Sonde in 0,2 · sec, 0,1% SDS, hybridisiert. Die Hybridisierung und das Waschen der Filter wurden bei 65ºC durchgeführt, wonach sich eine 24-stündige Autoradiographie mit einem Intensivierungsfilter anschloß. Nach der 24-stündigen Autoradiographie wurden die Filter mit steigenden Temperaturen gewaschen, wonach sich eine 24-stündige Autoradiographie mit einem Verstärkungsfilter anschloß. Auf diese Weise wurden mehr als 50 positive Klone identifiziert. Miniprep-Plasmid-DNA wurde aus hybridisierenden Kolonien gemäß standardmäßigen Verfahren (Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res., Bd. 7 (1979, S. 1513-1523) isoliert. Die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts wurde gemäß dem Sanger-Didesoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467) bestimmt. Das Peroxidase-cDNA-Fragment wurde aus dem Vektor durch Spaltung mit HindIII/XhoI geschnitten und durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, der Elektroelution unterzogen und für die Ligationsreaktionen fertiggestellt. Das cDNA-Fragment wurde mit. HindIII-XhoI-verdautem pHD414 ligiert, um pCip zu erzeugen, in dem die cDNA unter der transkriptionellen Kontrolle des TAKA-Promotors aus Aspergillus oryzae und des AMG-Terminators aus Aspergillus niger steht.

Konstruktion des Aspergillus-Expressionsvektors pHD414

Der Vektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP-238 023). Im Gegensatz zu p775 weist pHD414 eine Folge von besonderen Restriktionsstellen zwischen dem Promotor und dem Terminator auf.

Das Plasmid wurde durch Entfernung eines Fragments von etwa 200 bp Länge (mit einem Gehalt an unerwünschten Restriktionsstellen) am 3'-Ende des Terminators und durch anschließende Entfernung eines Fragments von etwa 250 bp Länge am 5'-Ende des Promotors, das ebenfalls unerwünschte Restriktionsstellen enthielt, konstruiert. Die 200 bp-Region wurde aus p775 durch Spaltung mit NarI (im pUC-Vektor positioniert) und XbaI (unmittelbar in 3'-Stellung zum Terminator positioniert) entfernt, wonach sich die Auffüllung der erzeugten Enden mit Klenow-DNA-Polymerase + dNTP, die Reinigung des Vektorfragments am Gel und die Religation des Vektorfragments anschlossen. Die DNA wurde in E. coli MC1061 gemäß den vorstehenden Angaben transformiert. 10 Kolonien (pHD413-1 bis -10) wurden ausgewählt und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Einer der Klone, der das erwartete Bandenmuster bei der Restriktionsenzymanalyse aufwies, wurde bei der Konstruktion von pHD414 verwendet.

pHD413 wurde mit StuI (positioniert im 5'-Ende des Promotors) und PvuII (positioniert im pUC-Vektor) geschnitten und an einem Gel fraktioniert. Das Vektorfragment wurde gereinigt, religiert und in E. coli MC1061 transformiert. 12 Kolonien wurden ausgewählt und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Sämtliche 12 Klone wiesen das erwartete Bandenmuster auf. Das Plasmid pHD414 ist in Fig. 1 dargestellt.

Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger (allgemeines Verfahren)

100 ml YPD-Medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) wurden mit Sporen von A. oryzae oder A. niger inokuliert und etwa 2 Tage unter Schütteln bei 37ºC inkubiert. Das Myzel wurde durch Filtration durch Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO&sub4; gewaschen. Das Myzel wurde in 15 ml 1,2 M MgSO&sub4;·10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 5,8, suspendiert. Die Suspension wurde auf Eis gekühlt und mit 1 ml Puffer mit einem Gehalt an 120 mg NovozymR 234, Charge 1687, versetzt. Nach 5 Minuten wurde 1 ml einer Lösung von 12 mg/ml BSA (Sigma Typ H25) zugesetzt. Die Inkubation unter mäßiger Bewegung wurde 1,5-2,5 Stunden bei 37ºC fortgesetzt, bis in einer unter dem Mikroskop betrachteten Probe eine große Anzahl von Protoplasten sichtbar war.

Die Suspension wurde durch Miracloth filtriert. Das Filtrat wurde in ein steriles Röhrchen übertragen und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,0, überschichtet. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 100 · g wurden Protoplasten aus dem Oberteil des MgSO&sub4;-Kissens gewonnen. 2 Volumina STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) wurden zu der Protoplastensuspension gegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 1000 · g zentrifugiert. Das Protoplastenpellet wurde in 3 ml STC resuspendiert und repelletisiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt. Schließlich wurden die Protoplasten in 0,2-1 ml STC resuspendiert.

100 ul der Protoplastensuspension wurde mit 5-25 ug der entsprechenden DNA in 10 ul STC vermischt. Protoplasten aus den argB-Stämmen wurden mit pSa143-DNA (ein A. nidulans-argB-Gen, das das Plasmid trug) vermischt. Protoplasten aus den argB&spplus;-Stämmen wurden mit p3SR2 (einem A. nidulans-amdS-Gen, das das Plasmid trug) vermischt. Das Gemisch wurde 25 Minuten bei Raumtemperatur belassen, Sodann wurden 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, zugegeben und sorgfältig (2 mal) vermischt. Schließlich wurden 0,85 ml der gleichen Lösung zugegeben und sorgfältig vermischt. Das Gemisch wurde 25 Minuten bei Raumtemperatur belassen und 15 Minuten mit 2500 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation wurden die Protoplasten auf den geeigneten Platten verteilt. Protoplasten von den argB-Stämmen, die mit pSal143 transformiert waren, wurden auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta., Bd. 113 (1966), S. 51-56) mit Glucose und Harnstoff als Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen, die 1,2 M Sorbit für eine osmotische Stabilisierung enthielten, verteilt. Protoplasten aus den argB-Stämmen, die mit p3SR2 transformiert waren, wurden auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta, Bd. 113 (1966), S. 51-56, die 1,0 M Saccharose, pH-Wert 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zur Hemmung des Hintergrundwachstums enthielten, verteilt. Nach 4- bis 7-tägiger Inkubation bei 37ºC wurden Sporen entnommen, in sterilem Wasser suspendiert und zu Einzelkolonien verteilt. Dieses Verfahren wurde wiederholt. Sporen einer einzelnen Kolonie nach der zweiten Reisolation wurden als definierte Transformanten gelagert.

Beispiel 2 Herstellung von rekombinanter Coprinus cinereus-Peroxidase in einem A. oryzae-Stamm in einem Hämin enthaltenden Fermentationsmedium

pCip wurde in A. oryzae A1560 (IFO 4177) durch Cotransformation mit p3SR2, das das vorstehend beschriebene amdS-Gen aus A. nidulans enthielt, mit einem Gemisch aus gleichen Mengen an pCip und p3SR2 (etwa jeweils 5 ug) transformiert. Transformanten, die zur Verwertung von Acetamid als einziger Stickstoffquelle befähigt waren, wurden 2 mal reisoliert.

300 ml fassende Propylen-Schüttelkolben enthielten 50 ml ASP03-Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung:

Hefeextrakt 1 g/l

Bernsteinsäure 10 g/l

MgCl&sub2;·6H&sub2;O 0,82 g/l

KCl 1,83 g/l

NaH&sub2;PO&sub4; · 2H&sub2;O 1,01 g/l

Na&sub2;SO&sub4; 1,8 g/l

Harnstoff 2 g/l

Citronensäure 2 g/l

Lösung von Spurenmetallen 0,5 ml/l

PluronicR 0,1 ml/l

Wasser ad 1000 ml

pH-Wert mit NaOH auf 6,00 eingestellt.

Die Kolben wurden 60 Minuten bei 121ºC autoklavisiert, wonach die Zugabe von 20 g/Liter Maltodextrin und variierenden Mengen an Hämin (Sigma H-2250), das in 0,01 M NaOH gelöst und durch eine 0,2 um Membran steril in die Kolben filtriert wurde (pH-Wert 12), erfolgte. Sodann wurde eine Inokulation mit 1 ml einer Sporensuspension (etwa 10&sup6; Sporen/ml) von A. oryzae-Transformanten sowie eine 72-stündige Inkubation bei 34ºC und 300 U/min vorgenommen.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Die Peroxidase-Aktivität wurde in PODU/ml gemessen (1 PODU (Peroxidase- Einheit) ist als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1 uMol H&sub2;O&sub2; pro Minute in einem System katalysiert, in dem 2,2-Azinobis-[3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonat] in Gegenwart von 1 mM H&sub2;O&sub2;, pH-Wert 7,0, bei einer Temperatur von 25ºC oxidiert wird).

Hämin-Konzentration im Medium Peroxidase-Aktivität nach 72 Stunden

0 mg/l 300 PODU/ml

1 - 360 -

10 - 680 -

100 - 1000 -

1000 - 1029 -

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Zugabe von Hämin zum Wachstumsmedium die Peroxidase-Ausbeute erheblich steigert.

Beispiel 3 Erzeugung einer rekombinanten Coprinus cinereus-Peroxidase in einem A. oryzae-Stamm in einem Fermentationsmedium, das Hämin und ein oberflächenaktives Mittel enthält

A. oryzae-Transformanten, die auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden waren, wurden gemäß den Angaben in Beispiel 2 in einem Medium das mit Glanapon DG 160 (Produkt der Fa. Bussetti) als oberflächenaktivem Mittel vor dem Autoklavisieren versetzt worden war, gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß das zugesetzte Glanapon zusammen mit Hämin einen hervorragenden synergistischen Einfluß auf die Peroxidase-Ausbeute ergibt.

Beispiel 4 Erzeugung einer rekombinanten Coprinus cinereus-Peroxidase in einem A. oryzae-Stamm in einem Fermentationsmedium, das Hämin, Hämoglobin oder rote Blutkörperchen enthält

Auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene A. oryzae-Transformanten wurden gemäß den Angaben in Beispiel 2 in einem Medium, das mit Hämin, Hämoglobin (Merck Art 4300) oder roten Blutkörperchen (sprühgetrocknetes Gemisch aus Schweine- und Rinder-Erythrozyten, Futtermittelqualität) versetzt worden war (vor oder nach dem Autoklavisieren) erhalten. Hämoglobin und rote Blutkörperchen wurden beim pH-Wert 10,5 (NaOH) vor dem Autoklavisieren und Sterilfiltrieren gelöst. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.

Peroxidase-Aktivität nach 72 Stunden

Aus der Tabelle geht hervor, daß Häm-Quellen, bei denen die Häm- Gruppe an Globin gebunden ist, zu einer signifikanten Steigerung der Peroxidase-Ausbeute führen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sie sehr billig erhalten werden können, und daß die Häm-Gruppe während der Wärmestabilisation gegen eine Zerstörung geschützt ist.

Beispiel 5 Erzeugung einer rekombinanten Coprinus cinereus-Peroxidase in einem A. oryzae-Stamm in einem 2 Liter fassenden Fermenter in einem Fermentationsmedium mit einem Gehalt an Hämoglobin

Gemäß den vorstehenden Angaben erhaltene A. oryzae-Transformanten wurden in 2 Liter fassenden Laboratoriumsfermentern in einem Zugabeverfahren (fed batch-Verfahren) gemäß folgenden Angaben fermentiert:

Tankmedium: MgSO&sub4;·7H&sub2;O 2 g/l

KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l

K&sub2;SO&sub4; 3 g/l

Citronensäure 4 g/l

Spurenmetall-Hefeextrakt 1 g/l

Pluronic 0,2 ml/l

Einspeisungsmedium: Maltose 250 g/l

Hefeextrakt 7 g/l

FeSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g/l

Harnstoff 20 g/l

Pluronic 2 ml/l

Fermentationsbedingungen: 2,0 l-Fermenter

Temperatur 34ºC

pH-Wert 7,8

pO&sub2; > 20% durch Erhöhung der Rührgeschwindigkeit

Belüftung: 1 VVM

Einspeisungsprofil: 3 g/lxh 0-24 Stunden

6 g/lxh 24-144 Stunden

Inokulation mit 50 ml einer 24 Stunden

alten ASP03-Schüttelkolbenkultur.

Während der Sterilisation stieg der pH-Wert für das Tankmedium und/oder das Einspeisungsmedium (falls mit Hämoglobin versetzt) auf 10,5. Das Hämoglobin wurde 40 Minuten beim pH-Wert 10,5 bei 121ºC autoklavisiert. Vor der Fermentation wurde der pH-Wert auf 7, 8 eingestellt.

Die Ergebnisse gehen aus der nachstehenden Tabelle hervor.

* Die Ausbeute an Peroxidase im Medium ohne zugesetztes Hämoglobin wird willkürlich auf 100% festgesetzt.

Aus der Tabelle ergibt sich, daß die Ausbeute an Peroxidase erheblich erhöht werden kann, indem man das Fermentationsmedium mit Hämoglobin versetzt. Ohne Hämin war es nicht möglich, die gleiche Ausbeutesteigerung zu erzielen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Häm-Proteins in erhöhten Ausbeuten, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Züchten eines filamentösen Pilzes, der mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert worden ist, der eine für ein Häm-Protein kodierende DNA-Sequenz umfaßt und der eine Überproduktion und Sekretion des entsprechenden Apoproteins bewirkt, wobei die Züchtung in einem Fermentationsmedium, das Häm oder ein hämhaltiges Material enthält, unter Bedingungen erfolgt, bei denen die Häm-Gruppe an das Apoprotein gebunden wird, und Gewinnen des erhaltenen Häm-Proteins aus dem Kulturmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz für ein heterologes Häm-Protein kodiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim filamentösen Pilz um einen Stamm von Aspergillus, z. B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, handelt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich beim Häm-Protein um eine Oxidoreduktase oder eine Katalase handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Oxidoreduktase um eine Peroxidase oder eine Halogenperoxidase handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Peroxidase von einer Spezies von Coprinus, z. B. Coprinus macrorhizus oder Coprinus cinereus, oder von Arthromyces, z. B. Arthromyces ramosus, abgeleitet ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich beim hämhaltigen Material um Hämoglobin oder rote Blutkörperchen handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fermentationsmedium Hämin in einem Anteil von 1-1000 mg/Liter und insbesondere von 10-100 mg/Liter enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Fermentationsmedium Hämoglobin in einer Menge von 0,5-50 g/Liter und insbesondere von 1-25 g/Liter enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Fermentationsmedium rote Blutkörperchen in einer Menge von 0,5-50 g/Liter und insbesondere von 1- 25 g/Liter enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei das Fermentationsmedium zusätzlich ein oberflächenaktives Mittel enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Fermentationsmedium das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von 1-100 ml/Liter enthält.







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