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Dokumentenidentifikation DE69327050T2 24.02.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0636139
Titel REINIGUNG VON 5-7-DIEN-STEROIDEN VON EINEM STERINGEMISCH
Anmelder SRI International, Menlo Park, Calif., US
Erfinder TANABE, Masato, Palo Alto, CA 94303, US;
JOHANSSON, John, G., Menlo Park, CA 94025, US;
YASUDA, Dennis, Campbell, CA 95008, US
Vertreter Dr. Weber, Dipl.-Phys. Seiffert, Dr. Lieke, 65189 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 69327050
Vertragsstaaten CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 14.04.1993
EP-Aktenzeichen 939122610
WO-Anmeldetag 14.04.1993
PCT-Aktenzeichen US9303559
WO-Veröffentlichungsnummer 9321205
WO-Veröffentlichungsdatum 28.10.1993
EP-Offenlegungsdatum 01.02.1995
EP date of grant 17.11.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.02.2000
IPC-Hauptklasse C07J 71/00
IPC-Nebenklasse C07J 9/00   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft allgemein Syntheseverfahren für Steroide und spezieller ein neues Verfahren zur Isolierung von Steroiden, die eine 5,7-Dienfunktionalität enthalten, aus einem Gemisch von Sterinen. Das Verfahren ist zur Isolierung von 5,7-dienhaltigen Sterinen aus einem Gemisch, das Hefe-Sterinabbauprodukte enthält, besonders brauchbar.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung entstand aus der Entwicklung eines biotechnologischen Fermentationsverfahrens, das ein Hefe-Steringemisch erzeugt, welches an Cholesta-5,7,24- trien-3β-ol angereichert ist und von anderen diolefinischen Hefe-Sterinabbauprodukten begleitet ist. Das obenerwähnte Trienol mit der chemischen Struktur (I)

ist eine wertvolle Verbindung, die unter anderem als ein Zwischenprodukt bei der Synthese verschiedener Verbindungen wertvoll ist, die zu Vitamin D&sub3;-Derivaten verwandt sind, z. B. Cholesta-5,7-dien-3β-25-diol und anderen 25-substituierten Vitamin D&sub3;-Vorläufern. Demnach ist es erforderlich, ein gangbares Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Trienols (I) aus einem Fermentationsgemisch zu bekommen, welches Hefe-Sterinabbauprodukte einschließlich Lanosterol, 4,4-Dimethylzymosterol, 4-Methylzymosterol, Zymosterol und Cholesta-7,24-dien- 3β-ol einschließen. Das Gemisch kann auch Squalen enthalten. Wie man aus den folgenden Strukturen ersehen kann, enthält eine Anzahl dieser Verbindungen zwei oder mehr Ungesättigtheitsgrade. So muß das Isolier- und Trennverfahren spezifisch sein.

Die vorliegende Erfindung begann somit als eine Methode zur Isolierung und Abtrennung von Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol von einem Gemisch der obenerwähnten Hefe- Sterinstoffwechselprodukte. Es wurde jedoch jetzt klar, daß die ursprünglich für die obenerwähnte Isolierung und Abtrennung entwickelte Synthesemethode breit auf die Entfernung von Steroiden, die 5,7-Diene enthalten, allgemein aus einem Gemisch von Sterinen, von denen einige zwei oder mehr Ungesättigtheitsgrade enthalten können, anwendbar ist.

Überblick über den Stand der Technik

Die folgenden Literaturstellen betreffen einen oder mehrere Aspekte der vorliegenden Erfindung:

S. C. Eyley et al., J. C. S. Perkins Trans. I., Seiten 771 bis 735 (1976) beschreiben ein Verfahren zum Synthetisieren von 25-Hydroxyprovitamin D&sub3; und 25ξ,26-Dihydroxyprovitamin D&sub3;. Das Verfahren schließt eine Anfangsreaktion des C-22-Aldehyds, der sich durch Abbau von Ergosterol herleitet, mit einem Grignard-Reagens, das sich von 4-Chlor-2-methylbut-1-en herleitet, und anschließende reduktive Entfernung des Mesylats des resultierenden C-22- Alkohols ein.

J. P. Moreau et al., J. Org. Chem., 39 (14), Seiten 2018 bis 2023 (1974) ist eine Hintergrundsliteraturstelle, die die Synthese von 5α-Cholesta-7,24-dien-3β-ol und Cholesta- 5,7,24-trien-3β-ol beschreibt.

J. W. Blunt et al., Biochemistry, 8 (2), Seiten 671 bis 675 (Februar 1969) beschreiben Verfahren zum Synthetisieren von Cholesta-5,7-dien-3β,25-diol gefolgt von einer Umwandlung in 25-Hydroxycholecaliferol.

S. S. Yang et al., Tetrahedron Letters, 27, Seiten 2315 und 2316 (1977) ist eine Hintergrundsliteraturstelle, die ein Verfahren zum Synthetisieren von 25-Fluorvitamin D&sub3; beschreibt.

D. R. Crump et al., J. C. S. Perkins Trans. I, Seiten 2731 bis 2733 (1973) beschreiben ein Verfahren zum Synthetisieren von (22S)-Hydroxyvitamin D&sub4; unter Verwendung von Ergosterolacetat als Ausgangsmaterial. Die Synthese schließt eine selektive Epoxidierung der 22,23-Doppelbindung von Ergosterolacetat ein, auf die eine Grignard-Reaktion mit dem Hexanor-22-aldehyd und Bestrahlung folgen.

A. M. Moiseenkov et al., Bioorg. Khim., 9 (1), Seiten 118 bis 122 (1983) beschreiben eine Cyclopropylcarbinylumlagerung zur Herstellung von 25-Hydroxycholesterol und 25- Hydroxyprovitamin D&sub3;. Die Synthese schließt ein Zwischenprodukt ein, welches ein Diels- Alder-Addukt eines 5,7-Diens ist.

G. M. Segal et al., Bioorg. Khim., 7 (3), Seiten 429 bis 435 (1981) beschreiben eine Synthese von (Z)-17(20)-Dehydrocholesterol und 25-Hydroxyprovitamin D&sub3; und gehen von 17-Kerosteroiden aus. Die Literaturstelle zeigt ein geschütztes 5,7-dienhaltiges Steroid in der Form eines Diels-Alder-Adduktes.

I. L. Stoilor et al., Tetrahedron, 48 (10), Seiten 2213 bis 2222 (1987) beschreiben ein Verfahren zur Abtrennung eines 5,7-haltigen Sterins von einem Gemisch von Δ5-Sterinen und Δ5,7-Sterinen unter Verwendung von 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion.

D. H. R. L. Barton et al., J. Chem. Soc. (C), Perkin Transactions, 1, Nr. 11, Seiten 1326 bis 1333 (1974) beschreiben die Biosynthese von Ergosterol und die Isolierung von Ergosterolacetat aus einer Kultur unter Verwendung von 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion.

D. H. R. Barton et al., J. Chem. Soc. (D) Chem. Commun. Nr. 15, Seiten 939 und 940 (1970) beschreiben die Herstellung eines Diels-Alder-Adduktes, das durch Behandlung von Ergosterol mit 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion gebildet wird.

D. H. R. Barton et al., J. Chem. Soc. (C), Perkin Transactions, 1, Seiten 1968 bis 1974 (1971) beschreiben die Verwendung von 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion unter Bildung eines Diels-Alder-Adduktes mit Ergosterol.

A. I. Shul'man et al., J. Gen. Chem. USSR, 58 (1), Seiten 191 bis 198 (1988) beschreiben die Herstellung eines Diels-Alder-Adduktes von Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol unter Verwendung von 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir fanden nun, daß es möglich ist, ein Verfahren zur Isolierung und Entfernung von 5,7-dienhaltigen Steroiden, insbesondere 3β-Olen und Estern von 3β-Olen aus einem Steringemisch zu bekommen,

ein solches Verfahren zu liefern, worin das Gemisch von Sterinen mehrere Hefe- Sterinstoffwechselprodukte einschließlich Squalen, Lanosterol, 4,4-Dimethylzymosterol, 4- Methylzymosterol, Zymosterol und Cholesta-7,24-dien-3β-ol umfaßt,

ein solches Verfahren zu liefern, worin vorzugsweise das 5,7-dienhaltige Steroid Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol ist,

ein solches Verfahren zu bekommen, welches eine Behandlung des Gemisches mit einem Dienophil einschließt, wie hier im einzelnen beschrieben wird,

vorzugsweise ein solches Verfahren zu liefern, welches eine Behandlung des Gemisches mit einem oxidierbaren Dienophilvorläufer und mit einem Oxidationsmittel einschließt, das den Dienophilvorläufer zu einem Dienophil oxidieren kann,

ein solches Verfahren zu liefern, welches die Herstellung der isolierten 5,7-dienhaltigen Steroide in gereinigter Form ermöglicht.

Weitere Ziele, Vorteile und neue Merkmale der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung ausgeführt und dem Fachmann bei der Prüfung des Folgenden offenbar oder können durch die Ausführung der Erfindung gelernt werden.

Die Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines 5,7-Dienfunktionalität enthaltenden Sterins aus einem Gemisch von Hefesterolstoffwechselprodukten, die Squalen, Lanosterol, 4,4-Dimethylzymosterol, 4-Methylzymosterol, Zymosterol, Cholesta-7,24-dien-3β-ol und ein einzelnes 5,7-Dienfunktionalität enthaltendes Sterol mit der Strukturformel

worin R³ unter H und R¹ CO ausgewählt ist, worin R¹ C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder monozyklisches Aryl mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen ist und R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander unter H, Hydroxyl und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ausgewählt sind, umfassen, mit den Stufen, in denen man

a) das Gemisch mit (i) einer dienophilen Verbindung mit der Strukturformel X-R=R-Y behandelt, worin die Gruppen R beide N oder C-Q sind, worin die Gruppen Q H sind oder zusammen eine dritte Bindung bilden, und worin X und Y unter elektronenziehenden Gruppen ausgewählt sind, welche selbst unabhängig unter -COOH, -CHO, -NO&sub2;, - CN, -COOR¹ und -COR¹ ausgewählt sind, wobei R¹ C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ist, oder worin X und Y miteinander verbunden sind, um eine -(CO)-Z-(CO)-Brücke zu bilden, in welcher Z C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylen, monozyklisches Arylen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und bis zu 4 Ringsubstituenten oder -NH²-, worin R² H, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder monozyklisches Aryl mmit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und bis zu 5 Ringsubstituenten ist, bedeutet, wobei die Ringsubstituenten unter -(CH&sub2;)n-NH&sub2;, -(CH&sub2;)-n-COOH, -NO&sub2;, Halogen und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ausgewählt sind und wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 6 einschließlich ist, und dabei das 5,7-Dienfunktionalität enthaltende Sterol in ein Diels-Alder-Addukt umwandelt,

b) das Diels-Alder-Addukt aus dem Gemisch entfernt, indem man das Reaktionsgemisch der Stufe (a) auf eine Kieselgelsäule aufbringt, mit einem Lösungsmittelsystem eluiert, das wirksam ist, alle Komponenten des Reaktionsgemisches mit Ausnahme des Diels- Alder-Adduktes aus der Säule zu entfernen, und das Diels-Alder-Addukt aus der Säule entfernt, und

c) das Diels-Alder-Addukt mit einem Reduktionsmittel behandelt, das wirksam ist, das Addukt zu spalten und das 5,7-dienhaltige Sterol zu regenerieren.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines eine 5,7-Dienfunktionalität enthaltenden Steroids aus einem Steringemisch, wobei das Verfahren einschließt, daß man

a) das Gemisch mit

i) einem oxidierbaren Dienophilvorläufer mit der Strukturformel X-NH-NH-Y, worin X und Y wie oben definiert sind, und

ii) einem Oxidationsmittel behandelt, welches wirksam ist, den Vorläufer zu oxidieren,

b) das so gebildete Diels-Alder-Addukt aus dem Gemisch entfernt und

c) das Diels-Alder-Addukt mit einem Reduktionsmittel behandelt, welches wirksam ist,

das Addukt zu spalten und das 5,7-dienhaltige Steroid zu regenerieren.

Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Modifizierung des Diels-Alder-Adduktes am Ende der Stufe (a) typischerweise durch eine Abwandlung durchgeführt, welche nicht mit der vorhandenen reaktiven 5,7-Dienfunktionalität durchgeführt werden könnte.

Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren (c) eine Behandlung des Diels-Alder- Adduktes mit einem Reduktionsmittel, das wirkam ist, das Addukt zu spalten und das 5,7- dienhaltige Sterin zu regenerieren.

Verschiedene bevorzugte Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun anhand nichtbeschränkender Beispiele beschrieben.

Es muß festgestellt werden, daß, wenn in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen die Einzahlformen "ein", "eine" und "der, die, das" verwendet werden, diese die Mehrzahlformen einschließen, wenn der Kontext nicht klar etwas anderes diktiert. So schließt beispielsweise eine Bezugnahme auf "ein Sterin" Gemische von Sterinen ein, und die Bezugnahme auf "ein Steroid" schließt Gemische zweier oder mehrerer Steroide ein usw.

In dieser Beschreibung und den Ansprüchen, die folgen, wird auf eine Anzahl von Begriffen, welche folgende Bedeutung haben sollen, Bezug genommen.

"Niedermolekulares Alkyl" bedeutet eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, stärker bevorzugt mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

"Niedermolekulares Alkylen" bedeutet eine difunktionelle gesättigte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwassertoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und schließt beispielsweise Methylen (-CH&sub2;-), Ethylen (-CH&sub2;-CH&sub2;-), Propylen (-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-), 2-Methylpropylen [-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-], Hexylen [-(CH&sub2;)&sub6;-] und dergleichen ein, wobei 1 bis 4 Kohlenstoffatome stärker bevorzugt sind.

"Monozyklisches Aryl" bedeutet eine Gruppe mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und ist vorzugsweise eine Phenylgruppe. Gegebenenfalls sind diese Gruppen mit bis zu 5 Ringsubstituenten substituiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus -(CH&sub2;)-NH&sub2;, -(CH&sub2;)-COOH, -NO&sub2;, Halogen und niedermolekularem Alkyl besteht, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 6 einschließlich ist.

"Monozyklisches Arylen" bedeutet eine Gruppe mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und ist vorzugsweise eine Phenylengruppe. Diese Gruppen können mit bis zu 4 Ringsubstituenten aus der Gruppe, die aus -(CH&sub2;)-NH&sub2;, (CH&sub2;)-COOH, -NO&sub2;, Halogen und niedermolekularem Alkyl besteht, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 einschließlich ist, substituiert sein.

"Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Jod, wobei gewöhnlich Halogen als Substitution für ein Wasserstoffatom in einer organischen Verbindung anzusehen ist. Von den Halogenen sind Chlor und Brom allgemein bevorzugt, wobei Chlor allgemein stärker bevorzugt ist.

"Gegebenenfalls" bedeutet, daß der anschließend beschriebene Fall oder Umstand sein kann, aber nicht zu sein braucht und die Beschreibung Fälle einschließt, in denen dieser Fall oder Umstand auftritt, wie auch Fälle, in denen er nicht auftritt. Beispielsweise bedeutet "gegebenenfalls substituiertes Phenyl", daß das Phenyl substituiert sein kann, aber nicht muß und daß die Beschreibung sowohl unsubstituiertes Phenyl als auch Phenyl, worin es eine Substitution gibt, einschließt.

Bei der Beschreibung der Stellung von Gruppen und Substituenten wird das folgende Nummeriersystem verwendet.

Dieses System soll mit der Nummerierung des Cyclopentanophenanthrenkerns nach der Konvention entsprechen, die von der IUPAC oder Chemical Abstracts Service verwendet wird. Der Begriff "Steroid", wie er hier verwendet wird, soll Verbindungen bedeuten, die den obenerwähnten Cyclopentanophenanthrenkern haben.

Die Symbole "α" und "β" zeigen die spezielle stereochemische Konfiguration eines Substituenten an einem asymmetrischen Kohlenstoffatom in einer chemischen Struktur, wie gezeichnet, an. So zeigt "α", durch eine gestrichelte Linie ausgedrückt, daß sich die Gruppe in der fraglichen Position unter der allgemeinen Ebene des Moleküls, wie gezeichnet, befindet, und "β", durch eine fette Linie wiedergegeben, zeigt, daß sich die Gruppe in der fraglichen Stellung oberhalb der allgemeinen Ebene des Moleküls, wie gezeichnet, befindet. Wenn bei der vorliegenden Beschreibung Bindungen nicht ausdrücklich als "α" oder "β" angegeben sind, sollte unterstellt werden, daß die Strukturformel beide Verbindungstypen einschließt, wobei die stereochemische Konfiguration des natürlich vorkommenden Steroidmoleküls bevorzugt ist.

Außerdem sind die 5- oder 6gliedrigen Ringe des Steroidmoleküls oftmals mit A, B, C und D bezeichnet, wie gezeigt.

Der Begriff "Sterin", wie er hier verwendet wird, soll ein Steroidmolekül mit der obenerläuterten Grundgerüststruktur und mit einem Gehalt wenigstens einer Hydroxylgruppe bedeuten.

Der Begriff "gereinigte Verbindung", wie er hier verwendet wird, meint eine Zusammensetzung, die wenigstens etwa 80 Gew.-% einer Verbindung, vorzugsweise wenigstens etwa 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 99 Gew.-% enthält.

Die 5,7-dienhaltigen Steroide, die unter Verwendung der vorliegenden Technik isoliert und gereinigt werden, haben die allgemeine Strukturformel

worin R³ H oder R'CO- ist, worin R' niedermolekulares Alkyl oder monozyklisches Aryl mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander H, Hydroxyl oder niedermolekulares Alkyl bedeuten. Der Rest R³ ist somit, wenn er etwas anderes als H ist, eine hydroxylschützende Gruppe. Typischerweise sind Reste R³ H, CH&sub3;CO- und C&sub6;H&sub5;CO-. Wenn R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; etwas anderes als H und OH sind, werden sie allgemein Methyl oder Ethyl, typischer Methyl, sein.

Wie oben festgestellt, ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders brauchbar für Isolierung und Reinigung von Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol aus einem Gemisch von Sterinen. Wie oben definiert, kann nahezu jedes Sterin in dem Gemisch vorliegen, so lange die Verbindungen keine konjugierte Dienfunktionalität enthalten. Wie durch das obengezeigte Hefe-Sterinstoffwechselproduktgemisch erläutert, können die Verbindungen, die in der Zusammensetzung vorliegen, aus welcher das 5,7-dienhaltige Sterin isoliert werden soll, zwei oder mehr Ungesättigtheitsgrade enthalten.

Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird das Steringemisch mit einem Dienophil mit der Strukturformel X-R=R-Y behandelt, worin die Gruppen R beide N oder beide C-Q sind, worin die Reste Q H sind oder zusammen eine dritte Bindung bilden. So wird das Dienophil in dieser Ausführungsform die Struktur X-N=N-Y, X-(CQ)=(CQ)-Y oder X-C C-Y haben. Diese Reaktionstype wird hier manchmal als Reaktionstype (1) bezeichnet. Die Substituenten X und Y sind Elektronen ziehende Gruppen, die unabhängig voneinander -COOH, -CHO, -NH&sub2;, -CN, -COOR¹ oder -COR¹ sind, worin R¹ niedermolekulares Alkyl ist, oder X und Y zusammen eine -(CO)-Z-(CO)-Brücke bilden können. Im letzteren Fall, d. h. wenn X und Y miteinander verbunden sind, ist die "Z"-Bindung niedermolekulares Alkylen, monozyklisches Arylen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und bis zu 4 Ringsubstituenten oder -NR², worin R² H, niedermolekulares Alkyl oder monozyklisches Aryl mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und bis zu 5 Ringsubstituenten ist. Ringsubstituenten sind -(CH&sub2;)n-NH&sub2;, -(CH&sub2;)n-COOH, -NO&sub2;, Halogen oder niedermolekulares Alkyl, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 6 einschließlich ist. Dienophile in der obenerwähnten Gruppe können im Handel erhältlich sein oder leicht unter Verwendung von Ausgangsmaterialien und Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der synthetischen organischen Chemie bekannt sind. Beispiele spezieller Dienophile, die hier brauchbar sind, sind folgende:

Diese Dienophile sind im Handel bei einer Reihe von Quellen erhältlich, z. B. bei Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI. Wie für den Fachmann auf der Hand liegt, können solche Dienophile auch leicht unter Verwendung herkömmlicher Methoden synthetisiert werden [siehe z. B. S. W. Moje und P. Beak, J. Org. Chem., 39 (20), Seite 2951 (1974) und K. Rufenacht, Heiv. Chim. Acta, 51, Seite 518 (1968)].

Bei einer zweiten Ausführungsform wird ein Dienophilvorläufer verwendet, der mit einem geeigneten Oxidationsmittel in ein Dienophil umgewandelt werden kann. Diese Reaktion wird hier manchmal als Reaktion (2) bezeichnet. Hier wird das Steringemisch gleichzeitig mit dem Dienophilvorläufer und einem Oxidationsmittel behandelt, welches wirksam ist, den Vorläufer zu einem aktiven Dienophil zu oxidieren. Der Dienophilvorläufer hat die Strukturformel X-NH-NH-Y, worin X und Y wie oben definiert sind. Beispiele von Dienophilvorläufern sind solche, worin X und Y miteinander verbunden sind, um eine -(CO)-Z-(CO)-Brücke zu bilden, wobei Z wie oben definiert ist. Bei dieser Ausführungsform ist Z vorzugsweise Arylen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen, substituiert mit bis zu 2 Substituenten aus der Gruppe, die aus -(CH&sub2;)n-NH&sub2; und -(CH&sub2;)n-COOH besteht, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 6 einschließlich ist.

Dienophilvorläufer in der obenerwähnten Gruppe können im Handel erhältlich sein oder leicht unter Verwendung von Ausgangsmaterialien und Techniken synthetisiert werden, welche dem Fachmann auf dem Gebiet der synthetischen organischen Chemie bekannt sind [siehe z. B. H. D. K. Drew und H. H. Hatt, J. Chem. Soc., 16 (1937)]. Beispiele hier verwendeter spezieller Dienophilvorläufer (wiederum sind solche Verbindungen im Handel erhältlich oder können leicht synthetisiert werden) schließen die folgenden ein:

Jedes Oxidationsmittel, das den Dienophilvorläufer zu einem aktiven Dienophil oxidieren kann, kann verwendet werden, mit Ausnahme von Oxidationsmitteln, die die Bildung des Diels-Alder-Adduktes stören könnten oder eine schädliche Wechselwirkung auf andere Weise mit irgendeinem der Sterine in dem Steringemisch ausüben könnten. Beispiele von Oxidationsmitteln schließen Kaliumperoxymonosulfat, Bleitetraacetat, Jodosobenzoldiacetat, N-Bromsuccinimid und tert-Butylhypochlorit ein.

Jede der obenerwähnten Reaktionen, d. h. eine Behandlung des Steringemisches mit einem Dienophil mit der Struktur X-R=R-Y oder einem Dienophilvorläufer mit der Struktur X-NH-NH-Y und einem Oxidationsmittel, führt zur Bildung eines Diels-Alder-Adduktes. Diese Reaktionen werden in den folgenden Reaktionsschemata erläutert:

Reaktion (1)
Reaktion (2)

Beide Reaktionstypen werden in einer inerten Atmosphäre, in einem nichtreaktiven, vorzugsweise polaren organischen Lösungsmittel, das wirksam ist, die Reaktionspartner aufzulösen, durchgeführt. Bei der Reaktion (2) ist es bevorzugt, daß das Oxidationsmittel allmählich zu einer Lösung des Steroids und des Dienophils in dem ausgewählten Lösungsmittel zugegeben wird und das Verfahren bei einer relativ niedrigen Temperatur, d. h. 10ºC oder niedriger, durchgeführt wird (0 bis 5ºC, wie durch ein Eis/Wasserbad erhalten werden kann, sind optimal). Wenigstens etwa 15 min. vorzugsweis wenigstens 1 h, sollte man die Reaktion ablaufen lassen.

Nach der Herstellung des Diels-Alder-Adduktes entweder unter Verwendung der Reaktion (1) oder (2) wird das Addukt aus dem Reaktionsgemisch entfernt und regeneriert, um das 5,7-dienhaltige Steroid in isolierter Form zu ergeben. Entfernung des Adduktes aus dem Reaktionsgemisch erfolgt vorzugsweise unter Verwendung einer Kieselgelsäule, welche bevorzugt das Diels-Alder-Addukt bindet. Die chemischen und physikalischen. Eigenschaften des Diels-Alder-Adduktes können durch Manipulieren der an dem Dienophil vorhandenen Substituenten und durch Variieren von R³ verändert werden. Beispielsweise können dem Diels-Alder-Addukt durch die Verwendung eines Dienophils, das einen basischen Substituenten enthält, z. B. -NH&sub2;, -(CH&sub2;)n-NH&sub2; oder dergleichen, basische Eigenschaften erteilt werden. Das Addukt ist dann ein basisches Molekül und aus dem Steringemisch unter Verwendung von Säureextraktion abtrennbar. Ähnlich können dem Diels-Alder-Addukt durch die Verwendung eines Dienophils, welches einen sauren Substituenten enthält, z. B. -COOH, -(CH&sub2;)n-COOH oder dergleichen, saure Eigenschaften verliehen werden. Das Addukt ist dann ein saures Molekül und von dem Steringemisch unter Verwendung basischer Extraktion abtrennbar.

Wie auch oben erwähnt wurde, kann nach der Herstellung des Diels-Alder-Adduktes der bei R³ vorhandene Rest in eine Funktionalität umgewandelt werden, welche erwünschte Kristallisations- und/oder Ausfällungsparameter verleiht. Beispielsweise kann eine bei C-3 vorhandene Hydroxylgruppe leicht in ein Benzoat, welches seinerseits das Addukt kristalliner und leichter von dem Steringemisch abtrennbar macht, umgewandelt werden.

Regenerierung des 5,7-dienhaltigen Steroids erfolgt dann durch Behandlung des Adduktes mit eine Reduktionsmittel, wie Lithiumaluminiumhydrid ("LAH"), Diisobutylaluminiumhydrid ("DiBAL"), Red-Al® [einer Lösung von Natriumbis-(2-methoxyethoxy)-aluminiumhydrid in Toluol, erhältlich bei der Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wis.] oder dergleichen. Lithiumaluminiumhydrid ist besonders bevorzugt. Die Reaktion verläuft anfangs bei einer niedrigen Temperatur, d. h. 10ºC oder niedriger (wiederum erhältlich durch ein Eis/Wasserbad), worauf nach wenigstens etwa 30 min ein Erwärmen auf wenigstens etwa 50ºC während wenigstens einiger Minuten folgt. Überschüssiges Reduktionsmittel und Salze oder Derivate desselben werden dann entfernt, z. B. durch Filtration durch Celite oder dergleichen. Eindampfen des Reaktionsgemisches wird dann zu dem 5,7-dienhaltigen Steroid führen.

Reinigung des regenerierten 5,7-dienhaltigen Steroids kann dann unter Verwendung irgendeiner aus einer Anzahl von Methoden durchgeführt werden, die für den Fachmann auf der Hand liegen. Beispielsweise kann eine Reinigung durch Umkristallisation, z. B. unter Verwendung von Methanol, Ethanol oder dergleichen, oder unter Verwendung einer Ausfällungs- oder Chromatographietechnik bewirkt werden.

Wenn das 5,7-dienhaltige Steroid Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol ist, kann das isolierte gereinigte Material verwendet werden, um Cholesta-5,7-dien-3β,25-diol herzustellen. Cholesta-5,7-dien-3β,25-diol ist ein biologisch wichtiges hydroxyliertes Provitamin D&sub3;-Stoffwechselprodukt, welches durch Sonnenlicht oder andere bekannte photochemische Methoden in 25- Hydroxy-Vitamin D&sub3; umgewandelt werden kann. Solche Vitamin D&sub3;-Derivate sind in einer Reihe von Zusammenhängen brauchbar, z. B. in örtlichen pharmazeutischen Formulierungen (für die Behandlung von Hautkrankheiten oder dergleichen), in oralen Vitaminpräparaten und als Futtermitteladditive.

Bei einer Variation der obenbeschriebenen Reaktionen kann eine chemische Umwandlung einer oder mehrerer Stellen an dem 5,7-dienhaltigen Steroid bewirkt werden, während das Molekül in der Form des Diels-Alder-Adduktes geschützt ist. Beispielsweise kann die Δ²&sup4;-Doppelbindung in eine 24-Amino-25-hydroxyl-Verbindung, eine 24,25-Dihydroxyl- Verbindung oder dergleichen umgewandelt werden. Auch kann der Ring "A" des Steroids oxidiert werden, wenn die Verbindung in Adduktform vorliegt.

Es sollte auch darauf hingewiesen werden, daß eine Anzahl der Diels-Alder-Addukte, die hier oben beschrieben und allgemein durch die Strukturformel (XIX) oben wiedergegeben wurden, die folgenden speziellen Addukte einschließen.

Die Vorteile der Erfindung schließen die folgenden ein: Selektivität der Reaktion des 5,7-dienhaltigen Steroids mit einem reaktiven Dienophil, Kristallinität des Diels-Alder-Adduktes, welche leicht eine Entfernung aus dem Anfangssteringemisch ermöglicht, sehr hohe Ausbeute des gereinigten Endproduktes in der. Größenordnung von 70% oder mehr, Einfachheit der "Vergrößerung des Ansatzes" im Zusammenhang mit einer Herstellung und die Fähigkeit, das 5,7-Dien in der Diels-Alder-Adduktform zu modifizieren.

Beispiel 1a

Zu einer gerührten Lösung eines Rohsteringemisches (erhalten von Amoco, 50 g) mit einem Gehalt von Squalen, Lanosterol, 4,4-Dimethylzymosterol, 4-Methylzymosterol, Zymosterol, Cholesta-7,24-dien-3β-ol und Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol (11,0 g, reines Trienol, 28,8 mmol), gelöst in Dichlormethan (600 ml) unter Argon wurde Phthalhydrazid (erhalten von Aldrich, 15,0 g, 92,5 mmol) zugegeben. Diese Lösung wurde in einem Eis/Wasserbad (0 bis 5ºC) gekühlt. Zu der gekühlten Lösung wurde eine Lösung von Bleitetraacetat (15,0 g, 33,9 mmol) und Essigsäure (1,95 ml) in Dichlormethan (215 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die Zugabezeit war 30 min. Nach Rühren bei 0 bis 5ºC während 1,5 h wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur insgesamt 4 h gerührt. TLC auf Kieselgel, imprägniert mit Silbernitrat, zeigt kein vorhandenes Trienol. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert, und die vereinigte Dichlormethanlösung wurde mit Wasser und Natriumbicarbonat und wiederum mit Wasser gewaschen. Verdampfen des Lösungsmittels ergab ein gelbes Rohprodukt, das in der folgenden Weise gereinigt wurde. Das Rohprodukt wurde in einem Gemisch von Ethylacetat und 20% Hexan aufgelöst und durch Kieselgel (125 g) filtriert. Nachdem die gesamten unumgesetzten Sterine aus der Säule ausgewaschen waren, wurde das Addukt mit 50% Ethylacetat in Hexan eluiert. Die Ausbeute an Reinprodukt war 14,1 g oder 90,4%. NMR, IR und Massenspektrum waren in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.

Beispiel 1b

Zu einer Lösung des Diels-Alder-Adduktes, das in dem vorausgehenden Abschnitt hergestellt worden war (13,9 g, 25,6 mmol), gelöst in THF (300 ml) und gekühlt auf 0 bis 5ºC, wurde 1 M Lithiumaluminiumhydrid (LAH) in THF (80 mmol) tropfenweise zugegeben. Nach Rühren (bei 0 bis 5ºC) während 1 h wurde das Reaktionsgemisch während 20 min auf 60ºC erwärmt. Das Gemisch wurde dann auf 0 bis 5ºC gekühlt, und gesättigte Ammoniumchloridlösung wurde tropfenweise zugegeben, bis überschüssiges LAH zerstört war (ca. 20 ml). Das Reaktionsgemisch wurde 30 min gerührt und anschließend 30 min stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Celite filtriert, um Aluminium und Lithiumsalze zu entfernen. Die klare THF-Lösung wurde eingedampft, um das rohe Trienol als einen dicken gelben Sirup zu ergeben. Das Rohmaterial wurde aus Methanol umkristallisiert und ergab insgesamt 7,3 g (74,5%) eines Cholesta-5,7,24-trien-3β-ols. F. = 114 bis 117ºC. NMR, IR und Massenspektrum waren in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.

Beispiel 2

Das Verfahren der Beispiele 1a und 1b kann wiederholt werden, ausgenommen daß das Phthalhydrazid einen -NH&sub2;-Substituenten in der 3-Stellung des Phenylringes enthält (wie bei der Aldrich Chemical Co. erhältlich). Das so vorgesehene Diels-Alder-Addukt kann leicht unter Verwendung von Säureextraktion von den restlichen neutralen Sterinen abgetrennt werden.

Beispiel 3

Das Verfahren der Beispiele 1a und 1b kann mit der Ausnahme wiederholt werden, daß das Phthalhydrazid einen -NH&sub2;-Substituenten in der 4-Stellung am Phenylring enthält (wie von Aldrich Chemical Co. erhältlich). Das so vorgesehene Diels-Alder-Addukt kann leicht unter Verwendung von Säureextraktion von den restlichen neutralen Sterinen abgetrennt werden.

Beispiel 4

Das Verfahren der Beispiele 1a und 1b kann mit der Ausnahme wiederholt werden, daß 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion (z. B. wie bei Aldrich Chemical Co. erhältlich) statt Phthalhydrazid verwendet wird und kein Oxidationsmittel erforderlich ist oder verwendet wird.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Isolierung eines 5,7-Dienfunktionalität enthaltenden Sterols aus einem Gemisch von Hefesterolstoffwechselprodukten, die Squalen, Lanosterol, 4,4-Dimethylzymosterol, 4-Methylzymosterol, Zymosterol, Cholesta-7,24-dien-3β-ol und ein einzelnes 5,7-Dienfunktionalität enthaltendes Sterol mit der Strukturformel

worin R³ unter H und R¹ CO ausgewählt ist, worin R¹ C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder monozyklisches Aryl mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen ist und R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander unter H, Hydroxyl und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ausgewählt sind, umfassen, mit den Stufen, in denen man

a) das Gemisch mit einer dienophilen Verbindung mit der Strukturformel X-R=R-Y behandelt, worin die Gruppen R beide N oder C-Q sind, worin die Gruppen Q H sind oder zusammen eine dritte Bindung bilden, und worin X und Y unter elektronenziehenden Gruppen ausgewählt sind, welche selbst unabhängig unter -COOH, -CHO, -NO&sub2;, -CN, -COOR¹ und -COR¹ ausgewählt sind, wobei R¹ C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ist, oder worin X und Y miteinander verbunden sind, um eine - (CO)-Z-(CO)-Brücke zu bilden, in welcher Z C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylen, monozyklisches Arylen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und bis zu 4 Ringsubstituenten oder - NH²-, worin R² H, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder monozyklisches Aryl mmit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen und bis zu 5 Ringsubstituenten ist, bedeutet, wobei die Ringsubstituenten unter -(CH&sub2;)n-NH&sub2;, -(CH&sub2;)-n-COOH, -NO&sub2;, Halogen und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ausgewählt sind und wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 6 einschließlich ist, und dabei das 5,7-Dienfunktionalität enthaltende Sterol in ein Diels-Alder-Addukt umwandelt,

b) das Diels-Alder-Addukt aus dem Gemisch entfernt, indem man das Reaktionsgemisch der Stufe (a) auf eine Kieselgelsäule aufbringt, mit einem Lösungsmittelsystem eluiert, das wirksam ist, alle Komponenten des Reaktionsgemisches mit Ausnahme des Diels-Alder-Adduktes aus der Säule zu entfernen, und das Diels-Alder-Addukt aus der Säule entfernt, und

c) das Diels-Alder-Addukt mit einem Reduktionsmittel behandelt, das wirksam ist, das Addukt zu spalten und das 5,7-dienhaltige Sterol zu regenerieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man in der Stufe (a) weiterhin eine chemische Umwandlung des Diels-Alder-Adduktes durchführt, um ein modifiziertes Diels-Alder- Addukt zu bekommen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem (a) darin besteht, daß man das Gemisch mit (i) einem dienophilen Vorläufer mit der Strukturformel X-NH-NH-Y und (ii) einem Oxidationsmittel, das wirksam ist, den Vorläufer zu oxidieren, behandelt und dabei das 5,7-Dienfunktionalität enthaltende Sterol in ein Diels-Alder-Addukt umwandelt.

4. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem in dem dienophilen Vorläufer X und Y unter Bitdung einer -(CO)-Z-(CO)-Brücke miteinander verbunden sind und Z monozyklisches Arylen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, welches mit bis zu 2 Substituenten substituiert ist, die unter -(CH&sub2;)n-NH&sub2; und -(CH&sub2;)n-COOH ausgewählt sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die dienophile Verbindung Phthalhydrazid ist.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das eine 5,7-Dienfunktionalität enthaltende Sterol Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Oxidationsmittel unter Kaliumperoxymonosulfat, Bleitetraacetat, Jodosobenzoldiacetat, N-Bromsuccinimid und Tertiärbutylhypochlorit ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Oxidationsmittel Bleitetraacetat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Sterol Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol ist und man in dem Verfahren

a) das Gemisch mit Phthalhydrazid und Bleitetraacetat in einer wirksamen Menge, um das Phthalhydrazid zu oxidieren, behandelt und dabei das Cholesta-5,7,24- trien-3β-ol in dem Gemisch in ein Diels-Alder-Addukt umwandelt,

b) das Reaktionsgemisch der Stufe (a) auf eine Kieselgelsäule aufbringt und mit einem Lösungsmittelsystem eluiert, das wirksam ist, alle Komponenten des Reaktionsgemisches mit Ausnahme des Diels-Alder-Adduktes aus der Säule zu entfernen,

c) das Diels-Alder-Addukt aus der Säule entfernt und

d) das Diels-Alder-Addukt mit Lithiumaluminiumhydrid behandelt, um das Addukt zu spalten und das Cholesta-5,7,24-trien-3β-ol in isolierter Form zu regenerieren.







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