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Dokumentenidentifikation DE69131589T2 04.05.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0466222
Titel Ribosomen-inaktivierende Proteine, inaktive Vorläuferformen derselben, Verfahren zur Herstellung und eine Methode zur Nutzung
Anmelder Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, Ind., US
Erfinder Walsh, Terence A., Midland, Michigan 48640, US;
Hey, Timothy D., Midland, Michigan 48640, US;
Morgan, Alice E. R., Midland, Michigan 48640, US
Vertreter H. Weickmann und Kollegen, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69131589
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 10.06.1991
EP-Aktenzeichen 912014362
EP-Offenlegungsdatum 15.01.1992
EP date of grant 08.09.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 04.05.2000
IPC-Hauptklasse C07K 14/415
IPC-Nebenklasse C12N 15/29   C12N 5/10   

Beschreibung[de]

Ribosomen-inaktivierende Proteine (ribosome-inactivating proteins, RIPs) sind Pflanzenproteine, die in der Lage sind, eukaroyntische Ribosomen katalytisch zu inaktivieren, und die demnach extrem starke Inhibitoren der eukaryontischen Proteinsynthese sind. RIPs wurden in zwei Klassen unterteilt: Typ 1 und Typ RIPs (siehe Barbieri und Stirpe (1982), Cancer Surveys, 1; 489- 520). Zwischen den Mitgliedern von Typ 1 und Typ 2 RIPs und auch mit den bakteriellen Shiga- und Shiga-ähnlichen Toxinen, welche ebenfalls denselben Wirkmechanismus aufweisen, besteht eine signifikante Aminosäuresequenzhomologie (siehe Hovde et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2568-2572).

Typ 2 RIPs bestehen aus zwei Polypeptiden: einem RIP (oder einer A-Kette), welche über eine Disulfidbrücke kovalent an ein Lectin-artiges Protein (oder B- Kette) mit einer Affinität für Zelloberflächenkohlenhydrate gebunden ist. Die B-Kette bindet an die Zelloberfläche und ermöglicht eine anschließende Internalisierung des RIP-A-Kettenbestandteils durch die Zelle, was zur raschen Inaktivierung der Proteinsynthese und zum Zelltod führt. Typ 2 RIPs sind daher extrem starke Cytotoxine und Tiergifte, deren am besten untersuchtes Beispiel Ricin ist.

Im Gegensatz dazu bestehen bisher charakterisierte Typ 1 RIPs aus einer einzigen Polypeptidkette, deren Aktivität zu der von A-Ketten-RIPs äquivalent ist, die jedoch keine kovalent gebundene B-Kette aufweist. Aus diesem Grunde sind sie kaum toxisch für intakte Zellen, behalten jedoch ihre extreme Wirksamkeit gegen zellfreie Proteintranslationssysteme. Typische Konzentrationen, welche die zellfreie Proteintranslation zu 50% inhibieren (IC&sub5;&sub0;) sind 0,5 bis 10 ng/ml (0,16 bis 33 pM). Bis zu den hierin beschriebenen Ergebnissen waren bekannte Typ 1 RIPs eine bemerkenswert homogene Klasse von basischen Proteinen mit MW-Werten von ungefähr 30.000. Typ 1 RIPs finden sich in einer großen Vielfalt von einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen und sind möglicherweise weit verbreitet. Beispielsweise in Samen, Wurzeln oder Latex sind diese Proteine oft reichlich vorhanden. Ihre Funktion in vivo ist unklar, es wurde jedoch spekuliert, daß sie antivirale Mittel (siehe Stevens et al., (1981), Experientia, 37: 257-259) oder Antipilzmittel (siehe Roberts und Seltrennikkoff (1986), Bioscience Reports, 6: 19-29) sein könnten.

Bis jetzt wurde in einem einzigen Artikel das Vorhandensein eines Inhibitors der tierischen zellfreien Proteinsynthese in Mais sowie in anderen Getreidepflanzen diskutiert (siehe Coleman und Roberts (1982), Biochimica et Biophysica Acta, 696: 239-244). Die Herstellung des Maisinhibitors erfolgte über Ammoniumsulfatpräzipitation und Phosphocellulosesäulenchromatographie. Es wird allgemein angenommen, daß der aus Mais isolierte Inhibitor rein war. Das berichtete Molekulargewicht des Inhibitors betrug 23 KiloDaltons (kD) mit einem berichteten IC&sub5;&sub0; von 50 bis 100 ng/ml in einem zellfreien ASCItes- Proteinsyntheseassay.

Dort wo die Wirkung von RIPs auf Ribosomen untersucht wurde, besaßen sowohl Typ 1 als auch Typ 2 RIPs eine einzigartige und hochspezifische N- Glykosidaseaktivität, welche die glykosidische Bindung von Adenin 4324 auf der ribosomalen 285 RNA in Rattenleber spaltet (siehe Endo (1988), In: Immunotoxins, (Hrsg.) Frankel).

Das gewerbliche Interesse an RIPs konzentrierte sich hauptsächlich auf deren Verwendung zur Konstruktion von therapeutischen Toxinen, die gegen spezifische Zellen, wie etwa Tumorzellen durch Anheftung eines zielgerichteten Polypeptids (targeting polypeptide), meistens ein monoklonaler Antikörper (siehe Immunotoxins (1988), supra) gerichtet sind. Dies ahmt die Bindungsfunktionalität der B-Kette von Typ 2 RIPs nach, ersetzt jedoch deren unspezifische Wirkung durch einen hochselektiven Liganden. Eine weitere neuere potentielle Verwendung liegt in der HIV-Therapie (siehe U.S. Patent 4,869,903 von Lifson et al., (Genelabs Incorporated und The Regents of the University of California)).

Während ein Proteinsyntheseinhibitor aus Mais wie auch Proteinsyntheseinhibitoren aus anderen Panicoideae für die Konstruktion für die cytotoxischen Konjugaten geeignet erscheint, hat jedoch bis jetzt kein Fachmann über eine erfolgreiche Verwendung eines Panicoideae-RIPs berichtet. Dies ist einigermaßen überraschend im Hinblick auf den Erfolg, der mit RIPs aus nicht-Panicoideae-Pflanzen, einschließlich Getreidepflanzen, wie etwa Gerste, erzielt wurde (siehe Lambert et al. (1988), In: Immunotoxins, supra). Zum Teil kann der bisherige Mangel an Erfolg der Fachleute bei der erfolgreichen Verwendung des durch Coleman und Roberts beschriebenen Mais-RIPs auf die Tatsache zurückgeführt werden, daß der Proteinsyntheseinhibitor relativ uncharakteristiert war.

Wegen der Möglichkeit, eine korrekte posttranlationale Prozessierung zu erzielen, besteht ein Interesse an einer Expression von rekombinantem RIP in allgemein verwendeten eukaryontischen Wirtszellen. Da jedoch RIPs die Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen wirksam inhibieren, besteht ein vorhersehbares Problem darin, daß die heterologe Expression eines RIPs zum Tod der Wirtszelle führen wird. Daher werden eukaryontische Zellen im allgemeinen nicht als rekombinante Wirtszellen verwendet. Obwohl eukaryontische Zellen unter bestimmten Umständen eingesetzt werden können, muß das RIP so konstruiert werden, daß es sezerniert wird, bevor die Zelle die Toxizität erfährt (siehe EP 0 335 476 von Gelfand et al. (Cetus Corp.)). Daher werden normalerweise prokaryontische Wirtszellen trotz gewisser Nachteile wie etwa der Unfähigkeit, heterolog exprimierte Proteine zu glykosylieren und korrekt zu falten, als Wirte verwendet.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein Verfahren zur Herstellung inaktiver RIP-Formen bereitzustellen, in welchem ein inaktives RIP durch eukaryontische Wirtszellen exprimiert und dann in eine aktive Form umgewandelt werden kann.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung bestand darin, eine DNA-Sequenz des für mindestens eine inaktive Form von RIP codierenden Gens, sowie Expressionsvehikel, Wirtszellen und Zellkulturen, die eine solche DNA-Sequenz enthalten, bereitzustellen.

Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den hierin beschriebenen Lehren offensichtlich werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Gegenstände.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auf ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, gerichtet, welches für ein homogenes als proRIP bezeichnetes Protein codiert, wobei das Protein nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch in ein als αβRIP bezeichnetes Protein umgewandelt werden kann, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist.

Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches für ein homogenes aus Panicoideae abgeleitetes und als proRIP bezeichnetes Protein codiert, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach der Entfernung des Linkers in ein Protein mit α- und β-Fragmenten umgewandelt werden kann, welches als αβRIP bezeichnet wird, und welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren.

Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches für ein aus Panicoideae abgeleitetes und als αβRIP bezeichnetes homogenes Protein codiert, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das RIP α- und β-Fragmente aufweist.

Ein vierter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches für ein aus Mais abgeleitetes und als proRIP bezeichnetes homogenes Protein codiert, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach Entfernen des Linkers in ein Protein mit α- und β-Fragmenten umgewandelt werden kann, welches als αβRIP bezeichnet wird und welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das α-Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die effektiv mit der folgenden Sequenz homolog ist:

und wobei das β-Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der folgenden Sequenz effektiv homolog ist:

Ein fünfter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umwandlung eines Proteins, welches nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, in ein Protein, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen eines homogenen aus Panicoideae abgeleiteten Proteins, welches durch ein pNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert codiert wird und als proRIP bezeichnet wird, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach Entfernen des Linkers in ein Protein mit α- und β- Fragmenten, welches als αβRIP bezeichnet wird, umgewandelt werden kann, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren; und

b) Inkontaktbringen des proRIP mit einem Spaltmittel, welches in der Lage ist, den Linker zu deletieren, um ein Protein mit α- und β- Fragmenten, das als αβRIP bezeichnet wird, zu ergeben, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren.

Ein sechster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Konjugat, umfassend ein zielgerichtetes Vehikel und ein aus Panicoideae abgeleitetes Protein, welches von einem DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, codiert wird und als proRIP bezeichnet wird, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach Entfernen des Linkers in ein Protein mit α- und β-Fragmenten umgewandelt werden kann, welches als αβRIP bezeichnet wird, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren.

Ein siebter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Konjugat, umfassend ein zielgerichtetes Vehikel und ein aus Panicoideae abgeleitetes und durch ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, codiertes Protein, welches als αβRIP bezeichnet wird, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das αβRIP α- und β-Fragmente aufweist.

Ein achter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Konjugat, umfassend ein zielgerichtetes Vehikel und ein aus Mais abgeleitetes Protein, welches durch ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, codiert wird, und welches als proRIP bezeichnet wird, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach Entfernung des Linkers in ein Protein mit α- und β-Fragmenten, welches als αβRIP bezeichnet wird, umgewandelt werden kann, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das α-Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der folgenden Sequenz effektiv homolog ist:

und wobei das β-Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der folgenden Sequenz effektiv homolog ist:

Ein neunter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches in der Lage ist, für ein als proRIP bezeichnetes Protein zu codieren, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach Entfernen des Linkers in ein Protein mit α- und β-Fragmenten umgewandelt werden kann, welches als αβRIP bezeichnet wird, und welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren.

Ein zehnter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches für ein als αβRIP bezeichnetes Protein codiert, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das αβRIP α- und β-Fragmente aufweist.

Ein elfter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches für ein aus Mais abgeleitetes und als proRIP bezeichnetes Protein codiert, wobei das proRIP eine entfernbare interne Peptidlinkersequenz aufweist und nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, welches jedoch nach Entfernung des Linkers in ein Protein mit α- und β-Fragmenten, welches als αβRIP bezeichnet Wird, umgewandelt werden kann, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das α-Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der folgenden Sequenz effektiv homolog ist:

und wobei das β-Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der folgenden Sequenz effektiv homolog ist:

Ein zwölfter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Isolat, wie in den Ansprüchen identifiziert, welches für ein Fusionsprotein codiert, das in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der folgenden Sequenz effektiv homolog ist:

Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen Expressionsvehikel die in der Lage sind, die Produktion solcher zuvor genannten Proteine in geeigneten Wirtszellen zu bewirken. Sie betreffen weiterhin die Wirtszellen und Zellkulturen, welche aus der Transformation mit diesen Expressionsvehikeln hervorgehen.

Eine Anzahl von Gegenständen der vorliegenden Erfindung wird weiterhin in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht, in denen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der Prozessierung von Mais- proRIP zur aktiven Form zeigt,

Fig. 2 die Wirkung von aktivem Mais-αβRIP auf zellfreie Proteinsynthese in Säugern zeigt.

Die gesamte Lehre aller hierin zitierten Literaturstellen ist hierin durch Verweis aufgenommen.

Definitionen

Nukleinsäuren, Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen, aktive Gruppen u. dgl. werden, falls abgekürzt, gemäß dem IUPACIUB (Kommission für biologische Nomenklatur) oder der Praxis in den betreffenden Gebieten abgekürzt. Die folgenden sind Beispiele.

Der Einzelbuchstabencode für Aminosäuren ist unten dargestellt:

Glycin: G Phenylalanin F

Alanin: A Tyrosin: Y

Valin: V Threonin: T

Leucin: L Cystein: C

Isoleucin: I Methion: M

Serin: S Glutaminsäure: E

Asparaginsäure: D Tryptophan: W

Lysin: K Prolin: P

Arginin: R Asparagin; N

Histidin: H Glutamin: Q

unbekannt: X

Der Ausdruck "proRIP" bezeichnet ein Vorläuferprotein, welches eine Leadersequenz und einen Linker enthält, und welches nicht in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen zu inaktivieren.

Der Ausdruck "Leader" bezieht sich auf eine N-terminale Aminosäuresequenz eines proRIPs, welches in der reifen, vollaktiven Form des αβRIP nicht vorhanden sein muß.

Der Ausdruck "Linker" bedeutet eine interne Aminosäuresequenz innerhalb eines proRIPs, wobei der Linker eine solche Länge aufweist und solche Reste umfaßt, so daß das proRIP nicht in der Lage ist, die Translation von einem eukaryontischen Ribosom katalytisch zu inhibieren.

Der Ausdruck "RIP" bedeutet ein Protein, welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen zu inaktivieren. Der Ausdruck "αβRIP" bedeutet ein RIP mit einem α-Fragment (welches den Leader enthalten kann oder auch nicht), einem β-Fragment und welches in der Lage ist, eukaryontische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren.

Der Ausdruck "IC&sub5;&sub0;" bedeutet die Konzentration eines Proteins, welche zu einer 50-prozentigen Inhibition der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsyntheseassay notwendig ist.

Der Ausdruck "inhibierende Menge" bezieht sich auf die spezifische Fähigkeit von RIPs, Tod oder Beschädigung von Zellen, auf die sie gerichtet sind, hervorzurufen.

Der Ausdruck "Zielzellen" bedeutet jene Zellen, welche Ribosomen enthalten, die von dem αβRIP der vorliegenden Erfindung inhibiert werden können. Die Zielzellen können in lebenden Organismen vorhanden sein, oder sie können in vitro konserviert oder gehalten werden. Diese Zellen können einzeln vorliegen oder in assoziierter Form, um ein Organ zu bilden. Beispielhafte Zielzellen umfassen jedwede eukaryontische Zelle (z. B. Säuger-, Insekten-, Pilz- und Pflanzenzellen).

Der Ausdruck "zielgerichtetes Vehikel" bedeutet einen Trägerbestandteil, welcher einen Liganden enthält, der in der Lage ist, an einen Rezeptor einer spezifischen Zelle oder eines spezifischen Gewebes zu binden.

"Gen" bedeutet den gesamten DNA-Teil, der an der Synthese eines Proteins beteiligt ist. Ein Gen umfaßt den strukturellen oder codierenden Teil, welcher am 5'-Ende von einem Translationsstartcodon beginnt und sich bis hin zu einem Stoppcodon am 3'-Ende erstreckt. Es enthält ebenfalls eine Promotorregion, im allgemeinen am 5'-Ende oder stromaufwärts des strukturellen codierenden Teils, welche die Expression eines strukturellen Gens initiiert und reguliert, sowie eine nicht translatierte 3'-Region stromabwärts von der translatierten Region.

"Expression" betrifft ein zweiteiliges Verfahren für die Transkription und Translation eines Gens. Die DNA, welche das Gen definiert, wird in eine Vorläufer-RNA transkribiert, welche zu ihrer reifen Form, der Boten-RNA (messenger RNA, mRNA) prozessiert wird. Während der Translation translatieren die Ribosomen der Zelle zusammen mit Transfer-RNA die RNA- "Botschaft" in Proteine.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß untersuchte Mitglieder von Panicoideae αβRIP und proRIP enthalten. Panicoideae ist eine Unterfamilie von Gramineae (Ordnung) und Graminaceae (Familie). Die Unterfamilie Panicoideae enthält drei Stämme: Maydeae (z. B. Tripsacum, Coix, Euchlaena und Zea), Andropogonea (z. B. Sorghum) und Paniceae. Für weitere taxonomische Information, siehe Arber (1934), The Gramineae, A Study of Cereal, Bamboo and Grass, Cambridge University Press, Seiten 410-411.

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, welche aus einer Pflanze der Unterfamilie Panicoideae abgeleitet sind. Gemäß der hierin beschriebenen Lehre haben aus verschiedenen Pflanzen innerhalb der Unterfamilie Panicoideae erhaltene Proteine eine antigene Kreuzreaktion gezeigt (d. h. Beweis für proRIP in Panicoideae sowie für α- und β-Fragmente eines αβRIPs).

Mit "abgeleitet" aus einer Pflanze innerhalb der Unterfamilie Panicoideae wird ein Protein bezeichnet, welches, wie unten definiert, mit einem proRIP oder αRIP aus Panicoideae effektiv homolog ist, ganz gleich auf welche Art und Weise das Protein hergestellt wurde. Mit den vorliegenden Lehren wird es nun möglich, allgemein homogenes proRIP und αβRIP unter Ausschluß von irrelevanten Proteinen und kontaminierenden Substanzen herzustellen, die damit in der Zellumgebung oder in extrazellulären Flüssigkeiten natürlich assoziiert sind. Beispielsweise zeigt ein im wesentlichen reines Protein konstante und reproduzierbare Eigenschaften innerhalb von experimentellen Standardabweichnungen für Parameter wie etwa die folgenden: Molekulargewicht, chromatographisches Verhalten und dergleichen andere Parameter. Der Ausdruck soll jedoch nicht artifizielle oder synthetische Gemische eines Proteins mit anderen Verbindungen ausschließen. Dieser Ausdruck soll nicht das Vorhandensein von geringfügigen Unreinheiten ausschließen, welche die biologische Aktivität des Proteins nicht beeinflussen und welche beispielsweise aufgrund von unvollständiger Aufreinigung vorhanden sein können.

Sowohl das proRIP und das αβRIP können direkt aus reifen und keimenden Samen und sich entwickelnden Kernen von Pflanzen innerhalb der Unterfamilie isoliert werden. Im allgemeinen kann die Isolierung des αβRIP und proRIP aus Panicoideae wie folgt erreicht werden.

Samen oder unreife Kerne von Pflanzen innerhalb der Unterfamilie Panicoideae können homogenisiert werden, um die einzelnen Samen oder Kerne aufzubrechen. Dies kann durch gewerblich erhältliche Homogenisierer jedweden Typs erreicht werden.

Das Panicoideae-proRIP und/oder -αβRIP kann mit Hilfe von geeigneten Proteinaufreinigungstechniken aus dem Homogenisierungsprodukt isoliert werden. Beispielhafte Techniken umfassen chromatographische Gelfiltrationstechniken, wie etwa herkömmliche Flüssigchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie und Revers-Phasenchromatographie.

Nach der Aufreinigung weist das Panicoideae-proRIP eine unbedeutende Ribosominaktivierungsfähigkeit auf im Vergleich mit seinem entsprechenden αβRIP. Beispielsweise besitzt Mais-proRIP einen IC&sub5;&sub0; von größer als 10 Mikrogramm pro Milliliter (ug/ml) in einem zellfreien Proteinsyntheseassay. Das Mais-αβRIP hat einen IC&sub5;&sub0; von ungefähr 1 Nanogramm pro Milliliter (ng/ml) in einem zellfreien Proteintranslationsassay von Säugetieren.

Das Mais-proRIP hat ein Molekulargewicht von ungefähr 34 kD, bestimmt durch SDS-PAGE (siehe Laemmli (1970), supra), und bewegt sich als einzelner Peak bei Ionenaustauschchromatographie. Homogenes Mais-αβRIP umfaßt zwei assoziierte Fragmente, ein α- und ein β-Fragment, welche jeweils Molekulargewichte von ungefähr 16,5 kD und 8,5 kD aufweisen (bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) (siehe Laemmli (1970), Nature, 22: 680-685). Das homogene Protein zeigt zwei dissoziierte Peaks auf Revers-Phasen-Chromatographie und einen einzelnen assoziierten Peak auf Ionenaustauschchromatographie. Polyklonale Antiseren gegen jedes Fragment kreuzreagieren mit einem in Maiskörnern vorhandenen Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 34 kD, wie bestimmt durch SDS-PAGE. Dies zeigt, daß die zwei Fragmente des Mais-αβRIP tatsächlich von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen (d. h. dem Mais- proRIP).

Die Mais-proRIP-Aminosäuresequenz (wie in Tabelle 1 gezeigt) enthält vier Sequenzuntersegmente:

(1) eine Leadersequenz, Reste 1 bis 16;

(2) ein α-Fragment, Reste 17 bis 161;

(3) eine interne Linkersequenz, Reste 162 bis 186; und

(4) ein β-Fragment, Reste 187 bis 301.

TABELLE 1 Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der Mais-proRIP-cDNA
TABELLE 1 Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der Mais-proRIP-cDNA (fortgesetzt)

Die Nettoladungen dieser Polypeptide sind wie folgt: Leader -3; α + 10; Linker -5; β + 1. Das Entfernen der Leader und Linker führt zu einer dramatischen Veränderung der Nettoladung vom Mais-proRIP (+3) zum Mais-αβRIP (+11). Zusätzlich hat das aus Mais isolierte proRIP einen beobachteten pl von 6,5, welcher gut mit dem aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz berechneten Wert von 6,1 übereinstimmt. Der pl des aktiven Mais- αβRIPs beträgt ≥ 9, im Vergleich mit dem berechneten Wert der abgeleiteten Aminosäuresequenz von 9,06 (d. h. nach der Detetion der sauren Leader- und Linkersequenzen). Experimentelle Daten legen weiterhin nahe, daß am nativen Mais-αβRIP einige Aminosäuren vom Carboxy-terminalen Ende entfernt sind. Somit hat das Mais- αβRIP einen basischen pl, was mit dem pl anderer RIPs in Übereinstimmung ist.

Ein Vergleich des Mais-proRIPs mit dem von Gerste, einer ein keimblättrigen Pflanze, ist in Tabelle 2 unten dargestellt. Die obere Sequenz zeigt Mais-αβ-RIP und die untere Sequenz Gersten-RIP, siehe Asano et al. (1986), Carlsberg Res. Commun., 51 : 129. Identische Reste sind durch eine durchgezogene Linie dargestellt, konservative Substitutionen durch eine gepunktete Linie, und gestrichelte Linien zeigen Insertionen an, um die Homologie zu maximieren. Die Raste sind von links numeriert.

TABELLE 2 Vergleich von Mais-RIP- und Gersten-RIP-Aminosäuresequenzen

Wie in Tabelle 2 dargestellt, beträgt die Homologie zwischen Mais-αβ-RIP und Gersten-RIP insgesamt 28% (34% einschließlich konservativer Substitutionen). Die Einzigartigkeit der Linkerregion von Mais-proRIP ist jedoch durch die daraus entstehende Lücke, die in die veröffentlichte Gerstensequenz zur Erhaltung der Homologie eingefügt wurde, deutlich zu sehen. Ein geringerer, jedoch signifikanter Grad an Homologie wird beobachtet, wenn die Mais-proRIP-Sequenz mit derjenigen der Ricin-A-Kette verglichen wird (wie in Tabelle 3 unten gezeigt). Die obere Sequenz ist Mais-αβ-RIP, und die untere Sequenz ist Ricin A, siehe Lamb et al., (1985), Eur. J. Biochem. 148: 265. Identische Reste sind durch eine durchgezogene Linie dargestellt und konservative Substitutionen durch eine gepunktete Linie, und gestrichelte Linien zeigen Insertionen an, um die Homologie zu maximieren. Die Reste sind von links numeriert, und die Numerierung der Ricin-Sequenz entspricht der des reifen Proteins.

TABELLE 3 Vergleich zwischen Mais-RIP und Ricin-A-Ketten-Aminosäuresequenzen

Wie in Tabelle 3 dargestellt, wurde wiederum eine Lücke entsprechend der Linkerregion von Mais-proRIP in die veröffentlichte Ricin A-Sequenz eingefügt, um die Homologie zu maximieren.

Ein weiterer Vergleich der Mais-proRIP-Sequenz mit publizierten vollständigen Sequenzen anderer nicht-Panicoideae-RIPs zeigen, daß es vier Regionen mit signifikanter Homologie zwischen diesen Proteinen gibt (siehe in Tabellen 4a und 4b unten dargestellt).

TABELLE 4A Alignment der N-terminalen Aminosäuresequenz des Mais-RIP Polypeptids von 16,5 kD mit den N-Termini von RIPs anderer Quellen

Tabelle 4A zeigt die erste Region und das Vergleichs-Alignment der N- terminalen Aminosäuresequenz des Mais-αβ-RIP-α-Fragments mit den N- terminalen Sequenzen von RIPs anderer Quellen. Die Sequenzen wurden aus Gerste (siehe Asano et al. (1986), supra); Ricin A-Kette (siehe Lamb et al. (1985), supra); Dodecandrin (siehe Ready et al., (1985), Biochem. Biophys. Acta, 791: 314); Kermesbeere antivirales Protein 2 (AP2) (siehe Bjorn et al. (1985), Biochim. Biophys. Acta, 790: 154); Shiga-ähnlichem Toxin 1A (SLT-IA) (siehe Calderwood et al., (1987), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4364); und α- Trichosanthin, M m rdinen, Bry din, G l nin, D d ndrin, Kermesbeere antiviralem Protein-2, Saporin 5 und Saporin 4 (siehe Montecucchi et al., (1989), Int, J. Peptide Res., 33: 263) entnommen. Die Positionen, die Homologie in vier oder mehr Sequenzen zeigen, sind durch durchgezogene Linien dargestellt (identische Reste) oder durch gepunktete Linien (konserativ substituierte Reste).

TABELLE 4B Alignment von Mais-RIP mit Homologieregionen in den Aminosäuresequenzen anderer RIPs

Tabelle 4b zeigt, daß die anderen drei Regionen intern orientiert sind. Tabelle 4b zeigt speziell das Alignment von Mais-αβ-RIP mit Homologieregionen in den Aminosäuresequenzen anderer RIPs. Die Sequenzen sind aus den folgenden Literaturstellen erhältlich: Gerste (siehe Asano et al. (1986), supra und Leah et al. (1991), J. Biol. Chem. 266: 1564-1574); Ricin A-Kette (siehe Lamb et al. (1985), supra); Abrin A-Kette (siehe Funatsu et al. (1988), Agric. Biol. Chem. 52: 1095); Saporin-6 (siehe Benatti et al. (1989) Eur. J. Biochem. 183: 465); Shiga-ähnliches Toxin 1A (SLT-1 A) (siehe Calderwood et al. (1987), supra) und α-Trichosanthin (siehe Xuejun und Jiahuai (1986), Nature, 321: 477; Chow et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 8670-8674 und Maragonore et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 11628-11633). Die Positionen, welche Identität oder konservative Substitutionen in vier oder mehr Sequenzen zeigen, sind unterstrichen, gestrichelte Linien zeigen Insertionen an, um die Homologie zu maximieren. Vertikale Linien zeigen Reste, welche in allen sieben Sequenzen konserviert sind. Die Startaminosäure jeder Sequenz ist angezeigt (es ist zu beachten, daß Trichosanthin eine Insertionssequenz zwischen den Resten 67 bis 76 aufweist).

Die Sequenzen und Teilsequenzen verschiedener zusätzlicher Typ 1 RIPs sind in den folgenden Artikeln beschrieben: Luffin-A (siehe Islam et al. (1990), Agric. Biol. Chem. 54: 2967-2978; Mirabilis antivirales Protein (siehe Habuka et al. (1989), J. Bio. Chem. 264: 6629-6637); Trichokirin (siehe Casellas et al. (1988), Eur. J. Biochem., 176: 581-588; Momordine (siehe Barbieri et al. (1980), Biochem. J. 186: 443-452; Dianthine (siehe Relsbig und Bruland (1983), Arch. Biochem. Biophys., 224: 700-706; Saporine (siehe Maras et al. (1990), Biochem. Intl., 21: 831-838 und Lappi et al. (1985), Biochem. Biophys. Res. Commun., 129: 934.942; und Momorcochin-S (siehe Bolognesi et al. (1989), Biochim. Biophys. Acta 993 : 287-292.

Weitere Typ 1 und Typ II-RIPs wurden ebenfalls bis zur Homogenität aufgereinigt. Diese umfassen: Momorcharine (siehe Yeung et al. (1986), Int. J. Peptide Res., 28 : 518 : 534; Tritine (siehe Roberts und Stewart (1979), Biochem. 18: 2615-2621); Roggen (siehe Coleman und Roberts (1982), Bochim. Biophys. Acta 696: 239-244; Agrostine und Hura crepitans (siehe Stirpe et al., (1983), Biochem. J. 216: 617-625; Asparagus officianalis (siehe Stirpe et al. (1983), Biochem. J. 216: 617-625; Cucumis melo (siehe Ferreras et al. (1989), Biochem. Intl., 19: 201-207; Cucurbitaceae (siehe Ng et al., Int. J. Biochem. 21: 1353-1358; Petrocoptis (siehe Ferreras et al., Cell. Molec. Biol. 35: 89-95) Volkensin-a (siehe Barbieri et al. (1984) FEBS Lett. 171: 277- 279; Viscumin-a (siehe Ofsnes et al. (1982), J. Biol. Chem., 257: 13263- 13270; Modeccin-a (siehe Gasperi-Campani (1978), Biochem. J. 174: 491- 496), Momordia charantia Lectin-a (siehe Lin et al. (1978), Linn. Toxicon. 16: 653-660); Phorandendron californicum Lectin-a (siehe Franz et al. (1989), FEBS Lett. 248: 115-118).

Es wurde gezeigt, daß Proteine aus den folgenden weiteren Pflanzen ebenfalls eine ribosomen-inaktivierende Aktivität aufweisen: Stellarea holostes, Lychnis flos-cuculi, Hordeum murinum, Aegylops geniculata, Euphorbia serrata, Capsella busapastoris, Muscari comosum (siehe Merino et al. (1990), J. Exp. Botany 41: 67-70); und Proteine aus Croton tiglium und Jatropha curcas (siehe Stirpe et al. (1976) Biochem. J. 156: 1-6).

Wenn die interne Linkersequenz aus proRIP entfernt wird, weist das αβ-RIP eine signifikante ribosomen-inaktivierende Aktivität auf. Die Aktivität ist signifikant, unabhängig davon, ob die Leadersequenz entfernt wurde (z. B. durch rekombinante Verfahren). Das proRIP weist jedoch die höchste Aktivität auf, wenn auch die Leadersequenz entfernt wird und wahrscheinlich, wenn die C-terminalen Reste auch entfernt werden. Es wird angenommen, daß in der Natur der Linker durch endogene Proteasen, die in keimenden Samen freigesetzt werden, gespalten wird. Es ist bedeutungsvoll, daß entdeckt wurde, daß der Linker auch in vitro durch gewisse Proteasen, z. B. Papain, gespalten werden kann, um aus dem Vorläufer ein aktives Mars-αβ-RIP zu bilden. Während man nicht an der Theorie festhalten sollte, glaubt man, daß Papain wahrscheinlich die Wirkung von endogenen, während der Keimung freigesetzten Endoproteinasen nachahmt.

Es scheint, daß nach dem Entfernen des internen Linkers die beiden Fragmente des prozessierten Polypeptids durch nicht-kovalente Kräfte zusammengehalten werden. Das bedeutet, daß die Assoziation der beiden Polypeptidketten nicht von zwischenkettigen Disulfidbindungen oder der Bildung einer Peptidbindung zwischen den Fragmenten abhängt.

Obgleich man nicht an die Theorie gebunden sein sollte, glaubt man, daß der Linker ein externes Loop mit exponierten Aminosäureresten bildet, welche Proteolyse-empfindlich sind. Eine Stütze für diese Hypothese findet sich im Alignment der Aminosäuresequenzen des Mais-proRIP und der von der Ricin-A- Kette, deren dreidimensionale Struktur bekannt ist (siehe Montfort et al. (1978), J. Biol. Chem. 262-5398). Die Glu 177, Arg 189, Asn 209 und Trp 211 von Ricin A wurden bereits mit der Region der aktiven Stelle des Moleküls in Verbindung gebracht (siehe Robertus (1988), In: Immunotoxins, supra).

Auf der Grundlage dieses Alignments können homologe Reste des Mais-αβ-RIP innerhalb der dreidimensionalen Struktur der Ricin-A-Kette positioniert werden. Die übereinander gelegten Strukturen zeigen, daß das C-terminale Lysin des α-Fragments (Rest 162) sich in einem entsprechenden Alignment mit einem extern positionierten Threonin (Rest 156) der Ricin-A-Kette befindet. Auch das N-terminale Alanin des β-Fragments (Rest 189) befindet sich in einem entsprechenden Alignment mit einem extern positionierten Glycin (Rest 157) der Ricin-A-Kette.

Die vorliegende Erfindung soll die Konstruktion von αβ-RIP- und proRIP-Formen jedweden RIPs einschließen. Wie in Tabellen 4a und 4b dargestellt, enthalten RIPs, für welche eine vollständige Sequenz bestimmt wurde, Regionen mit signifikanter Homologie. In ähnlicher Weise wurden auch die N-terminalen Sequenzähnlichkeiten in einer noch größeren Anzahl RIPs verglichen (in Tabellen 4a und 4b dargestellt). Es ist wahrscheinlich, daß diese Regionen eine besondere Wirkung auf die Funktion des jeweiligen RIPs haben.

Jedes RIP mit bekannten Aminosäuresequenzen kann nun in inaktive, proRIP- Formen durch die Insertion eines Linkers umgewandelt werden. Auf der Basis der aus dem hierin beschrieben Mais-Systemabgeleiteten Information wird es nun möglich, inaktive Formen jedweden RIPs herzustellen, welche eine dreidimensionale Struktur haben, die der dreidimensionalen Struktur der Ricin- A-Kette ähnlich ist. Die Abspaltung des Linkers führt zu einem αβ-RIP, welches zuvor in der Natur nicht gefunden wurde.

Der Stand der Technik hat die Methodologie für die Modifizierung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen beschrieben (siehe z. B. Van Brunt (1986), Biotechnology 4: 277-283). Der erste Schritt umfaßt die Auswahl von plausiblen Stellen auf dem RIP, zwischen denen der Linker eingefügt werden kann. Eine dieser Stellen liegt an den exponierten Aminosäureresten, welche den Rest 156 der Ricin-A-Kette oder dessen Äquivalent in anderen RIP- Sequenzen umgeben. Somit soll die vorliegende Erfindung die Insertion eines Peptidlinkers in solche Sequenzen umfassen, vorausgesetzt, daß die Insertion des Linkers die Ribosom inaktivierende Fähigkeit des RiPs wesentlich reduziert. "Wesentlich reduziert" bedeutet, daß die Insertion eines spaltbaren Linkers in ein aktives RIP den IC&sub5;&sub0;-Wert des daraus resultierenden Proteins mindestens 10-fach, bevorzugt 100-fach und stärker bevorzugt 1000-fach verringert.

Wie zuvor angegeben, wurde gezeigt, daß die Ricin-A-Kette eine Sequenzhomologie zu vielen einzelkettigen RIPs aufweist. Die in den Tabellen 4a und 4b dargestellten RIPs sollen allein zur Veranschaulichung dienen. Zukünftig charakterisierte RIPs, welche die obigen Kriterien erfüllen, sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.

Im allgemeinen kann der Linker jedwede Länge haben, er kann jedwede Aminosäuresequenz haben und kann intern so positioniert werden, daß die Ribosom inaktivierende Aktivität des RIPs wesentlich reduziert wird.

Da die Panicoideae-Linker die einzigen in der Natur gefundenen RIP-Linker sind, erwartet man natürlich, daß solche Aminosäuresequenzen logischerweise der Hauptkandidat für die Insertion in andere RIPs sein werden. Die vorliegende Erfindung soll jedoch auch Linker umfassen, welche zu einem ausgewählten Mais-Linker effektiv homologe Sequenzen aufweisen. Die Faktoren, die zur synthetischen Herstellung effektiv homologer Linker für αβ-RIPs in Betracht gezogen werden müssen, sind im allgemeinen dieselben, die zuvor für die Auswahl effektiv homologer Linker für einen ausgewählten Mais-Linker beachtet werden.

Jede Art von Verfahren kann verwendet werden, um proRIP-codierende Gensequenzen zu klonieren. Ein Verfahren zur Klonierung der proRIP- Gensequenz beinhaltet die Bestimmung der Aminosäuresequenz des proRIR- Moleküls. Um dies zu erreichen, kann das proRIP- oder αβ-RIP-Protein isoliert werden (wie oben beschrieben) und analysiert werden, um die Aminosäuresequenz des proRIP oder αβ-RIP zu bestimmen. Jedes Verfahren, mit dem eine solche Sequenz entschlüsselt werden kann, kann angewendet werden, die Edman-Abbaureaktion ist jedoch bevorzugt. Die Verwendung von automatisierten Sequenzierern ist besonders bevorzugt.

Es ist möglich, proRIP und αβ-RIP aus den darin enthaltenen Aminosäuren in vitro zu synthetisieren. Eine geeignete Technik umfaßt die Festphasenmethode (siehe Merrifield (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154 und Solid Phase Peptide Syntesis (1969), (Hrsg.) Stewart und Young). Automatische Synthetisierer sind ebenfalls erhältlich.

Die so hergestellten Peptide können durch bekannte Verfahren isoliert und gereinigt werden (siehe Current Protocols in Molecular Biology (1989), (Hrsg.) Ausebel et al. Band 1) und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Unter Verwendung der Aminosäuresequenzinformation können die DNA- Sequenzen, die für diese codieren, untersucht werden, um das für proRIP codierende Gen zu klonieren. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu codieren. Obwohl es möglich ist, die gesamte Aminosäuresequenz des proRIP oder αβ-RIP zu bestimmen, ist es bevorzugt, die Sequenz von Peptidfragmenten des Moleküls zu bestimmen und solche Sequenzdaten zu verwenden, um Oligonukleotidsonden herzustellen, welche zur Isolierung der gesamten proRIP-Gensequenz verwendet werden können. Die proRIP- Peptidfragmente können durch Inkubieren des intakten Moleküls mit Cyanogenbromid oder mit Proteasen wie etwa Papain, Chymotrypsin oder Trypsin erhalten werden.

Unter Verwendung des genetischen Codes können ein oder mehrere verschiedene Oligonukleotide identifiziert werden. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Oligonukleotid tatsächlich die für proRIP codierende Sequenz darstellt, kann durch Betrachtung anormaler Basenpaarungsverhältnisse und der Häufigkeit, mit der ein bestimmtes Codon tatsächlich in eukaryontischen Zellen verwendet wird (um für eine bestimmte Aminosäure zu codieren), geschätzt werden. Unter Anwendung dieser Regeln können einzelne Nukleotide oder Sätze von Oligonukleotiden, welche eine theoretisch "wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz enthalten, die in der Lage ist proRIP- oder αβ-RIP-Peptidsequenzen zu codieren, identifiziert werden.

Die Oligonukleotide oder der Satz von Oligonukleotiden, welche die theoretisch am meisten "wahrscheinliche" Sequenz enthalten, die in der Lage ist, für proRIP-Genfragmente zu codieren, können verwendet werden, um die Sequenz eines komplementären Oligonukleotids oder eines komplementären Satzes von Oligonukleotiden zu identifizieren, welches in der Lage ist, mit der "wahrscheinlichsten" Sequenz oder einem "wahrscheinlichsten" Satz von Sequenzen zu hybridisieren. Eine solche Komplementärsequenz enthaltendes Nukleotid kann als Sonde verwendet werden, um das Toxingen zu identifizieren und zu isolieren (siehe Sambrook et al. (1989), supra).

Durch Hybridisierung eines Oligonukleotids mit einer Sequenz, die zu der "wahrscheinlichsten" Gensequenz komplementär ist, erhält man ein DNA- Molekül (oder einen Satz von DNA-Molekülen) das in der Lage ist als Sonde zur Identifizierung und Isolierung des proRIP-Gens zu dienen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Sequenzen, welche für rekombinante proRIPs und αβ-RIPs codieren. Die rekombinant hergestellten proRIP und αβ-RIPs haben die gleichen folgenden Eigenschaften wie aus der Natur isolierte proRIPs und αβ-RIPs, die in den Lehren hierin charakterisiert wurden: (1) Teile der Aminosäuresequenz, die aus der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde und mit den direkt aus der Natur erhaltenen Aminosäuresequenzen äquivalent sind; (2) das Polypeptid wird durch Anti-RIP- Antikörper erkannt; (3) das Molekulargewicht der codierten proRIP- und αβ- RIP-Polypeptide entspricht dem der natürlich vorkommenden Proteine; (4) jedes proRIP-Protein ist umwandelbar in αβ-RIP; und (5) jedes proRIP und αβ-RIP- Protein zeigt eine relativ äquivalente Ribosomen-inaktivierungsaktivität.

Das Verfahren für die genetische Konstruktion des erfindungsgemäßen proRIP oder αβRIP wird durch Klonierung von genetischen Sequenzen ermöglicht, welche in der Lage sind, für das proRIP oder αβRIP oder, wie unten beschrieben, effektiv homologe Varianten davon zu codieren, und durch die Expression solcher genetischen Sequenzen. Der Ausdruck "genetische Sequenzen" soll, wie hierin verwendet, ein Nukleinsäuremolekül (bevorzugt DNA) bedeuten. Genetische Sequenzen, welche in der Lage sind, für das Toxin zu codieren, können aus einer Vielzahl von Quellen abgeleitet werden. Diese Quellen umfassen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon.

Es können Zellen, welche die gewünschte Sequenz enthalten, isoliert werden, und die genomische DNA kann mit Hilfe von einem oder mehreren Restriktionsenzymen fragmentiert werden. Die genomische DNA kann natürlich auftretende Introns umfassen oder auch nicht. Die mit ausgewählten Restriktionsendonukleasen verdaute genomische DNA ergibt Fragmente, welche verschiedene Anzahlen von Basenpaaren (bp) enthalten.

Als im Sinne dieser Erfindung insbesondere umfaßt gelten genomische DNA- Sequenzen, welche für allelische Variantenformen des proRIP-Gens codieren, welche natürlich auftretende Introns umfassen können. Das allelische Gen kann unter Verwendung einer aus der DNA oder RNA des proRIP-Gens sowie aus seinen flankierenden Regionen gewonnenen Hybridisierungssonde abgeleitet werden. "Flankierende Regionen" umfassen jene DNA-Sequenzen, die sich 5' und 3' der proRIP-codierenden Sequenzen befinden.

Das für das proRIP-Gen codierende DNA-Isolat kann auch aus einer cDNA- Bibliothek erhalten werden. Die mRNA kann aus einer geeigneten Quelle unter Verwendung von Standardtechniken der RNA-Isolation und von Oligo-dT- Cellulosechromatographie zur Anreicherung von poly-A-mRNA isoliert werden. Aus dem Gemisch von mRNA wird dann unter Verwendung eines geeigneten Primers, bevorzugt einer Nukleinsäuresequenz, welche für die gewünschte cDNA charakteristisch ist, eine cDNA-Bibliothek hergestellt. Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase wird eine einzelsträngige DNA-Kopie der mRNA erzeugt. Mit entweder der Reversen Transkriptase oder DNA-Polymerase wird aus der einzelsträngigen cDNA-Kopie der mRNA ein doppelsträngiges cDNA- Molekül synthetisiert.

Es ist auch möglich, Primer zur Amplifizierung durch Polymerasekettenreaktion (PCR) der DNA aus Zellen von auf geeignete Weise präparierten Samen und unreifen Kernen zu verwenden. Die PCR beinhaltet eine exponentielle Amplifikation der DNA in vitro unter Verwendung von sequenzspezifischen Oligonukleotiden (siehe Multis et al. (1987), Meth. Enz., 155: 335-350; Horton et al., (1989), Gene 77: 61; und PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (Herausgeber) Erlich (1989):

Die für das proRIP oder αβ RIP codierende DNA kann über manuelle Verfahren chemisch synthetisiert werden, z. B. durch die Phosphotriester- und Phosphodiestermethoden (siehe Caruthers (1983), In: Methodology of DNA and RNA, (Herausgeber) Weissman); oder durch automatische Verfahren, z. B. unter Verwendung von Diethylphosphoramiditen als Ausgangsmaterialien (siehe Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Letters, 22: 1859-1962). Die DNA kann durch Standardtechniken der Hybridisierung und Ligierung von Fragmenten oder durch andere Verfahren konstruiert werden.

Anschließend können die gewünschten Sequenzen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert und gereinigt werden (siehe Current Protocols in Molecular Biology (1989), supra) und Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Die Nukleotidsequenz der Mais-proRIP-cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines solchen entsprechenden Mais-proRIP ist in Tabelle 1 dargestellt.

Es ist nicht nötig, sich auf die Aminosäuresequenzen von proRIP und αβRIP zu beschränken, die in der Natur vorkommen. Es ist somit möglich, selektiv sowohl proRIP als auch αβRIP durch die Anwendung von gentechnologischen Verfahren herzustellen. Dies erlaubt wiederum die Herstellung einer ausreichenden Qualität und Quantität an Material, um neue Formen des Proteins zu entwickeln, ohne daß man die Beschränkungen, welche mit isolationsverfahren, welche die Produktion und Extraktion des Proteins aus natürlichen Quellen verbunden ist, in Kauf nehmen muß.

Rekombinante Verfahren ermöglichen die Herstellung von effektiv homologen Proteinen, welche Teile oder die gesamte Primärstrukturkonformation und/oder eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften des αβRIPs besitzen. Für die Zwecke dieser Erfindung ist eine Aminosäuresequenz effektiv homolog zu einer zweiten Aminosäuresequenz, wenn die aktiven Teile der Aminosäuresequenz zu mindestens 70%, bevorzugt zu mindestens 80% und am meisten bevorzugt zu mindestens 90% identisch sind und die vorgesehene Funktion behalten. Eine zu αβRIP effektiv homologe Sequenz behält somit die Fähigkeit bei, mit eukaryontischen Ribosomen wechselzuwirken und diese zu inaktivieren. Dies ist wichtig und kritisch für die Definition solcher Sequenzen. Die zu dem proRIP effektiv homologe Sequenz muß die Fähigkeit behalten, in ein αβRIP umwandelbar zu sein. D. h. daß das effektiv homologe proRIP eine Linkersequenz aufweisen muß, welche nach Abspaltung ein biologisch funktionstüchtiges αβRIP ergibt.

Allgemeine Kategorien von potentiell äquivalenten Aminosäuren sind unten beschrieben, wobei Aminosäuren innerhalb einer Gruppe für andere Aminosäuren in derselben Gruppe ausgetauscht werden können: (1) Glutaminsäure und Asparaginsäure; (2) Lysin, Arginin und Histidin; (3) hydrophobe Aminosäuren, wie etwa Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; (4) Asparagin und Glutamin; (5) Threonin und Serin; (6) Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; und (7) Glycin und Alanin.

Es ist denkbar, daß im Vergleich mit den Änderungen an den α- und β- Fragmenten an den proRIP-Leader- und Linkerregionen umfangreichere Änderungen vorgenommen werden können. D. h. daß, da die Leader- und Linkersequenzen abgespalten werden sollen, die Länge und die Aminosäurereste in diesen Sequenzen besser toleriert werden und als nicht signifikant betrachtet werden können, da sie die Funktionalität des Endprodukts nicht verändern.

Desweiteren braucht die Linkersequenz des proRIP nicht auf die in Tabelle 1 oben gezeigte Sequenz beschränkt zu sein. Beispielsweise kann die Länge des Linkers modifiziert werden, solange (1) der Linker spaltbar ist und (2) nach der Abspaltung des Linkers das resultierende Protein einen IC&sub5;&sub0;-Wert aufweist, welcher mindestens ungefähr 10-fach geringer ist als der IC&sub5;&sub0;-Wert des den Linker enthaltenden Proteins.

Hauptkriterien für die Auswahl eines effektiv homologen Linkers umfassen Ändern der Nettoladung des αβRIP (z. B. in Richtung sauer); Erzeugen eines Konformationsshifts im Protein oder Verursachen einer sterischen Behinderung der aktiven Stelle des Proteins.

Wie zuvor angemerkt, ist das Mais-αβRIP wie andere RIPs basisch. Das Mais- proRIP hat jedoch einen geringfügig sauren pl. Es ist daher bevorzugt, saure, für das Mais-proRIP ausgewählte, effektiv homologe Linker zu verwenden.

Der Linker sollte eine Länge haben, die gleichzeitig die Veränderung der dreidimensionalen Struktur des Proteins ermöglicht und nach Spaltung dem Protein erlaubt, die meisten der dreidimensionalen Eigenschaften des aktiven αβRIP-Moleküls beizubehalten.

Um sicherzustellen, daß der Linker spaltbar ist, ist es im allgemeinen erforderlich, daß die Konformation des proRIPs so beschaffen ist, daß die Linkerspaltstellen für ein ausgewähltes Spaltmittel leicht zugänglich sind.

Es ist auch denkbar, daß mindestens eine Restriktionsenzymstelle in die für ein RIP codierende Sequenz eingebracht wird, welche das Einfügen von DNA- Sequenzen, die für verschiedene Polypeptidlinker codieren, in das Gen und das Untersuchen ihrer Fähigkeit, ein inaktives, aber aktivierbares RIP zu ergeben, erlauben.

Im allgemeinen wird die Spaltung außerhalb der replikativen Umgebung bewirkt, beispielsweise im Anschluß an das Ernten einer mikrobiellen Kultur. Wenn also das proRIP genetisch modifiziert wird, kann es manchmal vorteilhaft sein, wenn die interne Linkerdomäne des proRIPs erhalten wird oder so verändert wird, daß die Art und Weise, auf welche ein natürliches, inaktives proRIP seine aktiven α- und β-Fragmente freisetzt, nachgeahmt wird.

Ein chemisches oder enzymatisches Verfahren, welches eine spezifische Sequenz oder Struktur erkennt und eine geeignete Spaltung an einer ausgewählten Stelle bewirkt, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann es vorteilhaft sein, die Carboxy-Termini und Amino-Termini der Linkersequenzen so zu konstruieren, daß sie einer Spaltung mit ausgewählten Mitteln unterzogen werden können. Beispiele solcher Sequenzen sind Pro-Xxx-Gly-Pro (wobei Xxx nicht spezifiziert ist), welche selektiv durch Collagenase gespalten wird; Ile-Glu-Gly-Arg, welche selektiv durch Faktor Xa gespalten wird; und Gly-Pro-Arg, welche selektiv durch Thrombin gespalten wird (siehe Nilsson et al. (1988), in: Advances in Gene Technology: Protein Engineering and Production, (Herausgeber) Brew et al.).

Ein chemisches oder enzymatisches Verfahren ist möglicherweise nicht geeignet, wenn seine Spaltstelle innerhalb der aktiven Aminosäuresequenzen der α- und β-Fragmente liegt. D. h. daß eine Spaltung innerhalb der nativen Aminosäuresequenz der α- und β-Fragmente im allgemeinen eine größere Wahrscheinlichkeit der negativen Beeinflussung der enzymatischen Aktivität des αβRIPs aufweist. Es ist möglich, eine spezifische Spaltsequenz lediglich eines einzigen Aminosäurerests auszuwählen, solange dieser Rest in den Aminosäuresequenzen der α- und β-Fragmente nicht zugänglich ist. Es ist jedoch bevorzugt, eine spezifische Spaltsequenz zu verwenden, welche zwei oder mehr Aminosäurereste enthält, d. h. eine ausgedehnte spezifische Spaltsequenz. Dieser Typ Sequenz nutzt die ausgedehnten aktiven Stellen verschiedener Enzyme aus. Zusätzlich ist es höchst wahrscheinlich, daß eine ausgedehnte spezifische Spaltsequenz nur an der gewünschten Stelle und nicht an anderen Stellen innerhalb des Proteins auftritt.

Die hier diskutierten Spalttechniken dienen nur als Beispiel und sind lediglich veranschaulichend für die vielen Variationen, die dem Fachmann durch diese Beschreibung offen stehen.

Unter gewissen Umständen kann es wünschenswert sein, die Spaltung des proRIP innerhalb der Zelle zu bewirken. Beispielsweise kann ein Expressionsvehikel mit geeigneten Promotoren mit einer DNA-Sequenz ausgestattet werden, welche für Enzyme codiert, die proRIP in seine aktive Form umwandeln, wobei sie zusammen mit den anderen DNA-Sequenzen, die für die Expression des proRIP codieren, operiert.

Desweiteren ist wohlbekannt, daß Proteinsequenzen durch posttranslationale Prozessierung, wie etwa durch Assoziierung mit weiteren Molekülen, beispielsweise Glykosiden, Lipiden oder anorganischen Ionen, wie etwa Phosphat, modifiziert werden können. Der Ionisierungszustand variiert je nach dem pH-Wert des Mediums oder dem pH-Wert, bei dem eine Kristallisierung oder Präzipitation der isolierten Farm auftritt. Desweiteren kann das Vorhandensein von Luft eine Oxidation von labilen Gruppen, wie etwa -SH, verursachen. Somit fallen unter die Definition des proRIP und αβRIP und Fragmenten davon alle solche Modifikationen und insbesondere die Primärstruktur, z. B. sowohl glykosylierte und nicht glykosylierte Formen, neutrale Formen, saure und basische Salze, Lipid- oder andere assoziierte Peptidformen, Seitenkettenmodifikationen aufgrund von Oxidation oder Derivatisierung und andere derartige Modifikationen einer Aminosäuresequenz, welche durch dieselbe genetische Kodonsequenz codiert wird.

Beispielhafte Techniken für Nukleotidaustausch umfassen die Addition, Deletion oder Substitution von verschiedenen Nukleotiden, solange der richtige Leserahmen beibehalten wird. Beispielhafte Techniken umfassen die Verwendung von Polynukleotid-vermittelter, ortsspezifischer Mutagenese, d. h. die Verwendung eines Einzelstranges als Templat für die Extension des Oligonukleotids, um einen die Mutation enthaltenden Strang herzustellen (siehe Zoller et al. (1982), Nuc. Acids Res. 10: 6487-6500; Norris et al. ()1983), Nuc. Acids Res. 11: 5103-5112; Zoller et al. (1984), DNA, 3: 479-488; und Kramer et al. (1982), Nuc. Acids Res. 10: 6475-6485) und unter Verwendung von PCR, d. h. durch exponentielle Amplifikation der DNA in vitro unter Verwendung von sequenzspezifischen Oligonukleotiden, um die ausgewählten Änderungen einzubringen (siehe PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Erlich, (Herausgeber) (1989); und Horton et al., supra).

Durch die geeignete Auswahl von Restriktionsstellen kann das gewünschte DNA-Fragment in einem biologisch funktionellen Vektor positioniert werden, welche geeignete Kontrollsequenzen enthalten kann, die in dem ausgewählten DNA-Fragment nicht vorhanden sind. Unter "biologisch funktionell" wird verstanden, daß der Vektor die Replikation und/oder Expression in einem geeigneten Wirt entweder durch Existenz als extrachromosomales Element oder durch Integration in das Wirtsgenom sicherstellt. Eine große Anzahl von Vektoren sind erhältlich oder können auf einfache Weise hergestellt werden. Diese sind dem Fachmann wohlbekannt.

Im allgemeinen enthalten Vektoren, welche die geeigneten Promotoren, die von einem Wirtsorganismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können, enthalten, zusätzlich Kontrollsequenzen, Ribosombindestellen und Transkriptionsterminationsstellen. Im allgemeinen werden die Replikon- und Kontrollsequenzen, die aus Spezies, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, abgeleitet wurden, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet.

Schließlich sollten die Vektoren bevorzugt ein Markergen aufweisen, welches in der Lage ist, eine phänotypische Eigenschaft zu übertragen, welche das Identifizieren von den Vektor enthaltenden Wirtszellen ermöglicht.

Zur Expression des αβRIP können die das α-Fragment und das β-Fragment codierenden DNA-Fragmente in getrennte Vektoren oder in denselben Vektor inseriert werden. Wenn die α- und β-Fragmente in getrennten Vektoren vorliegen, können die Wirtszellen spezifisch entweder durch Kotransformation oder zielgerichtete Transformationstechniken transformiert werden.

Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, welche die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, kann wie folgt erreicht werden.

Für die Insertion von das proRIP-Gen oder αβRIP-Gene enthaltenden DNA- Fragmenten in ein geeignetes Expressionsvehikel können Restriktionsendonukleasen verwendet werden. Beispielhafte Restriktionsenzyme umfassen Aat II, Bam HI; Eco RI, Hind III, Nde I, Spe I, Xba I, Sac I, Bgl II, Pst I, Sal I und Pvu II.

Die Spaltung wird durch Behandlung des Expressionsvehikels mit einem/mehreren Restriktionsenzymen durchgeführt. Im allgemeinen werden 10 ug Vektor oder DNA-Fragmente zusammen mit 10 Einheiten Enzym in 100 ul Pufferlösung verwendet. Der Endonukleaseverdau wird normalerweise bei Temperaturen im Bereich von 37 Grad Celsius (37ºC) bis 65ºC, bei einem pH-Wert von 7 bis 9 durchgeführt. Geeignete Puffer und Substratmengen für besondere Restriktionsenzyme sind von den Herstellern spezifiziert. Die Zeit für die Reaktion beträgt von 1 bis 18 Stunden.

Nach dem vollständigen Enzymverdau kann Protein mit Hilfe von Standardtechniken (z. B. Extraktion mit Phenol und Chloroform) entfernt werden. Die Nukleinsäure kann dann aus der wäßrigen Fraktion mit Hilfe von Standardverfahren rückgewonnen werden.

Das gewünschte Fragment wird dann aus dem Verdau isoliert. Geeignete Isolierungstechniken umfassen Gelelektrophorese oder Sucrosegradientenzentrifugation. Die Vektor- und Fremd-DNA-Fragmente können dann mit DNA-Ligase ligiert werden.

Es wird ein geeignet gepuffertes Medium, welches die DNA-Fragmente, DNA- Ligase und geeignete Kofaktoren enthält, verwendet. Die angewendete Temperatur liegt zwischen 4ºC und 25ºC. Wenn die DNA-Segmente Wasserstoffbrücken bilden, ist die DNA-Ligase in der Lage, eine kovalente Bindung zwischen zwei Segmenten, einzufügen. Die für die Ligation benötigte Zeit variiert mit der angewandten Temperatur, der Art der Salzlösung sowie der Art der klebrigen Enden oder kohäsiven Termini. Im allgemeinen beträgt die Zeit für eine Ligierung von 5 bis 18 Stunden (siehe Sambrook et al. (1989), supra).

Anschließend können die Vektorkonstruktionen verwendet werden, um eine geeignete Wirtszeile zu transformieren. Geeignete Wirtszellen umfassen aus einzelligen und vielzelligen Organismen abgeleitete Zellen, die in Kulturen oder durch Fermentation kultiviert werden können.

Verschiedene einzellige Mikroorganismen können sowohl für die Klonierung und die Expression verwendet werden. Prokaryonten umfassen Mitglieder der Enterobacteriaceae, wie etwa Stämme von Escherichia coli und Salmonella; Bacillaceae, wie etwa Bacillus subtilis; Pneumococcus, Streptococcus und Haemophilus influenzae.

Zusätzlich zu Prokaryonten können eukaryontische Zellen verwendet werden. Wie oben erwähnt, wurden eukaryontische Zellen bisher nicht als rekombinante Wirtszellen für RIPs verwendet. Durch Bereitstellung von inaktiven Formen von RIPs ermöglicht die vorliegende Erfindung den Fachleuten die Flexibilität, eukaryontische Zellen als rekombinante Wirte zu verwenden. Durch die Transformation von eukaryontischen Zellen mit dem proRIP-Gen kann das Protein in hohen Mengen exprimiert werden, ohne für die Wirtszelle toxisch zu sein. Da das Protein bis zur extrazellulären Spaltung mangelnde Bioaktivität aufweist, besteht die Wirkung darin, die Biosicherheit des Verfahrens zu erhöhen. Das proRIP kann dann selektiv chemisch oder enzymatisch in das gewünschte αβRIP umgewandelt werden.

Beispielhafte eukaryontische Mikroben umfassen Hefe. Saccaromyces cerevisae oder die gemeine Bäckerhefe wird unter den eukaryontischen Mikroorganismen am häufigsten verwendet, obwohl eine Anzahl weiterer Wirte allgemein erhältlich ist.

Zusätzlich zu eukaryontischen Mikroben können Kulturen von aus vielzelligen Organismen abgeleiteten Zellen ebenfalls als Wirte verwendet werden. Beispiele geeigneter Säugerwirtszellinien sind Sp2/0, VERO und HeLa-Zellen, Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellinien und W138, BHK, COS-7 und MDCK- Zellinien.

Weitere geeignete Wirte und Expressionssysteme sind die Baculovirussysteme, die in kultivierten Insektenzellen, beispielsweise aus Spodoptera frugiperda, durchgeführt werden.

Schließlich wurden Zellen aus und Teile höherer Pflanzen als nützliche rekombinante Wirte erkannt, und es sind geeignete Kontrollsequenzen für die Expression in diesen Systemen erhältlich. Geeignete Pflanzenzellen umfassen Zellen, die aus Tabak, Petunien, Tomaten, Kartoffeln, Reis, Mais und dgl. oder Sämlingen davon abgeleitet wurden.

Das Expressionsvehikel kann durch jedwede geeignete Methode in die Wirtszelle eingebracht werden. Herkömmliche Technologien zur Einführung biologischen Materials in lebende Zellen umfassen Elektroporation (siehe Shigekawa und Dower (1988), Biotechniques, 6: 742; Miller et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 856-860; und Powell et al (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54: 655-660); direkte DNA-Aufnahmemechanismen (siehe Mandel und Higa (1972), J. Mol. Biol., 53: 159-162; Dityatkin et al. (1972), Biochimica et Biophysica Acta, 281: 319-323; Wigler et al. (1979), Cell, 16: 77; und Uchimiya et al. (1982), in: Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (Herausgeber), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, S. 507-508); Fusionsmechanismen (siehe Uchidaz et al. (1980), in: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga et al. (Herausgeber) Wistar Symposium Series, 1: 169-185); infektiöses Material (siehe Fraley et al. (1986), CRC Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46; und Anderson (t984), Science, 226: 401-409); Mikroinjektionsmechanismen (siehe Crossway et al. (1986), Mol. Gen. Genet., 202: 179-185); und Hochgeschwindigkeitsgeschoßmechanismen (high velocity projectile mechanisms) (siehe EPO 0 405 696 von Miller, Schuchardt, Skokut und Gould (The Dow Chemical Company). Das geeignete Verfahren kann in Übereinstimmung mit der verwendeten Pflanzenspezies ausgewählt werden.

Im allgemeinen werden die Wirtszellen nach der Transformation für ungefähr 48 Stunden kultiviert, um die Expression von Markergenen zu erlauben. Anschließend werden die Zellen in selektives Medium und/oder screenbare Medien gebracht, wo nicht transformierte Zellen von transformierten Zellen entweder durch Tod oder eine biochemische Eigenschaft unterschieden werden können.

Die transformierten Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Produktion des gewünschten Proteins angemessen sind, und werden auf deren Expression getestet. Beispielhafte Testtechniken umfassen Enzyme-linked ImmunosorbentAssay (ELISA), Radioimmunoassays oder fluoreszenzaktivierte Zellsortieranalyse, Immunohistochemie und dgl.

Ausgewählte positive Kulturen werden subkloniert, um reine transformierte Kolonien zu isolieren. Eine geeignete Technik zur Erhaltung von Subklonen besteht in der limiting dilution-Methode (Verdünnungsreihen).

Anwendungen

Es werden praktisch alle Anwendungen, die im Stand der Technik für RIPs ins Auge gefaßt wurden, für die neuen αβ RIP und proRIP, die hierin dargestellt sind, vorgesehen (siehe Immunotoxins (1988), Frankel (Herausgeber); und U.S. Patent 4,869,903 an Lifson et al. (Genelabs Incorporated and die Regents of the University of California)).

Durch die Bereitstellung von inaktiven Vorläuferformen des αβ-RIP, ist es nun möglich, Proteinsyntheseinhibitoren bereitzustellen, die Verwendungen in praktischen und verbesserten Weisen haben, die zuvor nicht möglich waren. Die inaktive Form des αβ-RIP liefert gegenüber aktiven RIPs den zusätzlichen Vorteil, daß sie bis zur Entfernung der Linkersequenz nicht aktiv ist. Auch wenn das RIP für die Mehrheit der Säugerzellen nicht toxisch ist, ist bekannt, daß RIP durch Anbringen an ein zielgerichtetes Vehikel spezifisch cytotoxisch gemacht werden kann, welches in der Lage ist, an und in Zielzellen zu binden.

Beispielhafte zielgerichtete Vehikel umfassen jedes Peptidhormon, jeden Wachstumsfaktor oder jedes andere Polypeptid-Zellerkennungsprotein, für das ein spezifischer Rezeptor existiert. Ein paar Beispiele umfassen: Antikörper und Antikörperfragmente, Lectine, Insulin, Glukagon, Endorphine, Wachstumshormone, Melanozyten-stimulierendes Hormon, Transferrin, Bombesin, Lipoprotein geringer Dichte, luteinisierendes Hormon und Asialoglykoprotein, die selektiv an Zielzellen binden (siehe Immunotoxins (1988), supra). Es ist gut etabliert, daß Konjugate, die RIP enthalten, eine maximale Cytotoxizität nur zeigen, wenn die RIP-Einheit von dem zielgerichteten Vehikel freigesetzt wird.

Da das αβ-RIP und das proRIP keine reaktive Sulfhydrylgruppe enthalten, kann es notwendig sein, die Proteine unter Verwendung von chemischen Quervernetzungsreagenzien zu modifizieren, um ein solches proRIP und αβ-RIP an zielgerichtete Vehikel zu koppeln.

Konjugate aus einem monoklonalen Antikörper und dem αβ-RIP und dem proRIP können unter Verwendung einer Vielzahl von bifunktionellen Proteinkopplungsmitteln hergestellt werden. Allgemeine Beispiele solcher Reagenzien sind N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, 2-Iminothiolan, bifunktionelle Derivate von Imidoestern, wie etwa Dimethyladipimidat, aktive Ester, wie etwa Disuccinimidylsuberat, Aldehyde, wie etwa Glutaraldehyd, Bis- Azidoverbindungen, wie etwa Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin, Diisocyanate, wie etwa Toluol-2,6-diisocyanat und Bis-aktive Fluorverbindungen, wie etwa 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol (siehe z. B. WO86/05098).

Zusätzlich können rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, um ein cytotoxisches Fusionsprotein zu konstruieren. Für eine allgemeine Diskussion von chimären Toxinen (siehe z. B. Pastan und FitzGerald (1989), The Journal of Biological Cemistry, 264: 15157-15160; und U.S. Patent 4,892,827 an Pastan et al. (Die Vereinigten Staaten von Amerika, vertreten durch das Department of Health und Human Services)). Diese Literaturstellen lehren modifizierte Pseudomonas-Exotoxine, welche eine Deletion in einer Rezeptorbindedomäne umfassen, um ein Fusionsprotein zu bilden, das in der Lage ist, das modifizierte Toxin gegenüber ausgewählten Zellen weniger toxisch zu machen. Diese Literaturstellen lehren DNA-Sequenzen, die für den humanen α-transformierenden Wachstumsfaktor (α-TGF) oder humanes Interleukin fusioniert an Toxingene codieren.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird genauer durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele sind lediglich zu Veranschaulichungszwecken und sollten nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzend aufgefaßt werden. Alle Temperaturen, falls nicht anders angegeben, sind in ºC. Alle Teile und Prozentangaben sind nach Gewicht, falls nicht konkret anders angegeben.

Beispiel 1: Isolierung von Mais-αβ-RIP

Alle Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt, ausgenommen die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), welche bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Fünfhundert Gramm (500 g) fein gemahlene reife Maiskörner wurden mindestens 2 Stunden und bis zu 24 Stunden (h) mit 1500 ml von 25 mM Natriumphosphat, pH 7,2 (PB) + 50 mM Natriumchlorid extrahiert. Nachdem der Extrakt durch mehrere Lagen Gaze geseiht wurde, wurde das Protein, das zwischen 55% und 85% Ammoniumsulfat präzipitierte, gesammelt und wieder in PB gelöst, und dann über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt und auf eine 2,5 · 10 Zentimeter (cm) DE-52 Cellulosesäule, die mit PB äquilibriert worden war, aufgebracht. Das geradewegs die Säule durchlaufende Protein wurde gesammelt und auf eine Mono S 10/10-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Pscataway, NJ), die mit PS äquilibriert war, aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 200 mM Natriumchlorid in PB über 90 Minuten bei 2 Milliliter/Minute (ml/min) eluiert. Alternativ kann das Protein mit 85% Ammoniumsulfat präzipitiert werden und vor dem Aufbringen auf die Mono S 10/10-Säule über Nacht dialysiert werden.

Fraktionen, die eine Ribosomen-inaktivierende Proteinaktivität (wie durch einen Kaninchenretikulozyten-Proteinsyntheseassay gemessen, wie oben beschrieben) enthielten, wurden zusammengegeben und in Centricon-10- Vorrichtungen (Amicon, Danvers, MA)auf 0,5 ml konzentriert und auf eine Superose 12-Säule, die in PB (Pharmacia LKB Biotechnology) äquilibriert war, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,4 ml/min aufgebracht. Fraktionen, die eine Ribosomen-inaktivierende Proteinaktivität enthielten (wie durch einen Kaninchenretikulozyten-Proteinsyntheseassay gemessen, wie oben beschrieben) (der erste Hauptpeak), wurden zusammengegeben. Bei diesem Schritt war das αβ-RIP üblicherweise ziemlich rein, wie durch SDS-PAGE (siehe Laemmli (1970), supra) nachgewiesen. Falls nötig, kann eine weitere Reinigung durch Aufbringen des Proteins auf eine Mono S 5/5-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology), äquilibriert mit PB, und Eluieren bei 1 ml/min mit 0 bis 50 mM Natriumchlorid in PB über 5 Minuten, dann mit 50 bis 200 mM Natriumchlorid in PB über 25 Minuten erzielt werden.

Die Ergebnisse einer typischen Aufreinigung sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Wirkung von gereinigtem Mais-αβ-RIP auf eine Säugerproteinsynthese ist in Fig. 2 gezeigt.

Tabelle 5

Eine Aktivitätseinheit ist die Proteinmenge, die erforderlich ist, um 50% Inhibition im Kaninchenretikulozytenlysat-Proteinsyntheseassay zu erzeugen.

A. Zellfreier Kaninchenretikulozyten-Proteinsyntheseassay

Die Inhibitionsaktivität des Mais-αβ-RIP gegenüber einer Säugerproteinsynthese wurde in einem Kaninchenretikulozytenlysatsystem gemäß den Vorgehensweisen von Pelham und Jackson (siehe (1976), Eur. J. Biochem., 67: 247-256) gemessen.

Ein Gemisch der folgenden Reagenzien wurde hergestellt (2,5 Milliliter (ml) Gesamtvolumen): 125 Mikroliter (ul) 200 mM Tris-HCl, pH 7,6 + 40 mM Magnesiumacetat + 1,6 M Kaliumchlorid; 12,5 ul 3 mM Heminhydrochlorid in 50% Ethylenglykol; 1,0 ml unbehandeltes Kaninchenretikulozytenlysat (Promega, Madison, WI); 1,0 ml H&sub2;O; 62,5 ul Amminosäuregemisch; 125 ul 20 mM ATP + 4 mM GTP; 12 ul 200 mM Creatinphosphat; 50 ul 2,5 mg/ml Creatinphosphokinase in 50% Ethylenglykol. DasAminosäuregemisch enthielt 50 uM jeder Aminosäure außer Glycin (100 uM), Arginin, Isoleucin, Methionin und Tryptophan (jeweils 10 uM) und es enthielt kein Leucin. Alle Vorratslösungen wurden zunächst vor der Zugabe auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.

5 Mikroliter (5 ul) entsprechender Verdünnungen der zu untersuchenden Proben wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und es wurden 50 ul des Gemisches zugegeben. Nach 10 Minuten wurden 50 Nano-Curie (nCi) ¹&sup4;C-Leucin in 10 ul zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten (min) wurde die Reaktion mit 10 ul 1,5 M Kaliumhydroxid gequencht und für 45 min inkubiert. 25 Mikroliter (25 ul) jeder Probe wurden dann auf einzelne 2,1 cm Whatman 3 mm Papierscheiben (Whatman, Clifton, NJ) pipettiert und nach Trocknen für 2 bis 3 Minuten wurden die Scheiben nacheinander durch Schwenken in einem Kolben mit 250 ml 10%iger Trichloressigsäure, 250 ml 5%iger Trichloressigsäure (zweimal), 125 ml Ethanol, 250 ml 1 : 1 Ethanol/Aceton und 125 ml Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die Filter in Ampullen mit 10 ml eines Szintillationscocktails gegeben und gezählt.

B. Antiseren und Western-Blot-Analyse:

Die α- und β-Polypeptidbanden wurden aus 3 Millimeter (mm) SDS-PAGE-Gelen nach einem kurzen Anfärben mit Coomassie-Blau ausgeschnitten und sie wurden unter Verwendung einer Elektroelutionsvorrichtung (Bio-Rad, Richmond, CA) gemäß den Anleitungen des Herstellers elektroeluiert. Die Polypeptidpräparate wurden dann verwendet, um Kaninchen zu immunisieren, um polyklonale Antiseren zu ergeben (hergestellt von RIBI Immunochem, Montane).

Western-Blots mit PhastgelsTM-Reagenz (Pharmacia LKB Biotechnology) wurden durchgeführt, indem das Gel von der Kunststoffrückseifie entfernt wurde und dann auf Immobilon-Papier (Millipore Corporation, Bedford, MA) elektroaufgetragen wurde. Blots wurden unter Verwendung des primären Mais- αβ-RIP-Antiserums bei einer Verdünnung von 1 : 2000 und einem sekundären alkalischen Phosphatase-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper (Bio- Rad) gemäß den Instruktionen des Herstellers entwickelt.

Beispiel 2: Isolierung von Mais-proRIP

Die polyklonalen Antiseren gegen die α- und β-Fragmente wurden verwendet, um ein gemeinsames 34 kD Vorläuferpolypeptid in Rohextraken aus Maiskörnern zu identifizieren (Mais-proRiP). Die Anwesenheit des Mais-proRIP wurde während der nachfolgenden Reinigung durch Western Blot-Analyse, wie oben angegeben, beobachtet. Alle Reinigungsschritte wurden bei 4ºC ausgeführt, außer der HPLC, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde.

Zweihundertfünfzig Gramm (250 g) unreife Maiskörner wurden in 600 ml 25 mM Natriumphosphat, pH 7,2 (PB) + 5 ug/ml Antipapain homogenisiert. Nachdem der Extrakt durch mehrere Lagen Gaze geseiht worden war, wurde das zwischen 45 und 80% Ammoniumsulfat präzipitierende Protein gesammelt und in 15 ml PB wieder aufgelöst, und dann über eine 2,5 · 15 cm Sephadex G-25 Säule (Pharmacia LKB), äquilibriert in PB, geleitet. Protein enthaltende Fraktionen wurden zusammengegeben und mit Wasser auf etwa 60 ml verdünnt. Die Lösung wurde auf eine Q-Sepharose (schnellfließend)- Säule, gepackt in einer 10/10 FPLC-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology), äquilibriert mit PB, aufgebracht und mit einem 0 bis 300 mM NaCl-Gradienten bei 2 ml/min über 75 Minuten eluiert. Fraktionen, die den 34 kD-Vorläufer enthielten, wurden zusammengegeben und durch eine Centriprep 10- Vorrichtung (Amicon) auf 1,5 ml konzentriert. Dieses wurde vierfach mit Wasser verdünnt und auf eine Mono Q 5/5-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology), äquilibriert in PB, aufgebracht. Die Säule wurde mit einem 0 bis 250 mM NaCl-Gradienten über 60 Minuten eluiert. Fraktionen, die das 34 kD-Polypeptid enthielten, wurden zusammengegeben, auf 0,5 ml konzentriert und auf eine Superose 12-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology), äquilibriert in PB, aufgebracht. Der Hauptpeak aus dieser Säule enthielt den 34 kD-Mais-RIP- Vorläufer und entsprechende Fraktionen wurden zusammengegeben und bei -20ºC gelagert.

Beispiel 3: PAGE-Analyse von Mais-αβ-RIP und proRIP

SDS-PAGE wurde mit einem PhastsystemRM-Reagenz (Pharmacia LKB Biotechnology) unter Verwendung von 20% PhastgelsTM-Reagenz und gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Native PAGE wurde bei einem pH-Wert von 4,2, wie in dem PhastsystemTM-Reagenz Anwendungsordner Nr. 300, Methode 1 beschrieben, durchgeführt (Pharmacia LKB Biotechnology).

SDS-PAGE von hochgereinigtem aktivem Mais-αβ-RIP zeigte sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen zwei Polypeptide, ein α-Fragment (16,5 kD) und ein β-Fragment (8,5 kD). Eine einzelne Bande wurde in einer nativen PAGE-Analyse von gereinigtem aktivem Mais-αβ-RIP gesehen. Der minimale Mr-Wert des assoziierten nativen Mais-αβ- RIP betrug deshalb 25 kD.

Bei SDS-PAGE wanderte hochgereinigtes Mais-proRIP mit einem Wert von 34 kD.

Beispiel 4: In vitro-Aktivierung von Mais-proRIP durch Papain

Eine gereinigte Probe von proRIP wurde bei 0,5 mg/ml mit Papain, einen Pflanzenthiolprotease, bei 0,01 mg/ml in einem Natriumacetatpuffer, pH 6 enthaltend 2 mM Dithiothreitol inkubiert. Nach 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur war das 34 kD-proRIP zu einem stabilen Produkt verdaut, das ein Polypeptidmuster zeigte, das fast identisch mit dem von nativem, aktivem Mais-αβ-RIP war. Es gab einen gleichzeitigen Anstieg an Ribosomen inaktivierender Aktivität bei der Inkubation; das unverdaute proRIP hatte keine Ribosomen-inaktivierende Aktivität bis zu 2 ug/ml, wohingegen Papain- behandeltes proRIP einen IC&sub5;&sub0; von < 80 ng/ml aufwies. Im Gegensatz dazu hatte Trypsin keine Wirkung auf Mais-proRIP.

Beispiel 5: Chemisch bestimmte Aminosäuresequenzen A. N-Terminale Aminosäuresequenzen von Mais-αβ-RIP, α-Fragment und β Eine Probe von Mais-

αβ-RIP wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli ((1970), supra) in 1,5 mm dicken Gelen elektrophoretisch behandelt und das Gel wurde auf ein Immobilon PVDF-Papier (Millipore) unter Verwendung einer TransphorTM-Vorrichtung (Pharmacia LKB Biotechnology) elektrogeplottet. Das Papier wurde kurz mit Coomassie-Blau angefärbt und die den Polypeptiden mit 16,5 und 8,5 kD entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten. Diese wurden direkt vom PVDF-Papier unter Verwendung eines 470 A- Gasphasensequenzators (Applied Biosystems, Foster City, CA) vom N- Terminus her sequenziert. Die folgenden Daten wurden erhalten (Reste in Klammern bezeichnen Zuordnungen mit niedrigerer Konfidenz):

N-terminale Sequenz eines α-Fragments:

KRIVPKITEIFPVEDANYPVSAFIA[G]VX KDVI

Eine weitere geringfügigere Spezies (etwa 20% der Gesamtspezien) hatte eine N-terminale Sequenz von:

AQTNK[L]IVPK

N-Terminale Sequenz des β-Fragments:

AADPQADTKSXLVKLVVMS/CEGLXFNTV S

B. C-Terminale Aminosäuresequenz des α-Fragments

Die Carboxy-terminale Aminosäuresequenz des α-Mais-αβ-RIP α-Fragments wurde unter Verwendung einer zur Sequenzierung reinen Carboxypeptidase P von Penicillium japonicum (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bestimmt. Eine Probe des 16,5 kD-Polypeptids wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac 5 u C4 4,6 · 30 mm RP-Säule gereinigt. Die Säule wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) äquilibriert und mit 0 bis 40% 0,1 % TFA + 80% Acetonitril über 8 Minuten, dann mit 40 bis 60% einer 0,1 % TFA + 80% Acetonitril über 20 min eluiert. Das β-Fragment eluierte nach 21,9 min und das α-Fragment eluierte nach 23,3 min.

Eine lyophilisierte Probe des α-Fragments wurde in 20 mM Natriumacetat, pH 5,8 + 4 M Harnstoff gelöst. Das Verdaugemisch enthielt die folgenden Bestandteile in 0,1 ml: 1,6 ug Carboxypeptidase P, 66 ug β-Fragment, 0,12 M Natriumacetat, pH 4,2, 0,8 M Harnstoff. Nach 1, 5, 15, 60, 120 und 480 min wurden zweifache 8 ul Aliquots von dem Verdau zu 8 ul 0,4 M Natriumborat, pH 10,5 zugegeben und auf Trockeneis gefroren.

Eine Aminosäureanalyse wurde im wesentlichen wie von Jones (1986) in: Methods of Protein Microcharacterization (Herausgeber) J. E. Shevely durchgeführt. Die folgende Sequenz wird erhalten: NH&sub2;-Asp-Leu-Ala-(Lys)n- COOH, worin n = 2-4. Dies war der Carboxy-Terminus des α-Polypeptids, weshalb diese und die N-terminale Sequenz des β-Fragments die Linkerregion definieren, die im Vorläufer enthalten ist (siehe die von cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz in Tabelle 1).

C. N-Terminale Aminosäuresequenz von Mais-proRIP

Es wurden keine N-terminalen Sequenzdaten von einer Probe des Mais-proRIP mit 34 kD erhalten, das anzeigt, daß dieses Polypeptid N-terminal blockiert ist.

Beispiel 6: Isolierung und Charakterisierung von cDNA für Mais-proRIP A. Isolierung

Unreife Kerne eines im Feld gewachsenen Pioneerhybrid 3737 wurden geerntet, vom Maiskolben entfernt und bei -20ºC gelagert. Zehn Gramm (10 g) Körner wurden in flüssigem Stickstoff für einige Minuten eingefroren, dann in einem Waring-Mischer zu Pulver zermahlen. Das Pulver wurde in 20 ml eiskaltem TENS-Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, 0,3 M NaCl) suspendiert und unverzüglich mit einem gleichen Volumen von Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol (25 : 24 : 1), gesättigt mit TENS-Puffer, extrahiert. Die wäßrige Phase wurde gesammelt und drei weitere Male mit frischen Phenolgemischen extrahiert.

Nukleinsäuren wurden aus der wäßrigen Phase präzipitiert, indem sie auf 0,3 M Natriumacetat, pH 5,5, eingestellt wurde und 2,5 Volumen 100% Ethanol zugegeben wurden. Die Nukleinsäuren wurden durch Zentrifugation gesammelt und direkt in 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol plus 1 ml TENS suspendiert und durch Vortexen extrahiert. Die Nukleinsäure wurde aus der wäßrigen Phase durch Ethanolpräzipitation, wie oben, präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und in TE-Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA) resuspendiert. Einzelstrang-Nukleinsäure wurde durch Einstellen der Lösung auf 2 M LiCl und Inkubieren für 4 bis 12 Stunden bei 4 ºC präzipitiert. Eine Zentrifugation ergab ein Pellet, das aus zwischen 2,2 bis 2,5 mg Gesamt-RNA bestand.

Poly(A)-enthaltende RNA wurde aus der Gesamt-RNA-Probe unter Verwendung eines Hybond mAPTM mRNA-Reinigungsaffinitätspapiers (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) angereichert. Es wurde das Protokoll der Lieferfirma befolgt. Typischerweise wurden 5 bis 10 ug Poly(A)-angereicherte RNA pro Milligramm Gesamt-RNA gewonnen.

Fünf Mikrogramm (5 ug) Poly(A)-angereicherter RNA wurden unter Verwendung eines cDNA-SynthesisTM-Kits (Pharmacia LKB Biotechnology) in doppelsträngige cDNA überführt. Die cDNA wurde in den Klonierungsvektor Lambda gt11 (Stratagene Inc., La Jolla, CA) gemäß den Instruktionen der Lieferfirma ligiert. Das Verpacken des ligierten Vektor-Insert-Gemisches wurde mit dem Gigapack Plus Packaging-Extrakt (Stratagene, Inc.) durchgeführt, wiederum gemäß dem Protokoll der Lieferfirma.

Der PicoBlue ImmunodetectionTM-Kit (Stratagene, Inc.) wurde verwendet, um die Lambda gt11 Maiskern cDNA-Bibliothek unter Verwendung von polyklonalen Kaninchenantiseren zu screenen, die gegen das Mais-proRIP, wie oben beschrieben, erzeugt worden waren.

Positive Klone wurden bis zur Homogenität gereinigt und die cDNA-Inserts durch eine Eco RI-Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Eines der größten Eco RI-gebildeten cDNA-Inserts (etwa 1100 bp) wurde in die Eco RI-Stelle des Plasmids pUC19 (Bethesda Research Labs, Gaithersberg, MD) ligiert. Klone, die das proRIP-cDNA-Insert in beiden Orientierungen enthielten, wurden durch einen Restriktionsverdau identifiziert und für eine Plasmidreinigung im großen Maßstab verwendet.

B. Sequenzieren der cDNA von Mais-proRIP

Die Nukleotidsequenz der proRIP-cDNA (in Tabelle 1 angegeben) wurde durch das Dideoxy-Kettenabbruchsequenzieren unter Verwendung des SequenaseTM- DNA-Sequenzierkits (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) bestimmt. Die doppelsträngige pUC19-RIP wurde gemäß den Instruktionen des Herstellers als Templat verwendet. Die erste Sequenzierrunde wurde durch den M13/pUC-Vorwärts-Sequenzierprimer (Bethesda Research Labs) initiiert. Nachfolgende Primer wurden aus der sequenzierten Mais-proRIP-cDNA abgeleitet. Beide Stränge der cDNA wurden mindestens einmal vollständig sequenziert.

Der offene Leserahmen, der das αβ-RIP-Protein codiert, wurde durch einen Vergleich der von der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz (in Tabelle 1 angegeben) mit den chemisch bestimmten Proteinsequenzdaten bestätigt.

Beispiel 7: Expression von Mais-proRIP und Derivaten in Escherichia coli

Verschiedene genetische Derivate von Mais-proRIP können in E.coli exprimiert und hinsichtlich einer Ribosomen-inaktivierenden Aktivität untersucht werden. Eine Zusammenfassung von verschiedenen Konstruktionen und ihren Eigenschaften wird untenstehend angegeben.

A. R34 (in Tabelle 6 unten angegeben) stellt das intakte rekombinante proRIP-Gen dar, das ein Protein mit einem Mr von 33.237 codiert und, wie erwartet, kein potenter Proteinsynthese-Inhibitor ist. Nach einer Papainbehandlung wird es zu zwei assoziierten Polypeptiden (von etwa 17 + 9 kD; durch SDS PhastgelTm-Analyse) mit einer sehr potenten Ribosomeninaktivierenden Aktivität prozessiert. N34 stellt das native proRIP, wie aus der Natur isoliert, dar.

Tabelle 6 R34-DNA-Sequenz: die Mais-proRIP-DNA, konstruiert zur Expression in Escherichia coli

Die Expression des rekombinanten Mais-proRIP in E.coli wurde durch gentechnisches Verarbeiten der cDNA über eine PCR-Amplifikation erreicht. Ein 5'-Primer wurde synthetisiert, der Stoppkodons in allen drei Leserahmen enthielt, um eine Translation der Vektor-codierten Proteine stromauf der Mais- proRIP-cDNA zu stoppen. Der Primer enthielt auch eine Shine-Dalgarno- Sequenz, einige Basenpaare stromauf eines ATG-Startkodons, gefolgt von 23 Basen, welche homolog zur Mais-proRIP-cDNA waren. Der 3'-Primer umfaßt die 3'-cDNA-End-pUC19-Verbindung (die Primer werden durch die in Tabelle 6 angegebenen unterstrichenen Bereiche gezeigt). Eine PCR-Amplifikation der cDNA in pUC19 unter Verwendung des GeneAmpTM-Kits (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT) ergab, wie erwartet, ein vorherrschendes Amplifikationsprodukt von etwa 1 100 Basenpaaren.

Das konstruierte amplifizierte Produkt wurde auf einem Agarosegel gereinigt und in die aufgefüllte HindIII-Stelle des Expressionsvektors pGEMEX-1 (Promega Corp., Madison, WI) ligiert, um das Plasmid pGR, das untenstehend gezeigt ist, zu ergeben.

Dieses wurde in E.coli DH5α (Bethesda Research Labs) transformiert. Plasmide, die die Mais-proRIP-cDNA enthielten, wurden durch eine Koloniehybridisierung (siehe Sambrook et al., supra) mit einer 5'-Mais-proRIP-cDNA-Sonde isoliert und charakterisiert. Solche, die die cDNA-Sonde für das Mais-proRIP in der richtigen Orientierung enthielten, wurden hinsichtlich der Expression untersucht. Die Plasmide wurden in kompetente E.coli JM109(DE3) (Promega Corp., Madison, WI) transformiert, transformierte Zellen wurden in 15 ml Kulturen unter Ampicillinselektion bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,4 bis 1,0 gezüchtet. Isopropylthio-β-galactosid (IPTG) wurde auf 1,3 mM zugegeben, um die Bildung von rekombinantem proRIP zu induzieren und die Kulturen wurden weitere 4 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und als Pellet bei -20ºC gelagert.

Das aus der Mais-proRIP-cDNA hergestellte Protein wurde durch Lyse der induzierten Zellen in TE-enthaltendem 1 mg/ml Lysozym bei 37ºC für 15 min analysiert. Das Lysat wurde in einen Rohüberstand und ein Pellet durch eine Mikrozentrifugation fraktioniert. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung von 20% PhastgelsTM-Reagenz (Pharmacia LKB Biotechnology) analysiert. Ein Anfärben mit Coomassie-Blau und eine Western-Blot-Analyse der Gele mit Anti-Mais-proRIP-Seren identifizierte eine 34 kD-Bande, welche bei Induktion der Zellen mit IPTG deutlich erhöht wurde. Zellen, die das Plasmid nicht trugen oder das Plasmid mit der Mais-proRIP-cDNA in der umgekehrten Orientierung enthielten, enthielten diese 34 kD immunoreaktive Bande nicht. Der Großteil des rekombinanten Mais-proRIP war im Zellpellet enthalten, woraus man schließen kann, daß das Material unter diesen Bedingungen unlöslich war.

Um zu untersuchen, ob R34 das Faltungsmuster von N34 annehmen könnte, wurde die Pelletfraktion einer induzierten Kultur in 6 M Guanidin HCl gelöst und bei Raumtemperatur für 3 Stunden denaturieren gelassen. Das Material wurde dann 200-fach in eiskaltem TE verdünnt und bei 4ºC über Nacht inkubiert, um ein erneutes Falten des denaturierten R34 zu ermöglichen. Das verdünnte Material wurde dann durch eine Centricon 10-Vorrichtung (Amicon) konzentriert. Um zu untersuchen, ob ein erneut gefaltetes R34 das korrekte proteolytische Processing zur fragmentierten Form des Mais-proRIP durchmachen kann, wurde das Material mit 10 ug/ml Papain für verschiedene. Zeiten behandelt und es wurden Proben durch SDS-Phastgel und Western-Blot- Analyse analysiert. Das R34-Material wurde zu einem stabilen Gemisch von zwei immunoreaktiven Banden prozessiert, welche gemeinsam mit N34 Papainprozessiertem Material wandern, was anzeigt, daß das korrekte proteolytische Processing stattgefunden hatte.

In der Bemühung, die Reinigung des R34-Polypeptids aus induzierten Lysaten zu vereinfachen, wurde derGen 10-codierende Bereich des pGEMEX-1-Vektors durch Schneiden des Mais-proRIP-Gen-enthaltenden Plasmids (pGR) mit Xba I und Gelreinigen der Vektor/proRIP-DNA von der Gen 10-codierenden DNA entfernt. Eine erneute Ringbildung von pGR, nun ohne den für Gen 10 codierenden Bereich, resultierte in einem pGR1 genannten Plasmid, das unten dargestellt wird.

Das Plasmid pGR1 wurde in JM 109(DE3)-Zellen transformiert und hinsichtlich der Produktion von R34 nach Induktion mit IPTG untersucht. Wie bei pGR wurden große Mengen an R34 in Zellysaten sowohl durch Western Blot als auch durch Anfärben mit Coomassie-Blau nachgewiesen. Ungleich pGR war von pGR1 produziertes R34 löslich und im Überstand von lysierten Zellen fraktioniert. Dieses lösliche Material wurde mit Papain bei 10 ug/ml behandelt und das aus pGR1 hergestellte R34 wurde zu Produkten gespalten, die zusammen mit dem N34, Papain-gespaltenem Produkt wandern. Das Papain- behandelte Material hemmte eine Translation von Retikulozytenlysaten bei signifikant höheren Verdünnungen als das unbehandelte Material, was anzeigte, daß das lösliche R34 zu einer aktiven Form prozessiert wurde.

B. R34-DL stellt das proRIP ohne den Linker dar. Die α- und β-codierenden Sequenzen wurden direkt ohne eine intervenierende Linker-DNA verbunden, d. h. die Nukleotide A-502 bis A-594 werden deletiert. Das R34-DL-Gen codiert ein 30,6 kD-Protein, welches ein potenter Proteinsynthese-Inhibitor war. Eine Behandlung von R34-DL mit Papain resultierte in einem 28 kD-Polypeptid mit einer erhöhten Ribosomen-inaktivierenden Aktivität gegenüber dem unbehandelten Molekül.

Eine Bestätigung, daß eine Entfernung des Linkers von Mais-proRIP das Molekül aktivierte, wurde unabhängig durch ein gentechnologisches Bearbeiten erhalten. Der Linker-codierende Bereich mit 75 bp von R34 (A-520 bis einschließlich A-594, Tabelle 6) wurde unter Verwendung einer PCR- Amplifikation deletiert. Die neue Konstruktion, R34-DL, verband direkt, im Rahmen, die DNA, die die beiden α- und β-Fragmente codiert.

In dem pGEMEX-1-System lenkte das R34-DL-Gen die Synthese eines Polypeptids mit etwa 30,6 kD, welches von Antiseren, die spezifisch für das Mais-proRIP waren, erkannt wurde. Bei einer hohen Verdünnung waren E.coli- Lysate, die das R34-DL-Protein enthielten, potente Proteinsynthese-Inhibitoren in Kaninchenretikulozytenlysaten, in deutlichem Kontrast zu E.coli-Lysaten, die das R34-Polypeptid enthielten.

Diese genetischen Deletionsdaten bestätigen, daß eine Entfernung des Linkers dazu diente, das R34 (proRIP)-Molekül zu aktivieren. Dieses Experiment zeigte auch, daß die kovalente Verknüpfung der α- und der β-Polypeptidfragmente in einem aktiven αβ-RIP resultierte. Das Mais-proRIP benötigte kein Aufbrechen des Polypeptidgerüsts für eine enzymatische Aktivität, das Entfernen des Linkerbereichs war ausreichend, um eine potente Ribosomen-inaktivierende Aktivität zu verleihen.

Zusätzlich wird, wenn R34-DL-Lysate mit Papain behandelt wurden, eine leichte Abnahme im Molekulargewicht des R34-DL-Proteins festgestellt (von 30,6 kD auf etwa 28 kD). Das R34-DL-Polypeptid blieb intakt, d. h. es wurde nicht in die charakteristischen Mais-αβ-RIP α- und β-Fragmente gespalten. Verbunden mit dieser kleinen Änderung im Molekulargewicht war ein Anstieg in der Proteinsynthesehemmung in den E.coli-Lysaten. Diese Daten zeigten an, daß in bakteriellen Lysaten ein Entfernen des Linkerbereichs die Ribosomeninaktivierende Aktivität des Proteins um mindestens das 250-fache aktivierte, daß aber ein weiteres Prozessieren von den Enden des Proteins die Aktivität erhöhte.

Eine weitere genetische Konstruktion wurde unter Verwendung der PCR- Technologie durchgeführt, um den Leitsequenzbereich von R34-DL zu entfernen. Die neue Konstruktion, R30-DL genannt (die Nukleotide C-40 bis C- 80 und A-520 bis einschließlich A-594 sind deletiert), codierte ein Protein (etwa 29,5 kD), welches geringfügig kleiner als R34-DL war. E.coli-Lysate, die R30-DL enthielten, schienen sogar noch potentere Proteinsynthese-Inhibitoren als R34-DL-Lysate zu sein. Eine Papainbehandlung von R30-DL enthaltenden Lysaten erhöhte weiterhin die Proteinsynthese-hemmende Aktivität. Nach dieser Behandlung machte das R30-DL-Protein eine leichte Abnahme im Molekulargewicht durch, was ein Processing an den Enden des Polypeptids darstellt.

Beispiel 8:

Ein Segment des R30-DL-Gens wurde deletiert, welches mehrere saure Reste am Carboxy-Terminus des Proteins codiert. Die Deletion wurde unter Verwendung der PCR-Bearbeitungsverfahren bewerkstelligt.

Ein Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) wurde für die angezeigten Konstruktionen verwendet. Ein typischer Lauf wurde durchgeführt mit einem einminütigen Denaturierungsschritt, einem zweiminütigen Abkühlen und einem dreiminütigen Aufbauschritt. Die verwendeten Temperaturen waren 94ºC, 37 ºC oder 50ºC bzw. 72ºC. Nach 25 Zyklen wurde die Reaktion bei 72ºC für 7 Minuten zum Aufbau von unfertigen Produkten gehalten.

Amplifikationsbearbeitungsreaktionen wurden in vier separaten Röhrchen von jeweils 100 ul durchgeführt. Die Röhrchen wurden nach der Amplifikation vereint. Normalerweise waren 100 ng Templat in jedem Röhrchen umfaßt. DNA-Primer wurden auf einem PCR-Mate oder einem 380A DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert und auf Acrylamidgelen gereinigt. Fünfzig (50) pmol jedes Primers waren in jeder Reaktion enthalten. Die Reaktionsbedingungen für die Amplifikation waren solche, die von Perkin Elmer Cetus empfohlen werden (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, 200 uM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq DNA- Polymerase oder AmpliTaqTM-thermostabile DNA-Polymerase).

Verschiedene Gentechnologieverfahren wurden verwendet, um die unten beschriebenen genetischen Derivate herzustellen. Die Standardverfahren einer DNA-Reinigung, eines Verdaus mit Restriktionsenzymen, einer Agarosegel- Analyse, einer DNA-Fragmentisolierung, Ligierung und Transformation waren wie beschrieben (siehe Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra und Current Protocols in Molecuar Biology, (1987), supra).

Die für das Bearbeiten verwendeten Enzyme waren von einem der drei Hersteller (Pharmacia LKB Biotechnology; Bethesda Research Labs; oder New England Biolabs, Beverly, MA). Die verwendeten Puffer und Protokolle wurden durch die Hersteller geliefert.

Unter Verwendung von PCR-eingeführtem gentechnischen Bearbeiten wird ein modifiziertes RIP-Fragment von einem RIP-Plasmidtemplat amplifiziert, gereinigt, dann verwendet, um den nicht modifizierten Bereich im RIP-Gen zu ersetzen. Alle Fragmentaustausche wurden an RIP-Genen durchgeführt, die bereits in ein pGEMEX-Expressionsplasmid insertiert waren.

Ein pGEMEX-Plasmid enthaltend R30-DL, bei welchem die 3'-Hälfte des Gens durch Nco I und Stu I-Verdau, gefolgt von einer Gelreinigung entfernt worden war, wurde als Templat für die PCR verwendet. Die 3'-Hälfte des RIP-Gens wurde mit dem unten beschriebenen PCR-modifizierten Fragment ersetzt.

Ein 3'-PCR-Primer wurde synthetisiert, welcher die Deletion von 7 Aminosäuren nahe dem Carboxy-Terminus codierte und eine neue einzige Bam HI-Stelle einführte. Der 5'-Primer lenkte die Deletion des αβ-Linkers und umfaßte eine Nco I-Stelle. Die Sequenzen dieser Primer sind in Tabelle 7 angegeben. Die Primer wurden verwendet, um ein modifiziertes DNA-Fragment von einen pGEMEX-R34-DI-Templat zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die insertierte DNA wurde mit Nco I geschnitten und in den pGEPMEX-R30-DL- Vektor ligiert. Tabelle 7

Polymerasekettenreaktionsprimer für RDT Tabelle 7: Polymerasekettenreaktionsprimer für RDT

Das neue RIP-Genderivat wird RDT genannt und codiert ein Protein von vorhergesagten 28.233 Dalton und einem pl ~9,5. Das RDT-Gen codiert ein Protein mit einer trunkierten Leitsequenz, einem deletierten Linker und einem trunkierten Carboxy-Terminus.

Die DNA-Sequenz für RDT wird in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8

Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Mais-RIP-Derivats RDT Tabelle 8: Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Mais- RIP-Derivats RDT
Tabelle 8 (fortgesetzt)

Das RDT-Gen, exprimiert in E. coli unter Verwendung des oben beschriebenen pGEMEX-Systems wurde aus Bakterienlysaten bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt. Das RDT-Protein scheint ein potenterer Proteinsynthese-Inhibitor als R30-DL zu sein. Bei Verwendung des Retikulozytenlysat-Proteinsyntheseassays hat gereinigtes RDT einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 1 ng/ml.

Beispiel 9:

RDT wurde weiter verarbeitet, um ein weiteres Gen, RDT-NP genannt, herzustellen. Diese Konstruktion unterscheidet sich von RDT darin, daß sie zwei einzigartige Restriktionsstellen aufweist, die in das Gen eingearbeitet wurden. Diese Stellen wurden unter Verwendung der in Beispiel 8 beschriebenen PCR-Verfahren eingebracht. Der PCR-Primer war derart entworfen, daß er die gewünschte Änderung und eine einzige Restriktionsstelle in der Mais-RIP-DNA-Sequenz umfaßte. Ein 99 bp-Primer, der die Not I- und Pst I-Stellen am 3'-Ende des Primers einführte, und mußte zu der einzelnen Nco I-Stelle für Klonierungszwecke zurückgebaut werden. Die Primer für die Amplifizierung sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9

Polymerasekettenreaktionsprimer für RDT-NP Tabelle 9: Polymerasekettenreaktionsprimer für RDT-NP

Die Restriktionsstellen (Not I und Pst I) entsprechen der Stelle der α/β- Linkerinsertion im RIP-Polypeptid. RDT-NP ermöglicht, daß DNA-Segmente, die verschiedene Polypeptidlinker codieren, in das Gen insertiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet werden, eine inaktive, baer eine Protease-aktivierbare RIP zu erzeugen. Die Sequenz für RDT/NP ist in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10

Vorhergesagte Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Mais-RIP-Derivats RDT-NP Tabelle 10: Vorhergesagte Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Mais-RIP-Derivats RDT-NP
Tabelle 10 (fortgesetzt)

Das RDT-NP-Polypeptid hatte ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 28.446 Dalton und einen pl von 9,5. Rohlysate von E.coli, welche RDT-NP aus einem pGEMEX-Vektor exprimieren, sind potente Inhibitoren einer eukaryotischen Proteinsynthese.

Beispiel 10:

Um ein RIP-Molekül zu erzeugen, welches an Immunoglobulin IgG binden würde, wurde eine einzelne Antikörperbindebereichs (ABR)-Domäne aus dem Staphylococcus aureus Antikörper bindenden Protein A aus dem Plasmid pRIT5 (Pharmacia LKB Biotechnology) unter Verwendung von PCR-Techniken subkloniert. Die Antikörperbindedomäne des Proteins A (ABR-A) wurde mit PCR technisch verarbeitet, um eine Bam HI-Stelle an ihrem 5'-Ende und eine Bgl II-Stelle an ihrem 3'-Ende aufzuweisen. Dies ermöglichte eine Insertion der ABR-A-Domäne in die RDT Bam HI-Stelle, während die einzige Bam HI-Stelle beibehalten wurde. Die Sequenz von RDT-A ist in Tabelle 11 gezeigt.

Tabelle 11 Vorhergesagte Nukieotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von RDT-A
Tabelle 11 (fortgesetzt)

RDT-A wurde in E.coli-Zellen unter Verwendung des pGEMEX-Systems exprimiert. Das resultierende Polypeptid hatte ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 35.198 Dalton und einen pl von 9,2. Es wurde von Antiseren sowohl gegen Protein A als auch gegen Mais-RIP erkannt, was die chimäre Natur des Proteins anzeigt. Rohlysate von RDT-A exprimierenden Bakterien wiesen eine potente eukaryotische Proteinsynthesehemmaktivität auf.

Es wurde gezeigt, daß RDT-A spezifisch an IgG-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology) gemäß den Instruktionen des Herstellers bindet. Das Binden war am besten bei einem pH-Wert von 7,0. Wenn bei einem pH-Wert von 5,0 gewaschen, wurde das chimäre Protein in kleinen, aber nachweisbaren Mengen vom Harz freigesetzt. RDT alleine bindet nicht an das Gel.

Beispiel 11:

Um die Bindefähigkeit des RDT-A an IgG-Antikörper zu erhöhen, wurde die Antikörperbindedomäne aus Streptococcen-Gruppe G Protein G (ABR-G) unter Verwendung von Oligonukleotiden synthetisiert. Die synthetisierte Sequenz war die der natürlich auftretenden Sequenz, die von Guss et al. beschrieben wurde ((1986), EMBO Journal, 5: 1567-1575). Die einzige Veränderung war der Zusatz von Bam HI- und Bgl II-Stellen am 5'- bzw. 3'-Ende der synthetischen DNA.

Das ABR-G-Fragment wurde in die Bam HI-Stelle von RDT-A insertiert. Zwei Klassen von Klonen wurden untersucht. RDT-G-A enthält eine einzelne ABR-G- Domäne, insertiert in der korrekten Orientierung zwischen dem 3'-Ende von RDT und dem 5'-Ende von ABR-A. Eine zweite Klasse enthält zwei richtig orientierte ABR-G-Domänen. Die vorhergesagten DNA-Sequenzen für die Gene sind in den Tabellen 12 und 13 gezeigt.

Tabelle 12 Vorhergesagte Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz für RDT-G-A
Tabelle 12 (fortgesetzt)
Tabelle 13 Vorhergesagte Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz für RDT-G-G-A
Tabelle 13 (fortgesetzt)
Tabelle 13 (fortgesetzt)

Wenn diese Gene in E.coli unter Verwendung des pGEMEX-Systems exprimiert wurden, wurden die erwarteten chimären Proteine gebildet. Das RDT-G-A erzeugte ein Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 44.576 Dalton (pl 7,3). RDT-G-G-A erzeugte ein etwas größeres Polypeptid, von dem vorhergesagt wurde, daß es 53.955 Dalton aufweist, mit einem vorhergesagten pl von 5,4.

Bakterienrohlysate von RDT-G-A oder RDT-G-G-A exprimierenden Zellen waren potente Inhibitoren einer eukaryotischen Proteinsynthese in dem in Beispiel 1 beschriebenen Kaninchenretikulozytenassay. Eine Papainbehandlung der Lysate erhöhte die Aktivität weiter. Eine Analyse der Papain-behandelten Lysate zeigt an, daß die intakte RDT-Domäne von den ABR-Domänen abgetrennt wird.

Sowohl RDT-G-A als auch RDT-G-G-A binden stark an IgG-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology). Die Bindung ist bei einem pH-Wert von 5,0 stabil. Eine Elution wurde mit 0,5 M Ammoniumacetat, pH 3,5, oder durch Kochen des Harzes in SDS bewerkstelligt.

Beispiel 12:

Samen der folgenden Panicoideae-Spezies wurden zu einer feinen Konsistenz in einem Mörser und Stößel zerrieben (gegebenenfalls nach Entfernung der Spelze): Zea mays mays, Z.m. mexicana, Z.m. parviglumis, Z. luxurians, Z. mexicana, Z. mexicana, Tripsacum dactyloides, Coix lachryma-jobi, Sorghum bicolor.

Lösliche Proteine wurden aus reifen trockenen Samen durch die folgenden Techniken extrahiert. Die Proteine wurden für 2 Stunden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 25 ug/ml Leupeptin, 25 ug/ml Antipain, 2 mM EDTA und 4 mM Phenylmethansulfonylfluorid extrahiert. Es wurden 3 ml Extraktionspuffer pro Gramm Samengewebe verwendet. Nach einer Zentrifugation zur Entfernung von unlöslichem Material wurde ein Aliquot des Extraktes durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter Verwendung von Gelen mit einem Gradienten von 17 bis 27% analysiert, dann auf ein PVDF-Papier (Millipore) elektrogeblottet. Der Blot wurde unter Verwendung von Kaninchenantiseren gegen Mais-RIP α- und β- Fragmente (jeweils 1 : 2000 Verdünnung) als Primärantikörper und einem Ziege- Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper als Sekundärantikörper untersucht, und dann mit NBT/BCIP entwickelt.

Ausgenommen den Coix-Extrakt zeigten alle untersuchten Extrakte eine Kreuzreaktivität mit den Mais-RIP-Antiseren. Eine auffallende Bande bei etwa 34 kD entsprechend proRIP wurde beobachtet und Banden bei etwa 16,5 und 8,5 kD wurden ebenfalls beobachtet, entsprechend den α- bzw. β-Fragmenten. Dies zeigt an, daß RIP-Formen äquivalent zu Mais-proRIP und der aktivierten αβ-Form in vielen Mitgliedern der Subfamilie Panicoideae vorliegen.

Beispiel 13:

Gesamt-DNA aus den folgenden Spezies wurde gemäß der von Saghai-Maroof et al., PNAS, 81: 8014-8018, 1984 beschriebenen Vorgehensweisen isoliert. Die folgenden Panicoideae-Spezien waren enthalten: 3 Akzessionen von Zea mays ssp.; parviglumis; Zea luxurians; Zea mays ssp. mexicana; Coix lachryma-jobi; Sorghum bicolor und Zea mays ssp. mays var. B73.

Allgemein wurden etwa 8 ug der extrahierten DNA aus jeder Probe vollständig mit 20 Einheiten Hind III, Eco RI und Sst I in 20 Mikroliter eines Rekationsgemisches, das den entsprechenden Reaktionspuffer enthielt, bei 37 ºC für 2 Stunden verdaut.

Als nächtes wurde die gesamte extrahierte DNA aus jeder Probe der Southern- Hybridisierungstechnik (siehe Southern (1975), J. Mol. Biol. 98: 503-517) unterzogen. Die DNA-Fragmente wurden auf Grundlage ihrer Größe mittels Elektrophorse auf einem 0,8% Agarosegel fraktioniert. Die doppelsträngigen DNA-Fragmente wurden zu einzelsträngigen DNA-Fragmenten in einer Alkalilösung modifiziert; und dann wurde ein Nylonfilter in engen Kontakt mit dem Gel gebracht, um die modifizierten DNA-Segmente auf den Filter in Gegenwart einer Lösung mit hoher Salzkonzentration zu transferieren.

Eine Hybridisierung wurde ausgeführt unter Verwendung des cDNA-Klons des RIP-Gens als Sonde (das Sondenfragment wird geliefert von Position 2 bis 1075 in Tabelle 1). Die Sonde wurde mit ³²P radiomarkiert und die Signale des Southern-Transfers durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Die Southern Blots wurden mit dem cDNA-Klon des RIP-Gens hybridisiert. Ein einzelnes Fragment mit einer starken Homologie zum Klon wurde für jede Enzym/Spezies-Kombination außer für die Coix-Akzession beobachtet. Die Inzuchtlinie von Mais wies eine einzelne Hauptbande mit zwei kleineren Banden auf. Die anderen Spezies, welche mit Ausnahme von Sorghum nicht durch Inzucht gezüchtet sind, zeigten zwischen zwei und fünf kleineren Banden. Der Coix hatte entweder 4 oder 5 solcher Banden, abhängig vom verwendeten Enzym.


Anspruch[de]

1. DNA-Isolat, kodierend für ein Mais-proRIP mit einer ribosomeninaktivierenden Proteinsequenz und einer Linkersequenz, wobei das Mais-proRIP die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

2. DNA-Isolat, kodierend für ein Protein, das in der Lage ist eukariotische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das Protein die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

3. Biologisch funktionelles Expressionsvehikel, das ein DNA- Isolat nach Anspruch 1, 2, 7, 8, 9 oder 10 enthält.

4. Wirtszelle, die mit dem biologisch funktionellen Expressionsvehikel nach Anspruch 3 transformiert ist.

5. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle eine eukariotische Zelle ist.

6. Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle Mais ist.

7. DNA-Isolat, kodierend für ein Protein, das in der Lage ist eukariotische Ribosomen wesentlich zu inaktivieren, wobei das Protein die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

8. DNA-Isolat nach Anspruch 1, welches wie in Tabelle 6 gezeigt als R34 bezeichnet wird.

9. DNA-Isolat nach Anspruch 2, welches wie in Beispiel 7B gezeigt als R34-DL bezeichnet wird.

10. DNA-Isolat nach Anspruch 7, welches wie in Beispiel 7B gezeigt als R30-DL bezeichnet wird.







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