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Dokumentenidentifikation DE69515709T2 01.02.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0664338
Titel Enzymatische Kupplung von L-Phenylalaninemethylester und N-Benzyloxycarbonyl-Asparagensäure
Anmelder Holland Sweetener Co. V.O.F., Geleen, NL
Erfinder Irino, Shigeaki, Kumage-gun, Yamaguchi, JP;
Nakamura, Shin-ichiro, Yamaguchi 145, JP;
Oyama, Kiyotaka, Tokyo-pref, JP;
Quaedflieg, Peter Jan Leonard, NL-6162 JK Geleen, NL;
van Dooren, Theodorus Johannes Godfried, NL-6042 BZ Roermond, NL
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 69515709
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.01.1995
EP-Aktenzeichen 952001006
EP-Offenlegungsdatum 26.07.1995
EP date of grant 22.03.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.02.2001
IPC-Hauptklasse C12P 21/02

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von N- Benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch Hochumwandlungs-Enzymkopplung von N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester in einem wässerigen Medium mit Bildung eines Niederschlags.

N-geschützer α-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, wie insbesondere N-Benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester ist ein wichtiges Vorprodukt des "Intensivsüßstoffes" Aspartam, ein Produkt mit einer ungefähr 200-fachen Süßungskraft wie der von Sucrose und mit einem hervorragenden Geschmacksprofil, ohne zum Beispiel dem bitteren Nachgeschmack von anderen Intensivsüßstoffen wie zum Beispiel Saccharin und Cyclamat. Der Süßstoff Aspartam wird unter anderem in einem weiten Produktbereich wie alkoholfreien Getränken, Konfekt, "table-top (auf dem Tisch)-Süßstoffen", Arzneimitteln usw. verwendet.

Für die Herstellung von Aspartam sind verschiedene Verfahren bekannt. Zusätzlich zu chemischen Herstellungsverfahren gibt es auch enzymatische Herstellungsverfahren, welche ihre Bedeutung in erster Linie der Tatsache verdanken, das Enzymkopplung in einer stereoselektiven und regioselektiven Weise stattfindet. Enzymatische L,L-Kopplung von N-geschützer Asparaginsäure, insbesondere von N-Benzyloxycarbonylasparaginsäure (hier im weiteren als Z-Asp bezeichnet) und L- (oder DL-) Phenylalaninmethylester oder von daraus abgeleiteten Säuresalzen wie zum Beispiel dem Chlorwasserstoffsalz (im Folgenden auch als PM bezeichnet), wurde bis heute gründlich untersucht und beschrieben. Ein Überblick über Aspartam-Herstellungsverfahren wird durch K. Oyama in Kapitel 11 (pp. 237-247) aus "Chirality in Industry", John Wiley & Sons Ltd., 1992 gegeben.

Die fragliche Enzymkopplungsreaktion, die in der Regel bei einem pH von 6 bis 7,5 in Anwesenheit einer neutralen Protease, insbesondere einer Metallo-Protease wie zum Beispiel Thermolysin durchgeführt wird, ist eine gleichgewichtsgesteuerte Reaktion. Um hohe Umwandlungsgrade in solchen Enzymkopplungsreaktionen zu erzielen, sind gemäß Stand der Technik spezielle Maßnahmen notwendig. So macht zum Beispiel US-A-4165311 (welches als der naheliegendste Stand der Technik angesehen wird) Gebrauch aus der Tatsache, daß das Gleichgewicht der Kopplungsreaktion durch die Bildung einer sich niederschlagenden Additionsverbindung aus N- geschützem Aspartam, insbesondere aus N-Benzyloxycarbonyl-α-L- aspartyl-L-phenylalaninmethylester (hier im weiteren auch als Z- APM bezeichnet) mit in dem Reaktionsgemisch anwesenden D- oder L-Phenylalaninmethylester nach rechts verschoben werden kann. Solche Additionsverbindungen des Aspartam-Vorprodukts werden auch als Z-Asp.D-PM, beziehungsweise Z-APM.L-PM bezeichnet. Um solche Additionsprodukte zu bilden, ist es nach Stand der Technik für die Kopplungsreaktion von Z-Asp und L-PM wünschenswert, mit zumindest der doppelten Molmenge an L-PM in Bezug auf A-Asp oder in Anwesenheit einer zumindest äquivalenten Menge an D-PM durchgeführt zu werden, um hohe Umwandlungsgrade, also ≥ 60%, vorzugsweise ≥ 80% basierend auf Z-Asp zu erzielen. In der Praxis werden diese enzymatischen Kopplungsreaktionen daher üblicherweise in Verhältnissen von PM zu Z-Asp von beispielsweise 2,0 bis 2,5 : 1 oder höher beschrieben. Abwohl mit solchen Ausführungsformen hohe Umwandlungsgrade zum gewünschten Produkt tatsächlich erzielt werden, haben diese Verfahren eine Anzahl an Nachteilen, nämlich:

(a) Handhaben und Weiterverarbeiten des Niederschlags, um das schließlich gewünschte Aspartam (hier im weiteren APM) zu erhalten ist arbeitsaufwendig, teilweise weil das Additionsprodukt relativ schwierig zu filtrieren ist und gründlich gewaschen werden muß, um APM zu erhalten, welches nur kleine Mengen an Verunreinigungen enthält;

(b) Rückgewinnung und/oder Zurückführung ist notwendig für die im Überschuß vorhandene(n) Komponente(n) und für die nicht-APM Komponente, die von dem niedergeschlagenen Additionsprodukt des Kopplungsprodukts zu befreien sind; falls die Kopplungsreaktion mit DL-PM durchgeführt wird, sollte das verbleibende D-PM in der Regel wenn es verarbeitet wird auch racemisiert werden, in der Regel durch DL-Phenylalanin. Diese Verfahren sind daher weniger geeignet für Anwendungen im kommerziellen Vollbetrieb.

Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß WO-A-92/02617 eine Enzymkopplungsreaktion von im wesentlichen gleichen Mengen an Z-Asp und L-PM. HCl (in einem Molverhältnis von ungefähr 1,2 : 1) in einem wässerigen Medium und in Anwesenheit von Essigsäure bei pH = 7 beschreibt. In diesem Fall wird Gebrauch gemacht von durch Quervernetzen immobilisierten Proteaseenzymkristallen, aber der erzielte Umsetzungsgrad beträgt nur ungefähr 20%. EP-A-0149594 beschreibt die Verwendung von Formyl-Asp (F- Asp) für eine Enzymkopplungsreaktion in einem wässerigen Medium in einem 1 : 1 Verhältnis von F-Asp zu L-PM. Jedoch bleibt wegen der Bildung des F-APM.L-PM-Addtionsprodukts die Umwandlung von F-Asp deutlich unter 50% und der bei dem Verfahren erzielte Ertrag wird als sehr niedrig befunden (ungefähr 12% nach Bearbeitung, um F-APM zu ergeben).

In gleicher Weise beschreibt der Artikel von Zhou F. et al. (in: Huaxue Fanying Goncheng Yu Gongyi, 1992, 8(4), pp 413-419 (in chinesisch); Abstrakt in Chemical Abstracts, 120 (Nr. 5), 31-1-94, Abstrakt 48817v) neben anderen Dingen einen Versuch von 1 : 1 Enzymkopplung von Z-L-asp und L-PM bei einem Anfangs-pH von 6. Jedoch ist auch unter diesen Bedingungen auf Grund der üblichen Bildung des Z-APM. PM-Additionsprodukts die Umwandlung von Z-Asp bestenfalls 46,1%. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die L-PM-Umwandlung (von höchstens 92,2%), wie durch Zhou F. et al. berichtet, sich begründet aus der Summe der (chemischen) Kopplung von L-PM in Z-APM und dem gleichzeitigen Niederschlag von einem Äquivalent aus L-PM mit Z-APM. Es gibt keine Lehre in diesem Artikel, daß chemische Umwandlung von L-PM über 50% erreicht werden kann.

Es sollte ebenfalls beiläufig zur Kenntnis genommen werden, daß die in dem Kopplungsreaktionssystem anwesenden Ester relativ empfindlich für chemische Hydrolyse sind. Daher wird PM hydrolysiert um Phenylalanin (hier im weiteren auch als Phe bezeichnet) zu bilden; Z-APM wird hydrolysiert um Z-geschütztes Aspartylphenylalanin (manchmal als Z-AP bezeichnet) zu bilden. Diese unerwünschte Nebenreaktion kommt besonders bei einem pH von ≥ 6, oder ≤ 4 vor und ist stärker, je mehr der pH von den besagten Werten abweicht und die Verweildauer unter Reaktionsbedingungen länger ist.

Bis jetzt wurde allgemein angenommen, daß bei der Enzymkopplung von Z-Asp und L-PM, ausgehend von äquivalenten oder im wesentlichen äquivalenten Mengen an Z-Asp und L-PM, ohne Anwesenheit einer entsprechenden Menge an D-PM oder ohne Ergreifen anderer Maßnahmen, um das Kopplungsgleichgewicht zu verschieben, keine Umwandlungen größer als 50%, berechnet auf der Basis von Z-Asp, erzielt werden könnten. Insofern als es die Enzymkopplung in einem wässerigen Medium betrifft, erklärten Zhou und Huang (Indian J. Chem., 32B, pp 35-39, 1993) erst kürzlich, daß die optimalen Bedingungen für die Reaktion unter Verwendung immobilisierter Protease bei einem Verhältnis von Z-Asp zu PM von 1 : 4 liegen. Es sollte in diesem Zusammenhang zur Kenntnis genommen werden, daß wenn eine immobilisierte Protease verwendet wird (vgl. z. B. Biotechnology, 3., pp. 459-464, 1985; Nakanishi et al.), viel des gebildeten Produkts in dem zur Immobilisierung eingesetzten Harz absorbiert wird und daraus durch einen separaten Extraktionsschritt entfernt werden muß. Die von Nakanishi et al. mit einem 1 : 1 Verhältnis von Z-Asp zu L-PM in einem wässerigen Medium erzielten Ergebnisse, ein Ertrag von höchstens 58% bei einer relativ niedrigen Konzentration (80 mM) sind daher für die industrielle Praxis irrelevant. Darüber hinaus setzt sich bei so niedrigen Konzentrationen, die oft zum Bestimmen von Anfangsreaktionsraten verwendet werden, Kopplungsreaktion ohne Bildung eines Niederschlags fort.

Alternative Wege zum Verschieben des Kopplungsgleichgewichts sind unter anderem beschrieben worden in (i) J. Org. Chem. 46, p. 5241 (1981): Verwenden einer immobilisierten Protease und eines organischen Lösungsmittels, nicht mischbar mit Wasser; ähnlich JP-B-8533840, wo Erträge von nur ungefähr 20-30% aufgezeigt werden, wenn aus 1 : 1 Molverhältnissen Gebrauch gemacht wird; (ii) GB-A-2250023: Verwenden von immobilisierter Protease und mit Wasser mischbarem organischen Lösungsmittel; ähnlich EP-A-0272564 in Acetonitril, wo während vorgeschlagen wird, daß das Verhältnis von N-geschütztem Asp zu L-PM zwischen 10 : 1 und 1 : 10 liegen kann, die Beispiele nichtsdestoweniger zeigen, daß nur ein beträchtlicher Überschuß an L-PM in Erwägung gezogen wird, und daß im Fall stöchiometrischer oder im wesentlichen stöchiometrischer Verhältnisse, schlechte Umwandlungen und Erträge erhalten werden. Stöchiometrische Verhältnisse werden auch gleichmolare Verhältnisse genannt. Aus den in GB-A- 2250023 beschriebenen Beispielen kann man gleichfalls beiläufig ersehen, daß höhere Erträge erzielt werden, je höher das Verhältnis von L-PM zu N-geschütztem Asp ist (bei 2 : 1 ist der Ertrag ungefähr 85%, bei 1 : 1 nur ungefähr 50%). Bei solchen alternativen Ausführungsformen wird die Verschiebung des Gleichgewichts nicht durch einen gebildeten Niederschlag erzielt, sondern eher dadurch, daß das gebildete Kopplungsprodukt auf die organische Phase übertragen wird. Neben Kosten erhöhenden Aspekten als Ergebnis oft unvermeidbarer Lösungsmittelverluste, wenn organische Lösungsmittel verwendet werden, ist ein anderer Nachteil solch alternativer Ausführungsformen, daß während des Ver fahrens zum Herstellen von Aspartam spezielle Maßnahmen ergriffen werden müssen, um die in der Kopplungsreaktion verwendeten organischen Lösungsmittel zu entfernen. Bei Zugabe (oder Durchführen der Reaktion in oder in Anwesenheit, je nach Fall) eines organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel Acetonitril oder Dimethylformamid oder Substanzen wie Di- und Triglycolether (siehe EP-A-0278190) werden in der Regel nur niedrige Erträge an Z-APM und ähnlichem erzielt, falls die Reaktion nicht bei einem hohen Molverhältnis von L-PM (.HCl) zu Z-Asp durchgeführt wird.

Es sollte zusätzlich auch zur Kenntnis genommen werden, daß es im Fall von chemischen Kopplungsreaktionen (ausgehend von N- geschütztem Asparaginanhydrid, zum Beispiel dem N-Formylderivat und L-Phe oder L-PM) nicht ungewöhnlich ist, daß die Reaktion bei stöchiometrischen oder im wesentlichen stöchiometrischen Verhältnissen der Reaktanten stattfindet, aber dies lehrt nichts bezüglich Enzymkopplungsreaktionen unter Verwendung von Z-Asp als Ausgangsmaterial in Wasser.

Jedoch sollte Aufmerksamkeit auf DE-A-35 17 361 gelenkt werden, welches für eine Enzymkopplungsreaktion offenbart, daß die Reaktanten Z-Asp und L-PM tatsächlich in im wesentlichen stöchiometrischen Verhältnissen anwesend sein können, aber für die Adduktbildung (und anstelle des minimal benötigten Äquivalenzüberschusses von L-PM oder D-PM nach dem hier oben zitierten Stand der Technik) wird eine zumindest äquivalente Menge einer organischen Aminverbindung eingesetzt, in der zumindest ein C&sub6;- Kohlenwasserstoffrest anwesend ist. In der Praxis ist solch ein Verfahren von geringer Bedeutung für die Herstellung von APM, da einerseits das gebildete Additionsprodukt durch Ansäuerung gespalten werden muß, um die Amine freizusetzen, und andererseits eine weiterer, "dem Verfahren fremder" organischer Bestandteil eingeführt wird, welcher in Rückführungs- und Filtrationsströmen des Verfahrens schwierig von den für die APM-Synthese verwendeten Ausgangsmaterialien zu trennen ist.

Es gab daher einen Bedarf für eine einfache und effiziente, vorzugsweise stöchiometrische Enzymkopplung von Z-Asp und L-PM, welche sowohl hohe Umwandlung, als auch niedrigen Verbrauch an Ausgangsmaterialien und eine Begrenzung in Recycling-Strömen bietet und ein leicht filtrierbares Produkt erbringt, ohne den Bedarf für die Anwesenheit von mindestens äquivalenten Mengen an D-PM (oder einem zusätzlichen Äquivalent von L-PM) oder ähnli chem, und ohne die Notwendigkeit von Zugeben organischer Lösungsmittel oder Amine bei der Kopplungsreaktion.

Ziel der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren mit einem hohen Umwandlungsgrad für Enzymkopplung von Z-Asp und L-PM zu liefern, bei welchem die oben genannten Nachteile vermieden werden, stöchiometrische oder im wesentlichen stöchiometrische Mengen an Reaktanten eingesetzt werden können und ein leicht filtrierbares Produkt erhalten wird. Überraschenderweise wird dieses Ziel gemäß der Erfindung durch Durchführen der Kopplungsreaktion mit Hilfe von Mengen an Z-Asp und L-PM in einem Molverhältnis im Bereich von 1 : 0,7 bis 0,7 : 1, unter Einfluß einer neutralen Protease als Enzym, bei einem Anfangs-pH von 4,5 bis 6,0 und in Anwesenheit von 3 bis 25%, berechnet als Gew.-% basierend auf dem Gesamtreaktionsgemisch, von einem Alkalimetallsalz, Erdalkalimetallsalz oder Ammoniumsalz erreicht. In Verbindung mit der Reaktionsgeschwindigkeit und um unerwünschte Hydrolyse zu begrenzen, wird die Kopplungsreaktion vorzugsweise bei einem Anfangs-pH von 4,7 bis 5,5 durchgeführt.

Es wurde überraschenderweise ebenfalls herausgefunden, daß bei Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung, die Kopplungsreaktion ebenfalls sehr bequem bei relativ hohen Konzentrationen an Ausgangsmaterialien durchgeführt werden kann. Solch hohe Konzentrationen wurden bei den Verfahren nach Stand der Technik wegen der im Verlauf der Reaktion auf übermäßige Werte ansteigenden Viskosität des Reaktionssystems für unmöglich befunden. Ohne Festlegung auf eine besondere Erklärung nimmt der Antragsteller an, daß die vorteilhaften Ergebnisse der vorliegenden Erfindung Unterschieden in der Löslichkeit von Z-APM und Z-APM. L-PM bei unterschiedlichen pH-Werten und Salzkonzentrationen zugeschrieben werden können.

In dem Verfahren gemäß der Erfindung wird ein wässeriges Medium verwendet, welches ein Alkalimetallsalz, Erdalkalimetallsalz oder Ammoniumsalz in einer Menge von 3 bis 25%, berechnet als Gew.-% basierend auf dem Gesamtreaktionsgemisch enthält und einen Anfangs-pH von 4,5 bis 6,0 aufweist, um eine Enzymkopplungsreaktion mit einer neutralen Protease zwischen Z- geschützter Asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester in stöchiometrischen oder im wesentlichen stöchiometrischen Verhältnissen mit der Bildung eines Niederschlags durchzuführen. Der Begriff wässeriges Medium im Zusammenhang mit der vor liegenden Anmeldung betrifft ein homogenes, polares, wässeriges System, welches kleine Mengen (bis zu ungefähr 30%) eines organischen Lösungsmittels, wie beispielsweise Methanol oder Acetonitril enthalten kann.

Alle Arten von Alkalimetallsalzen, Erdalkalimetallsalzen oder Ammoniumsalzen können im Verfahren gemäß der Erfinden verwendet werden. Geeignete Salze sind zum Beispiel Halide oder Sulfate von Kalium, Natrium, Lithium, Calcium, Magnesium und Ammonium oder Gemische daraus. Der Begriff Ammonium bezieht sich hier auch auf mit ein oder mehreren C&sub1;&submin;&sub3;-Alkylgruppen substituiertes Ammonium; Beispiele für solche substituierten Ammoniumsalze sind Tri(m)ethylammoniumchlorid, Di(m)ethylammoniumchlorid usw. Insofern es den Gewichtsprozentsatz betrifft, welcher gemäß der Erfindung im Bereich von 3 bis 25 Gew.-% liegt, werden die möglichen Anwendungen teilweise durch die Löslichkeit der jeweiligen Salze bestimmt. Alkalimetall- und Ammoniumsalze haben im allgemeinen die beste Löslichkeit und sind zu bevorzugen. Besonderer Vorzug wird der Verwendung von Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumchlorid und/oder Ammoniumsulfat gegeben.

Je höher der Salzgehalt in dem Reaktionssystem, desto schneller schreitet die Umwandlung fort, ohne daß die Erträge bedeutend beeinflußt werden. Bei höheren Gehalten wird jedoch die Viskosität des Systems bald stark ansteigen und/oder die Löslichkeitsgrenze von einem oder mehreren der Ausgangsmaterialien und/oder des Salzes selbst wird überschritten werden, so daß der erhaltene Niederschlag unnötig mit dem besagten Salz verunreinigt wird, oder so daß der Umwandlungsgrad der Reaktion niedriger ist. Über 25% macht es die Viskosität des Systems im wesentlichen unmöglich, die Reaktion durchzuführen. Je niedriger der Salzgehalt in dem Reaktionssystem, desto länger wird die benötigte Gesamtreaktionszeit sein, eine erhöhte Hydrolyse von insbesondere L-PM hervorrufend. Bei Gehalten unter 3% wird die Anwesenheit von Salz als keine bedeutende Wirkung auf die Reaktion zu haben erachtet. Bei niedrigeren Salzkonzentrationen gibt es ebenfalls eine unerwünschte Wirkung auf die Löslichkeit des Kopplungsprodukts. Falls sich das Additionsprodukt (Z-APM.L-PM) vorzeitig niederschlagen sollte, stört dies nebenbei bemerkt nicht die Reaktion gemäß der Erfindung, da die Äquilibriumsverschiebung automatisch in Umwandlung des gesamten, oder Teilen dieses Produkts in Z-APM-Niederschlag während des Reaktionsverlaufs unter den besonderen fraglichen Bedingungen resultieren wird. Vorzugsweise beträgt der Salzgehalt 10 bis 18%, da in diesem Bereich die vorteilhaftesten Bedingungen vorgefunden werden bezüglich a) der Viskosität des Systems; b) der Löslichkeit der Ausgangsmaterialien und der Niederschlagsbildung des Endprodukts; und c) der Reaktionszeit. Dies wird hier im weiteren während der Erörterung der mechanischen Bedingungen, denen das System unterworfen wird, detaillierter erläutert.

Die Enzymkopplung findet in der Regel innerhalb eines Temperaturbereichs von 10 bis 60ºC statt. Je niedriger die Temperatur, desto niedriger die Geschwindigkeit bei welcher sowohl die Kopplungsreaktion, als auch die Nebenreaktionen wie Hydrolyse von L-PM und Z-APM fortschreiten. Je höher die Temperatur, desto schneller wird Deaktivierung des Enzyms vorkommen. Die Fachleute können leicht bestimmen, welche Temperatur für das verwendete Enzym gewählt werden sollte, um optimale Resultate bezüglich Umwandlung zu Z-APM und Lebensdauer des Enzyms zu erzielen.

Die Enzymkopplungsreaktion gemäß der Erfindung wird unter Verwendung einer neutralen Protease durchgeführt. Der Begriff neutrale Protease bezieht sich hier auf ein bekanntes, neutrales, proteolytisches Enzym, welches ebenso in der Synthese von Z-APM aus Z-Asp und L-PM verwendet werden kann, wie Mutanten davon mit einer vergleichbaren oder sogar erhöhten Aktivität. Beispiele sind Metallo-Proteasen wie Thermolysin, hergestellt durch Bacillus thermoproteolyticus und andere unter anderem durch verschiedene Bacillus-Arten wie Bacillus stearothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Kollagenase usw. hergestellte Proteasen. Im allgemeinen weisen diese Enzyme ein Optimum an Proteaseaktivität bei einem pH von ungefähr 6 bis 8 auf, aber es wurde herausgefunden, daß wenn sie unter den Bedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gute Ergebnisse auch bei dem Anfangs-pH von 4,5 bis 6,0, insbesondere 4,7 bis 5,5 erzielt werden, ohne den Bedarf, übermäßige Zusatzmengen an Enzym einzusetzen. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die Anwesenheit kleiner Mengen an Ca²&spplus;-Ionen im allgemeinen eine vorteilhafte Wirkung auf die Stabilität und das Verhalten des Enzyms hat.

Die Werte des pH-Bereichs (angezeigt als Anfangs-pH), innerhalb dessen die Erfindung mit guten Ergebnissen verwendet werden kann, sollten im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung als der pH-Wert in dem wässerigen Reaktionssystem bei Beginn der Enzymkopplung verstanden werden; während der Kopplungsreaktion gemäß der Erfindung wird in der Regel zuerst eine kleine Verringerung des pH-Werts beobachtet, wonach ein Anstieg vorkommt, während die Reaktion fortschreitet. Während sowohl der Verringerung, als auch des Anstiegs, können besagte pH- Grenzwerte ohne nachteilige Wirkung auf die Ergebnisse überschritten werden. Es wird jedoch bevorzugt, daß der pH während der Kopplungsreaktion und insbesondere während deren späteren Phase bei einem Wert von unter 6,2, vorzugsweise unter 5,7 gehalten wird.

Bei einem Anfangs-pH unter 4,5 verringern sich der Umsetzungsgrad und die Erträge auf Grund niedrigerer Enzymaktivität. Bei einem Anfangs-pH über 6,0 verringern sich der Umsetzungsgrad und der Ertrag ebenfalls, unter anderem wegen eines Anstiegs unerwünschter Hydrolyse der Ester, als auch wegen Bildung von Z- APM.L-PM, welches unter diesen Bedingungen nicht länger in Z-APM umgewandelt wird. Beiläufig sollte zur Kenntnis genommen werden, daß diese pH-Grenzwerte auch in kleinem Ausmaß, abhängig von dem verwendeten Enzym, variieren können. Daher wird zum Beispiel, wenn mit einem Mutant-Enzym gearbeitet wird, welches bei einem niedrigeren pH aktiv ist, eine weitere Verringerung des unteren Grenzwerts des pH-Bereichs, beispielsweise auf 3,5 bis 4 erzeilbar.

Am Ende des Reaktionszyklus, also bei Erreichen des endgültigen Umwandlungsgrads, hat die Aktivität des Enzyms sich in der Regel nicht oder kaum verändert, welches eine Wiederverwendung des Enzyms erlaubt. Folglich wird empfohlen, insbesondere bei Verwendung gelöster Enzyme, daß das Enzym für die Emzymkopplungsreaktion nach Abtrennung des erhaltenen Niederschlags wieder eingesetzt wird. Bei dieser Verfahrensweise sollte wo nötig die Zusammensetzung des wässerigen Mediums leicht angepaßt werden, bis die richtigen Ausgangsbedingungen wieder erreicht worden sind. Die Enzymkopplungsreaktion kann so mehrere Male mit der gleichen Menge an Enzym wiederholt werden; falls die Anfangsaktivität leicht abfällt, wird frisches Enzym, falls erforderlich zugegeben, so daß der gewünschte Umsetzungsgrad in einer für diesen Zweck annehmbaren Zeit erreicht wird.

Wenn in dieser Anmeldung Z- erwähnt wird, sollte dies so verstanden werden, daß es sich auf eine schützende Gruppe bezieht, die bezüglich des apolaren Charakters mit Z- verwandt ist, wie zum Beispiel Henzyloxycarbonyl-Verbindungen, im Benzylring durch eine oder mehrere Alkyl-, Alkoxy-, Acyl- oder Halogengruppen substituiert. Wo in dieser Anmeldung auf L- Phenylalaninmethylester (L-PM) Bezug genommen wird, sollte dies auch so verstanden werden, daß es sich auf die daraus abgeleiteten Säuresalze, wie beispielsweise das Hydrochlorid (L-PM.HCl) bezieht. Wo in dieser Anmeldung auf Benzyloxycarbonylasparaginsäure (Z-Asp) Bezug genommen wird, sollte dies auch so verstanden werden, daß es sich auf die daraus abgeleiteten Salze bezieht, wie zum Beispiel das Dinatriumsalz (Z-Asp.diNa). Offensichtlich wird es, wenn ein Säuresalz anstelle von L-PM und/oder ein Salz anstelle von Z-Asp verwendet wird, in begrenztem Ausmaß nötig sein, die Menge der einzusetzenden Chemikalien anzupassen, um den einzustellenden pH zu erzielen.

Die Begriffe stöchiometrische oder im wesentlichen stöchiometrische Verhältnisse werden in der vorliegenden Anmeldung so verstanden, daß sie sich auf ein Z-Asp:L-PM Molverhältnis im Bereich von 1 : 0,7 bis 0,7 : 1 beziehen. Vorzugsweise wird ein Molverhältnis von 1 : 0,8 bis 1 : 1 verwendet. Ein leichtes Übermaß an Z-Asp führt zu den besten Ergebnissen bezüglich Umwandlungsgrad und Ertrag. In der 1 : 1 Situation wird erforderliches Recyclen von einem oder beiden nicht reagierten Ausgangsmaterialien minimiert.

Es wurde herausgefunden, daß im Verfahren gemäß der Erfindung der Niederschlag sich sowohl bezüglich der chemischen Zusammensetzung, als auch bezüglich kristalliner Eigenschaften und Filtrierbarkeit, von dem Z-APM.(D/L)-PM-Additionsprodukt unterscheidet, welches bei dem Verfahren gemäß Stand der Technik erhalten wird. Insbesondere sind die erhaltenen Kristalle größer und die Filtrationsgeschwindigkeit ist daher gleichfalls höher, mit dem Ergebnis, daß die Reinigung des Produkts einfacher ist, weil weniger Verunreinigungen in der anhaftenden Feuchtigkeit zurückgehalten werden oder verbleiben.

Der Antragsteller hat herausgefunden, daß sofern es das Durchführen der Reaktion betrifft, viele Formen möglich sind, sowohl bezüglich der Anlage, als auch bezüglich der Art der Mittel, die verwendet werden können, um das System falls notwendig in Bewegung zu setzen oder zu halten. Die Kopplungsreaktion kann in allen Arten von Kesseln und Säulen, die aus Materialien wie Glas, Edelstahl usw. gemacht sind, welche die Reaktion nicht in nachteiliger Weise stören, durchgeführt werden. Säulen sind besonders geeignet, wenn immobilisierte Enzyme, wie unterstützte Enzyme verwendet werden. Die Ausmaße der Ausrüstung kann innerhalb weiter Grenzen variieren. Die Reaktion kann daher in jedem gewünschten Maßstab durchgeführt werden, von einer Teströhre oder -Becher bis hin zu beispielsweise einem Maßstab von 10 m³.

Es ist ebenfalls möglich, zwischen entweder chargenweiser oder teilweise kontinuierlicher Reaktion zu wählen. Falls das Verfahren der vorliegenden Erfindung (halb)-kontinuierlich durchgeführt wird, wird mit kontinuierlicher Abtrennung des Niederschlags vorzugsweise erst ab dem Moment begonnen, wenn mindestens ungefähr 60% der Umwandlung des Ausgangsreaktionsgemisches erzielt wurde, wonach weiteres Dosieren der Ausgangsmaterialen in im wesentlichen stöchiometrischen Verhältnissen zu dem Ausmaß bewirkt werden kann, in welchem der Niederschlag abgetrennt wird.

Die Umwandlung gemäß der Erfindung schreitet gut fort, ohne daß mechanischer Einfluß auf das Reaktionssystem ausgeübt wird, in welchem Fall sogenannte ruhende Bedingungen vorliegen. Der gewählte Reaktor muß dann nicht mit einem Rührer oder Mitteln, welche das Reaktionsmedium in einer anderen Weise in Bewegung halten, ausgestattet werden. Es werden ebenfalls hervorragende Ergebnisse erzielt, falls das Reaktionsgemisch in mehr oder weniger heftiger Bewegung gehalten wird, entweder kontinuierlich oder mit Unterbrechungen, zum Beispiel durch mechanisches Rühren oder durch in Bewegung halten des Reaktionskessels durch Schütteln. Die Begriffe Rühren und Schütteln umfassen in diesem Zusammenhang alle Ausführungsformen, die durch die Fachleute in Erwägung gezogen werden können. Daher kann zu Rührzwecken im Prinzip jede Art von Rührer verwendet werden; es gibt jedoch Vorteile bei der Verwendung von Rührern mit variierbarer Geschwindigkeit, da die Rührgeschwindigkeit dann auf ein Optimum eingestellt werden, und sogar an Veränderungen in Viskosität und ähnlichem angepaßt werden kann. Die Wirkungen der Rührgeschwindigkeit sind beiläufig nur gering. Zirkulation des Inhalts des Reaktionskessels mittels einer externen Pumpe sollte als eine Form des Rührens angesehen werden. Die Pumpgeschwindigkeit und die Ausmaße des Reaktionskessels bestimmen dann den Mischungs grad in dem System. Es wird offensichtlich sein, daß Varianten, in denen Schütteln verwendet wird, geeigneter sind, wenn die Reaktion in relativ kleinem Maßstab bis ungefähr 1000 l durchgeführt wird. Die Versuche, die vom Antragsteller durchgeführt wurden zeigen, daß hohe Umwandlungsraten erzielt werden, wenn die "Schüttelmethode" verwendet wird. Eine Ausführungsform, die ebenfalls als sehr geeignet befunden wird, ist eine, bei der der erste Teil der Reaktion unter ruhenden Bedingungen durchgeführt wird, bis ungefähr 20 bis 60%, vorzugsweise 30 bis 50% der Umwandlung erzielt worden ist, und die Reaktion dann unter Rührbedingungen fortgesetzt wird, bis der gewünschte Umwandlungsgrad erreicht worden ist. Alle möglichen Kombinationen dieser "mechanischen" Behandlungen können innerhalb des Umfangs dieser Erfindung gleichfalls verwendet werden.

Die Menge des in der Kopplungsreaktion verwendeten Enzyms ist nicht entscheidend, aber in der Regel wird solch eine Enzymmenge verwendet, daß die Reaktionsdauer bis ein hoher Umwandlungsgrad (60, vorzugsweise 80%) erreicht ist, nicht mehr als 150 Stunden beträgt. In der Regel sind Mengen an Enzym (welches hier als Protein mit der fraglichen Enzymaktivität, dem sogenannten aktiven Enzym verstanden wird) von 0,08 bis 1,5%, vorzugsweise von 0,15 bis 0,75%, ausgedrückt als Gew.-% basierend auf dem Gesamtreaktionsgemisch geeignet. Die hier erwähnten Prozentsätze entsprechen in der Regel ungefähr 0,5 bis 10% oder vorzugsweise 1 bis 5%, falls die Enzymmenge als Gesamtmenge an (trockenem) eingesetzten Enzympräparat angegeben ist, also aktives Protein und andere Proteine ebenso, wie andere Hilfsstoffe wie Salze. Die Enzyme werden häufig als Enzympräparat eingesetzt werden und sind auch als solches im Handel erhältlich. Gewöhnlich beträgt die Menge an aktivem Protein in solch einem Präparat ungefähr 15 Gew.-% des Präparats.

Im Verfahren gemäß der Erfindung kann das Enzym in jeder zu diesem Zweck geeigneten Form verwendet werden, also sowohl in gelöster, als auch in immobilisierter Form. Vorzugsweise wird ein gelöstes Enzym verwendet (erhalten durch Lösen eines Enzympräparats im Reaktionsmedium), da dies Vorteile sowohl bei der Abtrennung des erhaltenen Niederschlags und dessen Weiterverarbeitung liefert, als auch bei der Wiederverwendung des Biokatalysators selbst. Wie vorher erwähnt ist es ebenfalls möglich, Mutanten der fraglichen Enzyme zu verwenden. Die Prozentsätze, die hier oben für die Enzymmenge vorgegeben sind, können abhängig von der Aktivität des verwendeten Enzyms und der Sicherheit, wenn Mutanten verwendet werden variieren.

Die Konzentrationen der Ausgangsmaterialien Z-Asp und L-PM können gleichfalls innerhalb weiter Grenzen variieren und werden unter anderem durch die Löslichkeit dieser Materialien in dem Anfangsreaktionsgemisch bestimmt. Jedoch stört die Anwesenheit kleiner Mengen an ungelösten Ausgangsmaterialien nicht den Verlauf der Reaktion, da diese Mengen während der Reaktion in Lösung übergehen werden. In Verfahren nach Stand der Technik ist es als Ergebnis von Produkthemmung und in Verbindung mit der während der Reaktion auf einen übermäßigen Stand ansteigenden Viskosität unmöglich, die Reaktion bei Molkonzentrationen der Ausgangsmaterialien von über ungefähr 200 bis 700 mM durchzuführen; die vorliegende Erfindung ermöglicht es, sogar bei höheren Molkonzentrationen der Ausgangsmaterialien und daher auch des Kopplungsprodukts bis zu einer Größenordnung von ungefähr 1200 mM gute Umwandlungen zu erzielen. Dies bezeichnet einen zusätzlichen Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung, da es daher möglich ist, eine verbesserte Ausbeute pro Reaktorvolumen zu erzielen.

Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele und das Vergleichsbeispiel detaillierter beschrieben werden, ohne jedoch auf sie begrenzt zu werden. Vorab sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die Zusammensetzungen des in den Beispielen angegebenen Reaktionsgemisches (Molkonzentrationen und Gew.-% in der Anfangssituation) auf der Basis der genau bestimmten eingesetzten Mengen und dem Gewicht und Volumen des hergestellten Reaktionsgemisches berechnet werden. Die Umwandlungsgrade (und gleichfalls die Ergebnisse bezüglich L-PM-Hydrolyse, welche am Ende der Reaktionszeit aufgetreten ist) wurden mittels der sogenannten Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Umkehrphasen-HPLC), unter Verwendung UV- spektrophotomerischen Nachweises bei 257 nM bestimmt, verwendet wurde eine mit Nucleosil C18 und einem Mehrbereichs-Eluentsystem (Wasser/Acetonitril/Triethylammoniumphosphat) gepackte Säule bei pH 3,0. Die aus dem Reaktionsgemisch entnommenen Proben wurden in jedem Fall sofort in Methanol aufgenommen, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, und sie wurden vor ihrer Analyse (per Autoinjektion in den kontinuierlichen Fluß des Eluents) bei niedrigen Temperaturen gelagert. Die Enzymkonzentrationen und anfänglichen Enzymaktivitäten, die in den folgenden Beispielen vorgegeben sind, sind in jedem Fall auf der Basis der eingesetzten Menge an Enzympräparat berechnet. Die angegebenen Werte für L-PM-Hydrolyse werden am Ende der Reaktion bestimmt und werden als durchschnittliche Hydrolyse pro Stunde in Prozent, basierend auf der Menge an L-PM, die am Anfang vorhanden ist, ausgedrückt.

Beispiel 1

Eine Menge an L-PM. HCl (4,01 g; 18,6 mmol) wurde bei Raumtemperatur in einem 100 ml Becher und unter Rühren mit einer Lösung aus Z-Asp.diNa (7,28 g; 23,4 mmol) in Wasser (20,57 g) zusammengemischt. Nacheinander wurde die erhaltene Lösung, gleichfalls unter Rühren, mit 2,59 g NaCl und 0,17 g CaCl&sub2;.2H&sub2;O zusammengemischt und der pH wurde dann durch Zugeben von 3 N HCl auf 5,0 eingestellt. Die verbleibende klare Lösung wurde dann mit 2,98 g Thermolysin (Pulver, von Daiwa; enthaltend ungefähr 15% Thermolysinprotein und 70% NaCl) zusammengemischt.

So wurde ein Reaktionsgemisch mit der folgenden Zusammensetzung erhalten:

Gesamtgewicht: 39,7 g

Gesamtvolumen: 33,1 ml

[Z-Asp]&sub0;: 707 mM (26% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 562 mM

(NaCl): 14,5%

[Enzym]: 7,5% (Präparat)

pH: 5,0

Portionen von in jedem Fall ungefähr 2,0 ml dieses Reaktionsgemisches wurden sofort auf 15 Teströhren übertragen, welche dann gleichzeitig in ein Wasserbad von 40ºC plaziert wurden, freihängend in mit einer Schüttelmaschine (Gyrotory Water Bath Shaker, Model G76D von New Brunswick Scientific Co. Inc.) verbundenen Haltern. Die Schüttelmaschine wurde auf eine Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Nach bestimmten Intervallen wurde jeweils eine Teströhre aus dem Wasserbad genommen, um den Fortschritt der Reaktion zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde die Röhre nach Zugabe von ungefähr 15 ml Methanol, um die Reaktion zu stoppen, auf ungefähr 5ºC gekühlt, wonach die Zusammensetzung des Inhalts mit Hilfe einer Umkehrphasen-HPLC analysiert wurde. Eine anfängliche Enzymaktivität von 32 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Zusätzlich wur de nachgewiesen, daß der erste Niederschlag nach ungefähr 30 Minuten vorhanden war und daß ein Endumwandlungsgrad (berechnet auf Basis von L-PM) von 87% nach einer Reaktionszeit von 2,5 Stünden erzielt wurde. Falls die Reaktion länger dauerte, kam kein weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vor. Nach einer Reaktionszeit von 2,5 Stunden gab es keine feststellbare Bildung von L-Phe. Unter diesen Bedingungen fand daher keine Hydrolyse von L-PM statt.

Beispiel II

d Eine Suspension aus L-PM.HCl (3,34 g; 15,5 mmol) und Z-Asp (4,96 g; 18,6 mmol) in Wasser (14,9 g) wurde bei Raumtemperatur in einem Becher und unter Rühren mit eine Menge an 22 Gew.-% NaOH (6.72 g; 37,0 mmol NaOH) zusammengemischt, so daß eine klare Lösung mit einem pH = 5,0 gebildet wurde. Aufeinanderfolgend, gleichfalls unter Rühren, wurde diese Lösung mit 3,26 g NaCl, 0,12 g CaCl&sub2;.2H&sub2;O und 1,40 g Thermolysin (Pulver, von Amano; enthaltend ungefähr 15% Thermolysinprotein und 34% NaCl) zusammengemischt. So wurde ein Reaktionsgemisch mit der folgenden Zusammensetzung erhalten:

Gesamtgewicht: 34,7 g

Gesamtvolumen: 29,3 ml

[Z-Asp]&sub0;: 634 mM (20% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 529 mM

[NaCl]: 13,5%

[Enzym]: 4,0%

pH: 5,0

Das Reaktionsgemisch wurde sofort auf Teströhren verteilt und wie in Beispiel I beschrieben weiterbehandelt. Eine anfängliche Enzymaktivität von 27 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß der erste Niederschlag nach ungefähr 120 Minuten beobachtet werden konnte und daß ein Endumwandlungsgrad (berechnet auf Basis von L-PM) von 80% nach einer Reaktionszeit von 9 Stunden erzielt wurde. Als sich die Reaktion fortsetzte, kam kein weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vor. Nach einer Reaktionszeit von 9 Stunden war eine geringe Menge an L-Phe (0,21 mmol) hergestellt worden, entsprechend einer Hydrolyse von L-PM von 0,16% pro Stunde.

Beispiel III

Das Verfahren von Beispiel II wurde wiederholt, außer daß nun die unten in Klammern erwähnten Mengen an Anfangsmaterialien eingesetzt wurden:

L-PM.HCl (4,70 g; 21,8 mmol); Z-Asp (5,28 g; 19,8 mmol); Wasser (13,68 g); 22% NaOH (6,36 g; 35,0 mmol NaOH); NaCl (2,95 g); CaCl&sub2;.2H&sub2;O (0,13 g); Thermolysin (Pulver, von Amano; 1,50 g; wie in Beispiel 11).

Dies ergab die folgende Zusammensetzung des Anfangsreaktionsgemisches:

Gesamtgewicht: 34,6 g

Gesamtvolumen: 29,0 ml

[Z-Asp]&sub0;: 683 mM

[L-PM]&sub0;: 752 mM (10% Übermaß basierend auf Z-Asp))

[NaCl]: 13,7%

[Enzym]: 4,3%

pH: 5,0

Das Reaktionsgemisch wurde sofort auf Teströhren verteilt und wie in Beispiel I beschrieben weiterbehandelt. Eine anfängliche Enzymaktivität von 32 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß sich der erste Niederschlag nach ungefähr 60 Minuten gebildet hatte. Ein Umwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von 57% war nach einer Reaktionszeit von 13,5 Stunden erzielt worden und als sich die Reaktion fortsetzte, kam etwas weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vor. Nach einer Reaktionszeit von 13,5 Stunden wurde eine geringe Menge an L-Phe (0,32 mmol) beobachtet, entsprechend einer Hydrolyse von L-PM von ungefähr 0,1% pro Stunde.

Beispiel IVa

Das Verfahren von Beispiel 11 wurde wiederholt, außer daß nun die unten in Klammern erwähnten Mengen an Anfangsmaterialien eingesetzt wurden:

L-PM.HCl (4,31 g; 20,0 mmol); Z-Asp (5,87 g; 22,0 mmol); Wasser (14,53 g); 22% NaOH (6,89 g; 37,9 mmol NaOH); NaCl (3,20 g); CaCl&sub2;.2H&sub2;O (0,12 g); Thermolysin (Amano, 1,42 g; wie in Beispiel 11). Dies ergab die folgende Zusammensetzung des Anfangsreaktionsgemisches:

Gesamtgewicht: 36,3 g

Gesamtvolumen: 30,8 ml

[Z-Asp]&sub0;: 714 mM (10% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 649 mM

[NaCl]: 13,4%

[Enzym]: 3,9%

pH: 5,0

Das Reaktionsgemisch wurde sofort auf Teströhren verteilt und wie in Beispiel I beschrieben weiterbehandelt. Eine anfängliche Enzymaktivität von 27,9 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß ein Umwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von 83% nach einer Reaktionszeit von 15 Stunden erzielt worden war, und daß kein weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vorkam, als sich die Reaktion fortsetzte. Nach einer Reaktionszeit von 15 Stunden wurde nur eine geringe Menge an L-Phe beobachtet, entsprechend einer Hydrolyse von 0,2% pro Stunde.

Beispiel IVb

Das Verfahren von Beispiel IVa wurde wiederholt, außer daß unterschiedliche Mengen an Wasser, 22% NaOH und NaCl eingesetzt wurden, nämlich Wasser (13,58 g); 22% NaOH (7,30 g; 40,1 mmol); NaCl (4,60 g). Dies ergab die folgende Zusammensetzung des Anfangsreaktionsgemisches:

Gesamtgewicht: 37,2 g

Gesamtvolumen: 31,2 ml

[Z-Asp]&sub0;: 706 mM (10% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 641 mM

[NaCl]: 17,2%

[Enzym]: 3,8%

pH: 5,0

Das Reaktionsgemisch wurde sofort auf Teströhren verteilt und wie in Beispiel I beschrieben weiterbehandelt. Eine anfängliche Enzymaktivität von 42,0 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß ein Umwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von 77% nach einer Reaktionszeit von ungefähr 4 Stunden erzielt worden war, und daß kein weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vorkam, als sich die Reaktion fortsetzte. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden wurde eine geringe Menge an L-Phe (0,23 mmol) beobachtet, also eine Hydrolyse von 0,16% pro Stunde.

Beispiel IVc

Das Verfahren von Beispiel IVa wurde erneut wiederholt, außer daß wieder unterschiedliche Mengen an Wasser, 22% NaOH und NaCl eingesetzt wurden, nämlich Wasser (15,78 g); 22% NaOH (6,82 g; 37,5 mmol); NaCl (2,00 g). Dies ergab die folgende Zusammensetzung des Anfangsreaktionsgemisches:

Gesamtgewicht: 36,3 g

Gesamtvolumen: 30,8 ml

[Z-Asp]&sub0;: 714 mM (10% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 649 mM

[NaCl]: 10,0%

[Enzym]: 3,9%

pH: 5,0

Das Reaktionsgemisch wurde sofort auf Teströhren verteilt und wie in Beispiel I beschrieben weiterbehandelt. Eine anfängliche Enzymaktivität von 18,0 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß ein Umwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von 84% nach einer Reaktionszeit von ungefähr 16 Stunden erzielt worden war, und daß kein weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vorkam, als sich die Reaktion fortsetzte. Nach einer Reaktionszeit von 16 Stunden wurde eine Menge an L-Phe (1,1 mmol) beobachtet, entsprechend einer Hydrolyse von 0,3% pro Stunde.

Beispiel V

Das Verfahren von Beispiel II wurde wiederholt, außer daß nun die unten in Klammern erwähnten Mengen an Anfangsmaterialien eingesetzt wurden und daß, um die Wirkungen des Bewegungsgrads festzustellen, ebenfalls Test bei verschiedenen Schüttelgeschwindigkeiten und unter ruhenden Bedingungen durchgeführt wurden:

L-PM.HCl (12,93 g; 60,0 mmol); Z-Asp (18,33 g; 68,6 mmol); Wasser (43,86 g); 22% NaOH (19,99 g; 109,9 mmol NaOH); NaCl (9,75 g); CaCl&sub2;.2H&sub2;O (0,42 g); Thermolysin (Pulver, von Amano, 4,26 g; wie in Beispiel 11). Dies ergab die folgende Zusammensetzung des Anfangsreaktionsgemisches:

Gesamtgewicht: 109,5 g

Gesamtvolumen: 91,2 ml

[Z-Asp]&sub0;: 752 mM (14% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 658 mM

[NaCl]: 13,4%

[Enzym]: 3,9%

pH: 5,0

Von dem erhaltenen Reaktionsgemisch wurden 15 ml sofort in einen Glasreaktionskessel mit einem Durchmesser von 3,3 cm übertragen, welcher in einem Wasserbad von 40ºC plaziert wurde, freihängend in einem mit einer Schüttelmaschine verbunden Halter. Die Schüt telmaschine wurde auf eine Geschwindigkeit von 150 Umdrehungen pro Minute eingestellt.

Zur gleichen Zeit wurde eine zweite 15 ml Portion des gleichen Reaktionsgemisches in ähnlicher Weise in einer anderen Schüttelmaschine, eingestellt auf eine Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute behandelt. Zusätzlich wurde eine dritte Portion, 10 ml, unter ruhenden Bedingungen bei 40ºC gelagert.

Nach bestimmten Intervallen wurden Proben aus den Kesseln entnommen, um den Fortschritt der Reaktion zu bestimmen, (die ersten Proben, die noch keine oder nur geringe Mengen an Niederschlag enthielten, mit Hilfe einer Pipette; spätere Proben, wenn die Viskosität des Reaktionsgemisches sich als Ergebnis von Niederschlag erhöht hatte, mit Hilfe eines Spatels). Zu diesem Zweck wurden die entnommenen Proben mit ungefähr 15 ml Methanol verdünnt, auf ungefähr 5ºC gekühlt und mit Hilfe von Umkehrphasen-HPLC auf ihre Zusammensetzung hin analysiert. Anfängliche Enzymaktivitäten von 37,8, 30,0 und 21,0 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurden jeweils (bei 150 U/min. 250 U/min und unter ruhenden Bedingungen) gefunden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß in den drei Situationen nach einer Reaktionszeit von so wenig wie 8 Stunden (150 U/min) und 12 Stunden jeweils ein Umwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von ungefähr 89% erzielt wurde, und daß als sich die Reaktion fortsetzte keinen weiterer Anstieg des Umwandlungsgrads vorkam. In diesen drei Situationen belief sich die L-PM-Hydrolyse auf ungefähr 0,2% pro Stunde. Eine nach 4 Stunden vorhandene Menge des Niederschlags in der Situation, wo Schütteln angewendet worden war, wurde zusätzlich auf seine chemische Zusammensetzung hin analysiert und wurde als aus mindestens 98% Z-APM bestehend befunden.

Beispiel VI

Eine weitere 50 ml Portion des wie in Beispiel V hergestellten Anfangsreaktionsgemisches wurde in einen temperaturgeregelten Glasreaktionskessel mit einem Durchmesser von ungefähr 5 cm übertragen, welcher bei 40ºC gehalten wurde und mit einem geschwindigkeitsvariablen Rührer mit Flügelblättern, gerade oberhalb des Bodens und gerade unterhalb des Flüssigkeitspegels plaziert, ausgestattet war. Die Geschwindigkeit des Rührers wurde auf 60 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Nach bestimmten Intervallen wurden wie in Beispiel V mit einer Pipette und mit einem Spatel jeweils Proben entnommen und analysiert. Eine an fängliche Enzymaktivität von 20,1 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß nach einer Reaktionszeit von 25 Stunden ein Umwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von 67% erreicht worden war und daß der Umwandlungsgrad noch weiter anstieg, als sich die Reaktion fortsetzte. Nach einer Reaktionszeit von 25 Stunden wurde eine geringe Menge an L-Phe (0,55 mmol) beobachtet, also belief sich die Hydrolyse auf 0,07% pro Stunde.

Die Zusammensetzung des Niederschlags, wie nach jeweils 4 und 20 Stunden erhalten, wurde analysiert und bei den zwei Zeiten für unterschiedlich befunden: nach 4 Stunden war 98% als Z- APM.L-PM und 2% als Z-APM vorhanden, aber nach 20 Stunden hatten sich diese Prozentsätze auf jeweils 67% und 33% verändert.

Beispiel VII

Analog zu den Ausgangslösungen von Beispielen V und VI wurden ebenfalls Ausgangslösungen hergestellt, in welchen der Salzgehalt von 13,4 Gew.-% unter Verwendung von hauptsächlich KCl oder Na&sub2;SO&sub4; erzielt wurde, die Zusammensetzungen anderweitig jedoch identisch waren. In Gemisch A waren 12,1% KCl und 1,3% NaCl vorhanden; in Gemisch B 8,9% Na&sub2;SO&sub4; und 4,5% NaCl. Als die Kopplungsreaktionen durchgeführt worden war, wurden zu den Ergebnissen der Beispiele V und VI vergleichbare Ergebnisse gefunden.

Beispiel VIII

In gleicher Weise wie in Beispiel V beschrieben wurde ein neues Reaktionsgemisch hergestellt. Von diesem wurden 50 ml sofort in den temperaturgeregelten Glasreaktionskessel aus Beispiel VI übertragen, der bei 40ºC gehalten wurde. Nun wurde der Rührer jedoch erst nach Reaktion für 5 Stunden unter ruhenden Bedingungen gestartet und dann auf 60 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Nach bestimmten Intervallen wurden wie in Beispiel V Proben entnommen und analysiert. Eine anfängliche Enzymaktivität von 20,6 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Der Umsetzungsgrad nach 5 Stunden betrug 43%. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß nach einer Reaktionszeit von 20 Stunden ein Umsetzungsgrad (basierend auf L-PM) von 86% erreicht worden war und daß der Umsetzungsgrad sogar noch anstieg, als sich die Reaktion fortsetzte. Nach einer Reaktionszeit von 25 Stunden wurde eine geringe Menge an L-Phe (1,1 mmol) beobachtet, entsprechend einem Hydrolysegrad von ungefähr 0,17% pro Stunde.

Beispiel IX

Ein Reaktionsgemisch (Gesamtgewicht: 339,96 g; Gesamtvolumen: 275,6 ml) mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

[Z-Asp]&sub0;: 745 mM (14% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 653 mM

[NaCl]: 13,0%

[Enzym]: 3,8% (Präparat; Thermolysin von Amano)

pH: 5,3

Dies Gemisch wurde in drei Portionen (A, B, C) von 90 ml aufgeteilt, welche Portionen wie in Beispiel VI beschrieben eingesetzt wurden. Der pH von Portion A wurde während der Kopplungsreaktion nicht weiter beeinflußt; der pH von Portion B wurde bei ungefähr 5,3 durch tropfenweises Eindosieren von NaOH-Lösung (falls der pH sich verringerte) und HCl-Lösung (falls der pH sich erhöhte) gehalten; im Fall von Portion C wurde danach getrachtet, den pH bei ungefähr 5,3 durch tropfenweises Eindosieren von HCl-Lösung (wenn der pH über 5,3 stieg) zu halten.

Sowohl in der Kopplungsreaktion mit Portion A, als auch in der Reaktion mit Portion 8 bildeten sich nach 30 Minuten Kristalle, was im Fall von Portion C ungefähr 1 Stunde dauerte. In Portion A (mit einer anfänglichen Enzymaktivität von 33,0 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats) wurde ein Umwandlungsgrad von ungefähr 70% nach 24 Stunden erreicht, der nicht anstieg als sich die Reaktion fortsetzte; der End-pH war 6,16 und die PM- Hydrolyse betrug ungefähr 0,1% pro Stunde. In Portionen B und C (mit der selben anfänglichen Enzymaktivität) wurde ein Umwandlungsgrad von 95 bis 96% nach jeweils 60 und 45 Stunden erreicht und eine PM-Hydrolyse von ungefähr 0,07% pro Stunde wurde beobachtet.

Vergleichsbeispiel A

Das Verfahren von Beispiel 11 wurde wiederholt, außer daß nun die unten in Klammern erwähnten Mengen an Anfangsmaterialien eingesetzt wurden und ein pH von 6,0 eingestellt wurde:

L-PM.HCl (4,04 g; 18,8 mmol); Z-Asp (5,34 g; 20,0 mmol); Wasser (44,35 g); 22% NaOH (7,56 g; 41,6 mmol NaOH); NaCl (8,08 g); CaCl&sub2;.2H&sub2;O (0,12 g); Thermolysin (Pulver, von Amano, 1,42 g; wie in Beispiel 11). Dies ergab die folgende Zusammensetzung der klaren Lösung des Anfangsreaktionsgemisches:

Gesamtgewicht: 70,1 g

Gesamtvolumen: 61,7 ml

[Z-Asp]&sub0;: 324 mM (6% Übermaß basierend auf L-PM)

[L-PM]&sub0;: 305 mM

[NaCl]: 13,4%

[Enzym]: 1,0%

pH: 6,0

Dies Reaktionsgemisch wurde auf Teströhren aufgeteilt und wie in Beispiel I beschreiben weiterbehandelt. Eine anfängliche Enzymaktivität von 61 nmol.min&supmin;¹mg&supmin;¹ des Enzympräparats wurde gefunden. Es wurde ebenfalls gefunden, daß ein Endumwandlungsgrad (basierend auf L-PM) von 46% nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden erzielt wurde, und daß kein Anstieg des Umwandlungsgrads vorkam, als sich die Reaktion fortsetzte. Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden wurde beiläufig auch gefunden, daß sich 0,65 mmol L-Phe gebildet hatten, hergestellt durch Hydrolyse von L-PM (also ungefähr 1,15% pro Stunde, basierend auf den anfänglichen 18 mmol).


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von N-Benzyloxycarbonyl-α-L- aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch Hochumwandlungs- Enzymkopplung von N-Henzyloxycarbonyl-Lasparaginsäure und L- phenylalaninmethylester in einem wässerigen Medium mit Bildung eines Niederschlags, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsreaktion unter Verwendung von Mengen an N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester in einem Molverhältnis im Bereich von 1 : 0,7 bis 0,7 : 1 unter dem Einfluß einer neutralen Protease als Enzym bei einem Anfangs-pH von 4,5 bis 6,0 und in Anwesenheit von 3 bis 25%, berechnet als Gew.-% basierend auf dem Gesamtreaktionsgemisch, von einem Alkalimetallsalz, Erdalkalimetallsalz oder Ammoniumsalz durchgeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anfangs-pH im Bereich von 4,7 bis 5,5 liegt.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalimetallsalz, Erdalkalimetallsalz oder Ammoniumsalz in einer Menge von 10 bis 18% anwesend ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Alkalimetallsalz oder Ammoniumsalz Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumchlorid und/oder Ammoniumsulfat ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung in Anwesenheit von 0,08 bis 1,5, insbesondere von 0,15 bis 0,75 Gew.-% Enzym (aktives Protein), basierend auf dem Gesamtreaktionsgemisch, durchgeführt wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß von einem gelösten Enzym Verwendung gemacht wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester im Bereich von 1 : 0,8 bis 1 : 1 liegt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des wässerigen Reaktionssystems der Kopplungsreaktion bei einem Wert von unter 6,2, vorzugsweise unter 5,7 gehalten wird.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekenn zeichnet, daß die Kopplung unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß das Reaktionsgemisch zumindest teilweise während des Kopplungsverfahrens in Bewegung gehalten wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch zumindest teilweise während des Kopplungsverfahrens durch Schüttel in Bewegung gehalten wird.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsreaktion halb-kontinuierlich durchgeführt wird, wobei die kontinuierlicher Entfernung des Niederschlags ab dem Moment stattfindet, wo mindestens 60% Umwandlung des Ausgangsreaktionsgemisches erreicht worden ist und mit weiterer Zugabe des Ausgangsmaterials ab demselben Moment, in im wesentlichen stöchiometrischen Proportionen.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Teil des Kopplungsverfahrens, bis ungefähr 20-60% der Umwandlung erlangt worden ist, unter statischen Bedingungen durchgeführt wird und das Reaktionsgemisch dann zumindest teilweise während des nachfolgenden Kopplungsverfahrens in Bewegung gehalten wird.







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