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Verfahren zur Unterdrückung der Koloration von menschlichem Serum-Albumin - Dokument DE69329841T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69329841T2 31.05.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0591605
Titel Verfahren zur Unterdrückung der Koloration von menschlichem Serum-Albumin
Anmelder Welfide Corp., Osaka, JP
Erfinder Sumi, Akinori, Hirakata-shi, Osaka 573, JP;
Ohtani, Wataru, Hirakata-shi, Osaka 573, JP;
Furuhata, Naoto, Hirakata-shi, Osaka 573, JP;
Takeshima, Kazuya, Hirakata-shi, Osaka 573, JP;
Kamide, Kaeko, Hirakata-shi, Osaka 573, JP;
Ohmura, Takao, Hirakata-shi, Osaka 573, JP;
Yokoyama, Kazumasa, Hirakata-shi, Osaka 573, JP
Vertreter Patentanwälte von Kreisler, Selting, Werner et col., 50667 Köln
DE-Aktenzeichen 69329841
Vertragsstaaten BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.03.1993
EP-Aktenzeichen 931041230
EP-Offenlegungsdatum 13.04.1994
EP date of grant 10.01.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.05.2001
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C07K 14/765   C12N 15/14   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von gentechnisch exprimiertem Humanserumalbumin.

Hintergrund der Erfindung

Ein Albumin, insbesondere Humanserumalbumin (im folgenden auch als HSA bezeichnet), ist eine wichtige Komponente, die Protein in Plasma bildet. Dieses Protein wird in der Leber erzeugt und ist hauptsächlich dafür verantwortlich, einen normalen osmotischen Druck des Blutstroms aufrechtzuerhalten. Außerdem fungiert es als Träger für verschiedene Serummoleküle.

HSA wird in einer Vielzahl klinischer Situationen verabreicht. Wenn HSA zum Beispiel einem Patienten verabreicht wird, der unter Schock oder Verbrennungen leidet, bewirkt es eine Wiederherstellung des ursprünglichen Niveaus des Blutvolumens, wodurch einige Symptome, die mit einem Trauma zusammenhängen, verbessert werden. Für diese Wirkung wird HSA häufig verabreicht. Auch Patienten, die unter Hypoproteinämie oder fetaler Erythroblastose leiden, benötigen zuweilen Behandlungen mit HSA. Wie aus diesen Beispielen hervorgeht, erkennt man die grundlegende Bedeutung einer Verabreichung von HSA bei der Behandlung von Symptomen, die mit einem Verlust von Flüssigkeiten aus Blutgefäßen einhergehen, wie bei Operationen, Schock, Verbrennungen oder Hypoproteinämie, die Ödeme verursacht.

Zur Zeit wird HSA hauptsächlich durch Fraktionierung von Blut hergestellt. Dieses Herstellungsverfahren ist unökonomisch und beinhaltet außerdem das Problem, das die Versorgung mit Blut, aus dem HSA hergestellt wird, nicht immer gewährleistet ist. Da HSA außerdem aus dem Blut stammt, besteht bei HSA, das auf diese Weise hergestellt wird, ständig die Gefahr, dass es unerwünschte Substanzen, wie Hepatitisviren, enthält. Auch unter diesem Aspekt wäre die Entwicklung eines Ersatzes für Blut als Rohmaterial für HSA sehr vorteilhaft.

Unter den beschriebenen Umständen werden Verfahren zur Herstellung von HSA im großen Maßstab durch Gentechnik mit anschließender Hochreinigung entwickelt. Ein solches Verfahren erlaubt die ökonomische Herstellung von HSA, das keine unerwünschten Substanzen, wie Hepatitisviren, enthält.

Gentechnisch hergestelltes HSA ist jedoch gefärbt, da es mit einer bestimmten färbenden Komponente kombiniert ist, die in den Rohmaterialien vorhanden ist, oder durch Kontamination mit Substanzen, die von Mikroorganismen während der Kultur von Wirtsmikroorganismen und/oder während der Reinigung von HSA sezerniert werden. Diese Kontaminanten können mit herkömmlichen Reinigungsverfahren für HSA, das aus Plasma stammt, nicht ausreichend entfernt werden.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Dementsprechend besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von HSA bereitzustellen, die durch Komponenten im Medium oder durch Zellsekrete verursacht wird, wenn HSA gentechnisch hergestellt wird.

Die Erfinder führten verschiedene Untersuchungen durch, um das beschriebene Ziel zu erreichen, und fanden heraus, dass die Färbung von HSA, die durch die Kombination oder Reaktion zwischen gentechnisch extrazellulär erzeugtem HSA und färbenden Stoffen verursacht wird, unterdrückt werden kann, indem man die Kultur und/oder Reinigung für die gentechnische Herstellung von HSA in Gegenwart einer bestimmten Aminverbindung durchführt, und stellten die Erfindung fertig.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von gentechnisch exprimiertem Humanserumalbumin, das die Kultur und/oder Reinigung in Gegenwart einer Aminverbindung umfasst, die ausgewählt ist aus C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylaminen, C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylendiaminen, N,N-Di-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylendiaminen, Guanidinen, die aus Guanidin, Aminoguanidin und Phenylguanidin ausgewählt sind, Benzamidinen, die aus Benzamidin und p-Aminobenzamidin ausgewählt sind, basischen Aminosäuren, die aus Lysin und Arginin ausgewählt sind, und Aminophenylessigsäuren, in einem Anteil von 0,1 bis 1% (w/v), bezogen auf das Medium oder die das Humanserumalbumin enthaltende flüssige Fraktion.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von HSA, das mit Hilfe von Gentechnik hergestellt werden soll, welche das Kultivieren von Zellen (z. B. Escherichia coli, Hefe, Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, tierische Zellen), die HSA exprimieren können, und die anschließende extrazelluläre Expression (sekretorische Expression) umfasst.

1. Gentechnische Herstellung eines HSA-produzierenden Wirtes

Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende HSA-erzeugende Wirt unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er gentechnisch hergestellt wird, und jeder Wirt, ob er nun in der bekannten Literatur offenbart ist oder in der Zukunft erst entwickelt wird, kann in geeigneter Weise verwendet werden, vorausgesetzt, dass das Ziel der Erfindung damit erreicht werden kann. Spezielle Beispiele für geeignete Wirte mit der Eignung zur gentechnischen HSA-Erzeugung sind Escherichia coli, Hefe, Bacillus subtilis und tierische Zellen. In der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Verwendung einer Hefe als Wirt wünschenswert, insbesondere der Gattung Saccharomyces (z. B. Saccharomyces cerevisiae) oder der Gattung Pichia (z. B. Pichia pastoris). Auxotrophe Stämme oder antibiotikaempfindliche Stämme können ebenfalls verwendet werden. Außerdem kann vorzugsweise der Stamm Saccharomyces cerevisiae AH22 (a, his 4, leu 2, can 1) oder der Stamm Pichia pastoris GTS115 (his 4) verwendet werden.

Bei dem Verfahren zur Herstellung dieser HSA-erzeugenden Wirte, dem Verfahren zur Herstellung von HSA durch Kultivieren der Wirte und dem Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von HSA aus Kulturen kann es sich um bekannte oder zu diesen analoge Verfahren handeln. Zu den Verfahren zur Herstellung eines HSA-erzeugenden Wirtes (oder eines HSA-erzeugenden Stammes) gehören zum Beispiel ein Verfahren, bei dem ein bekanntes Humanserumalbumin-Gen verwendet wird (Europäische Patente Veröffentlichungs-Nr. 73 646, 79 739 und 206 733), ein Verfahren, bei dem ein neues Humanserumalbumin-Gen verwendet wird (Japanische Offenlegungsschriften Nr. 29985/1987, 98486/1989), ein Verfahren, bei dem eine synthetische Signalsequenz verwendet wird (Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 329 127), ein Verfahren, bei dem eine Serumalbumin-Signalsequenz verwendet wird (Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 319 641), ein Verfahren, bei dem ein rekombinantes Plasmid in ein Chromosom eingebaut wird (Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 399 455), ein Verfahren, bei dem Wirte verschmolzen werden (Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 409 156), ein Verfahren, bei dem in einem methanolhaltigen Medium eine Mutation verursacht wird, ein Verfahren, bei dem eine Variante des AOX&sub2;-Promotors verwendet wird, die man erhält, indem man einen natürlichen AOX&sub2;- Promotor zum Beispiel durch partielle Deletion, Substitution oder Addition seiner Basensequenz modifiziert, um die Aktivität als Promotor zu verbessern Japanische Patentanmeldungen Nr. 63598/1991, 63559/1991), eine Expression von HSA durch Bacilius subtilis (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 25133/1987), eine Erzeugung von HSA mit Hefe (Europäische Patente Veröffentlichungs-Nr. 123 544, 248 637 und 251 744) sowie eine Erzeugung von HSA mit Pichia (Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 344 459).

Unter den oben genannten Verfahren umfasst das Verfahren, bei dem in einem methanolhaltigen Medium eine Mutation verursacht wird, die folgenden Schritte. Ein Plasmid, das eine Transcriptionseinheit aufweist, mit der HSA unter der Kontrolle eines AOX&sub1;-Promotors exprimiert wird, wird mit einem herkömmlichen Verfahren in einen geeigneten Wirt, vorzugsweise eine Pichia-Hefe, insbesondere in einen AOX&sub1;-Genbereich des Stammes GTSII5 (NRRL Hinterlegungs-Nr. Y-15851), eingeschleust, so dass man eine Transformante erhält (siehe Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 344 459). Diese Transformante zeigt in einem methanolhaltigen Medium ein schlechtes Wachstum. Dann wird diese Transformante in einem Medium kultiviert, das Methanol enthält, um eine Mutation zu verursachen, und nur Stämme, die ein schnelles Wachstum zeigen, werden entnommen. Die Methanolkonzentration beträgt 0,0001-5%, und das Medium kann künstlich oder natürlich sein. Die Inkubation erfolgt 1-1000 Stunden lang bei 15-40ºC.

Zu den Verfahren zum Kultivieren eines HSA-erzeugenden Wirtes, d. h. zu den Produktionsverfahren für HSA, gehören ein Verfahren, bei dem Zellen und gewonnene Produkte in hoher Konzentration erhalten werden, indem man eine geeignete kleine Menge Glucose in hoher Konzentration hinzufügt, z. B. durch eine halbkontinuierliche Kultur, um eine durch in hoher Konzentration vorliegendes Substrat verursachte Inhibitionswirkung auf die gewonnenen Zellen zu vermeiden (Japanische Patentanmeldung Nr. 219561/1989), ein Verfahren, bei dem die HSA-Erzeugung durch Zugabe von Fettsäure in das Medium gesteigert wird (Japanische Patentanmeldung Nr. 81719/1991), und ein Verfahren zur Hemmung der Färbung von rekombinantem Humanserumalbumin, das durch Wirtszellen in einem Kulturmedium erzeugt wird, durch Abtrennen von färbenden Kontaminanten aus dem Humanserumalbumin, bevor die färbenden Kontaminanten an das Humanserumalbumin binden (EP-A-0 464 590).

Zu den Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von HSA gehört zum Beispiel die Inaktivierung von Protease durch Wärmebehandlung (Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 420 007).

Das für die Kultivierung eines transformanten Wirtes zu verwendende Medium ist ein auf diesem Gebiet bekanntes Medium, dem eine Fettsäure mit 10-26 Kohlenstoffatomen oder ihr Salz zugesetzt wurde, und die Kultivierung kann nach einem herkömmlichen Verfahren erfolgen. Das Medium kann synthetisch oder natürlich sein, wobei einem flüssigen Medium der Vorzug gegeben wird. Zum Beispiel kann ein synthetisches Medium verschiedene Zucker als Kohlenstoffquellen, Harnstoff, ein Ammoniumsalz oder Nitrat als Stickstoffquellen, verschiedene Vitamine und Nucleotide als Mikronährstoffe sowie Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co und Cu als anorganische Salze enthalten, und ein Beispiel dafür ist YNB-Flüssigmedium [0,7% Hefestickstoffbasis (hergestellt von Difco), 2% Glucose]. Beispiele für ein natürliches Medium sind YPD-Flüssigmedium [1% Hefeextrakt (hergestellt von Difco), 2% Bacto-Pepton (hergestellt von Difco), 2% Glucose]. Der pH-Wert des Mediums kann neutral, schwach basisch oder schwach sauer sein. Wenn ein Wirt Methanol verwertet, kann ein methanolhaltiges Medium verwendet werden. In diesem Fall beträgt die Methanolkonzentration 0,01-5%.

Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise 15-43ºC (20-30ºC für Hefen und 20-37ºC für Bakterien). Die Inkubation erfolgt 1 bis 1000 Stunden lang unter Belüftung durch diskontinuierliche, halbkontinuierliche oder kontinuierliche Kultur, wobei man die Kultur stehen lässt, schüttelt oder rührt. Eine Vorkultur vor der Hauptkultur ist zu bevorzugen, wobei zum Beispiel YNB-Flüssigmedium oder YPD-Flüssigmedium verwendet wird. Die Vorkultur erfolgt 10 bis 100 Stunden lang bei 30ºC für Hefen und 37ºC für Bakterien.

Nach der Kultur wird HSA mit bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren aus dem Kulturfiltrat oder den Zellen gewonnen.

2. Schritt der Unterdrückung einer Kombination oder Reaktion von HSA mit färbenden Stoffen

Der Schritt der Unterdrückung der Färbung von HSA ist in den Kulturschritt, den Reinigungsschritt (nach der Kultur) und/oder automatische Produktionsschritte (Schritte von der Kultur bis zur Reinigung, die voll automatisiert sind, d. h. ohne manuelle Operationen) eingebaut und wird auf eine HSA-haltige wässrige Lösung, wie eine Kulturlösung, einen Kulturüberstand, eine rohe Reinigungsfraktion oder eine gereinigte Fraktion, angewendet.

In der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination oder Reaktion von in der Kultur exprimiertem HSA mit färbenden Stoffen unterdrückt werden, indem man die oben genannten Behandlungen in Gegenwart einer speziellen Verbindung, die noch zu nennen sein wird, durchführt. Dieser Schritt des Unterdrückens wird im Falle einer extrazellulären Expression wünschenswerterweise während des Kulturschritts durchgeführt. Die für die Farbunterdrückung zu verwendende Verbindung ist eine Aminverbindung, wie oben dargelegt wurde.

Zu den C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylaminen gehören zum Beispiel Methylamin, Ethylamin, Propylamin, Isopropylamin und Butylamin. Zu den C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylendiaminen gehören Methylendiamin, Ethylendiamin und Propylendiamin, und zu den N,N-Di-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylendiaminen gehören N,N-Dimethylethylendiamin und N,N-Diethylethylendiamin.

Die Unterdrückung der Färbung im Kulturschritt erfolgt geeigneterweise unter den folgenden Bedingungen:

pH: 4-9 (vorzugsweise pH 5-7)

Anteil an Aminverbindung, der zugegeben werden soll:

0,1-1% (w/v), relativ zum Medium.

Die Unterdrückung der Färbung kann in der vorliegenden Erfindung auch während der Reinigung von HSA durchgeführt werden. Die Reinigung kann nach bekannten Verfahren erfolgen, wie durch verschiedene Fraktionierungen, Adsorptionschromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Dichtegradientenzentrifugation und Dialyse.

Die Unterdrückung der Färbung während des Reinigungsschritts kann unter den folgenden Bedingungen erfolgen:

pH: 4-9 (vorzugsweise pH 5-7)

Anteil an Aminverbindung, der zugegeben werden soll:

0,1-1% (w/v), relativ zur HSA-haltigen flüssigen Fraktion.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlich anhand von Beispielen beschrieben.

Beispiele 1-7

1. Verwendeter Stamm: Saccharomyces cerevisiae TMS-33-1h4

Der histidinprototrophe revertante Stamm TMS-33-1h4 wurde in folgender Weise aus dem histidinauxotrophen Stamm TMS-33-1 erhalten, der gemäß der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 72889/1991 präpariert wurde. Nachdem der Stamm TMS-33-1 über Nacht in einem nichtselektiven Medium gezüchtet worden war, wurden Zellen entnommen, gründlich gewaschen und auf eine selektive Platte (eine Platte aus einem Medium ohne Histidin) gestrichen. Die selektive Platte wurde bei 30ºC kultiviert, und der Stamm TMS-33-1h4 wurde aus den in Frage kommenden revertanten Stämmen, die gewachsen waren, erhalten.

2. Medium

i) YNB-Medium: Bacto-Hefestickstoffbasis (6,7 g, hergestellt von Difco), gelöst in 100 ml destilliertem Wasser und durch Filtration sterilisiert, wurde mit 20 g Glucose (hergestellt von Nakarai Kagaku, Japan), die in destilliertem Wasser gelöst war, so dass man eine Gesamtmenge von 900 ml erhielt, gemischt und dann autoklaviert.

ii) Synthetisches Glucose-Ammoniumacetat-Medium: mit der Zusammensetzung von Tabelle 1

Tabelle 1

Komponente Konzentration (mg/l)

Glucose 20 000

CH&sub3;COONH&sub4; 5000

KH&sub2;PO&sub4; 10 000

CaCl&sub2;·2H&sub2;O 100

KCl 2000

NaCl 100

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 2000

ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 100

CuSO&sub4;·5H&sub2;O 5

FeCl3·6H&sub2;O 100

Biotin 0,1

Vitamin B&sub1; 10

Vitamin B&sub6; 1

Natriumpantothenat 10

Inosit 50

pH 6,0

iii) Kultur

Vorkultur

Ein mit Leitflächen ausgestatteter Erlenmeyer-Kolben, der YNB-Medium enthielt, wurde mit einer geeigneten Menge des Stammes TMS-33-1h4 geimpft und 24 Stunden lang einer Schüttelkultur bei 30ºC unterzogen.

Hauptkultur

Die Vorkultur wurde zentrifugiert, und Zellen wurden entnommen. Die Zellen wurden in 10 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Mit der Zellsuspension (1 ml) wurde synthetisches Glucose-Ammoniumacetat-Medium (100 ml) beimpft. Das Kulturmedium (100 ml) wurde in einen mit Leitflächen ausgestatteten 300-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und 70 Stunden lang einer Schüttelkultur bei 30ºC mit 125 U/min unterzogen.

Bei dieser Gelegenheit wurden jeweils verschiedene Aminverbindungen, ' wie sie in Tabelle 2 angegeben sind, in die Kultur gegeben. Zum Vergleich wurde die Kultur auch ohne Aminverbindungen durchgeführt (Referenz).

iv) Experimentelles Beispiel (Wirkung verschiedener Aminverbindungen, die in Kulturmedien gegeben werden, auf die Färbung von HSA)

Reinigung des Kulturüberstands und Konzentration

Nach der Kultur wurde aus jedem Kulturmedium eine Probe entnommen. Die Probe wurde 5 Minuten lang mit 15 000 U/min zentrifugiert, und in einem Teil des erhaltenen Überstands wurde die HSA-Konzentration bestimmt.

Zu dem verbleibenden Kulturüberstand (100 ml) wurde Blue Cellulofine (1 g, mit physiologischer Kochsalzlösung gründlich gewaschen, hergestellt von Seikagaku Kogyo, Japan) als Filterkuchen gegeben, und man ließ Albumin 2 Stunden lang bei Raumtemperatur daran adsorbieren. Das Blue Cellulofine, an dem Albumin adsorbiert worden war, wurde in eine Minisäule übertragen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 3 ml 3 M Natriumthiocyanat eluiert. Das Eluat wurde in einem Konzentrator [Centricon 30 (30K), hergestellt von Amicon] konzentriert und als Probe für die Messung verwendet.

Messung von HSA

Die HSA-Konzentration im Külturüberstand wurde durch einen umgekehrten passiven Hämagglutinierungsassay (RPHA) bestimmt, der die Basis für die Bestimmung der HSA-Menge bildete. Die Menge des HSA wurde als Verhältnis mit einem Standard-HSA (hergestellt von Miles) als Basis ausgedrückt, wobei die dort enthaltene HSA-Menge als 1 genommen wurde.

Grad der Färbung

Die gereinigten und konzentrierten Proben wurden auf Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm, 350 nm oder 405 nm untersucht. Das Verhältnis der Extinktion bei einer Wellenlänge von 350 nm zu der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm sowie das Verhältnis der Extinktion bei einer Wellenlänge von 405 nm zu der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm wurden berechnet und als Hinweise auf den Grad der Färbung verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2

Anmerkung: * ausgedrückt als Verhältnis, wobei die Menge an HSA in der Referenz gleich 1 gesetzt wurde.

Beispiel 8

1. Verwendeter Stamm: Dieselben Stämme, die auch in den Beispielen 1- 7 verwendet wurden.

2. Medium

1) Medium für diskontinuierliche Kultur: mit der Zusammensetzung von Tabelle 3

ii) Medium für kontinuierliche Kultur: mit der Zusammensetzung von Tabelle 4

Tabelle 3

Komponente Konzentration (mg/l)

Glucose 1000

(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2000

KH&sub2;PO&sub4; 20 000

KCl 4000

NaCl 400

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 4000

CaCl&sub2;·2H&sub2;O 100

ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 100

CuSO&sub4;·5H&sub2;O 10

FeCl3·6H&sub2;O 100

Biotin 0,2

Vitamin B&sub1; 20

Vitamin B&sub6; 2

Natriumpantothenat 20

Inosit 100

pH 5,8

Tabelle 4

Komponente Konzentration (mg/l)

Glucose 500 000

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 20 000

ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 1000

CaCl&sub2;·2H&sub2;O 300

CuSO&sub4;·5H&sub2;O 50

Biotin 1

Vitamin B&sub1; 100

Vitamin B&sub6; 10

Natriumpantothenat 100

Inosit 500

3. Kultur

Vorkultur

Ein mit Leitflächen ausgestatteter Erlenmeyer-Kolben, der YNB-Medium enthielt, wurde mit einer Glyceringefriervorratszelllinie (1 ml, OD&sub5;&sub4;&sub0; = 10) geimpft und 24 Stunden lang einer Schüttelkultur bei 30ºC unterzogen. Nach der Ernte durch Zentrifugieren wurden die Zellen in sterilisiertem Wasser suspendiert, und 41 des Mediums für diskontinuierliche Kultur wurden damit geimpft.

Hauptkultur

Ein 10-l-Miniflaschenfermenter wurde verwendet, und die Kultur wurde unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Belüftungsrate wurde auf 1 vvm eingestellt, und die Rührgeschwindigkeit wurde so gesteuert, dass die Konzentration von gelöstem Sauerstoff nicht kleiner als 10 ppm wurde. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 28%igem wässrigem Ammoniak auf 5,8 gehalten. Die Schaumbildung wurde verhindert, indem nach Bedarf eine kleine Menge eines Schaumverhütungsmittels (Adekanol, hergestellt von Asahi Denka Kogyo, Japan) hinzugefügt wurde. Ein Medium (4 l) wurde im Einklang mit einem Steuerprogramm so zugeführt, dass die spezifische Wachstumsrate 0,12 h&supmin;¹ betrug.

Kultursteuerproqramm

Die Zufuhrgeschwindigkeit wurde gemäß einem Programm gesteuert. Das Programm stellt die Zufuhrgeschwindigkeit gewöhnlich so ein, dass die spezifische Wachstumsrate 0,12 h&supmin;¹ beträgt. Wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff jedoch auf 2 oder darunter fällt, während die Kultur unter Kontrolle ist, wird die spezifische Wachstumsrate auf 0 gesetzt, um eine konstante Zufuhrgeschwindigkeit beizubehalten.

Aminverbindung

Aminoguanidin (mit Garantie, hergestellt von Wako Junyaku, Japan) wurde jeweils zu dem diskontinuierlichen Medium und zu dem kontinuierlichen Medium gegeben, so dass seine Konzentration 0,6% (w/v) betrug.

Als Referenz wurde eine Kultur ohne Aminoguanidin durchgeführt.

4. Experimentelles Beispiel - HSA-Erzeugung in Gegenwart einer Aminverbindung und deren Wirkung auf die Färbung

i) Bestimmung der Zellkonzentration

Zu einem frei gewählten Zeitpunkt wurde eine Probe aus einem Kulturmedium entnommen, und die Probe wurde mit destilliertem Wasser in geeigneter Weise verdünnt. Die Extinktion bei 540 nm wurde mit einem Spektrophotometer gemessen (UV 240, hergestellt von Shimazu, Japan), und die Trockenzellmasse wurde anhand einer im voraus gezeichneten Eichkurve bestimmt.

In der beschriebenen Weise wurden die HSA-Konzentration und der Grad der Färbung verglichen. Die HSA-Konzentration in der Probe wurde in mg/l, ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Die Kultur schritt in Gegenwart von 0,6% (w/v) Aminoguanidin glatt voran. Die Zellmenge erreichte 120 g Trockenzellmasse/l, und die HSA- Produktion erreichte nach 72-75 Stunden Kultur 800 mg/l,.

Mit anderen Worten, eine herkömmliche Kultur (Kultur ohne die Behandlung zur Farbunterdrückung) konnte auch in Gegenwart von 0,6% (w/v) Aminoguanidin durchgeführt werden, und die Färbung des erhaltenen HSA betrug etwa ein Fünftel der gewöhnlich beobachteten Färbung (in der Kultur ohne die Behandlung zur Unterdrückung der Färbung).

Beispiele 9-11

1. Zu verwendender Stamm: Pichia pastoris GCP101

PC4130 kann erhalten werden, indem man den AOX&sub1;-Genbereich von Pichia pastoris GTS115 (his 4) (NRRL Y-15851) nach dem Verfahren, wie es im Europäischen Patent Veröffentlichungs-Nr. 344 359 beschrieben ist, durch die mit Not1 abgespaltenen Fragmente des Plasmids pPGP1 ersetzt, die eine Transcriptionseinheit aufweisen, wobei HSA unter der Kontrolle eines AOX&sub1;-Promotors exprimiert wird. Aufgrund des Fehlens des AOX&sub1;- Gens zeigt dieser Stamm ein schlechtes Wachstum in einem Medium, das Methanol als Kohlenstoffquelle enthält (Mut&supmin;-Stamm).

3 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose) wurden mit PC4130 beimpft, und 24 Stunden später wurde mit einer solchen Konzentration in 50 ml YPD-Medium übergeimpft, dass das ursprüngliche OD&sub5;&sub4;&sub0; 0,1 betrug. Nach 3 Tagen Inkubation bei 30ºC wurde mit einer solchen Konzentration in 50 ml YPD-Medium übergeimpft, dass das ursprüngliche OD&sub5;&sub4;&sub0; 0,1 betrug. Dieses Ansetzen von Tochterkulturen wurde alle drei Tage wiederholt. Bei jedem Ansetzen einer Tochterkultur wurden die Zellen mit sterilisiertem Wasser verdünnt, so dass man eine Zellkonzentration von 10&sup7; Zellen/Platte erhielt, und auf eine 2%-MeOH- YNB-ohne-Aminosäure-Platte (0,7% Hefestickstoffbasis ohne Aminosäure, 2% Methanol, 1,5% Agarpulver) aufgetragen. Nach 5 Tagen Inkubation bei 30ºC wurde beobachtet, ob Kolonien vorhanden waren oder nicht. Zwanzig Kolonien bildeten sich auf einer 2% -MeOH-YNB-ohne-Aminosäure-Platte, die nach 12 Tagen Ansetzen von Tochterkulturen mit Zellen beschichtet worden war. Der Mut&supmin;-Stamm bildete kaum eine Kolonie auf dieser Platte, aber der Mut&spplus;-Stamm konnte eine bilden. Das heißt, die Koloniebildung auf dieser Platte zeigt eine verstärkte Verwertung von Methanol an, und sie zeigt auch an, dass ein in Mut&spplus; umgewandelter Stamm erhalten werden konnte. Eine der gebildeten Kolonien wurde in geeigneter Weise mit sterilisiertem Wasser verdünnt und auf einer 2%- MeOH-YNB-ohne-Aminosäure-Platte zu einer einzelnen Kolonie ausgestrichen, die GCP101 genannt wurde.

2. Medium

1) Medium für die Vorkultur

Bacto-Hefestickstoffbasis (6,7 g, hergestellt von Difco) wurde in Wasser gelöst, so dass man eine Gesamtmenge von 100 ml erhielt, und 10x-YNB, das sterilisiert und filtriert wurde, 20%ige Glucose, die in einem Autoklaven sterilisiert wurde, sowie sterilisiertes Wasser wurden in einem Verhältnis von 1 : 1 : 8 (v) miteinander gemischt und verwendet.

ii) Medium für die Hauptkultur

Verschiedene Aminverbindungen wurden jeweils zu einem Medium gegeben, das Methanol und Glycerin als Kohlenstoffquellen enthielt (Tabelle 6), und dies wurde als Medium für die Hauptkultur verwendet (pH 6,0).

Tabelle 6

Komponente Konzentration (1/l)

Methanol 40 ml

Glycerin 1000 mg

Ammoniumacetat 5000 mg

KH&sub2;PO&sub4; 10 000 mg

CaCl&sub2;·2H&sub2;O 100 mg

KCl 2000 mg

NaCl 100 mg

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 2000 mg

ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 100 mg

CuSO&sub4;·5H&sub2;O 5 mg

FeCl&sub3;·6H&sub2;O 100 mg

Biotin 0,1 mg

Vitamin B&sub1; 10 mg

Vitamin B&sub6; 1 mg

Natriumpantothenat 10 mg

Inosit 50 mg

3. Kulturverfahren

1) Vorkultur

100 ml YNB-Nährbrühe wurden mit einem ml aus einer 20% -Glyceringefriervorratsampulle geimpft und 24 Stunden lang einer Schüttelkultur bei 30ºC in einem mit Leitflächen ausgestatteten 300-ml-Erlenmeyer- Kolben unterzogen.

ii) Hauptkultur

Nachdem 100 ml der Vorkultur einer Ernte durch Zentrifugieren unterzogen worden waren, wurde das Sediment in 10 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Die Zellsuspension (0,5 ml) wurde in 50 ml Hauptkultur übergeimpft. Das Kulturmedium (50 ml) wurde jeweils in einen mit Leitflächen ausgestatteten 300-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und 120 Stunden lang einer Schüttelkultur bei 30ºC mit 125 U/min unterzogen. Die Wirkung verschiedener Aminverbindungen auf die Färbung von HSA wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in den Beispielen 1-7 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.

Tabelle 7

Anmerkung: * ausgedrückt als Verhältnis, wobei die Menge an HSA in der Referenz gleich 1 gesetzt wurde.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Färbung von gentechnisch exprimiertem HSA auf die Hälfte bis ein Zehntel des Wertes, den man ohne die Behandlung zur Unterdrückung der Färbung erhält, unterdrückt werden. Außerdem kann HSA in hohen Ausbeuten gewonnen werden, und die Behandlung der Erfindung beeinflusst die inhärenten Eigenschaften von HSA nicht.

Da das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Zugabe eines Mittels zur Unterdrückung der Färbung von HSA während der Kultur und/oder Reinigung umfasst, lässt sich das Verfahren leicht und effizient durchführen.

Dementsprechend kann das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelte HSA genauso wie aus Plasma stammendes HSA als klinisch nützliches Pharmazeutikum verwendet werden.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von gentechnisch exprimiertem Humanserumalbumin, umfassend die Kultur und/oder Reinigung in Gegenwart einer Aminverbindung, die ausgewählt ist aus C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylaminen, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylendiaminen, N,N-Di-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylendiaminen, Guanidinen, die aus Guanidin, Aminoguanidin und Phenylguanidin ausgewählt sind, Benzamidinen, die aus Benzamidin und p-Aminobenzamidin ausgewählt sind, basischen Aminosäuren, die aus Lysin und Arginin ausgewählt sind, und Aminophenylessigsäuren, in einem Anteil von 0,1 bis 1% (w/v), bezogen auf das Medium oder die das Humanserumalbumin enthaltende flüssige Fraktion.

2. Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von Humanserumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei die C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylamine aus Methylamin, Ethylamin, Propylamin, Isopropylamin und Butylamin ausgewählt sind.

3. Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von Humanserumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei die C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylendiamine und N,N-Di-C&sub1;&submin;&sub6;- alkyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylendiamine aus Methylendiamin, Ethylendiamin, Propylendiamin, N,N-Dimethylethylendiamin und N,N-Diethylethylendiamin ausgewählt sind.

4. Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von Humanserumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei die Kultur das Kultivieren eines gentechnisch hergestellten, Humanserumalbumin erzeugenden Wirtes in einem Medium umfasst, dem eine Aminverbindung zugesetzt ist, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.

5. Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von Humanserumalbumin gemäß Anspruch 4, wobei der Humanserumalbumin erzeugende Wirt eine Hefe ist.

6. Verfahren zur Unterdrückung der Färbung von Humanserumalbumin gemäß Anspruch 5, wobei die Hefe aus der Gattung Saccharomyces und der Gattung Pichia ausgewählt ist.







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