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Dokumentenidentifikation DE69611548T2 07.06.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0885240
Titel VERFAHREN ZUR REINIGUNG VON 11BETA-21-DIHYDROXY-2'-METHYL-5'-BETAH-PREGNA-1,4-DIENO[17,16-D]-OXAZOLE-3, 20-DIONE
Anmelder Gruppo Lepetit S.p.A., Lainate, IT
Erfinder FORTE, Luigi, I-72100 Brindisi, IT
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69611548
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.12.1996
EP-Aktenzeichen 969423250
WO-Anmeldetag 04.12.1996
PCT-Aktenzeichen EP9605392
WO-Veröffentlichungsnummer 9730068
WO-Veröffentlichungsdatum 21.08.1997
EP-Offenlegungsdatum 23.12.1998
EP date of grant 10.01.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.06.2001
IPC-Hauptklasse C07J 71/00

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung der Verbindung 11β-21-Dihydroxy-2'-methyl-5'βH-pregna-1,4-dieno[17,16-d]-oxazolin-3,20-dion der Formel I:

Die vorstehende Verbindung ist insofern mit Deflazacort (INN - International Nonproprietary Name, internationaler Freiname) verwandt, als die Acetat-Einheit an C-21 von Deflazacort durch eine Hydroxyeinheit substituiert ist.

Deflazacort ist eine Verbindung, die seit einigen Jahren als calciumsparendes Glucocorticoid-Mittel bei der Therapie eingesetzt wird.

Diese Verbindungen gehören zur allgemeineren Klasse der Pregnenooxazoline, denen entzündungshemmende, Glucocorticoid- und hormonähnliche pharmakologische Aktivitäten zugeschrieben werden. Beispiele für Verbindungen der vorstehenden Klasse sind in US 3413286 und US 4440764 offenbart.

Die Verbindung (I) wurde für analytische Zwecke einer Festphasenextraktion auf Harzen auf Styrolbasis aus biologischen Proben unterworfen, siehe J. Chromatography, Bd. 657 (1) (1994) S. 248-53 und Xenobiotica Bd. 13(3) (1983) S. 185-196.

Die Herstellung der Verbindung der Formel I ist in EP-B-322630 offenbart, worin die Verbindung als 11β-21-Dihydroxy-2'-methyl-5'ßH-pregna-1,4-dieno[17,16-d]-oxazolin- 3,20-dion bezeichnet wird.

Gemäß dem in der vorstehend zitierten EP-B-322630 offenbarten Fermentationsverfahren wird 2'-Methyl-4-pregnen-21-ol-[17a, 16a-d]oxazolinyl-3,20-dion oder 2'-Methyl-4-pregnen-21- acetyloxy-[17a,16a-d]oxazolinyl-3,20-dion mit einer sequentiell wachsenden Mischkultur eines Curvularia-Stammes und eines Arthrobacter-Stammes in Kontakt gebracht. Insbesondere wird die vorstehende Verbindung gemäß einer bevorzugten Ausfübrungsform 12-24 Std. nach dem Animpfen zu einer wachsenden C. lunata-NRRL 2380-Kultur in einem geeigneten Fermentationsmedium gegeben, und 48-72 Std. nach dem Animpfen wird eine 18-36 Std. wachsende A. simplex ATCC 6946-Kultur zu dem Gemisch gegeben und weitere 40-55 Std. gezüchtet; die Fermentation erfolgt unter Tauchbedingungen, die Temperatur wird zwischen 27ºC und 32ºC und der pH-Wert zwischen 6 und 8 gehalten; das Fermentationsprodukt der Formel I wird dann durch Extrahieren der Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel (z. B. Chloroform), Einengen der organischen Extrakte und Fällen der Verbindung durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels (z. B. Petrolether) gewonnen.

Da die Konzentration der Verbindung der Formel I in der Fermentationsbrühe sehr niedrig ist, sind hohe Mengen an organischem Lösungsmittel notwendig, um die Verbindung vollständig zu extrahieren. Die Verwendung hoher Mengen an organischen Lösungsmitteln, insbesondere halogenierten Lösungsmitteln, kann hinsichtlich der Sicherheit, der industriellen Hygiene und des Umweltschutzes einige Probleme aufwerfen.

Man hat nun entdeckt, dass die Verbindung der Formel I geeigneterweise aus einer wässrigen Lösung gewonnen werden kann, die aus Fermentationsbrühen oder Verfahrensströmen hervorgegangen ist, indem die in der wässrigen Lösung enthaltene Verbindung an ein Polymerharz als Adsorber, das eine Styrol- oder Acrylmatrix aufweist, adsorbiert wird, das Harz mit Wasser gewaschen wird, die Verbindung anschließend durch Eluieren des Harzes mit einem geeigneten Gemisch aus Wasser und einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel desorbiert wird, das Eluat konzentriert wird und die Verbindung (I) daraus durch Filtration gewonnen wird.

Übliche wässrige Lösungen, welche die Verbindung der Formel (I) zusammen mit ungewünschten Produkten enthalten, sind die filtrierten Fermentationsbrühen aus den geeigneten Mycelien, gegebenenfalls zusammen mit den wässrigen Waschlösungen dieser Mycelien, oder partiell gereinigte Verfahrensströme. Beispiele für ungewünschte Nebenprodukte sind farbige Verunreinigungen, Nebenprodukte, unverbrauchte Ausgangsmaterialien, Salze und wasserlösliche Komponenten der Fermentationsmedien.

Insbesondere kann das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren zweckmäßigerweise angewendet werden zur Gewinnung der Verbindung der Formel I aus der filtrierten Fermentationsbrühe, die aus dem in EP-B-322630 offenbarten Fermentationsverfahren gewonnen wird, welches das Inkontaktbringen des vorstehend erwähnten Ausgangsmaterials mit einer wachsenden Kultur eines Curvularia-Stammes und anschließendes Zugeben einer wachsenden Kultur eines Arthrobacter-Stammes dazu einschließt.

Geeignete Harze für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren haben eine durchschnittliche Teilchengröße von etwa 20-50 Mesh und die nachstehenden durchschnittlichen physikalischen Eigenschaften:

poröses Volumen etwa 30% bis 70%;

Oberfläche: etwa 140 bis 800 m²/g;

Gerüstdichte: etwa 1,06 bis 1,10 g/ml (Styrolharze);

etwa 1,20 bis 1,26 g/ml (Acrylharze);

durchschnittlicher Porendurchmesser: etwa 20 bis 100 Å

Beispiele für Polymerharze auf Styrolbasis als Adsorber, die sich für das vorstehende Gewinnungsverfahren eignen, sind die kommerziell erhältlichen Harze, wie Kastel® S/112 (Dow Chemical), Amberlite® XAD/2, XAD/4 oder XAD/16 (Rohm & Haas) oder dergleichen. Beispiele für Polymerharze auf Acrylbasis als Adsorber, die sich für das vorstehende Gewinnungsverfahren eignen, sind die kommerziell erhältlichen Harze, wie Kastel® 5/221 oder 5/223 (Dow Chemical), Amberlite® XAD/7 oder XAD/8 (Rohm & Haas) und dergleichen.

Im allgemeinen werden für das erfindungsgemäße Verfahren Polymerharze auf Acrylbasis bevorzugt eingesetzt, insbesondere solche, die eine Teilchengröße von etwa 20- 50 Mesh und die nachstehenden durchschnittlichen physikalischen Eigenschaften aufweisen:

poröses Volumen etwa 30% bis 60%;

Oberfläche: etwa 350 bis 550 m²/g;

Gerüstdichte: etwa 1,24 bis 1,25 g/ml;

durchschnittlicher Porendurchmesser: etwa 20 bis 80 Å

Beispiele für Polymerharze auf Acrylbasis als Adsorber mit den vorstehenden Eigenschaften, die sich geeigneterweise einsetzen lassen, sind das vorstehend erwähnte Kastel® S/221 und Amberlite® XAD/7.

Für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren ist ein Polymerharz auf Acrylbasis besonders bevorzugt, das eine Teilchengröße von 20-50 Mesh und die nachstehenden durchschnittlichen physikalischen Eigenschaften aufweist:

poröses Volumen etwa 30% bis 60%;

Oberfläche: etwa 350 bis 550 m²/g;

Gerüstdichte: etwa 1,25 g/ml;

durchschnittlicher Porendurchmesser: etwa 20 bis 40 Å

Das kommerziell erhältliche Harz Kastel® S/221 kann bspw. geeigneterweise eingesetzt werden.

Die eluierenden Gemische sind Gemische aus 10 bis 50% Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie niedere Ketone (z. B. Aceton, Ethylmethylketon); niedere Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol) und dergleichen.

Vorzugsweise ist dies ein Gemisch, das etwa 30% Wasser enthält. Aceton ist das bevorzugte Lösungsmittel.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung der Verbindung der Formel I, erhalten gemäß dem in EP-B-322630 beschriebenen Fermentationsverfahren, eingesetzt wird, kann das nachstehende allgemeine Verfahren geeigneterweise eingesetzt werden.

Nach Beendigung des Fermentationsverfahrens wird die Fermentationsmasse zuerst gemäß den bekannten Techniken filtriert. Der Mycel-Kuchen wird mehrmals mit Wasser gewaschen, und die Waschlösungen werden dann mit der filtrierten Brühe vereinigt. Alternativ kann das Mycel mit einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus den vorstehend aufgeführten, gewaschen werden, um die darin enthaltene Aktivität zu gewinnen; in diesem Fall werden die Waschlösungen mit der filtrierten Brühe erst vereinigt, nachdem das Lösungsmittel entfernt worden ist, bspw. durch Abstrippen unter Vakuum.

Die mit den Waschlösungen vereinigte filtrierte Brühe wird dann auf die Säule aufgetragen, die das adsorbierende Harz enthält; gewöhnlich enthält die eluierte Lösung nur Spuren des Produkts. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen, um Salze und andere wasserlösliche Verunreinigungen zu eliminieren (wie oben, auch dieses Waschwasser enthält gewöhnlich nur Spuren des Produktes).

Die Verbindung der Formel I wird dann von dem Harz desorbiert, indem mit einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie vorstehend definiert, vorzugsweise einem 30/70-Gemisch aus Wasser/Aceton, eluiert wird. Das Eluat wird konzentiert, und das Produkt wird durch Filtration gewonnen. Mit diesem Verfahren wird die Hauptmenge an Produkt aus der filtrierten Brühe gewonnen; allgemein werden mehr als 90% der Gesamtmenge der gewünschten Verbindung, die zu Beginn auf die Säule aufgetragen worden ist, mit dieser ersten Elution gewonnen.

Die verbleibende Menge kann durch Wiederholen des vorstehenden Verfahrens gewonnen werden, nachdem die Mutterlaugen aus der ersten Elution und die Waschlösungen mit dem Wasser vereinigt worden sind. Die Gesamtausbeute beträgt etwa 96%.

Die nachstehenden Beispiele werden zur besseren Veranschaulichung der Erfindung angeführt.

Beispiel 1: Sequentielles Wachstum von C. lunata und A. simplex I) Schrägröhrchen-Kulturmedien

Sabouraud-Medium (für C. lunata)

Antibiotika-Agar Nr. 1 (für A. simplex)

II) Vegetative und Vorkultur-Medien

a) für C. lunata

Sojaschrot 13 g/l

KH&sub2;PO&sub4; 5 g/l

Dextrose 10 g/l

Pepton 5 g/l

pH-Wert vor dem Autoklavieren auf 6,5 bis 7,5 eingestellt

b) für A. simplex

Dextrose 1,0 g/l

Sojaschrot 5,0 g/l

Pepton 5,0 g/l

Basamin-Busch 3,0 g/l

KH&sub2;PO&sub4; 5,0 g/l

NaCl 5,0 g/l

Silikon 0,1 ml/l

pH-Wert vor dem Autoklavieren auf 6,5 bis 7,5 eingestellt

III) Fermentationsmedien

Ein Fermentationsmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehend beschriebene Vorkulturmedium für C. lunata.

IV) Fermentationsverfahren

Die Schrägröhrchen werden verwendet, um 500 ml Kulturkolben, die etwa 12-24 Std. (C. lunata) oder 18-36 Std. (A. simplex) bei etwa 28ºC in Gegenwart von 100 ml des vorstehend angegebenen vegetativen Mediums gewachsen waren, anzuimpfen. Dieses Impfgut wird im nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet.

Aliquote (etwa 1 bis 5%) der vorstehend erhaltenen C. lunata-Kultur werden in einen 8 l-Fermenter, der das vorstehend beschriebene Fermentationsmedium enthält, überführt und etwa 24 Std. bei 29-32ºC gezüchtet.

Dann werden 4 g 2'-Methyl-4-pregnen-21-ol-[17a, 16a-d]-oxazolinyl-3,20-dion zugegeben und die Fermentation wird bis zu etwa 36-72 Std. nach dem Animpfen fortgesetzt. Anschließend wird die 18-36 Std. Kultur von A. simplex dazu gegeben, und die Fermentation wird weitere 40-55 Std. fortgesetzt.

Der Reaktionsverlauf wird, wie im Fachgebiet bekannt, durch TLC oder vorzugsweise HPLC überwacht, indem das Verschwinden des Ausgangsmaterials und/oder das Erscheinen des Endproduktes verfolgt werden.

Als weitere Kontrolle kann zudem das Erscheinen/Verschwinden von Zwischenprodukten verfolgt werden. HPLC-Umwandlungsausbeute: 70-75%.

Beispiel 2: Gewinnung der Verbindung der Formel I

40-55 Std. nach der Zugabe von A. simplex kann die Transformation gewöhnlich als beendet angesehen werden, und die Fermentationsmasse kann aufgearbeitet werden, um die gewünschte Verbindung der Formel I zu isolieren.

Der pH-Wert der Fermentationsmasse wird mit H&sub2;SO&sub4; auf etwa 3 bis 4 eingestellt, und das Gemisch wird durch Filtration mittels Filtrierhilfe abgetrennt; das filtrierte Mycel wird dann mehrmals mit angesäuertem Wasser (3 < pH-Wert < 4) gewaschen. Die filtrierte Brühe und die Waschlösungen werden vereinigt, wobei 11 l eines Gemischs erhalten werden, das die Verbindung der Formel I enthält, mit 270 ppm Feingehalt (bestimmt durch HPLC auf Silicagel; Spherisorb-Säule 3 um, 100 · 4,6 mm; Fließgeschwindigkeit 1,3 ml/min. mobile Phase 0,0025 M NaH&sub2;PO&sub4; : CH&sub3;CN 7 : 3, UV-Detektor bei 254 nm). Das vorstehende Gemisch wird dann bei Raumtemperatur auf eine Chromatographiesäule (6 · 11 cm), die etwa 300 ml eines in Wasser gequollenen Polymerharzes auf Acrylbasis (Kastel® S/221, Dow Chemical) enthält, mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 300 ml/Std. aufgetragen. Die eluierte Brühe (Mutterlaugen), die weniger als 2 ppm Aktivität aufweist, wird gesondert aufgefangen.

Das Harz wird dann mit 600 ml demineralisiertem Wasser gewaschen, um die Salze und anderen wasserlöslichen Verunreinigungen zu entfernen. Auch in diesem Fall wird das Eluat (die Waschlösungen), das weniger als 2 ppm Aktivität enthält, gesondert aufgefangen.

Das Produkt wird dann vom Harz desorbiert, indem es mit einem 70/30-Gemisch aus Aceton/Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 150 ml/Std. eluiert wird, wobei etwa 200 ml Eluat aufgefangen werden.

Das Eluat wird unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt, wobei das Produkt ausfällt.

Die Suspension wird auf etwa 5ºC gekühlt, und nach 2 Std. wird das Präzipitat durch Filtration gesammelt und mit kaltem Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen unter Vakuum bei 50ºC werden 2,8 g der Verbindung der Formel I erhalten (Feingehalt 98%).

Die Mutterlaugen und Waschlösungen werden vereinigt und nach dem Verdünnen mit Wasser (etwa 1-2 Volumina bezüglich der Volumina der Mutterlaugen) auf eine Säule (2 · 13 cm), die 40 ml des vorstehenden gequollenen Harzes enthält, bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 40 ml/Std. aufgetragen.

Nach dem Waschen des Harzes mit 80 ml Wasser wird das Produkt durch Eluieren mit einem 70/30-Gemisch aus Aceton/Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 20 ml/Std. desorbiert. Nach dem Konzentrieren unter Vakuum, Kühlen, Filtrieren, Waschen mit kaltem Wasser und Trocknen werden weitere 0,14 g der Verbindung der Formel I erhalten. Die Gesamtausbeute bei der Gewinnung aus dem Fermentationsgemisch ist gewöhnlich etwa 96%.

Durch Wiederholen des in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahrens, jedoch unter Verwendung von 2'-Methyl-4-pregnen-21-acetyloxy-[17a,16a-d]-oxazolinyl-3,20-dion anstelle von 2'-Methyl-4-pregnen-21-ol-[17a,16a-d]-oxazolinyl-3,20-dion, wird die Verbindung der Formel I im Wesentlichen in den gleichen Ausbeuten erhalten.


Anspruch[de]

1. Verfahren Aufreinigunigung der Verbindung 11β-21-Dihydroxy-2'-methyl-5'βHpregna-1,4-dieno[17,16-d]-oxazolin-3,20-dion der Formel:

umfassend:

(a) Adsorbieren der Verbindung, die in einer aus Fermentationsbrühen oder Verfahrensströmen hervorgegangenen wäßrigen Lösung enthalten ist, auf einem Polymerharz als Adsorber, das eine Styrol- oder Acrylmatrix aufweist,

(b) Waschen des Harzes mit Wasser,

(c) Desorbieren der Verbindung der Formel (I) durch Eluieren des Harzes mit einem Gemisch aus 10 bis 50% Wasser und einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel,

(d) Konzentrieren des Eluats und Gewinnung der Verbindung der Formel (I) daraus durch Filtration.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Fermentationsbrühe, die die Verbindung der Formel (I) enthält, diejenige ist, die aus dem Fermentationsverfahren zur Gewinnung der Verbindung erhalten wurde, welches das Inkontaktbringen von 2'- Methyl-4-pregnen-21-ol-[17a,16a-d]oxazolinyl-3,20-dion oder 2'-Methyl-4- pregnen-21-acetyloxy-[17a,16a-d]oxazolinyl-3,20-dion mit einer sequentiell wachsenden Mischkultur eines Curvularia-Stamms und eines Arthrobacter-Stamms umfaßt, wobei die vorstehende Verbindung mit einer wachsenden Kultur eines Curvularia-Stamms in Kontakt gebracht wird und dem Gemisch darauffolgend eine wachsende Kultur eines Arthrobacter-Stamms zugefügt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das eluierende Gemisch in Schritt (c) etwa 30% Wasser enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei:

(a) die Fermentationsmasse zunächst filtriert wird, die Mycelschicht wiederholt mit Wasser gewaschen wird und die Waschlösungen anschließend mit der filtrierten Brühe zusammengegeben werden;

(b) die filtrierte Brühe, die mit den Waschlösungen zusammengegeben wurde, anschließend auf die Oberseite einer Säule aufgetragen wird, die das in Wasser gequollene Adsorptionsharz enthält;

(b') das Harz mit Wasser gewaschen wird;

(c) die Verbindung der Formel (I) vom Harz durch Eluieren mit einem 30/70- Gemisch aus Wasser/Aceton desorbiert wird;

(d) das Eluat konzentriert und die Verbindung der Formel (I) durch Filtration gewonnen wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Reinigungsverfahren an den vereinigten Stammlösungen aus der ersten Elution und den Waschlösungen, die aus der Elution gemäß den Schritten (b) und (b') erhalten wurden, wiederholt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das Polymerharz zur Adsorption ein Polymerharz ist, das eine Styrol- oder Acrylmatrix aufweist, die Teilchengrößen von etwa 20 bis 50 Mesh aufweist und die folgenden durchschnittlichen physikalischen Eigenschaften besitzt:

poröses Volumen: ungefähr 30% bis 75%;

Oberfläche: ungefähr 140 bis 800 m²/g

Gerüstdichte: ungefähr 1,06 bis 1,10 g/ml bei Styrolharzen;

ungefähr 1, 20 bis 1,26 g/ml bei Acrylharzen;

durchschnittlicher Porendurchmesser: ungefähr 20 bis 100 Å.

7. Verfahren gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das Polymerharz zur Adsorption ein Polymerharz auf Acrylbasis ist, das eine Teilchengröße von ungefähr 20 bis 50 Mesh und die folgenden durchschnittlichen physikalischen Eigenschaften besitzt:

poröses Volumen: ungefähr 30% bis 60%;

Oberfläche: ungefähr 350 bis 550 m²/g;

Gerüstdichte: ungefähr 1,24 bis 1,25 g/ml;

durchschnittlicher Porendurchmesser: ungefähr 20 bis 80 Å.

8. Verfahren gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das Polymerharz zur Adsorption ein Polymerharz auf Acrylbasis ist, das eine Teilchengröße von ungefähr 20 bis 50 Mesh und die folgenden durchschnittlichen physikalischen Eigenschaften besitzt:

poröses Volumen: ungefähr 30% bis 60%;

Oberfläche: ungefähr 350 bis 550 m²/g;

Gerüstdichte: ungefähr 1,25 g/ml;

durchschnittlicher Porendurchmesser: ungefähr 20 bis 40 Å.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 6 oder 7, wobei das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel ein niederes Keton oder ein niederer Alkohol ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 6 oder 7, wobei das organische Lösungsmittel Aceton ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 6 oder 7, wobei das eluierende Gemisch ein 30/70-Gemisch aus Wasser/Aceton ist.







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