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Dokumentenidentifikation DE10065241A1 26.07.2001
Titel Adorber für die extrakorporale Blutreinigung und Verfahren der Herstellung
Anmelder Research & Development Center of Bioengineering GmbH, 18119 Rostock, DE
Erfinder Boeden, Friedrich, 13187 Berlin, DE;
Schütt, Wolfgang, 18146 Rostock, DE;
Kunkel, Siegfried, 18057 Rostock, DE;
Klinkmann, Horst, 18059 Rostock, DE;
Holtz, Manfred, 18059 Rostock, DE;
Pommerenke, Hagen, 18055 Rostock, DE;
Kong, Deling, Nakai, CN;
Ramlow, Wolfgang, 18059 Rostock, DE
Vertreter Rother, B., Dipl.-Ing. Pat.-Ing. Dr.-Ing., Pat.-Anw., 18059 Rostock
DE-Anmeldedatum 27.12.2000
DE-Aktenzeichen 10065241
Offenlegungstag 26.07.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.07.2001
IPC-Hauptklasse B01J 20/30
IPC-Nebenklasse A61M 1/36   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft Immunadsorber für die extrakorporale Apherese und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Erfindung ermöglicht die Entfernung von immunologisch wirksamen Substanzen aus dem Blutplasma, Vollblut oder jeder Art von Blutbestandteilen von Patienten, die an immunologischen Erkrankungen leiden.
Die erfindungsgemäßen Immunadsorber werden durch kovalente Bindung von vorzugsweise Protein A an unterschiedliche Trägermaterialien hergestellt. Zuvor erfolgt eine Aktivierung der Träger unter Verwendung eines speziellen Chlorkohlensäureesters (N-Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid).
Die Erfindung zeichnet sich im Vergleich zu anderen auf dem Markt befindlichen Adsorbern durch höhere Stabilität und verbesserte Adsorptionseigenschaften, durch eine hohe Kapazität für die Elimination von Immunglobulinen, Antikörpern und Immunkomplexen aus dem Blutplasma und durch ein geringes Protein A-Leakage aus.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Immunadsorber für die extrakorporale Apherese und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Erfindung ermöglicht die Entfernung von immunologisch wirksamen Substanzen aus dem Blutplasma, Vollblut oder jeder Art von Blutbestandteilen von Patienten, die an immunologischen Erkrankungen leiden.

Die Erfindung zeichnet sich im Vergleich zu anderen auf dem Markt befindlichen Adsorbern durch höhere Stabilität und verbesserte Adsorptionseigenschaften, durch eine hohe Kapazität für die Elimination von Immunglobulinen, Antikörpern und Immunkomplexen aus dem Blutplasma und durch ein geringes Protein A-Leakage aus.

Neben der therapeutischen Anwendung in der Apherese bieten sich Einsatzmöglichkeiten auf anderen biowissenschaftlichen Gebieten an.

1. Trägeraktivierung mit N-Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid (Cl-CO-ONB)

Die Aktivierung von unterschiedlichen Trägermaterialien (z. B. Perlcellulose, Sepharose CL-4B, synthetische Polymere usw.) mit Cl-CO-ONB ist von Büttner W et al. in Biotechnol Bioeng 33 (1989) 26-31, Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414 und von Boeden HF et al. in Makromol Chem 193 (1992) 865-887 sowie in den Patentanmeldungen DD 219490, DD 220696 und EP 0134041 (unkatalytische Aktivierung) sowie in DD 279486 (basenkatalysierte Aktivierung) beschrieben.

Bei der Überprüfung der in diesen Patenten und bei Boeden HF et al. in Biotechnol Bioeng 33 (1989) 26-31 beschriebenen unkatalytischen Aktivierung von Sepharose CL-4B wurde gefunden, daß die Aktivierung in Dioxan (500 mg Cl-CO-ONB/ml Gel; 3 h bei 60°C) zu einer Veränderung der Gelstruktur und teilweisen Zerstörung der Sepharoseperlen führte. Nach der Überführung des Gels in Wasser löste sich die Sepharose zum Teil auf. Der verbliebene unlösliche Trägeranteil war sehr weich und für chromatographische Zwecke nicht einsetzbar.

Das heißt, daß die in den o. g. Patenten beschriebene Aktivierung von Sepharose CL-4B nicht für die Herstellung intakter aktivierter Träger sowie von Affinitätsträgern (nach Kopplung von Liganden) geeignet ist. Für Perlcellulose ist diese Verfahrensweise jedoch wegen ihrer höheren chemischen Stabilität anwendbar.

Bei eigenen umfangreichen Untersuchungen zur unkatalytischen Aktivierung von Sepharosen (CL-4B und -4FF) mit Cl-CO-ONB wurde Sepharose CL-4B mit 30 bzw. 50-100 mg Cl-CO- ONB/ml Gel in Aceton 16-20 h unter Schütteln bei 20-25°C aktiviert. Das aktivierte Gel löste sich bei der anschließenden Überführung in Wasser zu etwa 25-50% bzw. vollständig auf. Das heißt, die unkatalytische Aktivierung von Sepharose CL-4B mit Cl-CO-ONB kann nicht analog zur Aktivierung von Perlcellulose durchgeführt werden.

Auch bei der Aktivierung der höher quervernetzten (und deshalb stabileren) Sepharose Fast Flow wurde eine negative Veränderung der Matrix festgestellt, die sich dadurch äußerte, daß sich die Durchflußeigenschaften der Sepharose FF nach erfolgter Aktivierung verschlechterten.

Für die Herstellung ONB-Carbonat-aktivierter Agarose-Träger mit einem Aktivierungsgrad bis zu ca. 60 µmol aktiven Gruppen/ml Gel (abhängig von der Art des Trägers, dem eingesetzten supernucleophilen Amin, dem Wassergehalt des Lösungsmittels und der Menge an Cl-CO- ONB) ist generell auch die basenkatalysierte Aktivierung mit Cl-CO-ONB anwendbar [vgl. DD 279486 und Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414], bei der eine Schädigung der Gelstruktur durch die während der Aktivierung frei werdende HCl verhindert wird.

Bisher wurde nur die Herstellung von basenkatalytisch aktivierten Trägern mit einem Aktivierungsgrad ≥20 µmol/ml Gel (Sepharose, Perlcellulose) beschrieben. Für die Herstellung niedrigaktivierter Sepharose (Aktivierungsgrad: ca. 5-20 µmol/ml Gel) wurde diese Methode bisher nicht genutzt.

2. Immobilisierung von Protein A an ONB-Carbonat-aktivierte Träger

Die erfolgreiche Immobilisierung von Proteinen an unkatalytisch aktivierte ONB-Carbonat- Träger ist bereits mehrfach beschrieben worden [vgl. DD 219490, DD 220696, EP 0134041, Büttner W et al. in Biotechnol Bioeng. 33 (1989) 26-31, Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414, Boeden HF et al. in Makromol Chem 193 (1992) 865-887].

Es gibt aber keine detaillierten Angaben zum Einsatz von basenkatalytisch aktivierten Trägern für eine Protein-Kopplung.

Die Immobilisierung von Protein A wurde nur für ONB-Carbonat-Perlcellulose (Divicell, unkatalytisch aktiviert) beschrieben von Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414. Die Kopplung von Protein A an ONB-Carbonat-aktivierte Sepharose wurde bisher nicht beschrieben.

3. Immobilisierung von Protein A (PrA) an unterschiedlich aktivierte Träger

Von einer Vielzahl der auf unterschiedliche Weise hergestellten Protein A-Adsorber sind von den Herstellern Daten angegeben zur Aktivierung, zum immobilisierten Protein A und der IgG- Bindungskapazität. Die angegebenen Daten zur IgG-Bindungskapazität sind nicht direkt miteinander vergleichbar, weil deren Bestimmung nicht nach einer Standard-Methode erfolgte (Variation der Bindungspuffer und pH-Werte, Flußrate, Gelbetthöhe, Menge an angebotenem IgG und der Konzentration, Auswertung der Experimente, pH-Wert bei der Elution). Wegen der notwendigen Vergleichbarkeit wurden diese Werte z. T. unter Standardbedingungen nachgearbeitet.

Die kommerziell erhältlichen bzw. in der Apherese eingesetzten Protein A-Träger umfassen folgende Bereiche für die immobilisierte Protein A-Menge und die hIgG-Bindungskapazität:

  • a) 2-6,5 mg Protein A/ml Träger oder Gel
  • b) 15-33 mg hIgG/ml Träger oder Gel.

Diese Werte werden auch durch die erfindungsgemäß hergestellten ONB-Sepharose 4FF- Protein A-Adsorber erzielt.

Die bei der Immobilisierung von nativem Protein A an unterschiedlich aktivierte Träger (z. B. an CNBr-, Tresyl-, Epoxy-, NHS-, Azlacton-, FMP-aktivierte Träger) erzielten Kopplungsausbeuten betragen in der Regel weniger als 50%. Nur in einigen Ausnahmefällen (in Abhängigkeit von der angebotenen Protein A-Menge und -Konzentration sowie der Pufferzusammensetzung) wurden Kopplungsausbeuten von 60-90% erzielt.

In der Regel beträgt die dynamische hIgG-Bindungskapazität der meisten beschriebenen Protein A-Träger bei Einsatz eines Überschusses von hIgG-haltigen Lösungen in geeigneten Puffern zwischen 10-25 mg hIgG/ml Träger.

Die Mehrzahl der auf unterschiedliche Weise hergestellten Protein A-Adsorber bzw. -Träger (z. B. Immobilisierung von nativem Protein A über CNBr-, Tresyl-, Epoxy-, NHS-, Azlacton-, FMP-, bifunktionelle Silane) weist im Eluat mit 10-330 ng Protein A/mg eluiertes IgG ein relativ hohes Protein A-Leakage auf.

Ein direkter Vergleich ist wegen der sehr unterschiedlichen Bedingungen bei der Bestimmung des Protein A-Leakage schwierig (bei der IgG-Elution verwendete unterschiedliche pH-Werte, unterschiedliche ELISA zur Bestimmung der Protein A-Konzentrationen). Der Bereich gibt aber die Größenordnung des Protein A-Leakage der häufig verwendeten Protein-A-Träger an. Für den Apherese-Träger von Excorim gibt es konkrete Angaben von Gjörstrup P et al. in Transfus Sci 11 (1990) 281-302: protein A leakage: <1 ng/ml of treated plasma und Sepharose leakage <2 µg/ml. Weitere Datenquellen für CNBr-aktivierte Träger sind Data Files von Pharmacia Biotech, für NHS-aktivierte Träger Data Files von Pharmacia und Bio-Rad, für Epoxy-aktivierte Träger Data Files von Amersham Pharmacia, für Tresyl-aktivierte Träger Info-Material von TosoHaas GmbH und Nakamura K et al. in J Chromatogr 478 (1989) 159-167, für Azlacton- aktivierte Träger (Fa. Pierce, USA) Instructions: UltraLink™ Immobilized Protein A and Protein A Plus sowie Coleman PL et al. in J Chromatogr 512 (1990) 345-363 und Hermanson GT et al. in J Chromatogr A 691 (1995) 113-122, für FMP-aktivierte Träger Protein A AvidPak™ der Fa. UniSyn Technologies Incorp., USA, sowie Narinesingh C et al. in Analytical Letters 24 (1991) 2147-2155, für Silan-aktiviertes Kieselgel (Prosorba-Säulen) Firmenschriften der Imre-Corp. sowie US 4681870 (1985), US 4801449 (1986), US 5037649 (1989) und US 5122112 (1992).

Weitere Patente zum Aufbau und Einsatz von Protein A-Adsorbern bestehen von Repligen Corp. US 5089605 (1992), Hoechst Corp. US 4409330 (1983) und US 4464165 (1986), DuPont de Nemours US 5356374 (1992), Sepracor Inc. US 5362859 (1992), Cypress Biosc. US 5782792 (1998), sowie US 4614513 (1986), US 5091091 (1990), US 5277701 (1991), WO 9736614 (1997) und US 4879340 (1989).

Spezielle Nachteile der über andere Kopplungsmethoden hergestellten Protein A-Träger sind:

  • a) CNBr-Aktivierung: höheres Protein A-Leakage
  • b) Tresyl-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeuten
  • c) NHS-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeute und hIgG-Bindungskapazität
  • d) Epoxy-Aktivierung: geringe Reaktivität der aktiven Gruppen, geringe Kopplungsausbeuten
  • e) Azlacton-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeute und hIgG-Bindungskapazität
  • f) FMP-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeute und hIgG-Bindungskapazität
  • g) Kopplung an SiO2-Träger: höheres Protein A-Leakage

Die Aufgabe der Erfindung besteht erstens darin, ein Verfahren für die wirtschaftliche Herstellung von stabilen und hochwirksamen Adsorbern zu entwickeln, die vorteilhaft für die extrakorporale Blutreinigung eingesetzt werden können.

Zweitens liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Mängel der bisher in der extrakorporalen Blutreinigung (Apherese) eingesetzten Adsorber am Beispiel eines Protein A- Adsorbers zu beseitigen, d. h. Adsorber mit besseren Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich der Bindungskapazität für Antikörper und zirkulierende immunkomplexe, des Durchflußverhaltens und der Stabilität (geringeres Protein A-Leakage) herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß durch die Anwendung einer geeigneten Aktivierungsmethode für das Matrixmaterial eine optimale Immobilisierung von Protein A erreicht wird, die die vorteilhafte Anwendung des Adsorbers in der Apherese ermöglicht.

Als Aktivierungsmethode wurde die Aktivierung der Träger mit dem Chlorkohlensäureester N- Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid (Cl-CO-ONB) angewendet.

Für die Herstellung der aktivierten Sepharosen CL-4B, CL-6B, 4FF und 6FF wurden durch Optimierungsversuche Bedingungen für die unkatalytische ONB-Aktivierung ermittelt, die eine Herstellung der entsprechenden ONB-Carbonat-aktivierten Sepharosen ermöglicht, ohne daß eine erhebliche Veränderung der Gelstruktur oder der Durchfluß-Charakteristik festgestellt werden konnte.

Wesentlich für die Herstellung dieser ONB-Carbonat-aktivierten Sepharose-Gele ist, daß die Mengen an Cl-CO-ONB/ml Gel 100 mg, die Reaktionszeiten 2 h und die Temperaturen 30°C nicht übersteigen dürfen. Eine ausführliche Beschreibung der Reaktionsbedingungen erfolgt im Ausführungsbeispiel 1/A.

In Abhängigkeit von der Art der Sepharose und den speziellen Aktivierungsbedingungen können auf diese Weise aktivierte Sepharosen mit einem Aktivierungsgrad von 0.5 bis maximal 20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel hergestellt werden (siehe Ausführungsbeispiele 1-20). Hervorzuheben für die Aktivierung mittels Cl-CO-ONB ist:

  • a) Die hier angewandte Methode ist eine milde unkatalytische Aktivierungsvariante für die gegen Säuren relativ instabilen Träger auf Agarosebasis (z. B. Sepharosen).
  • b) Die unkatalytische Aktivierung mit Cl-CO-ONB ist auf einfache Weise durchführbar; sie ist insbesonders geeignet, Träger mit niedrigem Aktivierungsgrad herzustellen.
  • c) Sie gestattet die gezielte Einstellung des gewünschten Aktivierungsgrades in reproduzierbarer Weise (siehe auch Ausführungsbeispiele: 1; 2; 7; 14; 15; 16; 20).

    Durch Erhöhung der eingesetzten Cl-CO-ONB-Menge steigt der Aktivierungsgrad an, wie am Beispiel der Sepharose 4FF- Aktivierung in Aceton (1 h bei RT) gezeigt wird (s. Tab. 1) (s. auch Ausführungsbeispiele 1-7).
Tabelle 1 Einfluß von Angebot und Konzentration an Cl-CO-ONB auf den Aktivierungsgrad der Sepharose 4FF



Die so aktivierten Sepharosen können in vorteilhafter Weise für die Immobilisierung von Liganden, z. B. von Proteinen, eingesetzt werden. Sie zeigen keine wesentlichen Veränderungen in der Gelstruktur und den Durchflußeigenschaften. Lediglich beim Einsatz der Sepharosen CL wurde eine bis zu 10% geringere, maximal anwendbare Durchflußrate (nach Hydrolyse der aktiven Gruppen) beobachtet.

Dis bisher für die Sepharoseträger aufgeführten Zusammenhänge gelten auch für Träger auf Cellulosebasis (Ausführungsbeispiele 43-56). Die Aktivierung mit Cl-CO-ONB führt zu stabilen aktivierten Cellulosepartikeln, deren Aktivierungsgrad von der eingesetzten Menge und Konzentration an Cl-CO-ONB abhängt (Ausführungsbeispiel 50, 51).

Für die Herstellung ONB-Carbonat-aktivierter Agarose-Träger wurde die basenkatalysierte Aktivierung mit Cl-CO-ONB so optimiert, daß diese Methode auch für die Herstellung niedrigaktivierter Sepharose (Aktivierungsgrad: ca. 5-20 µmol/ml Gel) genutzt werden kann.

Ähnlich wie bei der unkatalytischen Aktivierung kann bei der basenkatalysierten Aktivierung durch Variation der Menge an eingesetztem Cl-CO-ONB der gewünschte Aktivierungsgrad eingestellt werden (siehe auch Ausführungsbeispiele 21; 24; 30; 34; 39; 41).

Es wurde eine einfache Nachbehandlungsmethode nach dem Koppeln und Blocken (z. B. 3 Tage schütteln mit 0.1 M Borat, pH 9.3) gefunden, um die bei einer Anwendung in der Apherese schädlichen Verunreinigungen HONB und DMAP, die von der basenkatalysierten Aktivierung herrühren, nahezu quantitativ (Nachweisgrenze: jeweils ca. 0.6 µg HONB und 0.2 µg DMAP/ml Gel) aus dem Adsorbergel zu entfernen (s. Ausführungsbeispiel 21).

Der Einfluß des Aktivierungsgrades auf die Protein A-Kopplungsausbeute wird durch die Ausführungsbeispiele 1-6 für Sepharose 4FF sowie durch die Beispiele 44, 51 und 50 für Cellulosepartikel belegt. Mit steigendem Aktivierungsgrad (unkatalytische Aktivierung) nimmt die pro mg Gel gebundene Protein A-Menge zu.

Mit Zunahme des Aktivierungsgrades nimmt dagegen die hIgG-Bindungskapazität ab (siehe Ausführungsbeispiele 2; 7; 26; 35; 38; 41).

Die Immobilisierung von Protein A an die unter optimierten Bedingungen unkatalytisch (Ausführungsbeispiel 1) oder basenkatalytisch (Ausführungsbeispiel 21) ONB-aktivierten Träger erfolgt unter den vorzugsweisen Bedingungen (Aktivierungsgrad, pH-Wert, Puffersystem, Protein A-Angebot), um einen stabilen Protein A-Adsorber mit niedrigem Protein A-Leakage und hoher hIgG-Bindungskapazität zu erhalten.

Der Einfluß des Aktivierungsgrades auf die Protein A-Kopplungsausbeute wird in den Beispielen 1-6, 44, 50 und 51 belegt. Mit steigendem Aktivierungsgrad nimmt die pro ml Gel gebundene Protein A-Menge zu.

Menge und Konzentration von Protein A haben Einfluß:

  • a) auf die Kopplungsausbeute (s. auch Ausführungsbeispiele 7; 9; 11; 12).

    Wird bei gleichem Aktivierungsgrad der Sepharose 4FF (3,3 µmol/ml Gel) das Protein A- Angebot gesenkt, fällt zwar die gekoppelte Protein A-Menge und damit auch die hIgG- Bindungskapazität ab, die Kopplungsausbeute steigt jedoch bis zum vollständigen Umsatz auf 100% an.
  • b) auf die hIgG-Bindung:

    Parallel mit dem Protein A-Angebot verändert sich auch die Bindungskapazität für hIgG.

    Die Herstellung von Protein A-Adsorbern mit niedrigerer (bei geringen Protein A Angeboten) und hoher hIgG-Bindungskapazität (bei höheren Protein A-Angeboten) wird belegt durch die Ausführungsbeispiele 7; 9; 11; 12, (s. Tab. 2).
Tabelle 2 Einfluß des Protein A-Angebotes auf die hIgG-Bindungskapazität



Vorteilhaft ist der Einsatz hochkonzentrierter Protein A-Lösungen (0,5 Vol.Kopplungslösung/ml Träger) im Vergleich zu Protein A-Lösungen mit 1,0 Vol.Puffer/ml Träger (s. Anspruch 4) (s. Ausführungsbeispiele 1, 2, 7, 13-16, 23, 27-30).

Erfolgt die Protein A-Kopplung bei unterschiedlichen pH-Werten unter sonst vergleichbaren Bedingungen (gleicher Aktivierungsgrad: 27 µmol/ml; gleiche Molarität der Puffer, ähnliches Protein A-Angebot von 6 mg), steigen Kopplungsgrad, Kopplungsausbeute und Bindungskapazität des Sepharose-Protein A-Adsorbers zum sauren pH-Bereich hin an (Ausführungsbeispiele 34-37).

Höchste Bindungskapazitäten werden bei pH 7,2 erzielt nach Immobilisierung in 1,0 M MOPS- oder HERPES-Puffern. Durch Zusatz von hohen Salzkonzentrationen (1 M Na2SO4 oder 3 M NaCl) zu verdünnten Pufferlösungen steigen Kopplungsrate und Bindungskapazität des Sepharose-Protein A-Adsorbers an 0,1 M Phosphatlösung mit 1 M Na2SO4-Zusatz pH = 7,2 wird vorzugsweise als Kopplungspuffer zur Immobilisierung eingesetzt (s. Anspruch 5) (s. Ausführungsbeipiele 1, 21, 23, 24, 25, 28, 29).

Die hIgG-Bindungskapazität dient zur Beurteilung der Effektivität des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers. Die Bestimmung erfolgt unter Einsatz von humanem γ- Globulin (hγ-Globulin, ICN) oder von Humanplasma unter bestimmten Bedingungen (Flußraten, Puffersysteme). Die hγ-Globulin- bzw. Plasma-Menge wird dabei im Überschuß eingesetzt, bezogen auf die hIgG-Bindungskapazität/ml Gel.

Die Ergebnisse zeigen, daß der eingesetzte IgG-Überschuß auf die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität (unter Standardbedingungen nach Ausführungsbeispiel 1/C für den gemäß Beispiel 1/B hergestellten Protein A-Adsorber) großen Einfluß hat und daher festgelegt werden muß.

Die Behandlung des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers für die Apherese in einer Chromatographie-Säule mit Citrat-Puffer pH 2,2 führt zu einem völlig regenerierten Protein A-Adsorber.

Ein Vergleich verschiedener, häufig eingesetzter Regenerierungs-Medien im pH-Bereich von 2-14 mit derselben Adsorber-Säule (s. Ausführungsbeispiel 13/D, Tab. 15) zeigt, daß die hIgG- Bindungskapazität des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers durch die verwendeten Regenerierungs-Medien nicht verändert wurde.

Bei der Bestimmung des Protein A-Leakage nach wiederholtem (7maligem) Schütteln des Protein A-Adsorber-Gels (in der Regel 1-7 Tage bei RT, jeweils bei Verwendung von frischem Puffer) mit der 10fachen Puffermenge (v/v) zeigt der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber ein erheblich geringeres Protein A-Leakage als der Immunosorba Protein A-Adsorber (bei pH 7.2 nur ca. 20%) (s. Ausführungsbeispiel 2/E, Tab. 12).

Nach Lagerung der Protein A-Adsorber über einen Monat mit 5 Vol. dieser Puffer bei 2-4°C hat der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber die niedrigsten Protein A-Leakagewerte (s. Ausführungsbeispiel 3/E, s. Tab. 14) im Vergleich zu kommerziell erhältliche Protein A- Adsorber, die durch Immobilisierung von Protein A an CNBr-aktivierte Sepharose hergestellt worden sind.

Nur unter Einhaltung der vorzugsweisen Herstellungsbedingungen

  • - für die ONB-Carbonat-Aktivierung, bei der die Menge an Cl-CO-ONB/ml Gel 100 mg, die Reaktionszeit 2 h und die Temperatur 30°C nicht übersteigen darf, um den optimalen Aktivierungsgrad zwischen 0,5-5 µmol/ml Gel zu erzielen (Patentanspruch 2 und 3),
  • - für die Immobilisierung von Protein A an die ONB-aktivierten Träger unter Einsatz von Protein A-Konzentrationen von 10-20 mg/ml Puffer und 0,5 Vol.Kopplungspuffer pro 1,0 Vol.Träger (Patentanspruch 4),
  • - sowie unter Einsatz von konzentriertem Puffer oder verdünntem Puffer mit hochkonzentrierten Salzzusätzen zur Einstellung des erforderlichen pH-Wertes und der Molarität des Kopplungspuffers (Patentanspruch 5)
können stabile Protein A-Adsorber auf Sepharose- und Cellulosebasis hergestellt werden, die eine hohe Bindungskapazität für hIgG und ein geringes Protein A-Leakage aufweisen.

Im Falle des Abweichens von den vorzugsweisen Herstellungsbedingungen (zu hoher Aktivierungsgrad: Beispiele 40 und 41, ungünstige pH-Bedingungen und zu niedrige Pufferkonzentration bei der Immobilisierung: Beispiele 8, 10, 22, 27, 31, 38, 39) werden Adsorber erzielt, die nicht dem Patentanspruch 1 genügen.

Die Eignung der Adsorber für die extrakorporale Blutreinigung wurde geprüft in der FPLC unter den in der Apherese gültigen Bedingungen.

Die Qualität des Adsorbers wurde beurteilt nach der Bindungskapazität für hIgG, der anzuwendenden Flußrate, der Beständigkeit gegenüber Regenerierungsmitteln, der Möglichkeit der Wiederverwendung, dem Protein A-Leakage und der Adsorption von zirkulierenden Immunkomplexen aus Patientenplasmen. Zum Vergleich wurde die Prüfung kommerzieller Adsorber (Immunosorba Protein A von Excorim) unter identischen Bedingungen vorgenommen.

Die hIgG-Bindungskapazität ist abhängig vom angebotenen Volumen an Humanplasma und von der angebotenen Menge an hIgG.

Die Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist beim Einsatz von 4.2 ml Humanplasma/ml Gel (5,7 mg hIgG/ml Humanplasma) um 13% höher als die des Immunosorba Protein A-Adsorbers (s. Ausführungsbeispiel 1/C, Tab. 6).

Die Bestimmung erfolgte mit einer linearen Flußrate von 2 cm/min.

Auch beim Einsatz verschiedener pathologischer Plasmen mit unterschiedlicher hIgG- Konzentration besteht ein deutlicher Unterschied der pro ml Gel gebundenen hIgG-Menge und der hIgG-Bindung [in %] (Reduktionsrate) zugunsten des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF- gegenüber dem Immunosorba Protein A-Adsorber (s. Ausführungsbeispiel 2/C, Tab. 10).

Eine Gegenüberstellung der statischen hIgG-Bindung (Batch-Versuch) von erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbern aus Cellulosepartikeln unterschiedlicher Partikelgröße (1 = 50-100 µm; 2 = 80-130 µm; 3 = 100-300 µm) mit Sepharose 4-Partikeln (45-160 µm) beim identischen hIgG-Angebot aus Humanplasma zeigt, daß praktisch keine Unterschiede in der Bindungskapazität und der hIgG-Reduktionsrate bestehen (s. Anspruch 1.1) (s. Ausführungsbeispiele 53-55, 59) (s. Tab. 17).

Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist auch bei höheren Flußraten um durchschnittlich 10% höher als die des Immunosorba Protein A (s. Ausführungsbeispiel 1/C) (s. Tab. 7). Bei einer Flußrate von 2 cm/min wurden die höchsten hIgG-Bindungskapazitäten erzielt. Diese Betriebsbedingung entspricht den Apheresebedingungen mit dem Immunosorba Protein A-System von Excorim in der Klinik.

Zur Überprüfung der chemischen Beständigkeit des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers gegenüber dem Regenerierungmittel wurde 0.5 N NaOH mit dem 80fachen des Gelvolumens wiederholt über die Säule gepumpt. Dazwischen wurde gewaschen (mit Wasser, Apheresepuffer pH 2.2 und pH 7.0) und anschließend die hIgG-Bindung bei Einsatz von Humanplasma bestimmt. Sämtliche Regenerierungszyklen wurden nacheinander mit derselben Adsorber-Säule durchgeführt (s. Ausführungsbeispiel 14/D). Die hIgG- Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers fiel nach 5 Zyklen auf 50%, die des Immunosorba Protein A dagegen auf 25% ab, bezogen auf die Bindungskapazität vor der ersten Regenerierung (s. Tab. 16).

Auf die Bedingungen der Apherese nach Excorim bezogen (7 min regenerieren bei 62.5 ml Adsorber) wurden nach 6 Regenerierungszyklen mit 0,5 M NaOH beim ONB-Sepharose- Protein A-Adorber noch 83% und beim Immunosorba-Adsorber noch 75% der initialen Bindungskapazität beobachtet.

Die Wiederverwendung des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A- Adsorbers erfolgte unter Apherese-ähnlichen Bedingungen bezogen auf die eingesetzte Humanplasma-Menge/ml Gel, die verwendeten Puffer und die Flußrate. Die Verweilzeit des Humanplasmas in der Adsorber-Säule wurde jedoch erheblich verkürzt.

Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers nach 200 Zyklen war praktisch identisch mit der, die nach dem ersten Zyklus ermittelt worden war. Die durchschnittliche hIgG-Bindung aller 200 Zyklen betrug 17.9 ± 0.46 mg hIgG/ml Gel (s. Ausführungsbeispiel 1/D, Tab. 8).

Der als Vergleich unter identischen Bedingungen eingesetzte Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) zeigte mit durchschnittlich 14.2 mg hIgG/ml Gel eine deutlich geringere dynamische hIgG-Bindungskapazität, die auch nach 200facher Wiederverwendung praktisch unverändert blieb.

Das Protein A-Leakage, bestimmt beim 200fachen Wiedereinsatz in den Human-Plasma- Durchlauf- und in den Elutions-Fraktionen, zeigte keine signifikante Veränderung in Abhängigkeit von der Zyklenzahl.

Im Eluat lagen die Leakagewerte des Immunosorba Protein A-Adsorbers über denen des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers (s. Anspruch 9). Die Nachweisgrenze betrug 5 ng Protein A/ml in Gegenwart von Humanplasma und 2 ng/ml in Gegenwart von hIgG (s. Ausführungsbeispiel 1/E, Tab. 9).

Die Bestimmung der Adsorption von zirkulierenden Immunkomplexen erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Rheumatoid arthritis (RA), Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt (s. Ausführungsbeispiele 2/D und 3/D, Tab. 11 und 13).

Beim Einsatz fast aller Plasmen wies der erfindungsgemäße Sepharose 4FF-Protein A- Adsorber höhere Adsorptionen an Immunkomplexen auf und zeigte damit höhere Reduktionsraten im Vergleich zum Protein A-Adsorber von Excorim (s. Anspruch 10).

Die Vorteile der erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorber werden durch folgende Fakten belegt:

  • 1. Der Einsatz von ONB-Carbonat-aktivierten Trägern für die Protein A-Adsorberherstellung hat den Vorteil, daß die aktivierten Träger auf einfache Weise in kürzester Zeit (1-2 h) auch im größeren Maßstab hergestellt werden können, ohne daß die Träger oder Gelstruktur, z. B. bei säureempfindlichen Agarosegelen, dabei verändert wird. Außerdem kann der gewünschte Aktivierungsgrad zielgerichtet zwischen 0.5-30 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel in reproduzierbarer Weise eingestellt werden (s. Anspruch 2 und 3).
  • 2. Die hohe Reaktivität der ONB-Carbonatgruppen ermöglicht bei Einhaltung der gemäß den Ansprüchen 1-4 vorzugsweise anzuwendenden Bedingungen hohe Protein A- Kopplungsausbeuten nach nur 1 h, die bei Protein A-Angeboten von 1-6 mg Protein A/ml Gel ca. 70-100% betragen (bezogen auf das angebotene Protein A) (s. Beispiele 1-7, 9, 11, 12, 17, 32, 42-56). Es können Protein A-Adsorber auf eine äußerst wirtschaftliche Art und Weise hergestellt werden, da das wertvolle Protein A nahezu quantitativ immobilisiert werden kann.

    Der Vergleich mit den erzielten Protein A-Kopplungsausbeuten beim Einsatz von einigen ausgewählten, kommerziell erhältlichen aktivierten Trägern für die Immobilisierung von nativem Protein A (Amersham Pharmacia) gemäß den empfohlenen Kopplungsvorschriften der Hersteller zeigt die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Protein A-Kopplungsprozedur (s. Tab. 3).

    Tabelle 3 Kopplungsausbeuten der Protein A-Immobilisierung bei kommerziellen aktivierten Trägern



  • 3. Die erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorber zeichnen sich durch eine hohe dynamische hIgG-Bindungskapazität aus. In Abhängigkeit von den Kopplungsbedingungen und den hIgG-Bindungsbedingungen ist es möglich, Adsorber mit einer Bindungskapazität von 25-35 mg hIgG/ml Gel herzustellen (siehe Beispiele 1, 2, 7, 13, 15, 16, 24, 28, 29, 33).
  • 4. Unter den hier fixierten Standardbedingungen ist die dynamische Bindungskapazität des Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers für hIgG aus Humanplasma zwar etwas geringer als beim Einsatz von hIgG, das in einem geeigneten Puffer gelöst ist. Sie ist aber (unter den gleichen Bedingungen bestimmt) deutlich höher als z. B. für den in der Apherese eingesetzten Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) (s. Anspruch 10) (s. Tab. 4).

    Tabelle 4 Vergleich der dynamischen Bindungskapazität beim Einsatz von IgG-Lösung bzw. Humanplasma



  • 5. Eine Gegenüberstellung der statischen hIgG-Bindung von erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbern aus Cellulosepartikeln vergleichbarer Partikelgröße mit Sepharose 4FF- Partikeln beim identischen hIgG-Angebot aus Humanplasma zeigt, daß keine Unterschiede in der Bindungskapazität und der hIgG-Reduktionsrate bestehen (s. Anspruch 11).
  • 6. Die erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber gestatten die Anwendung hoher Flußraten, z. B. bis zu 10 cm/min. Auch bei höheren Flußraten besitzen die erfindungsgemäßen Protein A- Adsorber eine höhere hIgG-Bindungskapazität im Vergleich zu dem Immunosorba Protein A- Adsorber (siehe Beispiel 1). So ist z. B. die Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers beim Einsatz von Humanplasma und einer linearen Flußrate von 4 cm/min mit 16.1 mg hIgG/ml Gel höher als die des Immunosorba Protein A- Adsorbers bei einer Flußrate von 2 cm/min (14.9 mg/ml Gel). Das bedeutet bei einem Einsatz in der Apherese, daß die Behandlungszeit der Patienten durch Einsatz der erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber erheblich verkürzt werden kann.
  • 7. Die Immobilisierung über ONB-Carbonatgruppen ermöglicht die Herstellung eines ungewöhnlich stabilen Protein A-Adsorbers. Das Protein A ist wesentlich fester am Träger verankert als z. B. das über CNBr-Aktivierung immobilisierte (z. B. in Protein A-Sepharose CL- 4B, Protein A-Sepharose 4 Fast Flow oder im Immunosorba Protein A): nur 50% des immobilisierten Protein A wird mit 1 N NaOH in 20 h bei 20°C im erfindungsgemäßen Adsorber abgespalten, während unter den gleichen Bedingungen eine 100%ige Abspaltung des über CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelten Protein A erfolgt. [Die Bestimmung des immobilisierten Protein A erfolgte nach Hydrolyse des Protein A vom Träger mit 1 N NaOH (20 h, RT) und mit 2 N NaOH (20 h, 50°C) im Überstand].
  • 8. Die größere Stabilität der Carbamat-Bindung, die nach Kopplung von Liganden an ONB- Carbonat-aktivierte Träger gebildet wird, gegenüber der Isoharnstoff-Bindung, die durch Kopplung an CNBr-aktivierte Träger entsteht, wurde bereits früher eindrucksvoll nachgewiesen durch Baeseler M et al. in J Chromatogr 589 (1992) 93-100. Die sehr stabile Carbamat- Bindung, über die das Protein A an die Matrix gebunden ist, bewirkt ein sehr geringes Protein A-Leakage (bestimmt mit Hilfe eines ELISA im Überstand des Protein A-Adsorbers).

    Aus den Vergleichen des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers mit Protein A-Adsorbern, die durch Immobilisierung von Protein A an CNBr-aktivierte Sepharose hergestellt wurden, ist ersichtlich, daß das-Protein A-Leakage (s. Anspruch 9)
    • a) nach Lagerung der Protein A-Adsorber als Suspension in Puffer pH 7.0 und pH 2.2 jeweils für 1 Monat bei 4°C,
    • b) nach wiederholtem Schütteln der Protein A-Adsorber mit PBS pH 7.2 und Borat-Puffer pH 9.3 für jeweils 24 h bei Raumtemperatur, sowie
    • c) beim wiederholten Einsatz der Protein A-Adsorber für die hIgG-Bindung aus Humanplasma unter Einsatz chromatographischer Säulen (Bedingungen analog zur Apherese)
    beim erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A-Adsorber immer niedriger ausfiel. Damit wird dessen größere Stabilität gegenüber dem Immunosorba Protein A-Adsorber belegt.
  • 9. Aufgrund der hohen Stabilität der Bindung zwischen Protein A und Matrix ist für die erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber beim Wiedereinsatz für die hIgG-Bindung eine Regenerierung des Adsorbers mit Puffern/Lösungen von pH 2-14 möglich, ohne daß die hIgG- Bindungskapazität abnimmt (s. Beispiel 13, Tab. 15).
  • 10. Die Regenerierung des erfindungsgemäß hergestellten Adsorbers kann mit 0.5 N NaOH erfolgen. Auf die Bedingungen der Apherese nach Excorim bezogen (7 min regenerieren bei 62.5 ml Adsorber) werden nach 6 Regenerierungszyklen mit 0,5 M NaOH beim ONB- Sepharose 4FF-Protein A-Adorber noch 83% und beim Immunosorba Adsorber noch 75% der initialen Bindungskapazität beobachtet (s. Beispiel 14/D, Tab. 16).
  • 11. Beim 200fachen Wiedereinsatz des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers unter Verwendung von Humanplasma unter Apherese-analogen Bedingungen wurde keine Abnahme der hIgG-Bindung/ml Gel festgestellt; die hIgG-Recovery (bestimmt mit dem Tina Quant Assay von Roche Diagnostics) betrug durchschnittlich 97±3% (s. Beispiel 1, Tab. 8).
  • 12. Selbst nach einer 2jährigen Lagerung des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers bei 4°C in Form einer Suspension in 20% Ethanol oder in Phosphat/Citrat-Puffer+0.1% Thimerosal, pH 7,0, konnte keine Abnahme der hIgG-Bindungskapazität festgestellt werden (s. Beispiel 2).
  • 13. Das im erfindungsgemäßen Protein A-Adsober immobilisierte Protein A zeigt eine hohe hIgG-Bindungseffizienz, die ungefähr mit der vergleichbar ist, die für in Lösung befindliches Protein A beschrieben wurde von Coleman PL et al. in J Chromatogr 512 (1990), p. 357. Während die meisten kommerziell erhältlichen Protein A-Träger für das molare Verhältnis von hIgG : immobilisiertem Protein A Werte von 0,8-1,4 aufweisen, wurden für den erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber in der Regel Werte von 1,4-2,1 gefunden.
  • 14. Beim Einsatz identischer Plasmaproben wurde für den erfindungsgemäßen Sepharose- Protein A-Adsorber eine höhere Adsorption an zirkulierenden Immunkomplexen (C1q-CIC und C3d-CIC) nachgewiesen im Vergleich zum Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) (s. Anspruch 10) (s. Tab. 5).
Tabelle 5 Mittelwerte (±1 SD) der Adsorption von zirkulierenden Immunkomplexen am erfindungsgemäß hergestellten Sepharose-Protein A- bzw. am Immunosorba Protein A-Adsorber



Ausführungsbeispiele

Die erfindungsgemäßen Adsorber, ihre Eignung für die extrakorporale Blutreinigung und das Verfahren für ihre Herstellung sollen anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert werden.

Die Ausführungsbeispiele 1-41 und 56-59 betreffen den Träger Sepharose 4FF, die Beispiele 42-56 Cellulosepartikel von Chisso Corp., Japan.

Beispiel 1 A. Unkatalytische Aktivierung von Sepharose 4 Fast Flow mit Cl-CO-ONB

Der Sepharose-Träger wurde in einer Glassäule vom wäßrigen Medium in Aceton (Wassergehalt ≤0,3%) überführt. Ein Volumen des in Aceton sedimentierten Trägers wurde mit dem halben Volumen der Aktivierungslösung versetzt, hergestellt durch Lösen von Cl-CO-ONB in Aceton (Angebot: 50 mg/ml Gel mit einer Konzentration von 100 mg/ml Aceton). Anschließend wurde die Sepharose-Suspension in einem gut verschlossene Reaktionsgefäß 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler geschüttelt. Danach wurde das Gemisch auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben. Man läßt die Aktivierungslösung abtropfen und wäscht danach gründlich mit Aceton (etwa 5mal mit jeweils einem Volumen bezogen auf das Gelvolumen). Die erhaltene ONB-Carbonat-Sepharose kann in einer gut verschlossenen Laborglasflasche mit PE- oder PP-Dichtung gelagert werden.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,8 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel (mit Hilfe einer HONB-Eichkurve spektralphotometrisch bestimmt nach Boeden HF et al. in Makromol Chem 193 (1992) 865-887).

B. Immobilisierung von Protein A an ONB-Carbonat-aktivierte Sepharose 4FF

100 ml des in Aceton sedimentierten, ONB-Carbonat-aktivierten Sepharose-Gels mit 3,8 µmol aktiven Gruppen/ml Gel wurden auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben und innerhalb von ca. 5 min in Wasser überführt. Das scharf abgesaugte Gel (Wasserstrahlpumpe) wurde in einen Erlenmeyerkolben überführt und mit 50 ml der Protein A-Kopplungslösung versetzt, die durch Lösen von 610 mg Protein A (Amersham Pharmacia) in 50 ml 0,1 M Phosphat + 1 M Natriumsulfat, pH 7,2 (12,2 mg PrA/ml) hergestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler (ca. 100 U/min) geschüttelt. Danach wurde das Gel auf einer Filternutsche mit 5 × 100 ml Kopplungspuffer (KP) und 5 × 100 ml Wasser gewaschen, das abgesaugte Gel in einen Erlenmeyerkolben überführt, 100 ml Blockungslösung (0,1 M Boratpuffer + 1 M Ethanolamin, pH 8.0) hinzugefügt und 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Gel auf einer Filternutsche nacheinander mit 5 × 100 ml KP, 5 × 100 ml Wasser, 10 × 100 ml 0,01 N HCl, 5 × 100 ml Wasser und zum Schluß mit 2 × 100 ml 0,1 M Borat, pH 9,3 gewaschen und 16-24 h mit 500-1000 ml 0,1 M Borat, pH 9,3 geschüttelt. Dann wurde das Gel auf einer Filternutsche abgesaugt und gründlich mit Boratpuffer und Wasser gewaschen und in das Lagerungsmedium (20% Ethanol oder 0,1 M Phosphat/Citrat- Puffer + 0,1% Thimerosal, pH 7,0) überführt und bei 4-6°C gelagert.

Die Bestimmung des immobilisierten Protein A wurde nach Hydrolyse einer Trägerprobe mit 2 N NaOH (20 h bei 50°C unter Schütteln) im Natronlauge-Überstand nach Lowry mit Hilfe einer Protein A-Eichkurve bestimmt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug 4,8 mg Protein A/ml Gel, das entspricht einer Kopplungsausbeute von 79% (bezogen auf die angebotene Protein A-Menge).

C. Bestimmung der dynamischen Human-IgG-Bindungskapazität

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität erfolgte mit verschiedenen Protein A-Adsorber-Chromatographiesäulen unter Einsatz von humanem γ-Globulin (hγ-Globulin, ICN) gelöst in 0,01-0.1 M Phosphat/Citrat/NaCl-Bindungspuffer, pH 7,0 (PCP) (Standard-PCP: 0,06 M + 0,08 M NaCl; über ein 0,2 µm-Membranfilter filtriert) oder von Humanplasma (über ein 0,45 µm- Membranfilter filtriert) bei linearen Flußraten von 1-8 cm/min (Standard-Flußraten für die hIgG-Bindung: 1,4 cm/min für hγ-Globulin-Lösungen und 2 cm/min für Humanplasma). Die hγ- Globulin-Menge wurde im 3- bis 6fachen Überschuß eingesetzt (IgG-Konzentration: 5-8 mg/ml Bindungspuffer), bezogen auf die hIgG-Bindungskapazität/ml Gel, die angebotene Humanplasma-Menge betrug ca. 4 ml/ml Gel (IgG-Konzentrationen: ca. 6-8 mg IgG/ml Plasma).

Nach der Bindung des hIgG wurde mit dem Bindungspuffer gewaschen (Standard-Methode: ca. 2 h mit 2,8 cm/min) und anschließend mit Elutionspuffer, pH 2,2 oder 2,0 (EP) (Standard-EP: 0,03 M Citrat-Puffer + 0,15 M NaCl, pH 2,2) das gebundene hIgG eluiert.

Die quantitative hIgG-Bestimmung in den Eluaten wurde entweder direkt spektralphotometrisch bei 280 nm (mit E1% = 13,8 berechnet) und/oder nach Neutralisation mit 0,5 M di- Kaliumhydrogenphosphat mit Hilfe des Tina-Quant-Assays (Roche Diagnostics) immunoturbidimetrisch bestimmt.

Für die Ermittlung der hIgG-Bindungskapazität wurden folgende 4 Varianten (weiter unten als C1, C2, C3 und C4 bezeichnet) mit unterschiedlichen Chromatographie-Säulen aus Glas oder PP verwendet:

  • 1. Omnifit-Säule (5,0.0,3 cm I. D.; ca. 350 µl Gel); Fa. Omnifit Limited, UK
  • 2. ECONO-Säule (5,1.1,0 cm I. D.; ca. 4,0 ml Gel); Fa. Bio-Rad, USA
  • 3. ECO-Säule (3,2.5,0 cm I. D.; ca. 62,5 ml Gel); Fa. KronLab, Deutschland
  • 4. ECONO Pac-Säule (17.1,5 cm I. D., ca. 3,0 ml Gel); Bio-Rad, USA

Als Chromatographie-System wurde ein BioLogic LP System (Bio-Rad) oder ein ÄKTA FPLC- System (Amersham Pharmacia) verwendet; für die 62,5 ml Gel-Säulen wurde eine Masterflex- Schlauchpumpe eingesetzt. Die verwendeten Puffer wurden generell sterilfiltriert und entgast (Degasser).

I. hIgG-Bindungskapazität bestimmt unter Standardbedingungen

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität unter Standardbedingungen (siehe oben) für den gemäß B hergestellten Protein A-Adsorber ergab folgende Werte: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß)

Nach C1: 23,6 mg hIgG/ml Gel

Nach C2: 23,5 mg hIgG/ml Gel

Nach C3: 24,5 mg hIgG/ml Gel Mit hγ-Globulin (6facher Überschuß):

Nach C1: 34,5 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,6facher hIgG-Überschuß):

Nach C2: 18,0 mg hIgG/ml Gel

II. hIgG-Bindungskapazität in Abhängigkeit von der Humanplasma-Menge

Die Bestimmung erfolgte nach Variante C2 mit einer linearen Flußrate von 2 cm/min. Der Gehalt an hIgG/ml Humanplasma betrug: 5,7 mg IgG. Nach dem Auftragen des Humanplasmas wurde der Protein A-Adsorber (4 ml Gel) mit 40 ml PCP gewaschen, mit 48 ml EP pH 2,2 eluiert und danach wieder mit 32 ml PCP gewaschen.

Als Vergleich für den erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorber wurde der Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) unter gleichen Bedingungen getestet.

Ergebnis

Die Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist beim Einsatz von 4,2 ml Humanplasma/ml Gel um 13% höher als die des Immunosorba Protein A-Adsorbers.

Die detaillierten Ergebnisse der Bindungsversuche sind in der Tabelle 6 dargestellt.

III. hIgG-Bindungskapazität in Abhängigkeit von der Flußrate

Die Bestimmung erfolgte wie unter II. beschrieben (siehe oben). Es wurde generell 4,2 ml Humanplasma/ml Gel (= 16,8 ml/4 ml Gel) eingesetzt. Die Flußraten wurden von 2-8 cm/min variiert. Für das Auftragen des Plasmas, für Waschen und Elution wurde stets die gleiche Flußrate verwendet.

Als Vergleich wurde der Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) unter gleichen Bedingungen getestet. Tabelle 6 Abhängigkeit der hIgG-Bindungskapazität von dem Angebot an Humanplasma



Ergebnis

Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist auch bei höheren Flußraten um durchschnittlich 10% höher als die des Immunosorba Protein A.

Die erzielten Resultate sind in der Tabelle 7 zusammengefaßt. Tabelle 7 Einfluß der Flußrate auf die hIgG-Bindungskapazität



D. 200fache Wiederverwendung des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers, hergestellt gemäß B, für die hIgG-Bindung aus Humanplasma

Die Wiederverwendung des Protein A-Adsorbers erfolgte unter Apherese-ähnlichen Bedingungen (wie von Excorim für die Verwendung des Immunosorba Protein A beschrieben), bezogen auf das eingesetzte Humanplasmavolumen/ml Gel, die verwendeten Puffer und die Flußrate.

Die Verweilzeit des Humanplasmas in der Adsorber-Säule wurde jedoch erheblich verkürzt (auf ca. 1,4 min = 20% der normalerweise in der Apherese angewendeten Zeit). Die Zeit für das Aufgeben des Plasmas und das anschließende Waschen mit pH 7,0-Puffer betrug ≈ 5 min/Zyklus.

Chromatographie-Bedingungen
  • - Säule: ECONO (0,64.1,0 cm I. D.; 0,5 ml Gel)
  • - Humanplasma-Angebot: 2,1 ml/Zyklus (d. h. 4,2 ml/ml Gel)
  • - hIgG-Gehalt/ml Plasma: ≈ 8 mg/ml
  • - Waschpuffer: PA pH 7,0 (Apherese-Puffer von Excorim)
  • - Elutionspuffer: PA pH 2,2 (Apherese-Puffer von Excorim)
  • - Flußrate: 2 cm/min
  • - Detektor: UV280 nm-Durchflußzelle
  • - Temperatur: 20-25°C
  • - Standard-Zyklus: 2,1 ml Plasma (Auftragen), 5 ml PA pH 7,0 (Waschen), 6 ml PA pH 2,2 (Elution), 4 ml PA pH 7,0 (Waschen); Durchlauf-Fraktion: 8 ml; Elutions-Fraktion: 7 ml; Gesamtzeit pro Zyklus: ≈ 11 min
Ergebnis

Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers nach 200 Zyklen war praktisch identisch mit der, die nach dem ersten Zyklus ermittelt worden war. Die durchschnittliche hIgG-Bindung aller 200 Zyklen betrug 17,9 ± 0,46 mg hIgG/ml Gel. Für die Berechnung der prozentualen hIgG-Bindung in Abhängigkeit von der Zyklenzahl wurde die Bindungskapazität von 18,0 mg hIgG/ml Gel für Zyklus 1 = 100% gesetzt (s. Tab. 8).

Der unter gleichen Bedingungen eingesetzte Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) zeigte mit durchschnittlich 142 mg IgG/ml Gel eine deutlich geringere hIgG-Bindungskapazität. Tabelle 8 hIgG-Bindungskapazität (in % des Ausgangswertes) in Abhängigkeit von der Anzahl der Zyklen der Wiederverwendung



E. Bestimmung des Protein A-Leakage während der IgG-Bindung und -Elution

Die Bestimmung erfolgte in den Humanplasma-Durchlauf-Fraktionen und in den Elution- Fraktionen (nach vorheriger Neutralisation mit 0,5 M di-Kaliumhydrogenphosphat) beim 200fachen Wiedereinsatz (s. unter D) mit Hilfe eines ELISA's.

ELISA-Bedingungen

Mikrotiterplatte MaxiSorp (Nunc, 96 wells); primärer Antikörper: rabbit anti-protein A IgG fraction (Sigma); sekundärer Antikörper: biotinylated monoclonal anti-protein A (Sigma); Enzym- Konjugat: streptavidin alkaline phosphatase conjugated (Calbio-chem); Substrat: Sigma Fast 4- nitrophenylphosphate tablet sets; Reader-Messung: 405 nm nach 15 min bei RT.

Die quantitative Bestimmung von Protein A in den ausgewählten, entsprechend verdünnten Fraktionen wurde mit Hilfe einer Eichkurve von Protein A (1-20 ng/ml) in Gegenwart von entsprechend verdünntem Humanplasma für die Durchlauf-Fraktionen oder in Gegenwart von 0,3 mg/ml Human IgG (Sigma) für die entsprechend verdünnten Elutions-Fraktionen durchgeführt (Regression 2. Ordnung mit r2 = 1.00; CV% = 1-5).

Die Nachweisgrenze beträgt 5 ng Protein A/ml in Gegenwart von Humanplasma und 2 ng/ml in Gegenwart von hIgG.

Ergebnis

Es wurde keine signifikante Veränderung des Protein A-Leakage in Abhängigkeit von der Zyklenzahl festgestellt. Die durchschnittlichen Protein A-Leakagewerte wurden in ng Protein A/ml Plasma oder in ng Protein A/mg eluiertes hIgG (häufigste Angabeform in der Literatur) angegeben. Als Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden die Leakagewerte für den Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) in analoger Weise bestimmt (s. Tab. 9). Tabelle 9 Protein A-Leakagewerte in Durchlauf- bzw. Elutions-Fraktionen der 200fachen Wiederverwendung



Beispiel 2 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 30 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 60 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 2,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 12,6 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 50 ml Gel und 25 ml Protein A-Kopplungs-Lösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,4 mg Protein A/ml Gel (70% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Ge Mit hγ-Globulin (5facher Überschuß):

Nach C2: 31,8 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,5facher hIgG-Überschuß):

Nach C2: 18,7 mg hIgG/ml Gel

Die Abhängigkeit der hIgG-Bindung und prozentualen Reduktion der hIgG-Spiegel vom Angebot an Plasma-hIgG wurde durch Einsatz verschiedener pathologischer Plasmen parallel mit dem erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF- und Immunosorba Protein A-Adsorber ermittelt.

Es besteht ein deutlicher Unterschied der pro ml Gel gebundenen hIgG-Menge und der hIgG- Reduktion [%] zugunsten des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF- im Vergleich zum Immunosorba Protein A-Adsorber von Excorim (s. Tab. 10). Tabelle 10 Abhängigkeit der hIgG-Bindung und prozentualen Reduktion der hIgG-Spiegel vom Angebot an hIgG in pathologischen Plasmen, ermittelt mit dem erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF- und Immunosorba Protein A-Adsorber



D. Bindung von zirkulierenden Immunkomplexen

Bestimmung der Bindungsfähigkeit des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers für zirkulierende Immunkomplexe (CIC) aus Patientenplasma:

Die Bestimmung erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Rheumatoid arthritis (RA), Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt.

Parallel wurde die Adsorption am Immunosorba Protein A-Adsorber ermittelt. Beim Einsatz fast aller Plasmen wies der erfindungsgemäße Adsorber (Adsorber I) höhere Adsorptionen an Immunkomplexen auf und zeigte damit höhere Reduktionsraten im Vergleich zum Protein A- Adsorber von Excorim (Adsorber II) (s. Tab. 11). Tabelle 11 Reduktion der Plasmaspiegel von C1q- und C3d-CIC durch den erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-(Adsorber I) und durch den Immunosorba Protein A- Adsorber (Adsorber II)



E. Bestimmung des Protein A-Leakage nach wiederholtem Schütteln des gemäß 2/B hergestellten Protein A-Adsorbers mit Puffern

Nach 7maligem Schütteln (in der Regel 1-7 Tage bei RT, jeweils bei Verwendung von frischem Puffer) des Protein A-Adsorber-Gels mit der 10fachen Puffermenge (v/v) wurde das Protein A im Überstand des Gels nach dem letzten Schütteln (24 h) bestimmt. Die Bestimmung erfolgte wie unter Beispiel 1/E angegeben. Die Protein A-Leakagewerte wurden in ng/mg immobilisiertes Protein A angegeben.

Ergebnis

Der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber zeigt ein erheblich geringeres Protein A-Leakage als der Immunosorba Protein A-Adsorber, bei pH 7,2 nur 20%.

Als Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden unter analogen Bedingungen Leakagewerte (schattiert) für den Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) bestimmt. Diese Werte sind in Tabelle 12 angeführt. Tabelle 12 Vergleich der Protein A-Leakagewerte nach 7maligem Schütteln in Puffer



F) Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität nach 2jähriger Lagerung des gemäß 2/B hergestellten Protein A-Adsorbers

Das Protein A-Adsorber-Gel wurde ca. 2 Jahre bei 2-4°C gelagert, wobei das Gel vor der Lagerung mit dem jeweils 10fachen Volumen der folgenden Lagerungslösungen auf einer Filternutsche (Por. 3) gewaschen und dann mit jeweils 2 Vol. dieser Lösungen in eine gut verschlossene Laborglasflasche überführt wurde:

  • a) 20% Ethanol/Wasser (v/v)
  • b) PCP-Bindungspuffer + 0,1% Thimerosal, pH 7,0.

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität erfolgte gemäß Beispiel 1 nach C1 (jeweils mit 3fachem hγ-Globulin-Überschuß).

Die hIgG-Bindungskapazität nach Lagerung betrug danach für

a) 24,9 mg hIgG/ml Gel, b) 25,2 mg hIgG/ml Gel.

Beispiel 3 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 20 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 40 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 1,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,15 mg/ml Gel; Konzentration: 6,3 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 100 ml Gel durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,8 mg Protein A/ml Gel (88% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (2facher Überschuß):

Nach C1: 17,8 mg hIgG/ml Gel Mit hγ-Globulin 1,4facher Überschuß):

Nach C3: 18,6 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,5facher hIgG-Überschuß):

Nach C2: 13,7 mg hIgG/ml Gel

D. Bindung von zirkulierenden Immunkomplexen

Bestimmung der Bindungsfähigkeit des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers für zirkulierende Immunkomplexe (CIC) aus Patientenplasma:

Die Bestimmung erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt.

Parallel wurde die Adsorption am Immunosorba Protein A-Adsorber ermittelt. Beim Einsatz fast aller Plasmen wies der erfindungsgemäße Adsorber (Adsorber I) höhere Adsorptionen an Immunkomplexen auf und zeigte damit höhere Reduktionsraten im Vergleich zum Protein A- Adsorber von Excorim (Adsorber II) (s. Tab. 13). Tabelle 13 Reduktion der Plasmaspiegel von C1q- und C3d-CIC durch den erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-(Adsorber I) und den Immunosorba Protein A-Adsorber (Adsorber II)



E. Bestimmung des Protein A-Leakage nach Lagerung des gemäß B hergestellten Protein A- Adsorbers in Puffern

Der Protein A-Adsorber wurde mit dem 10fachen Vol. an Lagerungspuffer auf einer Filternutsche (Por. 3) gewaschen und dann mit jeweils 5 Vol. dieser Puffer in eine gut verschlossene Laborglasflasche überführt und einen Monat bei 2-4°C gelagert. Das freigesetzte Protein A-Menge wurde im Überstand des Gels nach der Lagerung mit Hilfe eines ELISA's bestimmt. Die Bestimmung erfolgte gemäß Beispiel 1/E. Die Protein A- Leakagewerte wurden in ng/mg immobilisiertes Protein A angegeben. Als Vergleich zum erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden die analog bestimmten Leakagewerte für kommerziell erhältliche Protein A-Adsorber, die durch Immobilisierung von Protein A an CNBr- aktivierte Sepharose hergestellt worden sind, angeführt (schattiert) (s. Tab. 14). Tabelle 14 Leakagewerte von kommerziellen Protein A-Adsorbern im Vergleich mit dem erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A-Adsorber nach Lagerung in unterschiedlichen Pufferlösungen



Ergebnis

Der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber hat mit 7 ng bei pH 7,0 und mit 3 ng bei pH 2,2 die niedrigsten Protein A-Leakagewerte.

Beispiel 4 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 20 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 40 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 1,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,8 mg Protein A/ml Gel (93% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 18,4 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 5 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 10 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 20 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 1,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,1 mg/ml Gel; Konzentration: 6,2 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,5 mg Protein A/ml Gel (81% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 17,7 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 6 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 5 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 10 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 0,6 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,4 mg Protein A/ml Gel (80% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 18,4 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 7 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 12,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,6 mg Protein A/ml Gel (75% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 24,9 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 8 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,2 mg/ml Gel; Konzentration: 10,3 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,1 mg Protein A/ml Gel (50% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 19,4 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 9 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,6 mg Protein A/ml Gel (86% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 14,7 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 10 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 3.3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M MES, pH 6,1, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 1,3 mg Protein A/ml Gel (43% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 6,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 11 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 2,0 mg/ml Gel; Konzentration: 4,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 1,9 mg Protein A/ml Gel (95% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 11,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 12 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 3.3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 1,0 mg/ml Gel; Konzentration: 2,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungsösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 1,0 mg Protein A/ml Gel (100% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 6,8 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 13 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 30 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 60 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 2,6 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6.4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 100 ml Gel durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,1 mg Protein A/ml Gel (65% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin Nach C1 (3facher Überschuß): 23,8 mg hIgG/ml Gel

Nach C2 (3facher Überschuß): 24,4 mg hIgG/ml Gel

Nach C3 (ohne Überschuß): 19,1 mg hIgG/ml Gel Mit hγ-Globulin Nach C1 (6facher Überschuß): 32,8 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,6facher hIgG-Überschuß):

Nach C3: 19,0 mg hIgG/ml Gel

D. hIgG-Bindungskapazität in Abhängigkeit von dem verwendeten Regenerierungs-Medium

Die Regenerierung des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers erfolgte in einer Chromatographie-Säule unter Verwendung verschiedener, häufig eingesetzter Medien im pH- Bereich von 2-14.

Chromatographie-Bedingungen für die hIgG-Bindung
  • - Säule: ECONO (5,1.1,0 cm I. D.; 4,0 ml Gel)
  • - hγ-Globulin-Angebot: 2,7facher Überschuß (relativ zur Bindungskapazität); gelöst in PA pH 7,0 (Konzentration: 8 mg/ml)
  • - Waschpuffer: PA pH 7,0 (Apherese-Puffer von Excorim)
  • - Elutionspuffer: PA pH 2,2 (Apherese-Puffer von Excorim)
  • - Flußrate: 2,8 cm/min
  • - Detektor: UV280 nm-Durchflußzelle
  • - Temperatur: 20-25°C
Bedingungen der Regenerierung

Das Regenerierungs-Medium wurde für 1 h bei RT mit einer Flußrate von 1,4 cm/min (entspricht ca. dem 16fachen des Gelvolumens) über die Säule gepumpt. Danach wurde 20 min mit PA pH 7,0 gewaschen und anschließend die hIgG-Bindungskapazität bestimmt. Sämtliche Regenerierungsversuche wurden nacheinander mit derselben Adsorber-Säule durchgeführt.

Ergebnis

Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers wurde durch die verwendeten Regenerierungs-Medien nicht verändert.

In der Tabelle 15 sind die verwendeten Regenerierungs-Medien und die hIgG-Bindungskapazitäten zusammengestellt. Tabelle 15 Einsatz unterschiedlicher Medien zur Regenerierung des Sepharose 4FF- Protein A- Adsorbers



Beispiel 14 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 20 ml Gel und 10 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,4 mg Protein A/ml Gel (86% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin Nach C2 (3facher Überschuß): 20,3 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (4,2 ml Plasma/ml Gel; 6,5facher hIgG-Überschuß):

Nach C2: 19,1 mg hIgG/ml Gel

D. hIgG-Bindungskapazität in Abhängigkeit vom wiederholten Einsatz nach jeweiliger Regenerierung mit 0.5 N NaOH

Die Regenerierung des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers erfolgte in einer Chromatographie-Säule.

Chromatographie-Bedingungen für die hIgG-Bindung
  • - Säule: ECONO (5,1.1,0 cm I. D.; 3,0 ml Gel)
  • - Humanplasma-Angebot: 4,2 ml/ml Gel; 6,5facher hIgG-Überschuß (relativ zur Bindungskapazität); (hIgG-Konzentration: 9,8 mg/ml)
  • - Waschpuffer: PA pH 7,0 (Apherese-Puffer von Excorim)
  • - Elutionspuffer: PA pH 2,2 (Apherese-Puffer von Excorim)
  • - Flußrate: 2,0 ml/min
  • - Detektor: UV280 nm-Durchflußzelle
  • - Temperatur: 20-25°C
Bedingungen der Regenerierung

Das Regenerierungmittel 0,5 N NaOH wurde für 2 h bei RT mit einer Flußrate von 2 ml/min (= 240 ml; entspricht ca. dem 80fachen des Gelvolumens) über die Säule gepumpt. Danach wurde 5 min mit Wasser, 15 min mit PA pH 2,2 und zum Schluß 15 min mit PA pH 7,0 gewaschen und anschließend die hIgG-Bindung bei Einsatz von Humanplasma bestimmt. Sämtliche Regenerierungszyklen wurden nacheinander mit derselben Adsorber-Säule durchgeführt.

Ergebnis

Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers nahm nach 5 Zyklen lediglich um ca. 50%, die des Immunosorba Protein A dagegen um ca. 75% ab, bezogen auf die Bindungskapazität vor der ersten Regenerierung.

In der Tabelle 16 sind die hIgG-Bindungskapazitäten und die prozentuale Abnahme der hIgG- Bindungskapazität in Abhängigkeit von der Zyklenzahl zusammengestellt. Als Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden die hIgG-Bindungskapazitäten für den Immunosorba Protein A-Adsorber in analoger Weise bestimmt. Tabelle 16 Abhängigkeit der hIgG-Bindungskapazität von der Anzahl der Regenerierungszyklen



Beispiel 15 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,8 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 8,2 mg/ml Gel; Konzentration: 16,4 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,1 mg Protein A/ml Gel (50% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 28,4 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 16 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) 2 h bei RT aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 8,2 mg/ml Gel; Konzentration: 16,4 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,9 mg Protein A/ml Gel (48% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 26,6 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 17 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 16 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 4,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 4,1 mg/ml Gel; Konzentration: 8,2 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,9 mg Protein A/ml Gel (71% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 18,6 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 18 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 40 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 80 mg/ml Aceton) aktiviert. Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,0 µmol ONB- Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Phosphat + 0,5 M K2SO4, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,8 mg Protein A/ml Gel (60% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 24,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 19 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 18 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 3,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 12,6 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,7 mg Protein A/ml Gel (59% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 23,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 20 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) 2 h bei RT in getrocknetem Aceton (Wassergehalt: ≤0.01%) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,2 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,8 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,5 mg Protein A/ml Gel (75% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 22,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 21 A. Basenkatalysierte Aktivierung von Sepharose 4 Fast Flow mit Cl-CO-ONB

Sepharose 4FF (zuvor überführt in getrocknetes Aceton) wurde gemäß DD 279486 mit 8 mg Cl- CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 8 mg/ml Aceton) in trockenem Aceton (Wassergehalt: ≤0,01%) in Gegenwart von Triethylamin (TEA) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) bei einem Molverhältnis von Cl-CO-ONB : TEA : DMAP von 1,0 : 1.2 : 0,1 aktiviert. Dazu wurde das Amin- Gemisch in trockenem Aceton unter Schütteln oder Rühren (z. B. mit einem Schwimm- Magnetrührer) zur Gelsuspension innerhalb von 2-5 min zugetropft und weitere 20 min unter Ausschluß von Luftfeuchtigkeit auf einem Kreisschüttler bei RT geschüttelt. Anschließend wird das aktivierte Gel auf einer Filtemutsche (Por. 3) gründlich mit Aceton gemäß Beispiel 1/A gewaschen.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,4 mg/ml Gel; Konzentration: 10,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Phosphat + 3 M NaCl, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,0 mg Protein A/ml Gel (60% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 17,2 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 22 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,1 mg/ml Gel; Konzentration: 5,1 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,4 mg Protein A/ml Gel (47% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 15,2 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 23 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 11,8 mg/ml Gel; Konzentration: 23,6 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,8 mg Protein A/ml Gel (32% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 20,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 24 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 15 mg Cl-CO-ONB/mi Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 11,3 mg/ml Gel; Konzentration: 11,3 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,0 mg Protein A/ml Gel (44% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 25 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 24 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 10,1 mg/ml Gel; Konzentration: 10,1 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M HEPES, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,9 mg Protein A/ml Gel (49% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 23,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 26 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 24 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,1 mg/ml Gel; Konzentration: 12,2 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,8 mg Protein A/ml Gel (63% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 18,2 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 27 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 24 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 10,1 mg/ml Gel; Konzentration: 20,2 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat, pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,1 mg Protein A/ml Gel (31% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 8,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 28 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 17 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 12,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 12,2 mg/ml Gel; Konzentration: 20,4 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M MOPS + 1 M Na2SO4, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,8 mg Protein A/ml Gel (39% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 29 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 28 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 12,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 10,0 mg/ml Gel; Konzentration: 20,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,6 mg Protein A/ml Gel (46% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin Nach C1 (3facher Überschuß): 24,1 mg hIgG/ml Gel

Nach C2 (6facher Überschuß): 34,4 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (8,4 ml Plasma/ml Gel; 4,5facher hIgG-Überschuß):

Nach C2 (bei 1 cm/min): 22,7 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 30 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 30 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert. Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 7,8 mg/ml Gel; Konzentration: 15,6 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat + 1 M NaCl, pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,1 mg Protein A/ml Gel (52% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 23,2 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 31 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 30 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat, pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,2 mg Protein A/ml Gel (50% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 19,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 32 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 35 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 24 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,5 M MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,8 mg Protein A/ml Gel (92% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 16,9 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 33 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 32 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 24 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 12,0 mg/ml Gel; Konzentration: 20,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat + 1 M Na2SO2, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,6 mg Protein A/ml Gel (30% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 24,7 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 34 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 40 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,4 mg/ml Gel; Konzentration: 5,4 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Borat, pH 9.3, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,3 mg Protein A/ml Gel (61% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 11,4 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 35 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 34 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,3 mg/ml Gel; Konzentration: 5,3 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,0 mg Protein A/ml Gel (94% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 9,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 36 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 34 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 6,3 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Phosphat/Citrat, pH 5,1, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,1 mg Protein A/ml Gel (81% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 12,7 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 37 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 34 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,5 mg/ml Gel; Konzentration: 5,5 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat, pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,2 mg Protein A/ml Gel (95% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 16,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 38 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 40 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 29 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 4,2 mg/ml Gel; Konzentration: 4,2 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,7 mg Protein A/ml Gel (92% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 5,9 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 39 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,6 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,0 mg Protein A/ml Gel (95% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 12,8 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 40 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 39 aktiviert.

Aktivierungsgrad: 37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,6 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat + 1 M Na2SO4, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,1 mg Protein A/ml Gel (48% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (3facher Überschuß):

Nach C1: 13,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 41 A. Basenkatalysierte Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 150 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 56 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 12,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,5 mg Protein A/ml Gel (92% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (5facher Überschuß):

Nach C1: 7,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 57 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,97 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,89 mg Protein A/ml Gel (76,4% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 43/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin 10 ml (1,3facher Überschuß: 17,8 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma 10 ml (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 20,6 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 58 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 2,1 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,15 mg/ml Gel; Konzentration: 6,3 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,2 mg Protein A/ml Gel (69% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 43/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit Humanplasma 10 ml (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 20,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 59 A. Unkatalytische Aktivierung

Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,43 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,66 mg Protein A/ml Gel (72,8% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 43/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 24,1 mg hIgG/ml Gel

Ausführungsbeispiele für Cellulosepartikel Beispiel 42 A. Unkatalytische Aktivierung von Cellulosepartikeln mit Cl-CO-ONB

Cellulosepartikel wurden gemäß Beispiel 1 mit Cl-CO-ONB aktiviert.

Der Cellulose-Träger (Partikelgröße 50-100 µm) wurde in einer Glassäule vom wäßrigen Medium in Aceton (Wassergehalt ≤0,3%) überführt. Ein Volumen des in Aceton sedimentierten Trägers wurde mit dem halben Volumen der Aktivierungslösung versetzt, hergestellt durch Lösen von Cl-CO-ONB in Aceton (Angebot: 50 mg/ml Gel mit einer Konzentration von 100 mg/ml Aceton). Anschließend wurde die Cellulose-Suspension in einem gut verschlossenen Reaktionsgefäß 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler geschüttelt. Danach wurde das Gemisch auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben. Man läßt die Aktivierungslösung abtropfen und wäscht danach gründlich mit Aceton (etwa 5mal mit jeweils einem Volumen bezogen auf das Gelvolumen). Die erhaltene ONB-Carbonat-Cellulose kann in einer gut verschlossenen Laborglasflasche mit PE- oder PP-Dichtung gelagert werden.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A an ONB-Carbonat-aktivierte Cellulose

Die Immobilisierung erfolgte analog zu Beispiel 1B.

5 ml des in Aceton sedimentierten, ONB-Carbonat-aktivierten Cellulose-Gels mit 4,3 µmol aktiven Gruppen/ml Gel wurden auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben und innerhalb von ca. 5 min in Wasser überführt. Das scharf abgesaugte Gel wurde in einen Erlenmeyerkolben überführt und mit 2,5 ml der Protein A-Kopplungslösung versetzt (12,8 mg Protein A pro ml Kopplungspuffer 0,1 M Phosphat + 1 M Natriumsulfat, pH 7,2). Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler (ca. 100 U/min) geschüttelt. Danach wurde das Gel auf einer Filternutsche mit 5 × 5 ml Kopplungspuffer (KP) und 5 × 5 ml Wasser gewaschen, das abgesaugte Gel in einen Erlenmeyerkolben überführt, 5 ml Blockungslösung (0,1 M Boratpuffer + 1 M Ethanolamin, pH 8,0) hinzugefügt und 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Gel auf einer Filternutsche nacheinander mit 5 × 5 ml KP, 5 × 5 ml Wasser, 10 × 5 ml 0,01 N HCl, 5 × 5 ml Wasser und zum Schluß mit 2 × 5 ml 0,1 M Borat, pH 9,3 gewaschen und 16-24 h mit 25-50 ml 0,1 M Borat, pH 9,3 geschüttelt. Dann wurde das Gel auf einer Filternutsche abgesaugt und gründlich mit Boratpuffer und Wasser gewaschen und in das Lagerungsmedium (20% Ethanol oder 0,1 M Phosphat/Citrat-Puffer + 0,1% Thimerosal, pH 7,0) überführt und bei 4-6°C gelagert.

Die Bestimmung des immobilisierten Protein A wurde nach Hydrolyse einer Trägerprobe mit 2 N NaOH (20 h bei 50°C unter Schütteln) im Natronlauge-Überstand nach Lowry mit Hilfe einer Protein A-Eichkurve bestimmt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug 5,7 mg Protein A/ml Gel, das entspricht einer Kopplungsausbeute von 89,1% (bezogen auf die angebotene Protein A-Menge).

C. Bestimmung der statischen hIgG-Bindungskapazität

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität erfolgte unter Einsatz von humanem γ-Globulin (hγ-Globulin, ICN), gelöst in 0,01-0,1 M Phosphat/Citrat/NaCl-Bindungspuffer, pH 7,0 (PCP) (Standard-PCP: 0,06 M + 0,08 M NaCl, über ein 0,2 µm-Membranfilter filtriert) oder von Humanplasma (über ein 0,45 µm-Membranfilter filtriert). Die Menge an hγ-Globulin als auch an angebotenem hIgG im Humanplasma wurde im 1,3-1,6fachen Überschuß eingesetzt, bezogen auf die hIgG-Bindungskapazität/ml Gel (hIgG-Konzentration: ca. 8 mg/ml Bindungspuffer und hIgG-Konzentration ca. 8 mg hIgG/ml Plasma). Das Volumen betrug jeweils 10 ml/3 ml Gel.

Die Adsorption erfolgte im Batchversuch während 30 min unter Rotation (5 rpm) bei Einsatz von 3 ml Adsorber.

Die quantitative Bestimmung des hIgG im Überstand erfolgte mit dem Tina-Quant-Assay (Roche Diagnostics) immunoturbidimetrisch.

Für die Ermittlung der statischen hIgG-Bindungskapazität wurden unterschiedliche Chromatographie-Säulen aus Glas oder PP verwendet:

ECONO-Säule (5,1.1,0 cm I. D.; ca. 4,0 ml Gel); Fa. Bio-Rad, USA (C3)

ECONO Pac-Säule (17.1,5 cm I. D., ca. 3,0 ml Gel); Bio-Rad, USA (C4).

Unter diesen Standardbedingungen ergaben sich folgende Werte für die hIgG- Bindungskapazität an der 3 ml Cellulosesäule (C4): Mit hγ-Globulin 10 ml (1,3facher Überschuß): 20,2 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma 10 ml (1,3facher Überschuß): 22,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 43 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 80-130 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12.8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,8 mg Protein A/ml Gel (90,6% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 19,3 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 22,6 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 44 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,6 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,3 mg Protein A/ml Gel (98,4% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 18,6 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 21,6 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 45 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 25-55 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 m) Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,1 mg Protein A/ml Gel (95,6% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 16,3 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 19,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 46 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 50-100 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,15 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2,0 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,93 mg Protein A/ml Gel (100% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 14,2 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 18,6 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 47 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 80-130 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,03 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,47 mg Protein A/ml Gel (100% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 13,6 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 17,5 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 48 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 7,25 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,95 mg Protein A/ml Gel (93% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 12,3 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 16,7 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 49 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 25-55 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 8,37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,28 mg Protein A/ml Gel (98% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 10,7 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 16,3 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 50 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,79 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,25 mg Protein A/ml Gel (97,7% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 11,7 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 18,0 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 51 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,51 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,78 mg Protein A/ml Gel (90,3% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 15,1 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 19,8 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 52 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,79 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,0 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,4 mg Protein A/ml Gel (88,0% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit hγ-Globulin (1,3facher Überschuß):

Nach C4: 10,9 mg hIgG/ml Gel Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 14,73 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 53 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 50-100 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,30 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,72 mg Protein A/ml Gel (89,4% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 23,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 54 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 80-130 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,34 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,81 mg Protein A/ml Gel (90,8% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 23,1 mg hIgG/ml Gel

Beispiel 55 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,59 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,29 mg Protein A/ml Gel (98,3% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 21,6 mg hIgG/ml Gel

Aus den Beispielen 53-55 und 59 ergeben sich die in Tab. 17 zusammengestellten Bindungskapazitäten für die erfindungsgemäß hergestellten Cellulose- und Sepharose 4FF- Protein A-Adsorber. Tabelle 17 Statische hIgG-Bindung und prozentuale Reduktion der hIgG-Spiegel beim Angebot an Plasma-hIgG, ermittelt mit den erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbern aus Cellulose- und Sepharose 4FF-Partikeln



Beispiel 56 A. Unkatalytische Aktivierung

Cellulosepartikel (Größe 25-55 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,55 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.

B. Immobilisierung von Protein A

Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP) wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.

Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,10 mg Protein A/ml Gel (95,3% Kopplungsausbeute).

C. hIgG-Bindungskapazität des Protein A-Adsorbers

Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.

Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach: Mit Humanplasma (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):

Nach C4: 20,4 mg hIgG/ml Gel Abkürzungsverzeichnis CIC zirkulierende Immunkomplexe

Cl-CO-ONB N-Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid

DMAP 4-Dimethylaminopyridin

EP Elutionspuffer: 0,03-0,05 M Citrat + 0,15 M NaCl, pH 2,2

FF Fast Flow

FMP Fluormethyl-pyridinium-toluensulfonat

HEPES N-(2-Hydroxymethyl)-piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)

hγ-Globulin humanes γ-Globulin

hIgG humanes Immunglobulin G

HONB N-Hydroxy-5-Norbornen-2.3-dicarboximid

IgG Immunglobulin G

KP Kopplungspuffer: 0,1 M Natriumphosphat + 1 M Na2SO4, pH 7,2

MES 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure

MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure

NHS N-Hydroxysuccinimid

ONB-Carbonat N-(5-Norbornen-2,3-dicarboximidyl)-carbonat

PA pH 7.0 Apherese-Bindungspuffer der Fa. Excorim: Na2HPO4 + KH2PO4 + Na-Citrat + Natriumacetat + NaCl

PA pH 2.2 Apherese-Elutionspuffer der Fa. Excorim = Elutionspuffer

PE Polyethylen

PCP Bindungspuffer: 0,01-0,1 M Phosphat/Citrat + 0,07-0,15 M NaCl, pH 7,0-7,4

PP Polypropylen

PrA Protein A

rProtein A rekombinantes Protein A

RT Raumtemperatur

Seph. Sepharose

TEA Triethylamin

Vol. Volumen/Volumina


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Herstellung von Adsorbern für die extrakorporale Blutreinigung, dadurch gekennzeichnet, daß zum Erreichen einer hohen Bindungskapazität zum humanen Immunglobulin G (hIgG) ONB-Carbonat-aktivierte Träger mit relativ niedrigem Aktivierungsgrad mit Protein A, in hohen Konzentrationen gelöst in stark salzhaltigen Puffern, umgesetzt werden.
  2. 2. Verfahren der Herstellung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach unkatalytischer Aktivierung der Aktivierungsgrad der Träger zwischen 0,5 bis 30 µmol/ml Gel, vorzugsweise zwischen 0,5 bis 5 µmol/ml Gel, liegt.
  3. 3. Verfahren der Herstellung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach basenkatalytischer Aktivierung der Aktivierungsgrad der Träger zwischen 0,5 bis 60 µmol/ml Gel, vorzugsweise zwischen 0,5 bis 5 µmol/ml Gel, liegt.
  4. 4. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein A in Konzentrationen von 3 bis 20 mg/ml Kopplungspuffer, vorzugsweise von 10 bis 20 mg/ml, verwendet wird, wobei vorzugsweise 0,5 Vol. Kopplungspuffer pro 1,0 Vol.Träger eingesetzt werden.
  5. 5. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß relativ konzentrierte Puffer (z. B. 0,5 bis 1 M Citrat-, Phosphat-, MOPS-Puffer) von pH 4 bis pH 10 bzw. verdünnte Puffer mit hohen Salzzusätzen (z. B. 1 bis 3 M NaCl, 0,5 bis 1,0 M Na2SO4 oder K2SO4) eingesetzt werden.
  6. 6. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit ONB-Carbonat aktivierbare Träger, vorzugsweise Sepharosen, eingesetzt werden.
  7. 7. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit ONB-Carbonat aktivierbare Träger, vorzugsweise cross-linked Agarosen, eingesetzt werden.
  8. 8. Verfahren der Herstellung von Adsorbern nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit ONB-Carbonat aktivierbare Träger, vorzugsweise Cellulosen, eingesetzt werden.
  9. 9. Adsorber nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung von vorzugsweise Sepharose 4FF chemisch stabile Adsorber mit einem sehr geringen Protein A-Leakage hergestellt werden können.
  10. 10. Adsorber nach den Ansprüchen 1 bis 9 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung von Sepharose 4FF Adsorber mit hohen Bindungskapazitäten für humanes Immunglobulin G und für zirkulierende Immunkomplexe hergestellt werden können.
  11. 11. Adsorber nach den Ansprüchen 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung von Cellulosepartikeln vergleichbare Bindungskapazitäten für humane Immunglobuline wie beim Sepharose 4FF-Protein A-Adsorber erreicht werden.






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B Arbeitsverfahren; Transportieren
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G Physik
H Elektrotechnik

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