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Dokumentenidentifikation DE69613200T2 31.10.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0780470
Titel Beta-Fructofuranosidase, seine Herstellung und Verwendungen
Anmelder Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, Okayama, JP
Erfinder Nakada, Tetsuya, Okayama-shi, JP;
Chaen, Hiroto, Okayama-shi, JP;
Sugimoto, Toshiyuki, Okayama-shi, JP
Vertreter Patentanwälte Westphal, Mussgnug & Partner, 78048 Villingen-Schwenningen
DE-Aktenzeichen 69613200
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.12.1996
EP-Aktenzeichen 963086988
EP-Offenlegungsdatum 25.06.1997
EP date of grant 06.06.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.10.2001
IPC-Hauptklasse C12N 9/10
IPC-Nebenklasse C12N 1/20   C12P 19/18   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neuartige β-Fructofuranosidase mit einer relativ hohen fructosidischen Umwandlungsaktivität, ihre Herstellung sowie ihre Verwendung.

Fructosidisch umgewandelte Saccharide, wie z. B. Xylosylfructosid und Lactosucrose, welche durch die Reaktion der Saccharidumwandlung unter Einsatz von β- Fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) oder Fructosyltransferase, die man auf Sucrose oder andere Saccharide als Substrat einwirken lässt, hergestellt werden, besitzen die Eigenschaften einer Schutzwirkung gegen Karies und eine wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien. Daher finden diese Oligosaccharide einige Aufmerksamkeit im Lebensmittel- und Arzneimittel-Bereich.

Die konventionellen, bekannten β-Fructofuranosidasen, welche die fructosidisch umgewandelten Saccharide bilden, sind solche, die aus Mikroorganismen der Gattung Arthobacter sp. K-1 und Bacillus megaterium (IFO 13498) erhalten werden.

"Agricultural and Biological Chemistry", Vol. 54, No.4, pp. 913-919 (1990) beschreibt, dass die β-Fructofuranosidase aus Arthobacter sp. K-1 einen optimalen pH von 6.5-6.8 besitzt. Sie ist jedoch nicht brauchbar, da in diesem pH-Bereich die Reaktion der Braunfärbung der Saccharide bei den Temperaturen, die bei den enzymatischen Reaktionen im industriellen Maßstab eingesetzt werden, leicht einsetzt. Insbesondere ist die Tendenz noch kritischer bei der Reaktion zur Bildung der Fructose, was dann zu einer Überlastung bei den Entfärbungsschritten bei der Reinigung von Sacchariden in Reaktionsmischungen führen kann. Wie in der japanischen Offenlegungsschrift No. 200,386/92 beschrieben wird, hat die β- Fructofuranosidase aus dem Bacillus megaterlum IFO 13498 einen optimalen pH von 6.0. Unter der pH-Bedingung sollten die Reaktionsmischungen weniger stark gefärbt sein. Jedoch ist die optimale Temperatur mit 40-45ºC so tief, dass eine bakterielle Verunreinigung stattfinden kann, wenn die enzymatischen Reaktionen bei diesen Temperaturen durchgeführt werden.

Das japanische Patent No. 530 09 390 beschreibt ein säure- und hitzebeständige β- Fructofuranosidase, die durch Züchten von Corticium Rolfsii in einem Medium, das Sucrose enthält, erhalten wurde. Das Verfahren umfasst die Kultivierung von Corticium Rolfsii in einer Nährlösung, die Sucrose als Kohlenstoffquelle enthält, und das Auffangen des säure- und hitzebeständigen β-Fructofuranosidase Produktes aus der kultivierten Flüssigkeit. Das Produkt β-Fructofuranosidase hat einen optimalen pH-Bereich von 3-5 und kann seine Aktivität, auch nachdem es für drei Stunden bei 30ºC und einem pH von 1.5 gehalten wurde oder für zehn Minuten bei 65ºG und einem pH von 4.0 gehalten wurde, aufrechterhalten. Darüber hinaus behält es 90% seiner ursprünglichen Aktivität, selbst wenn es für 10 Minuten bei 70 ºC und pH 4 gehalten wurde.

Das europäische Patent No. 0 470 331 beschreibt ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung eines Fructose enthaltenden Oligosaccharids, bei der man eine β- Fructofuranosidase, die durch Züchten von Arthobacter sp. K-1 (FERM BP-3192) erhalten wurde, als Enzym auf Sucrose, Raffinose oder Stachyose als Donatoren in Gegenwart einer Aldose oder Ketose als Rezeptoren einwirken ließ. Das Enzym ist charakterisiert durch:

(1) Aktivität gegenüber Sucrose für die glycosidische Umwandlung einer Fructosyl- Gruppe am Rezeptor in Gegenwart eines Monosaccharids, Zuckeralkohols, Alkylalkohols, Glycosids oder Oligosaccharids;

(2) Aktivität zur Zersetzung von Sucrose, Erlose, Neoketose, Xylsucrose, Raffinose und Stachyose bei einer Inaktivität gegenüber einem Saccharid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1-Ketose, Nistose, Inulobiose und Levanbiose;

(3) einen optimalen pH von 6.5 bis 6.8 bei 40ºC mit einer Stabilität bei einem pH von 5.5 bis 10;

(4) eine optimale Temperatur von 55ºC bei einem pH von 6.5, wobei mindestens 70% Restaktivität bei 60ºC aufgezeigt werden;

(5) eine Anfälligkeit für eine Reaktionshemmung durch die Ionen Silber, Quecksilber, Zink, Kupfer und Zinn;

(6) zwei Molekulargewichte von 52,000 ± 2,500 und 58,000 ± 2,500; und

(7) zwei isoelektrische Punkte bei pH 4.3 und pH 4.6.

Die vorliegende Erfindung liefert eine β-Fructofuranosidase, welche eine relativ hohe Aktivität zur fructosidischen Umwandlung besitzt und geeignet ist, im industriellen Maßstab eingesetzt zu werden, ein Verfahren zur Herstellung von fructosidisch umgewandelten Sacchariden unter Einsatz des Enzyms sowie die Verwendung der Saccharide.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sichteten weitläufig Mikroorganismen, die eine neuartige β-Fructofuranosidase bilden, welche eine relativ hohe Aktivität zur Umwandlung von Sacchariden, eine optimale Temperatur und als optimalen pH einen leicht sauren pH, der Saccharide stabilisiert, aufweisen.

Als Resultat fanden sie, dass ein neuartiger Mikroorganismus des Typs Bacillus sp. V320 (FERM BP-5054), der aus einem Nährboden in Okayama, Japan, isoliert wurde, die gewünschte β-Fructofuranosidase bildet, und sie begründeten das Verfahren zur Herstellung von Saccharid-Verbindungen, die fructosidisch umgewandelte Saccharide enthalten, wobei das Verfahren das Einwirken des Enzyms auf Lösungen, die Sucrose und andere Saccharide enthalten und Verbindungen, die diese Saccharid-Verbindungen enthalten, umfasst.

Die Erfindung wird nun ausführlicher unter Bezugnahme auf die lediglich als Beispiel beigefügten Zeichnungen beschrieben, von denen:

Fig. 1 den Einfluss des pH's auf die Aktivität der erfindungsgemäßen β- Fructofuranosidase zeigt.

Fig. 2 den Einfluss der Temperatur auf die Aktivität der erfindungsgemäßen β- Fructofuranosidase zeigt.

Fig. 3 die pH-Stabilität der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase zeigt.

Fig. 4 die thermische Stabilität der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase zeigt.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sichteten in großem Umfang Mikroorganismen, die eine neuartige β-Fructofuranosidase produzieren. Als Resultat isolierten sie einen neuartigen Mikroorganismus, Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054), aus einem Nährboden in Okayama, Japan, der die gewünschte β- Fructofuranosidase bildet.

Gemäß dem Verfahren in "Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei (Classification and Identification of Microorganisms)", herausgegeben von Takeji Hasegawa, veröffentlicht von Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Japan (1985), identifizierten die Erfinder den Mikroorganismus als einen vom Stamm Bacillus und nannten ihn Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054). Die Ergebnisse waren wie folgt:

A. Morphologie

(1) Eigenschaften der Zellen, wenn sie bei 27ºC für einen Tag in einer Agar- Agar-Scheibe mit Fleischextrakt gezüchtet werden:

liegen gewöhnlich in Stäbchenform von 1.0-1.5 · 3.0-7.5 um vor;

liegen in Einzelform vor, jedoch selten liegen sie auch paarweise oder in verknüpfter Form vor;

frei beweglich mit abgerundeten Geißeln;

säurefrei resistent;

gramvariabel;

speichern kein Poly-β-Hydroxybutyrat; und

bilden gelegentlich Endosporen, wenn sie über 4 Tage gezüchtet werden.

(2) Eigenschaften der Zellen, wenn sie bei 27ºC für einen Tag in einer Agar- Agar-Scheibe aus Kartoffel-Extrakt, Pepton und Glucose gezüchtet werden:

liegen gewöhnlich in Stäbchenform von 0.9-1.5 · 2.7-6.0 um vor;

liegen in Einzelform vor, jedoch liegen sie selten paarweise oder in verknüpfter Form vor;

freie Beweglichkeit: positiv;

gramvariabel;

bilden Endospore;

bilden in den Ecken der Zelle Sporen ohne anzuschwellen; und

Sporengröße: 0.8-1.0 · 1.0-1.6 m in ovaler Form;

bilden Sporen auch wenn sie in einem Nährboden-Extrakt gezüchtet werden.

B. Eigenschaften der Kultur

(1) Eigenschaften der Kolonie, die durch eine Züchtung bei 27ºC in einer Agar- Agar-Scheibe aus Fleisch-Extrakt gebildet wird:

Form: ringförmige Kolonie mit einem ca. 1.0-1.5 mm Durchmesser, wenn sie für einen Tag gezüchtet wurde, und mit einem ca. 1.5-3 mm Durchmesser, wenn sie für 3 Tage gezüchtet wurde;

Rand: vollständig;

Projektion: gewellt;

Glanz: stumpfer Glanz;

Oberfläche: eben oder Warzenform;

Transparenz: halbtransparent oder opak; und

Farbe: Creme;

(2) Eigenschaften der Kolonie, die durch eine Züchtung bei 27ºC in einer schiefen Ebene aus Agar-Agar mit Fleischextrakt gebildet wird:

Wachstum: gut;

Form: fadenförmig; leicht vorspringend; ebene Oberfläche; feuchter Glanz oder stumpfer Glanz; halbtransparent; und sahnig; und

(3) verflüssigt keine Gelatine, wenn sie bei 27ºC in Gelatine mit Fleisch-Extrakt gezüchtet wird

C. Physiologischen Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: positiv

(2) Denitrifikationsreaktion: negativ

(3) Methylrot-Test: negativ

(4) VP-Test: negativ

(5) Bildung von Indol: negativ

(6) Bildung von Wasserstoffsulfid: negativ

(7) Hydrolyse von Stärke: positiv

(8) Hydrolyse von Casein: negativ

(9) Speichern von Poly-β-Hydroxybutyrat: negativ

(10) Hydrolyse von Procatecsäure: negativ

(11) Verwertung von Zitronensäure: negativ

(12) Verwertung von anorganischen Stickstoff-Quellen: verwertet Ammoniumsalze und Nitrate

(13) Pigmentbildung: negativ

(14) Bildung eines fluoreszierenden Pigments: negativ

(15) Urease: positiv

(16) Oxidase: positiv

(17) Katalase positiv

(18) Wachstumsbedingungen: wächst bei einem pH von 5-8 und einer Temperatur von 15-45 ºC

(19) Sauerstoffbedarf: aero b

(20) Verwertung von Kohlenstoffquellen und Säurebildung

(21) Decarboxylase-Test an Aminosäuren: negativ auf L-Lysin, L- Arginin und L-Ornithin

(22) Verwertung von Aminosäuren: verwertet Natrium-L- Glutamat, Natrium-L- Aspartat, L-Arginin, L-Tryptophan, L-Histidin, L-Valin und D-Alanin

(23) DN-ase: negativ

(24) Bildung von 3-Ketolactose: negativ

(25) Mol-% Guanin (G) und Cytosin (C) von DNA: %

(26) Diaminosäure der Zellwand: Mesodiaminopimelin- säure

Der Mikroorganismus mit diesen bakteriologischen Eigenschaften wurde mit denen der konventionellen, bekannten Mikroorganismen unter Bezugnahme von "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Vol. 2 (1996) verglichen. Als Resultat wurde gezeigt, dass der Mikroorganismus als einer vom Stamm Bacillus identifiziert wurde, weil er Bedarf an Sauerstoff hat und Endosporen bildet, obwohl er gramvariabel ist. Auf Basis dieser Eigenschaften ähnelt der Mikroorganismus denen vom Typ Bacillus megaterium, ist aber von diesen durch die Tatsache unterscheidbar, dass er in den Ecken seiner Zelle innere Sporen bildet, Casein nicht hydrolysiert, keine Zitronensäure verwertet und bei 10ºC nicht wächst.

Auf Basis dieser Daten nannten die Erfinder der vorliegenden Erfindung diesen Mikroorganismus "Bacillus sp. V230" und hinterlegten ihn am 24. März im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, lbaraki, Japan. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde von dem Institut akzeptiert und ist unter der Zugangsnummer FERM BP-5054 aufbewahrt.

Der Mikroorganismus und seine Abkömmlinge können für die vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Jeder Nährboden für Kulturen kann bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, solange die Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, darin wachsen und das erfindungsgemäße Enzym produzieren: Zum Beispiel können synthetische und natürliche Nährböden für Kulturen als Nährböden eingesetzt werden. Jede Kohlenstoff enthaltende Substanz kann bei der vorliegenden Erfindung als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, solange die Mikroorganismen sie verwerten: Zum Beispiel können Saccharide, wie Sucrose, Lactose, Maltose, Dextrin und Stärke, ebenso wie Saccharide enthaltende Produkte, wie Melasse und Hefeextrakte, als Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Konzentrationen dieser Kohlenstoffquellen in den Nährböden werden im einzelnen jeweils in Abhängigkeit von der der Art der Kohlenstoffquelle ausgesucht. Zum Beispiel beträgt im Hinblick auf das Wachstum und die Vermehrung des Mikroorganismus eine empfehlenswerte Konzentration der Sucrose üblicherweise 20 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise 5 Gew.-% oder weniger. Die für die vorliegende Erfindung brauchbaren Stickstoffquellen sind zum Beispiel anorganische, Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Ammoniumsalze und Nitrate; organische, Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Harnstoff, Kornmaische, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Rinderextrakt. Die für die vorliegende Erfindung brauchbaren anorganischen Bestandteile sind zum Beispiel Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate und andere Salze von Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybdän und Kobalt.

Die für die vorliegende Erfindung geeignete Züchtung von Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von üblicherweise 15-45ºC, vorzugsweise 25-37ºC, und einem pH von 5-8, vorzugsweise 5.5-7.5, durchgeführt. Bei der Zeit für die Kultivierung der Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, handelt es sich um eine Zeit, die länger ist als die, die für die Vermehrung der Mikroorganismen benötigt wird, vorzugsweise 5-100 Stunden. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO) im Nährboden für die Kultur ist nicht besonders eingeschränkt, vorzugsweise liegt sie im Bereich von 0.5-20 ppm. Die Konzentration kann in diesem Bereich durch Kontrolle des Belüftungsgrades, Rührgeschwindigkeit, der Menge der Sauerstoffzufuhr und der Erhöhung des inneren Druckes des Gärbehälters gehalten werden. Die Kultivierung wird in Einzelansätzen oder kontinuierlich durchgeführt.

Wenn die Kultur des Mikroorganismus fertiggestellt ist, wird das erfindungsgemäße Enzym aufgefangen. Da die Aktivität des Enzyms in dem von Zellen freien Nährboden der Kultur entdeckt wurde, kann der Nährboden aufgefangen und als rohes Enzym verwendet werden. Auch kann die unversehrte Kultur als rohes Enzym verwendet werden. Konventionelle Flüssig-Fest-Trennmethoden können zur Abtrennung der Zellen von den Kulturen eingesetzt werden. Zum Beispiel können wahlweise Verfahren zum direkten Zentrifugieren der Kulturen und solche zum Filtrieren der Kulturen mit Hilfe von vorbehandelten Filtern oder zum Abtrennen der Zellen über Membranfiltration unter Einsatz eines Flachfilters oder mitlaufenden Fasern eingesetzt werden. Die resultierenden zellfreien Kulturen können unversehrt als rohe Enzym-Lösung und vorteilhaft nach einer Konzentration eingesetzt werden. Geeignete Konzentrationemethoden für die vorliegende Erfindung sind zum Beispiel das Aussalzen unter Einsatz von Ammoniumsulfat, die Sedimentation unter Einsatz von Aceton und/oder Alkohol und die Konzentration unter Einsatz von Membranen wie z. B. einem Flachfilter und mitlaufenden Fasern.

Rohe Enzyme in Form von zellfreien Kulturen und deren Konzentrate können mit konventionellen Methoden fixiert werden, wie z. B. Verschmelzungsverfahren unter Einsatz von Ionenaustauschern, Ausbildung von kovalenten Bindungen und Absorption unter Einsatz von Harzen und/oder Membranen und Einschlussverfahren unter Einsatz von Substanzen mit hohen Molekulargewichten.

Rohe Enzyme können unversehrt oder nach einer Reinigung eingesetzt werden. Zum Beispiel werden zellfreie Kulturen mit Ammoniumsulfat ausgesalzt und die konzentrierten rohen Enzyme werden dialysiert und sukzessive über Anionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von "DEAE- TOYOPEARL®", einem Anionaustauscher, vertrieben durch Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, hydrophobe Säulenchromatographie unter Einsatz von "BUTYL- TOYOPEARL®", einem hydrophoben Harz, vertrieben durch Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, und Anionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von "DEAE-TOYOPEARL®" gereinigt, um ein Enzym-Präparat zu erhalten, das elektrophoretisch ein Einzelproteinband zeigt.

Die erfindungsgemäße β-Fructofuranosidase, die auf diese Weise erhalten wurde, hat die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

(1) Wirkungsweise

Bei der Hydrolyse der fructofuranosidischen Bindung von Zucker, Raffinose und Erlose setzt sie Fructose frei; sie katalysiert den Übergang des β- Fructofuranosyl-Restes von diesen Sachariden als Donatoren, die eine β- fructofuranosidische Bindung aufweisen, zu einem Akzeptor, ausgewählt aus anderen Sacchariden, Zuckeralkoholen und Alkoholen;

(2) Molekulargewicht

49,000 ± 5,000 Daltons über SDS-PAGE;

(3) Isoelektrischer Punkt (pI)

4.6 ± 0.5 über Elektrophorese unter Einsatz von Ampholyten;

(4) optimaler pH

ca. 5.5-6.0, bei einer Inkubation bei 40ºC für 10 Minuten;

(5) optimale Temperatur

ca. 45ºC und ca. 50ºC, bei Abwesenheit bzw. bei Anwesenheit von Calciumionen bei einer Inkubation bei pH 6.0 für 10 Minuten;

(6) pH-Stabilität

ca. 5.0-8.0, bei einer Inkubation bei 4ºC für 24 Stunden;

(7) thermische Stabilität

stabil bis zu ca. 45ºC, bei einer Inkubation bei pH 6.0 für 1 Stunde; und

(8) Reaktionshemmung

Reaktionshemmung tritt bei 1 mM Cu&spplus;&spplus;, Pb&spplus;&spplus;, Fe&spplus;&spplus;, Fe&spplus;&spplus;&spplus; oder Hg&spplus;&spplus; ein.

Die Aktivität der β-Fructofuranosidase gemäß der vorliegenden Erfindung wird wie folgt geprüft: Man gebe 0.2 ml einer Enzym-Lösung zu 5 ml einer wässerigen Lösung (pH 6.0), die aus 1.0 Gew.-% Sucrose, 20 mM Acetat-Puffer, und 5 mM Calciumchlorid besteht. Man kultiviere die Mischung bei 40ºC für 10 Minuten, gebe Somogyi-Kupfer-Lösung zu, um die Reaktion zu unterbrechen, und prüfe die die Reduktionskraft nach der Somogyi-Nelson-Methode. Man nehme zur Kontrolle eine Enzym-Lösung, die bei 100ºC für 10 Minuten vorgeheizt wurde, um das Enzym zu desaktivieren, und prüfe die Reduktionskraft auf die gleiche Art wie oben. Eine Aktivitätseinheit des Enzyms ist definiert als der Anteil Enzym, der die Reduktionskraft um 2 umol Glucose pro Minute anhebt, wenn nach er oben genannten Methode geprüft wird.

Die erfindungsgemäße β-Fructofuranosidase wirkt auf Sucrose, dass sie sich in Glucose- und Fructose-Einheiten zersetzt, bewirkt aber im wesentlichen selbst bei höheren Sucrose-Konzentrationen keine intermolekularen Umwandlungen zwischen den Sucrose-Molekülen und bildet im wesentlichen keine Oligosaccharide mit einem höheren Molekulargewicht als Sucrose. Statt dessen bildet das Enzym Xylolfructosid, Galctosylfructosid, Lactosylfructosid (Lactosucrose), Maltosylfructosid (Erlose) und Isomaltosylfructosid wenn es auf beide einwirkt, Sucrose als Saccharid-Donator und andere Saccharide als ein Akzeptor, wie z. B. reduzierende Saccharide, einschließlich Xylose, Galactose, Lactose, Maltose und Isomaltose, um die fructosidischen Reste auf die reduzierenden Saccharide zu übertragen. Wenn nicht reduzierende Disaccharide, die aus Glucose-Einheiten, wie Trehalose und Neotrehalose, bestehen, als Saccharid-Akzeptor eingesetzt werden, bildet das erfindungsgemäße Enzym Fructosyltrehalose bzw. Fructosyl-Neotrehalose. Zusätzlich zu den Mono- und Disacchariden können höhere Oligosaccharide, wie z. B. Xylooligosaccharide, Galactooligosaccharide, Maltooligosaccharide und Isomaltooligosaccharide sowie Zuckeralkohole, wie z. B. Sorbitol und Maltitol als Akzeptoren eingesetzt werden. Einer oder mehrere dieser Akzeptoren können wahlweise in Kombination eingesetzt werden. Zusätzlich zu Sucrose können andere Oligosaccharide mit β-fructofuranosidischer Bindung, wie z. B. Raffinose und Erlose, als Saccharid-Donatvren eingesetzt werden.

Die Substrat-Konzentration, die bei der fructosidischen Transfer-Reaktion eingesetzt wird, um unter Einsatz der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase Saccharide zu bilden, ist nicht besonders eingeschränkt und eine Konzentration von 10 Gew.-% (die Bezeichnung "Gew.-% " wird als "%" abgekürzt, solange es nicht anders spezifiziert wird) oder mehr, vorzugsweise 20-60%, kann als geeignet eingesetzt werden. Die Reaktionstemperatur, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist eine Temperatur, die das erfindungsgemäße Enzym nicht desaktiviert, d. h. eine Temperatur bis zu ca. 60ºC, vorzugsweise ca. 50-55ºC. Der pH wird auf einen pH von ca. 3.5-8.0, vorzugsweise ca. 4.5-6.5, kontrolliert. Die Reaktionszeit wird wahlweise in Abhängigkeit von den enzymatischen Bedingungen ausgewählt. Üblicherweise wird das erfindungsgemäße Enzym mit einem Gehalt von ca. 0.1-50 Einheiten/g Substrat, gerechnet auf trockner und fester Basis (d.s.b.) und die Reaktionszeit beträgt ca. 0.1-100 Stunden.

Die Ausbeute an fructosidisch umgewandelten Sacchariden variiert in Abhängigkeit von der Substrat-Konzentration, dem Typ des Akzeptors und den Reaktionsbedingungen für das erfindungsgemäße Enzym. Zum Beispiel beträgt die höchste mögliche Ausbeute an Lactosucrose ca. 40%, wenn 20% Sucrose und 20 % Lactose eingesetzt werden.

Die resultierenden Reaktionsmischungen werden filtriert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen auf eine konventionelle Art zu entfernen, und die Mischungen werden durch Entfärbung mit Aktivkohle und Entsalzen mit Ionenaustauschern in H- Form und OH-Form gereinigt. Die gereinigten Lösungen werden zu sirupartigen Produkten konzentriert und nach Bedarf weiterhin zu pulverförmigen Produkten getrocknet.

Um den Anteil an umgewandelten Sacchariden zu erhöhen, werden sie von den Reaktionsmischungen abgetrennt und zu Verbindungen gereinigt, die reich an fructosidisch umgewandelten Sacchariden sind. Die geeigneten Methoden, die zu diesem Zweck eingesetzt werden, umfassen ein Hefe-Fermentations-Verfahren, um die Monosaccharide unter Einsatz einer Invertase-defekten Hefe abzutrennen, eine Methode der Alkali-Behandlung, um die reduzierenden Saccharide durch Erhitzen, nachdem die Reaktionsmischungen alkalisch gemacht wurden, zu zerstören, und ein Trennverfahren, um die verunreinigenden Saccharide durch Membranfiltration und Säulenchromatographie zu entfernen. Insbesondere kann die Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, wie es in den japanischen Patent-Offenlegungsschriften No. 23,799/83 und 72,598/83 beschrieben wird, vorteilhaft im industriellen Maßstab eingesetzt werden, um verunreinigende Saccharide aus den Reaktionsmischungen zu entfernen, um Fraktionen zu erhalten, welche die gewünschten Verbindungen, die mit fructosidisch umgewandelten Sacchariden angereichert sind, enthalten. In diesem Fall kann jede konventionelle Methode, wie Festbett-Methode, Fließbett- Methode und Quasi-Fließbettmethode, eingesetzt werden.

Die von verunreinigenden Sacchariden freien Lösungen werden gefiltert und zentrifugiert, um die Verunreinigungen auf konventionelle Art zu entfernen, und die überstehenden Lösungen werden über Entfärbung unter Einsatz von Aktivkohle und Entsalzen unter Einsatz eines Ionenaustauschers in H- und OH-Form gereinigt und zu sirupartigen Produkten konzentriert. Bei Bedarf können die sirupartigen Produkte durch Versprühen zu pulverförmigen Produkten getrocknet werden.

Üblicherweise enthalten die Saccharid-Verbindungen fructosidisch umgewandelte Saccharide, die mit der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase produziert wurden, zu einem Anteil von 5% oder mehr, bevorzugt 10% oder mehr.

Die Saccharid-Verbindungen, die so erhalten werden, haben die folgenden befriedigenden Eigenschaften: einen guten Geschmack und Süße, die Fähigkeit die Osmose zu kontrollieren, die Fähigkeit Feuchtigkeit festzuhalten oder eine Feuchtigkeit anziehende Wirkung, die Fähigkeit Glanz zu vermitteln, die Fähigkeit die Kristallisation zu verhindern, die Fähigkeit den Zerfall zu verhindern, eine Wirksamkeit gegen Karies, eine wachstumsfördende Wirkung für Bifido-Bakterien und eine Wirkung die Absorption von Mineralien zu fördern. Somit können die Saccharid-Verbindungen wahlweise in Verbindungen eingesetzt werden, wie z. B. Lebensmitteln, Tabak, Zigaretten, Futter, Tiernahrung, Kosmetika, Arzneimitteln, Formkörpern und anderen Produkten, wie z. B. Produkten des täglichen Gebrauchs, landwirtschaftlichen und Fischerei-Produkten, chemischen Reagenzien und Produkten für die chemische Industrie.

Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen, die fructosidisch umgewandelte Saccharide enthalten, können unversehrt als ein Gewürz zum Süßen eingesetzt werden. Bei Bedarf können die Verbindungen zusammen mit adäquaten Anteilen eines oder mehrerer anderer Süßstoffe eingesetzt werden, zum Beispiel pulverisiertem Sirup, Glucose, Maltose, Trehalose, Sucrose, Isomer-Zucker, Honig, Ahornzucker, Sorbitol, Maltitol, Lactitol, Dihydrochalcon, Steviosid, α-Glycosyl- Steviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, Saccharin, Glycin, und Alanin und/oder Füllstoffen, wie Dextrin, Stärke und Lactose.

Da die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen einen Geschmack besitzen, der gut mit anderen Substanzen hamonisiert, die einen säuerlichen, sauren, salzigen, bitteren, zusammenziehenden und wohlschmeckenden Geschmack besitzen können sie wahlweise in Lebensmitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung und Mittel zur Qualitätsverbesserung eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen können als Gewürz für Soja- Sauce, pulverisierte Soja-Sauce, "miso", "funmatsu-miso" (ein pulverisiertes Miso), "moromi" (ein verfeinerte Sake), "hishio" (eine verfeinerte Soja-Sauce), "furikake" (ein gewürztes Fischpulver), Majonnaise, Dressing, Essig, "sanbai-zu" (eine Sauce aus Zucker, Soja-Sauce und Essig), "funmatsu-sushi-zu" (gepulverter Essig für Sushi), "chuka-no-moto" (eine Fertigmischung für chinesisches Essen), "tentsuyu" (eine Sauce für japanisches, in Fett gebratenes Essen), "mentsuyu" (eine Sauce für japanische Fadennudeln), Sauce, Ketchup, "takuan-zuke-no-moto" (eine Fertigmischung für japanischen Rettisch), "hakusai-zuke-no-moto" (eine Fertigmischung für chinesichen Kohl), "yakiniku-no-tare" (eine Sauce für japanisches Grillfleisch), Curry-Mehlschwitze, Instant-Eintopfmischung, Instant-Suppenmischung, "dashi-no-moto" (eine Instant-Vorratsmischung), gemischte Gewürze, "mirin" (ein süßes Sake), "shin-mirin" (ein synthetisches Mirin) und Zucker für den Gebrauch bei Tisch und in Kaffee.

Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen können auch zum Süßen und zur Verbesserung des Geschmacks und der Eigenschaften eingesetzt werden von "wagashi" (japanischer Kuchen), wie z. B. "senbei" (ein Reiskeks), "arare-mochi" (ein würfelförmiger Reiskuchen), "okoshi" (ein Hirse- und Reiskuchen), "mochi" (eine Reispaste), "manju" (ein runder Kuchen (Bun) mit einer Füllung aus Bohnenbrei), "uiro" (ein süßes Reisgelee), "an" (ein Bohnenbrei), "yokan" (ein süßes Bohnengelee), "mizu-yokan" (ein mildes Adzuki-Bohnengelee), "kingyoku" (eine Art Yokan), Gelee, Pao de Castella und "amedama" (ein Karamelbonbon nach japanischer Art); Süßigkeiten wie Bun, Biskuit, Kekse, Plätzchen, Torte, Pudding, Buttercreme, Eiermilch-Creme, Windbeutel, Waffeln, Schaumpudding, Berliner, Schokolade, Kaugummi, Bonbons und Süßigkeiten; gefrorenem Dessert, wie Eiscreme und Sorbet; Sirup, wie z. B. "kajitsu-no-syrup-zuke" (eine konservierte Frucht) und "korimitsu" (ein Zuckersirup für gehobeltes Eis); Pasten, wie z. B. Mehlpaste, Erdnusspaste, Obstbrei und Aufstrich; verarbeiteten Früchten und Gemüse, wie z. B. Marmelade, Konfitüre, "syrup-zuke" (eingelegte Früchte) und "toka" (Konserven); Gurken und eingelegten Produkten, wie z. B. "fukujin-zuke" (rot gefärbte Rettichgurken), "bettara-zuke" (eine Art vollkommen frischer Rettichgurken), "senmai-zuke" (eine Art in Scheiben geschnittener, frischer Rettichgurken) und "rakkyo-zuke" eingelegte Schalotten); Fleischprodukten, wie z. B. Schinken und Wurst; Fischprodukten, wie z. B. Fischschinken, Fischwurst, "kamaboko" (eine gekochte Fischpaste), "chikuwa" (eine Art Fischpaste) und "tenpura" (eine japanische, in Fett gebackene Fischpaste); "chinmi" (Würze), wie z. B. "uni-no- shiokara" (gesalzene Eingeweide der Seegurke), "ika-no shiokara" (gesalzene Eingeweide von Tintenfischen), "su-konbu" (aufbereiteter Tang), "saki-surume" (getrocknete Tintenfisch-Streifen) und "fugu-no-mirin-boshi" (ein getrockneter mit Mirin gewürzter Schwellifisch); "tsukudani" (in Soja-Sauce eingekochte Lebensmittel), wie z. B. solche auf Basis von Tang, essbaren wilden Pflanzen, getrockneter Tintenfisch, Fisch und Schalentiere; Beilagen, wie z. B. "nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalat und "konbu-maki" (eine Tangrolle); Milchprodukten; Produkten in Flaschen und Dosen, wie z. B. solche auf Basis von Fleisch, Fisch, Obst und Gemüse; alkoholischen Getränken, wie z. B. Sake, synthetisches Sake, Wein und Liköre; alkoholfreien Getränke, wie z. B. Kaffee, Tee, Kakao, Saft, kohlensäurehaltige Getränke, Sauermilch-Getränke und Getränke, die Milchsäurebakterien enthalten; Fertiggerichten, wie z. B. Fertigmischungen für Pudding, Fertigmischungen für Pfannkuchen und "sokuseki-shiruko" (eine Fertigmischung für Adzukibohnen-Suppe mit Reiskuchen) und Fertigmischungen für Suppen; und Getränken, wie z. B. Babynahrung, therapeutische Nahrungsmittel, Getränke, die mit Nährstoffen ergänzt sind, verdauungsfördernde Lebensmittel und gefrorene Lebensmittel, sowie zur Geschmacksverbesserung und Verbesserung der Qualität der oben genannten Lebensmittelprodukte.

Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen können darüber hinaus in Futtermitteln und Tiernahrung eingesetzt werden für Tiere, wie z. B. Haustiere, Geflügel und Fische, um deren geschmackliche Vorlieben zu verbessern und das Wachstum der Tiere zu fördern. Diese Verbindungen können wahlweise als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Mittel zum Überdecken des Geschmacks und als Mittel zur Qualitätsverbesserung in anderen Produkten in pastöser oder flüssiger Form eingesetzt werden, wie z. B. Tabak, Zigaretten, Zahnpasta, Lippenstift, Rouge, Lippencreme, inwendige Medizin, Tabletten, Halstabletten, Lebertran in Tropfenform, Katechu, Mundspray, Mundwasser, Kosmetik und Arzneimittel.

Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen können als Mittel zur Qualitätsverbesserung und Stabilisator eingesetzt werden für Lösungen von biologisch aktiven Substanzen, die Gefahr laufen, ihre Wirkstoffe und ihre Aktivitäten zu verlieren, ebenso wie in homöopathischen Lebensmitteln und Arzneimitteln, die biologisch aktive Substanzen enthalten. Beispiele für diese biologisch aktiven Substanzen sind Lymphokine, wie z. B. α- β- und γ-Interferon, Tumor-Nekrosis- Faktor-α, (TNF-α), Tumor-Nekrosis-Faktor-β (TNF-β), Makrophage-Migrations- Inhibitor-Faktor, Anregungsfaktor zur Koloniebildung, Transfer-Faktor und Interleukin-2; Hormone, wie z. B. Insulin, Wachstumshormone, Prolactin, Erythropoietin, Follikel anregende Hormone, und Placenta-Hormone; biologische Präparate, wie z. B. BCG-Impfstoff, Impfstoff gegen japanische Enzephalitis, Masern- Impfstoff, lebend Polio-Impfstoff, Impfstoff gegen Pockenvirus, Tetanus-Toxoid, Habu Venom oder Trimeresurus-Antitoxin und menschliches Immunoglobulin; Antibiotika, wie z. B. Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycin-Sulfat; Vitamine, wie z. B. Thiamin, Riboflavin, L- Ascorbinsäure, Lebertran, Carotenoid, Ergosterol und Tocopherol; Enzyme, wie zB. Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, β-Amylase, Isoamylase, Glucanase, und Lactase; Extrakte, wie z. B. Ginseng-Extrakt, Schappschildkröten-Extrakt, Chlorella- Extrakt, Aloe-Extrakt und Propolis-Extrakt; lebende Mikroorganismen, wie z. B. Viren Milchsäure-Bakterien und Hefe; und andere biologisch aktive Substanzen, wie z. B. Götterspeise. Unter Einsatz der erfindungsgemäßen nicht-reduzierenden Saccharide, relativ schwach reduzierenden Sacchariden, die diese enthalten, und Trehalase, die aus diesen Sacchariden hergestellt wurde, werden die oben erwähnten biologisch aktiven Substanzen wahlweise in homöopathischen Lebensmitteln und Arzneimitteln mit einer zufriedenstellend hohen Haltbarkeit und Qualität, ohne befürchten zu müssen, dass ihre Wirkstoffe und ihre Wirkungen verlorengehen oder inaktiv werden, verarbeitet.

Wie oben beschrieben ist, umfassen die Verbindungen, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, oral und parenteral einsetzbare Lebensmittel und Arzneimittel und sie können in Kosmetika, Produkten des täglichen Gebrauchs, chemischen Reagenzien, land- und forstwirtschaftlichen Produkten und Fischereiprodukten eingesetzt werden.

Die Verfahren, um die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen, die fructosidisch umgewandelte Saccharide enthalten, in die oben genannten Verbindungen einzulagern, umfassen konventionelle Methoden, wie z. B. Mischen, Kneten, Lösen, Schmelzen, Eintauchen, Durchdringen, Tränken, Auftragen, Ummanteln, Besprühen, Injizieren, Auskristallisieren und Ausfällen. Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen werden im allgemeinen zu einem Anteil von 0.1% oder mehr, bevorzugt 0.5% oder mehr, bezogen auf die fructosidisch umgewandelten Saccharide, d.s.b, in diese Verbindungen eingebaut.

Die folgenden Versuche erläutern die vorliegende Erfindung ausführlicher:

Experiment 1 Enzym-Produktion

Jeweils 100 ml Proben eines flüssigen Nährbodens, der aus 1.0 Gew.-% Sucrose, 0.5 Gew.-% Polypepton, 0.1 Gew.-% Hefe-Extrakt, 0.1 Gew.-% Kaliumdihydrogenphosphat, 0.06 Gew.-% Dinatrium-hydrogenphosphat-dihydrat, 0.05 Gew.-% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0.3 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser besteht, wurden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Die Kolben wurden im Autoklaven bei 121ºC für 15 Minuten sterilisiert, gekühlt und dann mit einer Kultur des Bacillus sp. V230 (FERM-5054) geimpft und bei 30ºC für 20 Stunden unter rotierendem Schütteln bei 200 rpm gezüchtet. Die Kulturen wurden zusammengefasst und als Keimkultur verwendet.

Ca. 7 l eines frisch aufbereiteten Ansatzes des gleichen Nährbodens wurde in einen 10 l Gärbehälter gegeben, durch Erhitzen sterilisiert und auf 30ºC gekühlt, dann mit einem Vol.-% der obigen Keimkultur geimpft und anschließend bei 30ºC für ca. 20 Stunden unter Belüften und Rühren gezüchtet.

Ca. 6.5 l der resultierenden Kultur wurden bei 15,000 · g für 20 Minuten zentrifugiert, um ca. 6.3 l einer überstehende Lösung einer Kultur mit einer Aktivität von 3.6 Einheiten/ml β-Fructofuranosidase zu erhalten.

Experiment 2 Reinigung des Enzyms

Zur überstehenden Lösung der Kultur aus Experiment 1 wurde bis zu einem Sättigungsgrad von 0.8 Ammoniumsulfat gegeben und gelöst und die Lösung wurde über Nacht bei 4ºC stehengelassen, dann zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen.

Der Niederschlag wurde in 10 mM Acetat-Puffer (pH 6.0), der 5 mM Calciumchlorid enthielt, gelöst und die Lösung wurde gegen den gleichen Puffer für einen Tag dialysiert und anschließend bei 15,000 · g für 20 Minuten zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit (210 ml) wurde einer säulenchromatographischen Behandlung mit einem Ionenaustauscher unter Einsatz von 380 ml "DEAE-TOYOPEARL® 650", einem Gel, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, vertrieben wird, unterzogen.

Die erfindungsgemäße β-Fructofuranosidase, die an dem Gel absorbiert war, wurde mit ein 0.1 M Salzlösung eluiert und die eluierten Fraktionen wurden zusammengefasst und durch die folgenden Maßnahmen gereinigt: Dialyse der Lösung gegen eine frisch bereitete Lösung des gleichen Puffers, der 1 Mol Ammoniumsulfat enthielt, und anschließend wurde die dialysierte innere Lösung bei 15,000 · g für 20 Minuten zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wurde einer hydrophob säulenchromatographischen Behandlung unter Einsatz von 100 ml "BUTYL-TOYOPEARL®", einem Gel, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, unterzogen. Die β- Fructofuranosidase, die an dem Gel absorbiert war, wurde mit einer Ammoniumsulfat-Lösung mit einem linear abnehmendem Gradienten von 1 M bis 0 M aus de Säule eluiert, anschließend wurden die Fraktionen mit Enzym-Aktivität aufgefangen.

Die Fraktionen wurden vereinigt und einer säulenchromatographischen Behandlung mit einem Ionenaustauscher unter Einsatz von 10 ml "DEAE-TOYOPEARL® 650" unterzogen, anschließend wurden die eluierten Fraktionen mit der Enzym-Aktivität aufgefangen.

Die Ausbeute an Enzym-Präparat, das auf diese Weise gewonnen wurde, betrug ca. 13%, bezogen auf die Gesamtaktivität in der überstehenden Flüssigkeit der Kultur. Die spezifische Aktivität des Enzym-Präparats betrug 205 Einheiten/mg Protein. Der Protein-Gehalt wurde nach der Lowry-Methode unter Einsatz von Kalb-Albumin- Serum als Standardprotein bestimmt.

Die Reinheit der gereinigten β-Fructofuranosidase wurde über Gel-Elektrophorese mit einem 7.5-Gew.-%igen Polyacrylamid-Gel bestimmt, wobei ein Einzelproteinband mit einer relativ hohen Reinheit resultierte.

Experiment 3 Enzym-Eigenschaften

Ein β-Fructofuranosidase-Präparat, das nach dem Verfahren in Experiment 2 gewonnen wurde, wurde elektrophoretisch mit einem 10 Gew.-%igen Natrium- Dodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS) Gel unter Einsatz von Markierungsproteinen, die von den Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan, vertrieben werden, behandelt, anschließend konnte, verglichen mit den Molekulargewichten der Markierungsproteine, gezeigt werden, dass das Enzym ein Molekulargewicht von 49,000 ± 5,000 Daltons besitzt. Bei einer Bestimmung über Gel-Filtration unter Einsatz einer Säule "TSKgel G3000SW" mit einem Durchmesser von 7.8 mm und einer Länge von 300 mm, die von der Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, vertrieben wird, zeigte das Enzym ein Molekulargewicht von 37,000 ± 3,000 Daltons.

Die gereinigte β-Fructofuranosidase wurde einer Elektrophorese zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes über ein 2 Gew.-%iges "AMPHOLINE"-Gel unterzogen, einem Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese, vertrieben durch die Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, anschließend wurden die Proteine in dem Gel gefärbt und der pH des Gels wurde gemessen, um den pI des Enzyms zu bestimmen, wobei sich der pI zu 4.6 ± 0.5 ergab.

Gemäß dem Verfahren, das bei der oben durchgeführten Bestimmung der Enzym- Aktivität angewandt wurde, wurde der Einfluss des pH und der Temperatur auf die Aktivität der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase in Gegenwart und in Abwesenheit von Calciumchlorid untersucht. Diese Ergebnisse bezüglich pH und Temperatur sind in der Fig. 1 bzw. Fig. 2 wiedergegeben. Der optimale pH des Enzyms lag in beiden Fällen bei ca. 5.5-6.0 bei einer Inkubation bei 40ºC für 10 Minuten sowohl bei Anwesenheit wie auch bei Abwesenheit von Calciumchlorid, während die optimale Temperatur des Enzyms bei einer Inkubation bei pH 6.0 für 10 Minuten in Gegenwart von Calciumchlorid ca. 50ºC betrug und in Abwesenheit von Calciumchlorid ca. 45ºC. Die pH-Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms wurde durch eine Inkubation in 50 mM Puffer mit verschiedenen pHs bei 4ºC für 24 Stunden und der Bestimmung der Restaktivität des Enzyms, nachdem der Puffer auf pH 6 eingestellt worden war, bestimmt. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubation in 20 mM Acetat-Puffer (pH 6.0) bei verschiedenen Termperaturen für eine Stunde und durch Bestimmung der Restaktivität des Enzyms in jedem Puffer, nachdem die Puffer abgekühlt waren, bestimmt. Die Ergebnisse der pH- Stabilität und thermischen Stabilitäten des erfindungsgemäßen Enzyms sind in Fig. 3 bzw. Fig. 4 wiedergegeben. Die pH-Stabilität ds Enzymsbetruig ca. 5.0-8.0 und die thermische Stabilität betrug ca. 45ºC. Die Anwesenheit von Calciumchlorid beeinflusste die pH-Stabilität und die thermische Stabilität nicht. Ein mM Cu&spplus;&spplus;, Pb&spplus;&spplus;, Fe&spplus;&spplus;, Fe&spplus;&spplus;&spplus; oder Hg&spplus;&spplus; hemmte die Enzym-Aktivität.

Experiment 4 Substrat-Spezifität

Eine Lösung mit einer endgültigen Konzentration von 2 Gew.-% Sucrose, Raffinose, Erlose, Stachyose, Lactose, Xylosylfructosid, Maltose, Cellobiose, Lactose, Inulin oder Laevan als Substrat wurde mit 2 Einheiten einer β-Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten worden war, pro g Substrat vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 40ºC und pH 5.5 für 24 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde einer Dünnschicht-Chromatograpie (hier später als "TLC" abgekürzt) unter Einsatz von "KIESEL GEL 60", eine Aluminiumplatte, 20 · 20 cm vertrieben von Merck & Co., Inc., NJ, USA, unterzogen, um festzustellen, ob das Enzym mit diesen Sacchariden reagiert. Das Lösungsmittel-System, das bei der TLC eingesetzt wurde, bestand aus 1-Butanol, Pyridin und Wasser (= 7 : 3 : 1, bezogen auf das Volumen) und die Proben wurden zunächst bei Raumtemperatur entwickelt. Die Saccharide, die Fructose-Einheiten als Saccharid-Bestandteile enthielten wurden durch Einsprühen mit einer 0.5 N Phosphorsäure-Lösung, die 0.2 Gew.-% Naphthoresorcinol enthielt, und durch Erhitzen bei 110ºC für ca. 5 Minuten gefärbt, während die anderen Saccharide durch Einsprühen mit einer Methanol-Lösung, die 20 Gew.-% Schwefelsäure enthielt, und Erhitzen bei 110ºC für ca. 10 Minuten gefärbt wurden.

Als Resultat wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße β-Fructofuranosidase mit Sucrose, Raffinose, Erlose, Stachyose, Lactosucrose und Xylosylfructosid reagiert, um insbesondere Fructose freizusetzen, aber nicht mit Maltose, Cellobiose, Lactose Inulin und Laevan reagiert.

Experiment 5 Akzeptor-Spezifität

Eine Saccharid-Lösung mit einer Endkonzentration von 10%, welche aus einem der Monosaccharide, Oligosaccharide und Alkohole der Tabelle 1 und einem gleichen Anteil an Sucrose als Donator, d. s. b., besteht, wurde mit 2 Einheiten einer gereinigten β-Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten worden war, pro g Sucrose vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 40ºC und einem pH von 5.5 für 24 Stunden unterzogen. Die Mischungen vor der enzymatischen Reaktion und die Mischungen nach der enzymatischen Reaktion wurden einer TLC, ähnlich wie in Experiment 4, unterzogen und die Saccharide wurden durch Einsprühen mit 0.5 N Phosphorsäure, die 0.2 Gew.-% Naphthoresorcinol enthielt, und Erhitzen für 5 Minuten bei 110ºC gefärbt, um die Bildung an umgewandelten Sacchariden zu prüfen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgezeigt:

Tabelle 1

Anmerkung: Die Bildung der umgewandelten Saccharide wurde durch Vergleich mit einer enzymatischen Reaktionsmischung, bei der ausschließlich Sucrose eingesetzt wurde, bewertet. Die Bezeichnungen "-", "+", und "++" bedeuten "unverändert", "das Signal für den Akzeptor war leicht verringert, weil sich fructosidisch umgewandelte Saccharide in geringen Mengen gebildet hatten" und "das Signal für den Akzeptor war deutlich verringert, weil sich fructosidisch umgewandelte Saccharide in großen mengen gebildet hatten".

Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, konnte aufgezeigt werden, dass die erlindungsgemäße β-Fructofuranosidase wirksam Fructosyl-Reste an reduzierende Saccharide überträgt, wie z. B. D-Xylose, D-Galactose, Maltose, Isomaltose, Cellobiose, Maltotriose, Panose, Lactose und Melibiose, ebenso an nichtreduzierende Saccharide, wie z. B. Trehalose. Es wurde auch gefunden, dass das Enzym wirksam einen Fructosyl-Rest an Zuckeralkohole, wie z. B. D-Xylitol, D- Sorbitol und Maltitol überträgt, ebenso wie an Alkohole, wie z. B. Glycerol und Äthylenglykol, um fructosidisch umgewandelte Saccharide zu produzieren.

Experiment 6 Fructosidisch umgewandeltes Saccharid aus Sucrose und einem reduzierenden Saccharid

Ein Bestimmungstest wurde durchgeführt, um die fructosidisch umgewandelten Saccharide, die durch die Saccharid-Umwandlungsreaktion unter Einsatz der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase gebildet worden waren, zu identifizieren. Ein Teil der Reaktionsmischung, die in Experiment 5 unter Einsatz von Sucrose und Lactose als Subtrate erhalten wurde, wurde mit 20 mM Acetat-Puffer (pH 4.5) verdünnt, um eine Saccharid-Konzentration von 2% zu ergeben, und 0.5 ml der verdünnten Lösung wurden mit 0.1 Einheiten Invertase oder 0.1 Einheiten β- Galactosidase, die beide von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd., Hyogo, Japan, vertrieben werden, vermischt und anschließend einer enzymatischen Reaktion bei 40ºC für 20 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung, die beim Einsatz der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase erhalten wurde, und die anderen Reaktionsmischungen, die durch die Behandlung der Reaktionsmischung mit Invertase oder β-Galactosidase erhalten wurden, wurden auf die Saccharid- Komponenten über Gaschromatographie (GLC) analysiert. Ein Teil jeder Reaktionsmischung wurde getrocknet, in Pyridin gelöst und mit Trimethylsilan behandelt, um eine Probe für die GLC-Analyse vorzubereiten. Die Bedingungen und die Apparatur, die bei der Analyse eingesetzt wurden, waren wie folgt: GLC-Kolonne, Edelstahlkolonne, 3 mm Durchmesser und 2 m lang, gepackt mit 2% "SILICONE OV-17/CHROMOSOLVE W", vertrieben durch GL Sciences Inc., Tokyo, Japan; Trägergas, Stickstoff-Gas, mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/min. Temperatur des Säulenofens, 160-320ºC, eine Aufheizrate von V.5ºC/min und der Detektor, Wasserstoff-Flammenionendetektor.

Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Retentionszeit des Peaks für ein fructosidisch umgewandeltes Saccharid, das aus Sucrose und Lactose durch die Einwirkung der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase gebildet wurde, mit der der authentischen Lactosucrose oder Lactosylfructosid übereinstimmte. Es wurde auch herausgefunden, dass der Peak des fructosidisch umgewandelten Saccharids nicht gefunden wurde, wenn mit Invertase oder β-Galactosidase behandelt wurde, weil das Saccharid durch die Einwirkung der Invertase in Fructose und Lactose oder durch die Einwirkung der β-Galactosidase in Galactose und Sucrose zersetzt wurde. Unter Berücksichtigung der Reaktionskraft von Invertase und β-Galactosidase wurde die Schlußfolgerung gezogen, dass es sich bei dem fructosidisch umgewandelten Saccharid um Lactosucrose handelt.

Auf Basis der Daten der GLC-Analysen von Reaktionsmischungen vor und nach der Behandlung mit Invertase und von authentischen Sacchariden, wurden die fructosidisch umgewandelten Saccharide, die sich aus Xylose, Maltose, und Isomaltose als Akzeptoren gebildet hatten, als Xylosylfructosid, Eriose (Maltosylfructosid) bzw. Isomaltosylfructosid identifiziert. Die fructosidisch umgewandelten Saccharide, die aus diesen reduzierenden Sacchariden als Akzeptoren bei der Einwirkung der erfindungsgemäßen β-Fructofuranosidase gebildet wurden, werden dahingehend bewertet, dass sie β-fructofuranosidische Verknüpfungen an den C-1-Positionen der Reste des reduzierenden Saccharids besitzen.

Experiment 7 Fructosyltrehalose

Fructosyltrehalose wurde isoliert und auf ihre Struktur untersucht, um das Saccharid zu identifizieren, das zu Trehalose umgewandelt wurde. Eine Saccharid-Lösung, die Sucrose und Trehalose jeweils zu einem Anteil von 20% enthielt, wurde auf pH 6.0 eingestellt, mit 4 Einheiten einer gereinigten β-Fructofuranosidase, die nach Experiment 2 erhalten wurde, pro g Sucrose vermischt, einer enzymatischen Reaktion bei 55ºC für 20 Stunden unterzogen und für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren. Die Reaktionsmischung, die ca. 23% Fructosyltrehalose, d. s. b., enthielt, wurde durch Entfärben mit Aktivkohle, Filtration und Aussalzen mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form gereinigt, auf ca 50% konzentriert und einer säulenchromatographischen Behandlung unterzogen und anschließend wurden die mit Fructosyltrehalose angereicherten Fraktionen aufgefangen.

Bei dem Harz, das für die Fraktionierung eingesetzt wurde, handelte es sich um "XT- 1016 (Na-form, polymerization degree of 4%)", einem stark sauren Kationenaustauscher, vertrieben von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan. Beim Einsatz wurde es zunächst in Wasser suspendiert, dann in zwei ummantelte Edelstahlkolonnen gepackt, jede mit 3 cm Durchmesser und 1 m lang, die kaskadenartig in Reihe geschaltet waren, um eine Gesamtbadtiefe des Gels von 2 m zu ergeben. Der Vorgänge zu Fraktionierung verliefen wie folgt: Man beschicke die Kolonnen mit einer Saccharidlösung zu einem Anteil von 5 Vol.-%, bezogen auf das Harz, während die Innentemperatur der Säule auf 40ºC gehalten wird, und fraktioniere dann die Lösung durch Beschicken mit 40ºC heißem Wasser bei einer SV (space velocity = Durchlaufgeschwindigkeit) von 0.15, um die mit Fructosyltrehalose angereicherten Fraktionen aufzufangen. Man fasse die Fraktionen zusammen, entsalze die Lösung der Mischung, reinige die entsalzene Lösung und konzentriere die gereinigte Lösung auf eine Lösung von ca. 40%. Man beschicke eine Säule, die mit "YMC-PACK ODS", einer Säule aus Octadecyl-Silika- Gel, das von YMC Co., Tokyo, Japan, vertrieben wird, gepackt ist, mit dem Konzentrat, um die mit Fructosyltrehafose angereicherten Fraktionen aufzufangen. Man fasse die Lösungen, die durch Wiederholung dieser Vorgänge erhalten wurden, zusammen, entsalze die Lösung der Mischung, reinige die entsalzene Lösung, konzentriere die gereinigte Lösung und trockne das Konzentrat im Vakuum, um ein mit Fructosyltrehalose angereichertes Pulver mit einer Ausbeute von ca. 10%, d. s. b., zu erhalten. Das Pulver enthielt ca. 98% Fructosyltrehalose, d.s.b.

Unter Einsatz des Pulvers wurde die Struktur von Fructosyltrehalose über ein enzymatisches Verfahren und GLC-Analyse für partielle Methylhexitolacetate analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Behandlung mit Invertase die Fructosyltrehalose, die bei der Einwirkung der erfindungsgemäßen β- Fructofuranosidase gebildet wurde, in Fructose und Trehalose-Einheiten in einem Mol-Verhältnis von 1 : 1 zersetzt hat. Die GLC-Analyse auf partielle Methylhexitolacetate, die durch Methylieren der Fructosyltrehalose, Hydrolysieren der methylierten Produkte mit Säure, Reduzieren der hydrolysierten Produkte und Acetylieren der reduzierten Produkte gewonnen wurden, zeigte 1,5,6-Trio-Acetyl- 2,3,4-tri-o-Methylglucitol und 1,5-Di-o-Acetyl-2,3,4,6-tetra-o-Methylglucitol in äquimolarem Verhältnis. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fructosyltrehalose als Trisaccharid identifiziert wird, wobei Trehalose die Fructosyl-Reste über die β-2,6- Bindung bindet.

Experiment 8 Prüfung auf akute Toxizität

Beim Einsatz von 7 Wochen alten "dd-strain Mäusen" wurde den Mäusen zur Prüfung der akuten Toxizität ein Pulver, das mit Lactosucrose angereichert war, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4, das später beschrieben wird, erhalten wurde, oral verabreicht. Bis zu einer Dosis von 15 g/kg Maus starb keine Maus und ein Test mit höherer Dosis war nicht durchführbar. Somit besitzt die Lactosucrose eine relativ niedrige Toxizität. Ähnlich wie oben beschrieben, wurde ein Pulver, das mit Erlose angereichert war und nach dem Verfahren in Beispiel A-6, das später beschrieben wird, erhalten wurde, ein Sirup, der mit Xylosylfructosid angereichert war und nach dem Verfahren in Beispiel A-8, das später beschrieben wird, erhalten wurde, ein Sirup, der mit Fructosyltrehalose angereichert war und nach dem Verfahren in Beispiel A-11 erhalten wurde, oder ein Sirup, der mit Isomaltosylfructosid angereichert war und nach dem Verfahren in Beispiel A-12, das später beschrieben wird, erhalten wurde, zur Prüfung der akuten Toxizität 7 Wochen alten "dd-strain Mäusen" oral verabreicht. Bis zu einer Dosis von 15 g/kg Maus starb keine Maus und der Test mit einer höheren Dosis war nicht durchführbar. Auf Basis dieser Ergebnisse besitzen die Saccharide eine relativ niedrige Toxizität.

Die folgenden Beispiele A und B erläutern die erfindungsgemäße β- Fructofuranosidase und das Verfahren, Saccharid-Verbindungen herzustellen, die fructosidisch umgewandelte Saccharide enthalten:

Beispiel A-1

Eine Keimkultur des Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054) wurde in einen Nährboden injiziert und für ca. 24 Stunden unter Belüften und Rühren kultiviert, ähnlich wie in Experiment 1, mit der Ausnahme, dass ein 30 l Gärbehälter und ca. 20 l einer Nährlösung, die 2 Gew.-% Sucrose als Nährstoff enthielt, eingesetzt wurde. Die Aktivität der β-Fructofuranosidase in der überstehenden Flüssigkeit der Kultur betrug 7.3 Einheiten/ml. Die Kultur wurde mit einer MF-Membran gefiltert und das Filtrat wurde mit einer UF-Membran konzentriert, um eine Enzym-Lösung mit einer Aktivität von ca. 130 Einheiten/ml β-Fructofuranosidase mit einer Ausbeute von ca. 80%, bezogen auf die gesamte Enzym-Aktivität der Kultur, zu erhalten.

Beispiel A-2

Eine wässerige Lösung, die Sucrose und Lactose zu einem Anteil von jeweils 20% enthielt, wurde auf pH 5.5 eingestellt, mit einer Einheit β-Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, pro g Sucrose vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 55ºC für 16 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, gereinigt durch Entsalzen über einen Ionenaustauscher in H-Form und OH-Form und konzentriert, um einen Sirup mit einer Konzentration von ca. 75% in einer Ausbeute von ca. 95%, d. s. b., zu erhalten.

Da der Sirup ca. 37% Lactosucrose, d. s. b., enthält und einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße und eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann er wahlweise in Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Füllstoff, wachstumsförderndes Mittel für Bifido- Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-3

Eine wässerige Lösung, die 22% Sucrose und 18% Lactose enthielt, wurde auf pH 6.0 eingestellt, mit einer Einheit β-Fructofuranosidase aus Beispiel 1 pro g Sucrose und 5%, bezogen auf die Gehalte, d. s. b., feuchter Invertase-defekter Hefe vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 35ºC für 20 Stunden unterzogen, wobei der pH der Mischung durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxyd auf 6-7 gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, gefiltert, gereinigt durch Entsalzen über einen Ionenaustauscher in H-Form und OH- Form und zu einem ca. 75%igen Sirup mit einer Ausbeute von ca. 70%, d.s..b., konzentriert.

Das Produkt enthält ca. 65% Lactosucrose, d. s. b., und weist einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße und eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt auf, so dass es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator, wachstumsförderndes Mittel für Bifido- Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden kann.

Beispiel A-4

Eine Lösung, die ca. 37% Lactosucrose als Ausgangslösung für das Saccharid enthielt und nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhalten wurde, wurde zu einer ca. 45%igen Lösung konzentriert. Um den Lactosucrose-Anteil zu erhöhen, wurde die konzentrierte Lösung einer säulenchromatographischen Behandlung unter Einsatz von "XT-1016 (Na-form, polymerization degree of 4%)", einem stark sauren Kationenaustauscherharz, vertrieben von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, unterzogen. Die Vorgehensweise war wie folgt: Das Harz wurde in 4 ummantelte Edelstahlkolonnen mit einem Innendurchmesser von 5.4 cm gepackt, die kaskadenförmig aneinandergereiht waren, um eine Gesamttiefe des Gelbettes von 20 m zu ergeben. Fünf Vol.-% der konzentrierten Lösung wurden in die Kolonne chargiert, während die Temperatur im Innern der Kolonne auf 40ºC gehalten wurde, und durch Beschickung der Kolonne mit Wasser, das auf 40ºC geheizt war, bei einer SV von 0.2 fraktioniert, um mit Lactosucrose angereicherte Fraktionen zu erhalten. Die Frakionen wurden zusammengefasst, gereinigt, konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um ein mit Lactosucrose angereichertes Pulver in einer Ausbeute von ca. 30%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 90%, d. s. b., Lactosucrose enthält und eine relativ geringe Reduzierbarkeit und kariesbildende Wirkung sowie einen angenehmen Geschmack, eine angenehme Süße und einen befriedigenden Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika, und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilsator, Füllstoff, wachstumförderndes Mittel für Bifido-Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-5

Eine Saccharid-Lösung, die Sucrose und Maltose jeweils zu einem Anteil von 20% enthielt, wurde auf einen pH von 5.5 eingestellt, mit einer Einheit β- Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, pro g Sucrose vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 50ºC für 24 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, gereinigt durch Entsalzen mit einem Ionenaustauscher in H- und OH-Form und konzentriert, um einen ca. 75%igen Sirup mit einer Ausbeute von ca. 95%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 28% Erlose, d. s. b., und einen zufriedenstellenden Geschmack und Süße sowie eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann es wahlweise in Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden.

Beispiel A-6

Eine Lösung, die ca. 28% Erlose als Ausgangslösung für das Saccharid und nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhalten wurde, wurde zu einer ca. 45%igen Lösung konzentriert. Um den Erlose-Gehalt zu erhöhen, wurde die konzentrierte Lösung säulenchroatographisch behandelt nach dem Verfahren in Beispiel A-4, mit der Ausnahme, dass "DOWEX 50WX4 (Ca-form)", vertrieben von Dow Chemical Company, Midland, Mich., USA, als Ionenaustauscher eingesetzt wurde, anschließend wurden die mit Erlose angereicherten Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen wurden zusammengefasst, gereinigt, konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um ein mit Erlose angereichertes Pulver in einer Ausbeute von ca. 25%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 84%, d. s. b., Erlose enthält und eine relativ geringe Reduzierbarkeit und gering kariesbildende Wirkung sowie einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße und einen befriedigenden Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden.

Beispiel A-7

Eine Saccharid-Lösung, die 30% Sucrose und 15% Xylose enthielt, wurde auf einen pH von 5.5 eingestellt, mit 0.5 Einheiten β-Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, pro g Sucrose vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 50ºC für 40 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC geheizt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, gereinigt durch Entsalzen mit einem Ionenaustauscher in H- und OH-Form und darüber hinaus konzentriert, um einen 75%igen Sirup in einer Ausbeute von ca. 95 %, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 35% Xylosylfructosid, d. s. b., enthält und einen angehmen Geschmack und eine angenehme Süße, eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt sowie eine relativ geringe kariensbildende Wirkung aufweist, kann es wahlweise in Verbindugen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator, wachstumsfördendes Mittel für Bifido-Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-8

Eine Saccharid-Lösung, die 30% Sucrose und 15% Xylose enthielt, wurde auf einen pH von 6.0 eingestellt, mit 0.5 Einheiten β-Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, pro g Sucrose versetzt und einer enzymatischen Reaktion bei 50ºC für 40 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde auf 100ºC erhitzt, während der pH durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 10 oder mehr gehalten wurde, gekühlt und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, gereinigt durch Entsalzen mit einem Ionenaustauscher in H- und OH-Form und konzentriert, um einen ca. 75%igen Sirup mit einer Ausbeute von ca. 55%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 60% Xylosylfructosid, d. s. b., enthält und einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße sowie eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator, wachstumsförderndes Mittel für Bifido- Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-9

Eine Saccharid-Lösung, die Sucrose und Trehalose jeweils zu einem Anteil von 20 % enthielt, wurde auf einen pH von 5.5 eingestellt, mit 4 Einheiten β- Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, pro g Sucrose vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 55ºC für 16 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt, und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, gereinigt durch Entsalzen mit einem Ionenaustauscher in H- und OH-Form und konzentriert, um einen ca. 75%igen Sirup mit einer Ausbeute von ca. 95%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 24% Fructosyltrehalose, d. s. b., enthält und einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße sowie eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt sowie ein relativ geringe kariesbildende Wirkung aufweist, kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator, wachstumsförderndes Mittel für Bifido-Bakterien und Mittel zu Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-10

Eine Saccharid-Lösung, die Sucrose und Trehalose jeweils zu einem Anteil von 20 % enthielt, wurde auf einen pH von 5.5 eingestellt, mit 4 Einheiten β- Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, und mit 5%, bezogen auf die Anteile, d. s. b., feuchter Invertase-defekter Hefe pro g Sucrose vermischt und einer enzymatischen Reaktion bei 35ºC für 20 Stunden unterzogen, während der pH durch Zugabe von 1-N Natriumhydroxid bei 6-7 gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt, und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, gereinigt durch Entsalzen mit einem Ionenaustauscher in H- und OH-Form und konzentriert, um einen ca. 75%igen Sirup mit einer Ausbeute von ca. 70%, d. s. b., zu erhalten.

Das Produkt enthält ca. 34% Fructosyltrehalose, d. s. b., und weist einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße sowie eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt auf. Somit kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator, wachstumsförderndes Mittel für Bifido-Bakterien und Mittel zu Förderung der Absorptiojn von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-11

Als Saccharid-Ausgangslösung wurde eine wässerige Lösung, die ca. 24% Fructosyltrehalose, d. s. b., enthielt und nach dem Verfahren in Beispiel A-9 erhalten wurde, auf eine ca. 45%ige Lösung konzentriert. Um den Gehalt an Fructosyltrehalose zu erhöhen, wurde die konzentrierte Lösung säulenchromatographisch nach dem Verfahren in Beispiel A-4 behandelt, mit der Ausnahme, dass "DOWEX 50WX4 (Ca-form)" als Harz für die Fraktionierung eingesetzt wurde, anschließend wurden die mit Fructosyltrehalose angereicherten Frakionen aufgefangen. Die Fraktionen wurden zusammengefasst, gereinigt, konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um ein mit Fructosyltrehalose angereichertes Pulver mit einer Ausbeute von ca. 20%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 80% Fructosyltrehalose, d. s. b., enthält und einen angehmen Geschmack und eine angenehme Süße sowie eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt besitzt, kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittei zur Geschmacksverbesserung Stabilisator, Füllstoff, wachstumsfördendes Mittel für Bifido-Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel A-12

Eine Saccharid-Lösung, die 30% Sucrose und 15% Isomaltose, d. s. b., enthielt, wurde auf einen pH von 5.5 eingestellt, mit 0.5 Einheiten β-Fructofuranosidase, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, pro g Sucrose versetzt und einer enzymatischen Reaktion bei 50ºC für 40 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um das restliche Enzym zu desaktivieren, gekühlt und auf die übliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, gereinigt durch Entsalzen mit einem ionenaustauscher in H- und OH-Form und konzentriert, um einen ca. 75%igen Sirup mit einer Ausbeute von ca. 95%, d. s. b., zu erhalten.

Da das Produkt ca. 25% Isomaltosylfructosid, d. s. b., enthält und einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße sowie eine adäquate Viskosität und einen adäquaten Feuchtigkeitsgehalt und eine relativ geringe kariesbildende Wirkung aufweist, kann es wahlweise in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator, wachstumsförderndes Mittel für Bifido-Bakterien und Mittel zur Förderung der Absorption von Mineralien eingesetzt werden.

Beispiel B-1 Gemischter Süßstoff

Ein Gewichtsanteil eines mit Lactosucrose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 verhalten wurde, wurde homogen vermischt mit 0.5 Gewichtsanteilen "α-G SWEET", einem α-Glycosylsteviosid, das von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan, vertrieben wird, um einen pulverförmigen Süßstoff zu erhalten. Das Produkt besitzt eine qualitativ hochwertige Süße und einen ca. zweifach höhere Süßkraft als Sucrose. Das Produkt zeigt eine befriedigende wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien und wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten, zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten und zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Hyperammonämie und Leberentzündung. Das Produkt kann ebenfalls bei Haustieren zur Vorbeugung gegen infektiöse Krankheiten, zur Vorbeugung gegen Diarrhoe, Förderung des Appetits, Wachstumsförderung und zur Verhinderung eines unangenehmen Geruchs der Exkremente eingesetzt werden.

Beispiel B-2 Hartbonbon

Dreißig Gewichtsanteile eines Sirups, der Isomaltosylfructosid, das nach dem Verfahren in Beispiel A-12 erhalten wurde, enthielt, wurde in 80 Gewichtsanteilen eines hydrierten Maltose-Sirups mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 25% gelöst und die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 2% zu ergeben. Das Konzentrat wurde mit einem Gewichtsanteil Zitronensäure und adäquaten Mengen eines Zitronenaromas und eines Färbungsmittel vermischt und die Mischung wurde auf die übliche Weise zu einem Hartbonbon geformt.

Das Produkt besitzt eine hochwertige Süße und eine geringe kariesbildende Wirkung. Da das Produkt eine wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien und eine Wirkung zur Förderung der Absorption von Mineralien zeigt, kann es wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten, zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten und zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-3 Kaugummi

Zwei Gewichtsanteile einer Gummibasis wurden bis zum Erweichen erhitzt und mit 4 Gewichtsanteilen eines mit Lactosucrose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, 3 Gewichtsanteilen Glucose und adäquaten Mengen an einem Minze-Aroma und Färbungsmittel vermischt. Die Mischung wurde auf die übliche Weise mit einer Rolle geknetet und geformt, um einen Kaugummi zu erhalten.

Das Produkt hat eine befriedigende Konsistenz und Süße, zeigt eine wachstumsfördende Wirkung für Bifido-Bakterien und kann wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten, zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten und zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-4 Schokolade

Vierzig Gewichtsanteile einer Kakao-Paste, 10 Gewichtsanteile Kakao-Butter, 15 Gewichtsanteile eines mit Erlose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhalten wurde, 10 Gewichtsanteile Sucrose und 15 Gewichtsanteile Milchpulver wurden vermischt und anschließend durch eine Maschine zum Raffinieren gegeben. Nachdem die Teilchengröße verringert worden war, wurde die Mischung in eine Konche gegeben und mit 0.5 Gewichtsanteilen Lecithin vermischt und anschließend für 2 Tage bei 50ºC geknetet. Die geknetete Mischung wurde zur Formgebung in eine Formgebungsmaschine eingegossen und verfestigt.

Das Produkt, welches im wesentlichen frei von Fett und Zuckerausblüten ist, besitzt einen angenehmen Geschmack und ein angenehmes Schmelzverhalten auf der Zunge.

Beispiel B-5 Milchgetränk

Siebzig Gewichtsanteile eines Kaffee-Extrakts, 100 Gewichtsanteile Milch, 24 Gewichtsanteile eines mit Lactosucrose angereicherten Sirups, der nach dem Verfahren in Beispiel A-3 erhalten wurde, und adäquate Mengen an Kaffee-Aroma und Färbungsmittel wurden homogen miteinander vermischt und auf die übliche Weise sterilisiert, gekühlt, abgefüllt und verpackt, um ein Milchgetränk zu erhalten.

Das Produkt ist eine mit Kaffee gemischte Milch mit einem angenehmen Aroma und Geschmack. Da das Produkt eine wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien und eine Wirkung zur Förderung der Absorption von Mineralien zeigt, kann es wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten und zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-6 Eiermilch-Creme

Fünfhundert Gewichtsanteile Kornstärke, 400 Gewichtsanteile "SUNMALT®", ein Maltose-Produkt, vertrieben von Hayashibara Shoji, In., Okayama, Japan, und 5 Gewichtsanteile Salz wurden durch ein Sieb gegeben, um die Bestandteile ausreichend zu mischen, und die Mischung wurde zu 1,400 Gewichtsanteilen frischen Eiern und 600 Gewichtsanteilen eines mit Fructosyltrehalose angereicherten Sirups, der nach dem Verfahren in Beispiel A-10 erhalten wurde, gemischt und verrührt und darüber hinaus schrittweise mit 5,000 Gewichtsanteilen kochender Milch versetzt. Die resultierende Mischung wurde unter Rühren leicht erhitzt und das Erhitzen wurde eingestellt, sobald alle Bestandteile vollständig geliert waren und halbtransparent wurden, dann wurde gekühlt und mit einer adäquaten Menge Vanille-Aroma vermischt, um eine Eiermilch-Creme zu erhalten.

Das Produkt hat eine glatte Oberfläche und einen angenehmen Geschmack mit einer adäquaten Süße. Da das Produkt eine wachstumsfördernde Wirkung für Bifido- Bakterien zeigt, kann es wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten und zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-7 Vormischung für Korn-Suppeneintopf

Dreißig Gewichtsanteile eines vorgelierten Kornpulvers, 5 Gewichtsanteile einer vorgelierten Stärke, 4 Gewichtsanteile einer vorgelierten Kartoffelstärke, 12 Gewichtsanteile wachsartigen vorgelierten Kornstärke, 8 Gewichtsanteile eines mit Fructosyltrehalose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-11 erhalten wurde, 5 Gewichtsanteile Natriumglutamat, 8.5 Gewichtsanteile Salz, 7 Gewichtsanteile Magermilchpulver und 0.5 Gewichtsanteile Zwiebelpulver wurden vermischt und ausreichend zermahlen und die Mischung wurde mit 0.5 Gewichtsprozent Fettsäureester der Sorbinsäure und 9 Gewichtsanteilen gehärtetem Pflanzenöl, das durch Erhitzen geschmolzen wurde, versetzt und darüber hinaus mit 10 Gewichtsanteilen Lactose versetzt. Die resultierende Mischung wurde in eeinen Flüssigbett-Granulator gegeben, unter Besprühen mit einer geringen Wassermenge granuliert, getrocknet mit 70ºC heißer Luft und gesiebt, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Das Produkt löst und verteilt sich leicht in heißem Wasser zu einer geschmackvollen Suppe. Da das Produkt eine wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien und eine Wirkung zur Förderung der Absorption von Mineralien zeigt, kann es wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten und zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-8 Milchlotion

Ein halber Gewichtsanteil Polyoxyäthylen-Behenyl-Äther, 1 Gewichtsanteil Polyoxyäthylen-Sorbitol-Tetraoleat, ein Gewichtsanteil lipophiles Glyceryl- Monostearat, 0.5 Gewichtsanteile Behenyl-Alkohol, ein Gewichtsanteil Avokado-Öl, 3.5 Gewichtsanteile eines Erlose-Sirups, der nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhalten wurde, ein Gewichtsanteil α-Glycosylrutin und adäquate Mengen an Vitamin E und eines antiseptischen Mittels wurden durch Erhitzen auf die übliche Weise gelöst. Die Mischung wurde mit 5 Gewichtsanteilen 1,3-Butylenglycol, 0.1 Gewichtsanteilen Carboxy-Vinyl-Polymer, 85.3 Gewichtsanteilen abgekochtem Wasser versetzt und die resultierende Mischung wurde mit einem Homogenisierapparat zu einer Milchlotion emulgiert.

Das Produkt ist eine Milchlotion mit einem zufriedenstellenden Feuchtigkeitsgehalt und kann wahlweise als Sonnenschutz oder als Mittel zum Aufhellen der Haut eingesetzt werden.

Beispiel B-9 Hautcreme

Zwei Gewichtsanteile Polyoxyäthylen-Glycol-Monostearat, 5 Gewichtsanteile selbstemulgierendes Glyceryl-Monostearat, 2 Gewichtsanteile α-Glycosylrutin, ein Gewichtsanteil flüssiges Petrolatum, 10 Gewichtsanteile Glyceryl-tri-2-Äthylhexanoat, 4 Gewichtsanteile eines Sirups, der Fructosyltrehalose enthielt, die nach dem Verfahren in Beispiel A-9 verhalten wurde, und ein adäquater Anteil eines antiseptischen Mittels wurden auf die übliche Weise durch Erhitzen gelöst. Die Lösung wurde mit 5 Gewichtsanteilen 1,3-Butylenglycol und 66 Gewichtsanteilen abgekochtem Wasser versetzt und die resultierende Mischung wurde mit Hilfe eines Homogenisierapparats emulgiert und während des Rührens mit einer adäquaten Menge eines Aromas versetzt, um eine kosmetische Creme zu erhalten.

Das Produkt besitzt eine ausreichende Streichfähigkeit und kann wahlweise als Sonnenschutz, Mittel zum Glätten der Haut oder als Mittel zum Aufhellen der Haut eingesetzt werden.

Beispiel B-10 Zahnpasta

Eine Zahnpasta wurde durch Mischen von 13 Gewichtsanteilen Wasser mit 45 Gewichtsanteilen sekundärem Calciumphosphat, 1.5 Gewichtsanteilen Natriumlaurylsulfat, 25 Gewichtsanteilen Glycerin, 0.5 Gewichtsanteilen Polyoxyäthylen-Sorbitan-Laurat, 15 Gewichtsanteilen Xylosylfructosid, das nach dem Verfahren in Beispiel A-8 erhalten wurde, 0.02 Gewichtsanteilen Saccharin und 0.05 Gewichtsanteilen eines antiseptischen Mittels erhalten.

Das Produkt ist eine zufriedenstellende Zahnpasta, da es den Zähnen einen befriedigenden Glanz verleiht und eine wirksame Reinigungswirkung zeigt.

Beispiel B-11 Nährstoff für Intubations-Nahrung

Eine Nährstoffzusammensetzung wurde durch Mischen von 20 Gewichtsanteilen eines mit Erlose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhalten wurde, 1.1 Gewichtsanteilen Glycin, ein Gewichtsanteil Natriumglutamat, 0.4 Gewichtsanteile Calciumlactat, 0.1 Gewichtsanteile Magnesiumcarbonat, 0.01 Gewichtsanteile Thiamin und 0,01 Gewichtsanteile Riboflavin hergestellt.

Um das gewünschte Produkt zu erhalten, wurden 24 g Proben der Nährstoffverbindung in kleine, mit Aluminium beschichtete Beutel injiziert, die dann heiß versiegelt wurden.

Ein Beutel wird in ca. 300-500 ml Wasser zu einer Nährlösung gelöst, bevor sie über die Nasenhöhle und den Magen als Intubations-Nahrung verabreicht wird.

Das Produkt kann wahlweise als eine parenterale Nährlösung für Menschen und Haustiere eingesetzt werden.

Beispiel B-12 Nährstoff für Intubations-Nahrunci

Eine Nährstoffzusammensetzung wurde hergestellt durch Mischen von 580 Gewichtsanteilen eines mit Lactosucrose angereicherten Pulver, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, 190 Gewichtsanteilen getrocknetem Eigelb, 209 Gewichtsanteile Magermilchpulver, 4.4 Gewichtsanteilen Natriumchlorid, 1.85 Gewichtsanteilen Kaliumchlorid, 4 Gewichtsanteilen Magnesiumsulfat, 0.01 Gewichtsanteilen Thiamin, 0.1 Gewichtsanteilen Natriumascorbat, 0.6 Gewichtsanteilen Vitamin-E-Acetat und 0.04 Gewichtsanteilen Nicotinamid. Um einen festen Nährstoff für eine Intubations-Nahrung zu erhalten, werden 25 g Proben der Nährstoffverbindung in kleine, mit Aluminium beschichtete Beutel injiziert und dann heiß versiegelt.

Das Produkt hat eine relativ lange Lebensdauer und eine ausreichende Löslichkeit und Dispergierbarkeit. Bei Gebrauch wird ein Beutel des Produktes in ca. 150-300 ml Wasser zu einer Nährlösung gelöst, bevor es über die Nasenhöhle, den Darm oder den Magen verabreicht wird. Das Produkt zeigt eine wachstumsfördende Wirkung für Bifido-Bakterien und eine Wirkung zur Förderung der Absorption von Mineralien und kann wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten, zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten und zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das Produkt wahlweise zur Förderung des Wachstums von Haustieren und Geflügel und zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-13 Tablette

Vierzig Gewichtsanteile eines mit Fructosyltrehalose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-11 erhalten wurde, 10 Gewichtsanteile Maltose, ein Gewichtsanteil tertiäres Calciumphosphat, ein Gewichtsanteil Zuckerester und eine adäquate Menge eines pulverförmigen Aromas wurden homogen miteinander vermischt und die Mischung wurde mit einer Tablettenpresse zu Tabletten gepresst, um Tabletten von jeweils 350 mg zu erhalten.

Das Produkt ist eine leicht einzunehmende und stabile Tablette, die nicht zerbricht. Eine Dosis von ca. 1-40 Tabletten/Tag/Erwachsener, vorzugsweise ca. 2-20 Tabletten/Tag/Erwachsener, zeigen eine zufriedenstellende wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien und eine wirksame Aktivität zur Förderung der Absorption von Mineralien. Somit kann das Produkt wahlweise zum Erhalt und zur Verbesserung der Gesundheit und der Schönheit, zur Vorbeugung gegen Alterskrankheiten, zur Förderung der Rekonvaleszenz während und nach Krankheiten und zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten eingesetzt werden.

Beispiel B-14 Interferon-Tablette

Ein natürliches menschliches Interferon-α-Präparat, hergestellt von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, und vertrieben von Cosmo Bio Tokyo, Japan, wurde auf eine übliche Weise über eine stationäre Kolonne mit menschlichen Interferon-α-Antikörpern gegeben, um das menschliche Interferon-α zu absorbieren. Ein Puffer, der Kalbsserum-Albumin als Stabilisator enthielt, wurde auf die Kolonne gegeben, anschließend ein überschüssiger Anteil des Albumin aus der Kolonne entfernt. Danach wurde das Interferon-α mit einer physiologischen Salzlösung, die 5% eines mit Lactosucrose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, aus der Kolonne eluiert. Das Eluat wurde über eine Membran filtriert und das Filtrat wurde durch Zugabe von "FINETOSE®", einem wasserfreien, kristallinen Maltose-Pulver, vertrieben durch Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, dehydriert, anschließend wurde das dehydrierte Produkt pulverisiert und das resultierende Pulver unter Einsatz einer Tablettenpresse zu Tabletten gepresst, um Tabletten von je ca. 200 mg Gewicht zu erhalten, die ca. 150 Einheiten des natürlichen menschlichen Interferon-α pro Tablette enthalten.

Das Produkt kann als eine sublinguale Tablette den Patienten mit einer Dosis von 1- 10 Tabletten/Tag/Erwachsener oral verabreicht werden und wahlweise eingesetzt werden, um Viruserkrankungen, Allergien, Rheumatismus, Diabetes und bösartige Tumore zu behandeln. Insbesondere kann das Produkt brauchbar als therapeutische Mittel für AIDS und Hepatitis eingesetzt werden; die Zahl der Patienten, die unter diesen Krankheiten leiden, hat deutlich zugenommen. Die Lactosucrose und Maltose, die in dem Produkt eingelagert sind, stabilisieren das natürliche menschliche Interferon-α, um eine relativ lange Lebensdauer zu ergeben, selbst wenn das Produkt bei Raumtemperatur gelagert wird.

Beispiel B-1 5 Säucilingsfutter

Ein Säuglingsfutter wurde hergestellt durch Mischen von 40 Gewichtsanteilen pulverisierter Weizenkleie, 38 Gewichtsanteilen Magermilchpulver, 12 Gewichtsanteilen eines mit Fructosyltrehalose angereicherten Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-11 erhalten wurde, 10 Gewichtsanteilen eines Vitaminpräparats, 5 Gewichtsanteilen Fischmehl, 5 Gewichtsanteilen sekundäres Calciumphosphat, 3 Gewichtsanteilen füssiges Öl und Fett, 3 Gewichtsanteilen Calciumcarbonat, 2 Gewichtsanteilen Salz und 2 Gewichtsanteilen eines Mineralpräparats.

Das Produkt ist ein Futtermittel mit einer verbesserten Geschmacksrichtung für Haustiere und Geflügel, besonders für Ferkel. Da das Produkt eine zufriedenstellende wachstumsfördende Wirkung für Bifido-Bakterien und eine wirksame Aktivität zur Förderung der Absorption von Mineralien zeigt, kann es wahlweise eingesetzt werden, um trächtige Tiere vor infektiösen Erkrankungen zu schützen, um Diarrhoe und unangenehmem Gestank der Exkremente zu verhindern und den Appetit und die Mast zu fördern. Bei Bedarf kann das Produkt zusammen mit anderen Futtermitteln, wie z. B. konzentrierten Materialien einschließlich Körner, Weizenmehl, Stärke, Ölspeisen sowie Spreu und Kleie, ebenso wie zellulosereiches Futter, wie z. B. Reis, Weizenstroh, Heu, Bagasse und Maiskolben.

Wie oben beschreiben, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine neuartige bakterielle β-Fructofuranosidase, die eine relativ hohe fructosidische Umwandlungsaktivität besitzt und im industriellen Maßstab eingesetzt werden kann, ihre Herstellung sowie ihre Verwendung. Die β-Fructofuranosidase bildet reduzierende und nicht-reduzierende Saccharide unter Einsatz von Sucrose als Donator. Die gebildeten fructosidisch umgewandelten Saccharide haben die folgenden Eigenschaften: einen angenehmen Geschmack und eine angenehme Süße, die Fähigkeit zur Kontrolle der Osmose, ein Gehalt an Feuchtigkeit, die Fähigkeit Glanz zu vermitteln, die Fähigkeit zu Verhinderung der Kristallisation, die Fähigkeit zur Verhinderung des Zerfalls, eine Schutzwirkung gegen Karies, eine wachstumsfördernde Wirkung für Bifido-Bakterien und eine Aktivität zur Förderung der Absorption von Mineralien. Aufgrund dieser Eigenschaften können die Saccharide wahlweise in Lebensmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden. Somit liefert die vorliegende Erfindung einen großen Beitrag für die Lebensmittel-, Kosmetik- und pharmazeutische Industrie.


Anspruch[de]

1. Isolierte Fructofuranosidase, die die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(1) Wirkungsweise

Bei der Hydrolyse der β-fructofuranosidischen Bindung von Zucker, Raffinose und Erlose setzt sie Fructose frei. Beim Einsatz dieser Saccharide als Saccharid-Donatoren katalysiert sie den Übergang des β-Fructofuranosyl-Restes zu einem Akzeptor, ausgewählt aus der Gruppe, die aus anderen Sacchariden, Zuckeralkoholen und Alkoholen besteht;

(2) Molekulargewicht

49,000 ± 5,000 Dalton über die Elektrophorese mit Natrium- Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE);

(3) Isolektrischer Punkt (pI)

4.6 ± 0.5 über die Elektrophorese unter Einsatz von Ampholyten;

(4) Optimaler pH

Ein pH von ca. 5.5-6.0 bei einer Inkubation bei 40ºC für 10 Minuten; (5) Optimale Temperatur

Ca. 45ºC und ca. 50ºC in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit von Calciumionen bei einer Inkubation bei pH 6.0 für 10 Minuten;

(6) pH-Stabilität

Stabil bei einem pH von ca. 5.0-8.0 bei einer Inkubation bei 4ºC für 24 Stunden; und

(7) Thermische Stabilität

Stabil bis zu einer Temperatur von ca. 45ºC bei einer Inkubation bei pH 6.0 für eine Stunde.

2. β-Fructofuranosidase gemäß Anspruch 1, welche aus einem Mikroorganismus des Stammes Bacillus erhalten wird.

3. β-Fructofuranosidase gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054) handelt.

4. Biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus des Stammes Bacillus, welche das Enzym gemäß Anspruch 1 bildet.

5. Kultur gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054) handelt.

6. Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054), welcher die β-Fructofuranosidase gemäß Anspruch 1 bildet.

7. Verfahren zur Herstellung von β-Fructofuranosidase gemäß Anspruch 1, welches die Kultivierung eines Mikroorganismus, der β-Fructofuranosidase produziert, in einem Nährboden für eine Kultur und die Gewinnung der β- Fructofuranosidase aus der Kultur umfasst.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um einen aus dem Stamm Bacillus handelt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054) handelt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Schritt der Kultivierung bei einem pH von 5-8 und bei einer Temperatur von 15-45ºC für 5-100 Stunden durchgeführt wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Schritt der Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.

12. Verfahren zur Herstellung eines fructosidisch umgewandelten Saccharids, welches (a) das Einwirken der β-Fructofuranosidase gemäß Anspruch 1 auf eine Lösung umfasst, die als Donator ein Saccharid mit einer β- fructofuranosidischen Bindung und als ein Akzeptor ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus anderen Sacchariden, Zuckeralkoholen und Alkoholen, enthält, um das besagte fructosidisch umgewandelte Saccharid herzustellen, und (b) die Gewinnung des fructosidisch umgewandelten Saccharids umfasst.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der betreffende Donator ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, die Sucrose, Raffinose, Erlose und Mischungen daraus umfasst, und das entsprechende andere Saccharid ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, die Monosaccharide, Disaccharide und Oligosaccharide umfasst.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die entsprechende β- Fructofuranosidase aus einem Mikroorganismus des Stammes Bacillus erhalten wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem entsprechenden Mikroorganismus um Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054) handelt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das fructosidisch umgewandelte Saccharid ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, die Xylosylfructosid, Erlose, Isomaltosylfructosid und Mischungen daraus umfasst.

17. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt der Gewinnung (b) eine oder mehrere der Techniken ist, ausgewählt aus der Gruppe, die Fermentationsverfahren unter Einsatz von Hefen, Alkalibehandlung und Säulenchromatographie umfasst, um den Gehalt an fructosidisch umgewandelten Saccharid anzureichern.

18. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt (a) bei einer Temperatur von weniger als ca. 60ºC und einem pH von ca. 3.5-8.0 ausgeführt wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Konzentration des entsprechenden Donators und entsprechenden Akzeptors in Schritt (a) mindestens 10 Gew.-% beträgt, berechnet auf trockener und fester Basis.

20. Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes, eines kosmetischen Artikels, eines Arzneimittels oder eines Formkörpers, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) das Einwirken der β-Fructofuranosidase gemäß Anspruch 1 auf eine Lösung, die als einen Donator ein Saccharid mit einer β- fructofuranosidischen Bindung und als einen Akzeptor ein Mitglied umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus anderen Sacchariden, Zuckeralkoholen und Alkoholen besteht, um das entsprechende fructosidisch umgewandelte Saccharid herzustellen;

(b) die Gewinnung des hergestellten fructosidisch umgewandelten Saccharids; und

(c) die Einlagerung des fructosidisch umgewandelten Saccharids, das in Schritt (b) gewonnen wurde, in ein Lebensmittelprodukt, einen kosmetischen Artikel oder ein Arzneimittel.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das fructosidisch umgewandelte Saccharid in Schritt (c) in das betreffende Lebensmittelprodukt, den betreffenden kosmetischen Artikel oder das betreffende Arzneimittel mindestens zu einem Anteil von 0.1 Gew.-%, berechnet auf trockener und fester Basis, eingelagert ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das betreffende fructosidisch umgewandelte Saccharid ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Xylosylfructosid, Erlose, Isomaltosylfructosid, Lactosucrose, Fructosyltrehalose, Galactosylfructosid und Mischungen daraus.

23. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der entsprechende Donator ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sucrose, Raffinose, Erlose und Mischungen daraus, und das entsprechende andere Saccharid ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Monosacchariden, Disacchariden und Oligosacchariden.

24. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die betreffende β-Fructofuranosidase aus einem Mikroorganismus des Stammes Bacillus erhalten wird.

25. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei es sich bei dem betreffenden Mikroorganismus um Bacillus sp. V230 (FERM BP-5054) handelt.

26. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der Schritt der Gewinnung eine oder mehrere der Techniken ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fermentationsverfahren unter Einsatz von Hefen, Alkalibehandlung und Säulenchromatographie, um den Gehalt an fructosidisch umgewandeltem Saccharid anzureichern.







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