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Anticholestatisches Arzneimittel - Dokument DE10029047A1
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE10029047A1 20.12.2001
Titel Anticholestatisches Arzneimittel
Anmelder Sertürner Arzneimittel GmbH, 33332 Gütersloh, DE
Erfinder Eich, Jürgen, Dr., 33334 Gütersloh, DE;
Gebhardt, Rolf, Prof. Dr., 04103 Leipzig, DE
Vertreter Weickmann & Weickmann, 81679 München
DE-Anmeldedatum 13.06.2000
DE-Aktenzeichen 10029047
Offenlegungstag 20.12.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.12.2001
IPC-Hauptklasse A61K 31/352
Zusammenfassung Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon eignet sich als Wirkstoff zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase.

Bei Cholestase handelt es sich um ein Syndrom, das bei gestörtem Gallefluss entsteht. Man unterscheidet extrahepatische und intrahepatische Cholestase. Die extrahepatische Cholestase wird meist durch einen Gallengangstein oder ein Pankreaskarzinom hervorgerufen. Bei intrahepatischer Cholestase handelt es sich um eine Stauung in den Gallengängen. Die häufigsten intrahepatischen Ursachen sind virale und andere Hepatitiden, Medikamente, z. B. zur Krebsbehandlung, sowie die alkoholinduzierte Leberschädigung. Weniger häufige Ursachen sind die primäre billiäre Zirrhose, die Cholestase in der Schwangerschaft, und weitere Erkrankungen.

Extrakt aus Blättern der Artischocke (Cyanara scolymus L.) ist für seine choleretische Wirkung bei dyspeptischen Beschwerden bekannt. Echte choleretische Mittel, als welches ein Artischockenextrakt angesehen wird, führen zu einer Erhöhung der Menge an Gallensäuren, wohingegen unechte choleretische Mittel zu einer Erhöhung des Volumens an Gallenflüssigkeit führen. Neben der choleretischen Wirkung wird für Artischockenextrakt in der Literatur auch eine anticholestatische Wirkung genannt (Ärzte-Ztg., 15. Jahrgang, 1996, Seite 16). Allerdings war bisher nicht bekannt, welcher Wirkstoff die anticholestatische Wirkung hervorruft.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Arzneimittel bereitzustellen, das einen Wirkstoff mit anticholestatischer Wirkung mit definierter Wirksamkeit enthält.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase, welches gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an Luteolin-7-O-Glucuronid der Formel





worin R, einen Glucuronsäurerest bedeutet oder an einem physiologisch annehmbaren Salz davon als Wirkstoff. Vorzugsweise enthält das Arzneimittel mindestens 0,1 Gew.-% dieses Wirkstoffes, mehr bevorzugt mindestens 1 Gew.-%.

Es wurde gefunden, dass Luteolin-7-O-Glucuronid eine anticholestatische Wirksamkeit aufweist und deshalb zur Behandlung einer intrahepatischen Cholestase geeignet ist. Eine intrahepatische Veränderung der Gallengänge kann mit Luteolin-7-O-Glucuronid verhindert oder rückgängig gemacht werden, sodass auch eine prophylaktische Behandlung zur Prävention einer intrahepatischen Cholestase möglich ist.

Durch die Kenntnis, dass Luteolin-7-O-Glucuronid eine anticholestatische Wirksamkeit aufweist, ist die Herstellung eines Arzneimittels mit vorbestimmter und definierter Wirkungsdosis und eine Standardisierung möglich. Weiterhin kann mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel eine schnelle und zielgerichtete Wirkung erreicht werden.

In Artischockenextrakten, insbesondere Artischockenblätter- Trockenextrakten, wie sie beispielsweise kommerziell von Sertürner Arzneimittel unter dem Namen HEPAR-SL® forte erhältlich sind, liegen zahlreiche Verbindungen vor, bei denen es sich um mögliche Wirkstoffe handeln könnte. Die anticholestatische Wirksamkeit konnte bisher keiner der zahlreichen im Extrakt vorliegenden Verbindungen zugeordnet werden. Es war somit schwierig, aus dem Artischockenextrakt ein standardisiertes Arzneimittel herzustellen.

Es wurde nun festgestellt, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine anticholestatische Wirksamkeit aufweist und die Cholesterinsynthese beeinflusst. Ein Hinweis, dass gerade Luteolin-7-O-glucuronid eine derartige Wirkung aufweisen könnte findet sich im Stand der Technik nicht.

Bekannte Bestandteile von Artischockenextrakt sind Kaffeesäure, Chlorogensäure, Cynarin (1,5-di-O-Caffeoylchinasäure), 1,3-di-O-Caffeoylchinasäure, Scolymosid und Cynarosid (Luteolin-7-O-glucosid). Cynarosid (Luteolin-7-O-glucosid) wird im Magen-Darm-Trakt gespalten, wobei Luteolin freigesetzt wird. Allerdings findet sich Cynarosid auch in vielen anderen Pflanzen, ohne dass von solchen eine anticholestatische oder/und die Cholesterinsynthese beeinflussende Wirksamkeit berichtet worden ist. Die Verbindungen Luteolin-7-O-glucosid, 3',4'-Hydroxyflavon, Genistein und Daidzein zeigten keine anticholestatische Wirkung. Es ist daher überraschend, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine ausgeprägte Wirksamkeit dieser Art besitzt.

Die Wirkmechanismen von anticholestatischen und choleretischen Mitteln sind grundsätzlich verschieden. Eine häufig als Modell verwendete Cholestase, die durch Taurolithocholat ausgelöst wird, bewirkt eine leicht detektierbare Membranveränderung. Bekannte choleretische Substanzen sind im allgemeinen nicht in der Lage, diese Membranveränderung zu verhindern oder zu beseitigen (Layden et al., Gastroenterology 50 (1977), 2305 bis 2312. Z. B. zeigte die als choleretisch wirksam bekannte Dehydrocholsäure bei einer durch Taurolithocholat ausgelösten Cholestase keine Wirksamkeit, sodass eine Verwendung von choleretisch wirksamen Verbindungen bei einer Cholestase im allgemeinen nicht angezeigt ist. Ein physiologisch annehmbares Salz von Luteolin-7-O-glucuronid ist jede salzartige Verbindung, die diese Verbindung in ionischer Form zusammen mit einem Gegenion umfasst, welches physiologisch unbedenklich ist. Beispiele solcher Salze sind insbesondere Säureadditionssalze.

Der Wirkstoff liegt im erfindungsgemäßen Arzneimittel bevorzugt in einer Menge von ≥ 0,1 Gew.-%, mehr bevorzugt ≥ 1 Gew.-%, besonders bevorzugt ≥ 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt ≥ 20 Gew.-% vor. Es ist aber auch möglich, Arzneimittel bereitzustellen, die einen noch höheren Gehalt an dem Wirkstoff enthalten, insbesondere ≥ 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels.

Für eine wirksame Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase werden einem Patienten im allgemeinen von 10 mg bis 1000 mg des Wirkstoffs pro Tag verabreicht. Bevorzugt werden mindestens 20 mg, insbesondere mindestens 50 mg und besonders bevorzugt mindestens 100 mg des Wirkstoffs pro Tag pro Person und höchstens bis zu 750 mg, bevorzugt bis zu 500 mg, besonders bevorzugt bis zu 300 mg pro Person und Tag verabreicht.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann gegebenenfalls mit physiologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen formuliert werden. Solche Hilfsstoffe müssen physiologisch unbedenklich sein und dürfen die Wirksamkeit nicht nachteilig beeinflussen. Geeignete Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Füllstoffe, Bindemittel und Gleitmittel, wie etwa mikrokristalline Cellulose, Amylose, Lactose, Mannit, Talkum, Magnesiumstearat, Stärke, hochdisperses Magnesiumoxid, Siliciumdioxid, Natriumcarboxymethylstärke, Polyvidon, Macrogol und andere.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in allen, dem Fachmann bekannten verabreichbaren Arzneimittelformen hergestellt werden. Bevorzugt wird es in einer Formulierung hergestellt, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, insbesondere in fester Form. Beispiele solcher fester Arzneimittelformen umfassen Kapseln, Tabletten, Granulate, Dragees, Filmtabletten und ähnliches. Bevorzugt sind Formulierungen, bei denen der Wirkstoff erst im Magen-Darm-Trakt freigesetzt wird.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann den Wirkstoff der Erfindung als einzige wirksame Verbindung oder zusammen mit anderen Wirkstoffen enthalten. Für ein solches kombiniertes Arzneimittel können Wirkstoffe derselben Wirkungsart oder/und Wirkstoffe, welche die anticholestatische Wirksamkeit ergänzen, verwendet werden. Sie können aus pflanzlichen Extrakten isoliert oder chemisch synthetisierte Verbindungen sein. Die Isolierung von geeigneten Flavon- oder Flavanonderivaten, beispielsweise Luteolin aus pflanzlichen Extrakten ist in der Literatur ausführlich beschrieben (vgl. z. B. Pharmacia 21 (39) (1972) 37). Es ist auch möglich, einen Pflanzenextrakt mitzuverwenden, beispielsweise einen Artischockenextrakt. Im Fall der Verwendung eines natürlichen Extraktes wird ein erfindungsgemäßes Arzneimittel dadurch hergestellt, dass ein herkömmlicher Extrakt an dem Wirkstoff der Erfindung angereichert wird, sodass er ≥ 0,1 Gew.-%, bevorzugt ≥ 1 Gew.-%, mehr bevorzugt ≥ 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt ≥ 20 Gew.-% an dem Wirkstoff, bezogen auf das Extraktgesamtgewicht, aufweist. Eine solche Anreicherung kann dadurch erfolgen, dass die Extraktionsbedingungen so gewählt werden, dass im Extrakt ein möglichst höher Gehalt an dem Wirkstoff der Erfindung vorliegt. Es ist aber auch möglich, einem handelsüblichen Extrakt einen zusätzlichen Gehalt an diesem Wirkstoff zuzugeben, um auf diese Weise eine Erhöhung der Wirkstoffkonzentration zu erzielen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in eine physiologisch verabreichbare Formulierung bringt.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Luteolin-7-Oglcucuronid als Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase sowie ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in einer Dosierung von 0,01 bis 1 g/Tag verabreicht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Isolierung und Identifizierung von Luteolin-7-O-β-D-glucuronid in Artischocke Allgemeines

Extraktion und Isolierung wurden mit analytischer HPLC (Supelcosil LC-18, 150 × 4,6 mm mit Vorsäule 20 × 4,6 mm, 5 µm) begleitet. (Chromatografische Bedingungen: Die Proben wurden in 80% Methanol gelöst und zur Injektion 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Trennung erfolgte mit einem Gradientensystem Acetonitril (A) und Wasser mit 0,5% Phosphorsäure (B). Gradient: 0 bis 1 min 8% A, 6 min 12%, 8 bis 18 min 18%, 19 bis 29 min 32%, 30 bis 35 min 100%, 36 bis 50 min 8% A, Flussrate: 1,0 ml/min. Säulentemperatur: 40°C, Detektionswellenlänge: 330 nm).

Extraktion und Isolierung

Die für die einzelnen Isolierungsstufen angegebenen Ausbeuten beziehen sich auf die jeweils eingesetzte Menge.

Extraktion: 100 g zerkleinerte Artischockenblätter-Droge (Sieb 6 mm) (Gehalt der zu isolierenden Substanz: 0,297% ber. als Cynarosid) wurde fünfmal mit insgesamt 800 ml heißem Wasser perkoliert (Ausbeute: 570 ml Eluat I = 28,7 g Trockenmasse = 28,7%).

Reinigung: Eluat I (Trockenmasse = 28,7 g) wurden mit dem vierfachen Volumen Methanol gemischt und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Das Filtrat wurde auf ein Zehntel seines Volumens einrotiert und mit Wasser auf 570 ml verdünnt. Diese Lösung wurde zweimal mit 285 ml Ethylacetat/2-Butanol (60140-V/V) im Scheidetrichter gewaschen und zur Trockene einrotiert. Es wurden 19,2 g Extrakt II erhalten (Ausbeute = 66,9 %).

Festnhasenreaktion: Je 100 mg des Extraktes 11 wurden in 1,0 ml Wasser gelöst und auf eine mit 2,5 ml Methanol und 5 ml Wasser konditionierte RP- 18-Festphase (Merck Lichrolut 2023) aufgetragen. Es wurde mit 15 ml Wasser gespült und mit 2,0 ml wässrigem Methanol (35%, V/V) eluiert. Insgesamt wurden 192 Portionen zu 100 mg des Extraktes II ( = 19,2 g) über RP-18-Festphasenextraktion bearbeitet. Die vereinigten Eluate wurden zur Trockene einrotiert, sodass 1,286 g des Extraktes III resultierten (Ausbeute = 6, 7%).

Seminränarative HPLC: Die weitere Reinigung erfolgte in zwei Schritten durch semipräparative HPLC (SUPELCOSIL SPLC-18, 250 × 10 mm, 5 µm). Als Laufmittel wurde Methanol (A) und Wasser (B) verwendet, zu denen je 0,25% (V/V) Essigsäure gemischt wurde. Die Säulentemperatur betrug 30°C.

Der Extrakt III wurde in Wasser gelöst (ca. 50 mg/ml), filtriert und in 26 Proteionen zu 1000 µl injiziert. Die Trennung erfolgte isokratisch mit 25% A und einem Fluss von 5 ml/min. Die Substanz eluierte zwischen 12 und 19 min und wurde manuell entsprechend dem DAD-Spektrum aufgefangen. Die zusammengefassten Fraktionen aus 26 HPLC-Läufen wurden zur Trockene eingeengt. Die erste HPLC-Reinigung erag 233 mg Rohprodukt IV (Ausbeute = 18,1%) mit einer HPLC-Reinheit von etwa 70% (Flächenprozente bei λ = 330 nm).

Das Rohprodukt IV wurde einer weiteren HPLC-Reinigung unterzogen. Je 20 mg Substanz wurden in 1,0 ml Methanol gelöst und mit Wasser 1 : 1 verdünnt. Nach Filtration wurde in 400 µl Portionen injiziert. Die Trennung erfolgte isokratisch mit 35% A und einem Fluss von 5 ml/min. Die zusammengefassten Substanz-Fraktionen aus 60 HPLC-Läufen wurden zur Trockene eingeengt. Es wurden 132 mg Substanz V (Ausbeute = 56,6%) mit einer HPLC-Reinheit von etwa 99% erhalten.

Gesamtausbeute: Auf den Gehalt der Droge (0,296%) bezogen ergibt sich eine Gesamtausbeute von 44,6%.

Identifizierung

Die Identifizierung erfolgte durch positve und negative FABMS sowie durch 1H und13C NMR-Spektroskopie. Die Substanz wurde als Luteolin-7-O-β-D- glucuronid identifiziert (Romussi et al., 1996). Zusätzlich konnte Luteolin bzw. Glucuronsäure nach saurer Hydrolyse durch HPLC bzw. DC nachgewiesen werden.

Beispiel 2 Verhinderung einer Taurolithcholat-induzierten Transformation kanilikulärer Membranen durch Luteolin-7-O-glucuronid

Taurolithocholat induziert in Ratten in vivo eine schwere Cholestase, die mit der Umwandlung der Gallekanälchen in bizarr strukturierte, lamelläre Membranformationen verbunden ist. Die Induzierung einer intrahepatischen Cholestase durch Lithocholsäure und Natriumtaurolithocholat in Tierversuchen ist ausführlich beschrieben (Javitt, N.B., Nature 210, (1966), 1262-1263; King. J.E. et ah, J. Clin. Invest. 50, (1971) 2305-2312; Layden et al., Gastroenterology 73 (1977), 120-128; Mockel et al., Am. J. Physiol., 269 (1995), G73-G84). Neben einer kanalikulären Dilatation induzieren sie bizarre lamellare Deformationen der Ultrastruktur der Gallekanälchen, die charakteristisch für diese Art von Cholestase sind (Miyai et al., Lab. Invest. 32 (1975), 527-535; Kakis et al., Lab. Invest. 43, (1980) 73-81). Kürzlich wurde gezeigt, dass Taurolithocholat, das den Primärkulturen von Rattenhepatozyten zugegeben wurde, ähnliche Deformationen in vitro bildet, die von den in vivo gebildeten nicht unterscheidbar sind (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29, (1982) 77-82; Thibault et al., J. Hepatol. 19 (1993) 367-376). Für die Versuche wurde deshalb in Primärkulturen von Rattenhepatocyten die Transformation neu gebildeter Gallekanälchen durch Taurolithocholat wie beschrieben (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982) 77-82) in vitro ausgelöst.

Leberparenchymzellen wurden aus männlichen Sprague-Dawley-Ratten (220 bis 280 g) isoliert und für 2 Tage in einem serumfreien William-Medlum E wie beschrieben kultiviert (Gebhardt et al., Cell Biol. Toxicol. 6 (1990) 369-372; Gebhardt, Toxicol. Appt. Pharmacol. 144 (1997), 270-286). Für die Behandlung der kultivierten Hepatocyten mit Taurolithocholat wurde eine 10 mM Vorratslösung dieses Gallensalzes mit Ethanol hergestellt, die mit Williams-Medium E verdünnt wurde, um eine Endkonzentration von 0,1 mM zu ergeben. Für 1 bis 2 Tage kultivierte Hepatocyten wurden mit dem Taurolithocholat enthaltenden Medium für 3 Stunden behandelt, um maximale Veränderungen der Gallekanälchen zu induzieren (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982), 77-82). Taurolithocholat (0,1 mM) induziert an primär kultivierten Rattenhepatocyten innerhalb von 3 Stunden eine ausgeprägte Transformation der kanalikulären Membranen zu bizarr strukturierten Formationen. Die normale kanalikuläre Membran, die mit zahlreichen Mikrovilli bedeckt ist, wird in bizarre lamillare Strukturen transformiert, die fast die gesamten Kanälchen ausfüllen. Dieser Vorgang scheint nach 2 bis 3 Stunden vollständig abgelaufen zu sein und betraf etwa 50 bis 70% der Kanälchen am zweiten Tag der Kultivierung.

Die Membranveränderungen im Bereich der Gallekanälchen wurden mittels Elektronenmikroskopie an Ultradünnschnitten nachgewiesen (vgl. Gebardt et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982) 68-76). Dazu wurden kultivierte Zellen für 30 bis 45 Minuten in situ mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,2 bei 0°C fixiert. Nach Waschen mit Cacodylatpuffer wurden die Zellen in eine 2%-ige Lösung von Agar bei 46°C gegeben, das in kleine Stücke geschnitten wurde und in 1% OsO4 in einem Cacodylatpuffer nachfixiert wurde. Nach Dehydration wurden die Blöcke in Epon 812 eingebettet. Silberschnitte wurden mit einem Siemens Ia-Elektronenmikroskop nach Anfärben untersucht.

Für eine halbquantitative Abschätzung der Veränderung der kanalikulären Membranen wurde die Erscheinungsform von 100 Gallekanälchen aus zwei bis drei verschiedenen Experimenten untersucht. Gallekanälchen wurden als transformiert eingestuft, wenn die Hälfte oder mehr der kanalikulären Fläche mit bizarren lamellaren Strukturen bedeckt war.

Der oben beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei den Primärkulturen der Rattenhepatocyten gleichzeitig mit dem Taurolithocholat Luteolin-7-O-glucuronid zugegeben wurde. Die Zugabe von Luteolin-7-Oglucuronid in einer Menge von 20 mg gleichzeitig mit Taurolithocholat ergab eine vollständige Hemmung der lamellaren Transformation. Statt dessen behielten die Gallenkanälchen ihre Mikrovilli, wenn auch in etwas geringerer Anzahl und erschienen nur leicht dillatiert. Eine vergleichbare Wirkung konnte erzielt werden, wenn die Kulturen mit Luteolin-7-O-glucuronid vorinkubiert wurden. Dies zeigt, dass eine mögliche Adsorption von Taurolithocholat an andere Inhaltsstoffe keine Rolle spielt.

Weiterhin wurde gefunden, dass der Schutz gegen Taurolithocholat induzierte Transformation dosisabhängig war.

Luteolin-7-O-glucuronid ist somit in der Lage, die Taurolithocholat-induzierte Umwandlung der kanalikulären Membranen spezifisch zu verhindern und anticholestatisch zu wirken.


Anspruch[de]
  1. 1. Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Luteolin-7-O-glucuronid oder an einem physiologisch annehmbaren Salz davon als Wirkstoff.
  2. 2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an Luteolin-7-O-glcucuronid von ≥ 1 Gew.-% aufweist.
  3. 3. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an Luteolin-7-O-glucuronid von ≥ 20 Gew.- % aufweist.
  4. 4. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung, dadurch gekennzeichnet, dass man Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in eine physiologisch verabreichbare Formulierung bringt.
  5. 5. Verwendung von Luteolin-7-O-glucuronid oder eines physiologisch annehmbaren Salzes davon als Wirkstoff zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung.
  6. 6. Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung, dadurch gekennzeichnet, dass man Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in einer Dosierung von 0,01 bis 1 g/Tag verabreicht.






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