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Dokumentenidentifikation DE69521520T2 25.04.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0789750
Titel BIOLOGISCHES PRODUKT ZUR PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN WEINSTABILISIERUNG
Anmelder Faculté d'Oenologie, Talence, FR
Erfinder MOINE, Virginie, F-33600 Pessac, FR;
DUBOURDIEU, Denis, F-33410 Beguey, FR
Vertreter Sparing . Röhl . Henseler, 40237 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 69521520
Vertragsstaaten AT, CH, DE, ES, GR, IT, LI, PT
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 27.10.1995
EP-Aktenzeichen 959366204
WO-Anmeldetag 27.10.1995
PCT-Aktenzeichen FR9501426
WO-Veröffentlichungsnummer 9613571
WO-Veröffentlichungsdatum 09.05.1996
EP-Offenlegungsdatum 20.08.1997
EP date of grant 27.06.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.04.2002
IPC-Hauptklasse C12H 1/14
IPC-Nebenklasse C12H 1/00   C12P 21/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung hat ein biologisches Produkt für die Behandlung von Wein und insbesondere für eine Verbesserung der Proteinstabilität von Weiß- und Roseweinen sowie für die Vermeidung von Tartratausscheidungen von Weißweinen, Roseweinen und Rotweinen zum Gegenstand.

Es ist bekannt, daß der Flaschenverkauf von Weinen nicht nur erfordert, daß der Wein bei der Abfüllung klar ist, sondern dies auch dauerhaft bleibt, insbesondere bei Weinen, die relativ lange aufbewahrt werden.

Nun ist aber bekannt, daß die derzeitigen Behandlungen zur Stabilisierung von Weinen wenig zufriedenstellend sind, was die Ausscheidungen von Tartratsalzen oder von Proteinen anbelangt, die in der Önologie als "Trub von Tartraten und Eiweißstoffen" bezeichnet werden.

Während der Lagerung von Weißweinen führt nämlich der Eiweißtrub zu Trübungen oder spezifischen Ausscheidungen, die in der Flasche sichtbar werden, wenn die Lagertemperatur des Weins erhöht ist, und/oder infolge der Anreicherung des Weins mit Gerbstoffen aus dem Korken.

Eine bekannte Lösung besteht darin, die Moste und Weine mit Bentonit zu behandeln; jedoch können die notwendigen Mengen in Abhängigkeit von den Erfordernissen so groß werden, daß sie ausreichen, die organoleptischen Eigenschaften der so behandelten Weine zu mindern.

Andere Versuche wurden auf enzymatischen Wege unter Nutzung von exogenen oder aus Hefen stammenden Proteasen durchgeführt, um die Proteine zu beseitigen, die für den Trub durch Eiweißstoffe verantwortlich sind, jedoch sind die Ergebnisse nicht zufriedenstellend gewesen.

Vor kurzem ist von den Erfindern der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt worden, daß eine festgestellte Verbesserung der Proteinstabilität von Weißweinen während der Reifung über Weißweinhefen der Anwesenheit von Mannoproteinen, die von den Hefen freigesetzt werden, zuzuschreiben ist.

Die Ausscheidungen von Tartrat-Salzen, die im wesentlichen in Form von Kaliumhydrogentartrat (Weinsteinsäure) vorkommen, liegen in den Weinen in einem übersättigten Zustand vor. Außerdem verursacht Frost während der Reifung im Winter kristalline Niederschläge; jedenfalls erscheint dieser Niederschlag jedoch auch im Laufe der Zeit und wird in den Flaschen sichtbar.

Es wurde nach Lösungen zur Stabilisierung derartiger Tartrat-Salze geforscht, wobei von diesen Lösungen derzeit drei bekannt sind.

Die erste Lösung besteht darin, durch eine Lagerung des Weins über mehrere Wochen bei Minusgraden das Ausscheiden zu beschleunigen und dann den Wein zu filtern, um die Kristalle zu entfernen.

Die zweite Lösung besteht in einer Verbesserung der ersten, indem dem Wein größere Mengen von Kristallen zugesetzt werden, so daß die Kältebehandlung wirksamer und ihre Dauer kürzer wird, wobei die Filterung obligatorisch bleibt, um die zugesetzten Kristalle sowie die gebildeten Kristalle zu entfernen.

Die dritte Lösung besteht darin, dem Wein Metaweinsäure zuzusetzen, die die Kristallisation von Tartrat-Salzen unter Kälteeinwirkung hemmt. Die schützende Wirkung geht verloren, sobald die Metaweinsäure hydrolysiert, was um so schneller geschieht, je höher die Lagerungstemperatur des Weins ist.

Diese Lösungen sind nicht zufriedenstellend, denn die beiden ersten sind langwierig und teuer, wobei sie außerdem die organoleptischen Eigenschaften des behandelten Weins verändern.

Was die dritte Lösung anbelangt, so ist, abgesehen von der Tatsache, daß in den Wein ein Fremdbestandteil einzubringen ist, der ursprünglich dort nicht vorhanden ist, ihre Wirksamkeit von kurzer Dauer und folglich Weinen vorbehalten, die zum alsbaldigen Verbrauch bestimmt sind.

Neuere Versuche haben gezeigt, daß die wärmeextrahierten Mannoproteine der Zellwände von zur Gattung Saccharomyzene cerevisiae gehörenden Hefen eine hemmende Wirkung auf die Kristallisation von Tartratsalzen haben.

Das Verfahren zur Darstellung dieser Mannoproteine besteht darin, sie durch Wärme bei 100ºC in einer wäßrigen Umgebung zu lösen und sie entweder direkt durch Gefriertrocknen oder durch Ausfällen mittels Ethanol und Trocknen des Niederschlags nach dem Zentrifugieren zu erhalten.

Jedoch ist die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Aufbereitungen, die in einer modellhaften Umgebung gezeigt worden ist, nicht für die Mehrzahl der Weine überprüft worden. Außerdem bringt diese Aufbereitung der Mannoproteine keine Verbesserung der Proteininstabilität von Weißweinen.

Aus der Veröffentlichung von D. R. Cameron u. a. "The Mannoprotein of Saccaromycenes cerevisiae is an effective bioemulsifier" in der Zeitschrift Applied and Environmental Microbiology, Bd. 54, Nr. 6, S. 1420-1425 (Juni 1988) ist ein Verfahren zum Erhalt von Hefe-Mannoproteinen bekannt, die durch enzymatische Digestion ganzer Hefezellen mittels Zymolase oder Zymolyase, die nur eine β-1-3- Glukanase ist, erhalten werden. Diese enzymatische Digestion ermöglicht folglich nur, Mannoproteine mit beschränkten Aktivitäten zu erhalten.

Außerdem ist ein im Journal international des Sciences de la vigne et du vin, Bd. 27, Nr. 1, S. 13-22 (1993) von S. Lubbers u. a. zum Thema "Effet colloideprotecteur d'extraits de parois de levures sur 1a stabilite tartrique d'une solution hydro-alcoolique modele veröffentlichter Artikel bekannt. Es handelt sich darin um wärmeextrahierte Mannoproteine, die keinen Erhalt der gesuchten Stabilisierungswirkungen ermöglichen. Die erzielten Ausbeuten sind nur für Versuche im Labormaßstab geeignet, ohne daß die Möglichkeit einer Überführung auf die Ebene der industriellen Produktion besteht.

Um den Stand der Technik zu vervollständigen, können weitere Veröffentlichungen angeführt werden, wie der im Journal international des Sciences de 1a vigne ef du vin, Bd. 26, Nr. 4, S. 239-251 (1992) von V. Ledoux u. a. veröffentlichte Artikel zum Thema "Interpretation de I'amelioration de la stabilite protéique des vins au cours de l'elevage sur lies" sowie in der Zeitschrift Carbohydrate polymers, Bd. 23, S. 185-191 (1994) ein Artikel von E. J. Waters u. a.: "A Saccharomyces mannoprotein that protects wine from protein haze".

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Behandlung von Weiß-, Rot- oder Roseweinen zu schaffen, um diese in bezug auf Tartrat- und Proteinausscheidungen mit einer hinreichend andauernden Wirkung zu stabilisieren, so daß diese als bleibend angesehen werden kann. Außerdem sieht die Behandlung die Zugabe eines biologischen Produkts vor, das mittels eines Verfahrens gemäß der Erfindung erhalten wurde, welches Produkte wirken läßt, die durch die Weine betreffende Gesetzgebung zugelassen sind, wobei dieses biologische Produkt geruchlos und in den Weinen vollständig löslich ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung eines Weins im Hinblick auf seine Stabilisierung in bezug auf Tartrat-Salze und Proteine dadurch gekennzeichnet, daß sie darin besteht, dem Wein Mannoproteine zuzusetzen, die durch enzymatische Digestion aus Zellwänden von Hefen extrahiert werden.

Diese Behandlung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie darin besteht, dem Wein Mannoproteine zuzusetzen, die durch enzymatische Digestion mittels eines Gemischs von β-1-3-Glukanasen und β-1-6-Glukanasen aus den Zellwänden von Hefen extrahiert werden.

Gemäß der Erfindung gehören die verwendeten Hefen zur Gattung Saccharomyzene cerevisiae, wobei die im Wein verwendete Menge kleiner als 30 g/hl ist.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Extrahieren der Mannoproteine durch enzymatische Digestion von Hefen für die Ausführung der Behandlung gemäß der Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

- die Hefezellwände in wäßriger Umgebung in Gegenwart von β- Glukanasen inkubiert werden,

- die Feststoffe abgetrennt werden,

- die flüssige Phase insbesondere durch Ultrafiltrierung konzentriert wird,

- ein zusätzlicher Schritt darin besteht, das erhaltene Produkt insbesondere durch Gefriertrocknung oder Zerstäubung zu trocknen, um beispielsweise die Handhabung zu erleichtern.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten β-Glukanasen vom Typ β-1-3-Glukanasen und β-1-6-Glukanasen sind.

Die Erfindung beschreibt außerdem ein Mannoprotein, das durch das Verfahren für die Durchführung der Behandlung gemäß der Erfindung erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse durch Flüssigkeitschromatographie bei hohem Druck mit molekularer Siebung das Vorhandensein einer charakteristischen Spitze zeigt, daß die Analyse durch Elektrophorese SDS PAGE das Vorhandensein zweier Proteine mit 41600 und 31800 Daltons zeigt und daß die Analyse durch Kapillar-Elektrophorese das Vorhandensein einer charakteristischen Spitze, die dem Mannoprotein von 31800 Daltons entspricht, zeigt.

Die Behandlung gemäß der Erfindung sowie eine besondere Ausführungsform des Verfahrens zum Extrahieren der für diese Behandlung erforderlichen Mannoproteine sind nachfolgend beschrieben.

- Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm der Flüssigkeitschromatographie bei hohem Druck mit molekularer Siebung der durch enzymatische Digestion extrahierten Mannoproteine;

- Fig. 2 zeigt ein Chromatogramm von wärmeextrahierten Mannoproteinen;

- Fig. 3 zeigt den Graphen, der durch Kapillarelektrophorese der durch enzymatische Digestion extrahierten Mannoproteine (MEE) erhalten wird im Vergleich zu dem Graphen der wärmeextrahierten Mannoproteine (MEC);

- Fig. 4 zeigt die durch Natriumchlorid-Eluierung erhaltenen Proteinfraktionen;

- Fig. 5 zeigt den Trübungsindex (NTU) für den unbehandelten Wein sowie für mit den verschiedenen Fraktionen behandelten Weine;

- Fig. 6 zeigt die durch Eluierung mit α-D-Mannosid erhaltenen Proteinfraktionen;

- Fig. 7 zeigt den Trübungsindex (NTU) für den unbehandelten Wein sowie für die mit den verschiedenen Fraktionen behandelten Weine;

- Fig. 8 ist ein Vergleich der MP 32-Konzentration in den verschiedenen Fraktionen;

- Fig. 9 zeigt den Prozentsatz an MP 32 in den MEC und den MEE. Nachfolgend wird nun das Verfahren gemäß der Erfindung nach einer besonderen Ausführungsform beschrieben.

Hefezellwände, insbesondere von Saccharomyzene cerevisiae, werden bei 40ºC in Wasser unter Anwesenheit eines β-Glukanase-Präparats, das insbesondere von der Firma Novo unter der Handelsbezeichnung "Glucanex®" vertrieben wird, inkubiert.

Dieses Präparat enthält exogene β-(1-3)-Glukanase-Aktivitäten, endogene β-(1-3)-Glukanase-Aktivitäten und exogene β-(1-6)-Glukanase-Aktivitäten. Dann werden die Feststoffe abgetrennt.

Die flüssige Phase wird anschließend insbesondere durch Ultrafiltrierung konzentriert.

Die Trockenmasse des Produktes entspricht in etwa 50% der anfangs in den Ansatz gegeben Masse an Zellwänden.

Das Produkt besteht zu 88% aus Polysacchariden, zu 4% aus Proteinen und zu 8% aus nicht dosierten Bestandteilen, was sicherlich dem Hydratationsgrad des Produkts entspricht.

Das Produkt ist geruchlos, in Wasser und in Weinen löslich und setzt die für die Filtrierung des Weins verwendeten Filteroberflächen nicht zu.

Mit Bezug auf die Fig. 1 und 2 ist ein beträchtlicher Unterschied zwischen den Graphen festzustellen, die für jede dieser Figuren durch spektrometrisches Erfassen der Proteine bei 225 nm und refraktometrisches Erfassen der Polysaccharide aufgezeichnet worden sind.

Der Graph der Fig. 2 zeigt nämlich eine erste Spitze (X), die dem Leervolumen der Kolonne entspricht und eine zweiten Spitze (Z), die dem Gesamtvolumen der Kolonne entspricht.

Es ist festzustellen, daß der Graph der Fig. 1 eine zweite Spitze (Y) in unmittelbarer Nähe der Spitze (X) des Leervolumens der Kolonne aufweist, die dem Graphen der Fig. 3 fehlt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung hat das Extrahieren und Konservieren eines bestimmten Mannoproteins ermöglicht.

Andererseits zeigen die mittels Kapillar-Elektrophorese unter nicht denaturierenden Bedingungen über eine Quarzgut-Kolonne analysierten Mannoproteine, die durch enzymatische Digestion extrahiert worden sind, eine Spitze (W), die dem Mannoprotein entspricht, das für die Wärmebeständigkeit der Proteine von Weißwein verantwortlich ist. Diese Spitze fehlt hingegen bei der ebenfalls mittels Kapillar-Elektrophorese durchgeführten Analyse der wärmeextrahierten Mannoproteine.

Anschließend wurden Untersuchungen durchgeführt, die die Wirkungen der auf enzymatischem Wege aus verschiedenen Hefestämmen, die sämtliche der Gattung Sacharomyzene cerevisiae angehören, extrahierten Mannoproteine, der sogenannten "MEE", in bezug auf die Tartrat-Stabilisierung einerseits und in bezug auf die Protein-Stabilisierung andererseits betreffen.

I/Tartrat-Stabilisierung

Es sind zwei Typen von Untersuchungen bekannt:

1. Bestimmung des Tartrat-Stabilitäts-Index

In die zu untersuchenden Proben wird in veränderlichen Mengen Kaliumbitartrat gegeben, das durch Erwärmen auf 30ºC gelöst wird, danach wird auf -4ºC abgekühlt.

Je stabiler das Milieu ist, desto größer ist die Menge an Kaliumbitartrat, die erforderlich ist, um die Kristallisation auszulösen.

Die Bewertung der Kristallisation erfolgt visuell oder durch flammenphotometrische Bestimmung des Konzentrationsunterschieds an Kalium des gefilterten Weins, bevor und nachdem dieser der Kälte ausgesetzt worden ist.

Ein Wein wird als stabil angesehen, wenn die Zugabe von 75 mg Kaliumbitartrat auf 100 ml Probe keine Kristallisation hervorruft.

Versuch im Modellmilieu

Die nachfolgend gegebenen Versuchsergebnisse geben Aufschluß über 100 ml eines hydro-alkoholischen Modellmilieus, zusammengesetzt aus:

- 1,1 g/l Kaliumchlorid,

- 2,1 g/l Weinsäure und

- 10,5% Ethanol.

Der veränderliche Parameter ist die Menge an Kaliumhydrogentartrat (KHT), die in Dosierungen von 0, 50, 75, 100 und 125 mg zugegeben wird. Die Proben werden im Vergleich untersucht, wobei Metaweinsäure, wärmeextrahierte Mannoproteine (MEC) und durch enzymatische Digestion extrahierte Mannoproteine (MEE) dreier Sorten zugegeben werden.

Die Ergebnisse der nachstehenden Tabelle geben die Konzentrationsunterschiede an Kalium (mg/l) der Proben vor und nach der Kältebehandlung wieder.

Es ist festzustellen, daß in dem synthetischen Milieu die Ausscheidung von Kaliumbitartrat durch die Metaweinsäure vollständig verhindert wird - eine Hemmung aber auch durch die mittels enzymatischer Einwirkung extrahierten Mannoproteine erfolgt, selbst wenn die Wirksamkeit bei gleicher Dosierung etwas geringer ist.

Versuch mit einem Weißwein

Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse, die mit Metaweinsäure, wärmeextrahierten und durch enzymatische Digestion extrahierten Mannoproteine erzielt worden sind.

Es ist festzustellen, daß die unbehandelte Probe eine Tartratausscheidung ab einer Zugabe von 50 mg/l zeigt, was auf einen besonders instabilen Wein hindeutet.

Die Metaweinsäure sowie eines der mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine sind in der Lage, die Ausscheidung bis zu Zugaben von 125 g/hl zu verhindern.

Die übrigen mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine führen ebenfalls zu sehr guten Ergebnissen, da jeder Wein, der bei einer Menge von 75 g/hl nicht ausfällt, als stabil angesehen wird.

Die wärmeextrahierten Mannoproteine besitzen selbst bei hoher Dosierung keine Wirksamkeit.

2. Ermittlung des Verhaltens bei Kälteeinwirkung

Diese Prüfung des Verhaltens bei Kälteeinwirkung besteht darin, die Proben 6 Tage lang bei -4ºC kalt zu halten, nachdem diese über eine Membran mit einer Porigkeit von 1 um filtriert worden sind.

Eine fehlende Kristallisation unter diesen Bedingungen erlaubt, den geprüften Wein als stabil anzusehen.

Die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen die für verschiedene Weiß-, Rose und Rotweine erzielten Resultate.

***: Kristallisation

u: unbestimmt

0: keine Kristallisation

Es ist festzustellen, daß die mittels enzymatischer Digestion aus den Hefezellwänden extrahierten Mannoproteine in einer Menge von 25 g/hl die Bildung von Kristallen verhindern.

Zudem kann das visuelle Ergebnis bestätigt werden, indem die Differenz der Konzentration der Weine an Kalium in mg/l vor und nach der Kältebehandlung bestimmt wird, wie in den folgenden Tabellen gezeigt ist.

Mit dem Weißwein Nr. 3 erzielte Ergebnisse:

Mit dem Roséwein Nr. 1 erzielte Ergebnisse:

Die mit den Rotweinen Nr. 1, 2 und 3 erzielten Ergebnissen entsprechen einem nicht geschönten Rotwein, einem mit 10 g/hl Gelatine geschönten Rotwein und einem mit 10 g/hl Eiweiß geschönten Rotwein.

Es ist festzustellen, daß Metaweinsäure ab 25 g/hl zu guten Ergebnissen führt.

Die mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine besitzen ebenfalls eine ausgezeichnete Wirksamkeit bei einer Menge von 25 g/hl, was gleich der Konzentration ist, die eine vollständige Stabilisierung der drei Weiß-, Rose- und Rotweine ermöglicht.

Die mittels Wärme und Gummiarabicum extrahierten Mannoproteine verhindern in akzeptablen Mengen die Tartrat-Ausscheidung nicht vollständig.

3. Dauerhaftigkeit der Wirksamkeit

Die Versuche haben ermöglicht, die Wirksamkeit der Metaweinsäure und der mittels enzymatischer Digestion erhaltenen Mannoproteine zu vergleichen.

Der Test besteht darin, eine behandelte Probe 10 Wochen lang bei 30ºC unterzubringen und sie anschließend der Kälte auszusetzen. Die Menge an Kalium vor und nach der Kältebehandlung ermöglicht die Feststellung der Tartrat- Stabilität des mit dem Extrakt (MEE1) behandelten Weins sowie die Instabilität des unbehandelten oder des mit Metaweinsäure behandelten Weins. Während des Aufenthalts bei 30ºC hydrolysiert nämlich die Metaweinsäure und verliert ihr Schutzvermögen; außerdem wird Weinsäure freigesetzt, die die Übersättigung des Weins verstärkt und die Kristallisation von Tartrat sogar noch begünstigt.

Konzentrationsunterschied an Kalium (m/l) nach 6 Tagen bei -4ºC

unbehandelte Probe 200

Metaweinsäure 10 g/hl 260

MEE1 25 g/hl 0

II/Protein-Stabilisierung

Die Proteinstabilität der Weine wird anhand eines sogenannten Wärmetests geschätzt, der darin besteht, den Wein 30 min lang einer Temperatur von 80ºC auszusetzen. Die Trübung wird nephelometrisch gemessen und in Einheiten (NTU) ausgedrückt. Es wird die Menge an Bentonit zugeordnet, die notwendig ist, damit das Ergebnis der Trübungsmessung unter 2 NTU bleibt.

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse, die für drei mit verschiedenen Mannoproteinen behandelte Weißweine erzielt worden sind.

Die Ergebnisse zeigen für die mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine gut die Verringerung der Menge an Bentonit, die erforderlich ist, um eine Stabilität des Weins zu erzielen. Die Verringerung der Menge an Bentonit beträgt etwa 50%.

Infolgedessen werden die organoleptischen Eigenschaften weniger beeinträchtigt, und insbesondere werden die Weine ohne Veränderung des Geschmacks dauerhaft stabilisiert, da die mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine geschmacksneutral sind.

Die durchgeführten Versuche zeigen sämtliche Vorteile, die durch die mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine geboten werden, sowohl hinsichtlich der Verhinderung von Tartratsalzen als auch hinsichtlich der Proteinstabilisierung von Weißweinen, und dies mit geringen Mengen.

Es empfiehlt sich nun, die mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine genauer zu untersuchen, um die Fraktion aufzuzeigen, die sowohl in bezug auf die Tartrat-Salze als auch auf die Proteinstabilität die größte Wirksamkeit besitzt.

Zuvor kann die Zusammensetzung der Präparate der mittels Wärme und der auf enzymatischem Wege extrahierten Mannoproteine direkt verglichen werden. Aus der nachfolgenden Tabelle ist festzustellen, daß die mittels enzymatischer Digestion erhaltenen Mannoproteine einen deutlich höheren Proteingehalt besitzen.

Der Proteingehalt ist jeweils mit der BRADFORD-Methode (1976), der Gehalt an Polysacchariden mit der Phenylschwefelsäure-Methode (MONTREUL und SPIK, 1963) bestimmt worden.

Die Glykosidzusammensetzung des Polysaccharidanteils ist durch Gaschromatographie der durch Hydrolyse durch Trifluoressigsäure und Derivate freigesetzten Monosaccharide mittels Silylierung (LLAUBERS, 1988) bestimmt worden.

Die Präparate der wärmeextrahierten Mannoproteine (MEC) und der auf enzymatischem Wege extrahierten Mannoproteine (MEE) sind im einzelnen mittels Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) untersucht worden, wodurch eine molekulare Siebung möglich ist, deren Ergebnis in der untenstehenden Tabelle angegeben ist.

Molekülmassen in kDa (Kilodaltons)

MEC MEE

77,8 77,8

70

44,1 44,1

41,6

35,2 35,2

31,8 31,8

30, 3

27,5 27,5

25,2 25,2

23,2 23,2

21,3 21,3

19,8 19,8

18,4 18,4

17,2 17,2

16 16

15,2 15,2

Es wird das Fehlen des Proteins mit 70 kDa bei den MEE's und das Fehlen der Proteine mit 30,3 kDa und 41,6 kDa bei den MEC's festgestellt. Diese besonderen Proteine der MEE's werden dann durch Fraktionieren isoliert.

1. Versuch: Chromatographie über DEAE-Sepharose® (eingetragener Handelsname)

Das Rohextrakt der MEE's (100 mg) wird in 1 ml Phosphatpuffer, pH 8,0 gelöst.

Die DEAE-Kolonne wird gewaschen und danach stufenweise mit NaCl 0,25 Mol/l, anschließend mit 0,5 Mol/l eluiert. Es werden Fraktionen von 3 ml aufgefangen und die Proteine durch Absorptionsmessung bei 280 nm erfaßt. Die Fraktionen, die jeweils einer der drei Spitzen entsprechen, werden zusammengestellt, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet (siehe Fig. 4).

25 g/hl werden einem Wein zugesetzt, der anschließend einem Wärmetest unterzogen wird, um das Proteinstabilisierungsvermögen zu bestimmen. Die Trübung wird in NTU gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt.

Festgestellt wird das Proteinstabilisierungsvermögen der mit 0,25 M/l NaCl eluierten Fraktion sowie eine geringe Wirkung der nicht zurückgehaltenen Fraktion (FNR) und der mit 0,5 M/l eluierten Fraktion.

Der Gehalt der MEE's und jeder der eluierten Fraktionen an Proteinen und an Polysacchariden konnte bestimmt werden.

Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, enthält die aktive Fraktion bei 0,25 M/l 16% Proteine und 78% Polysaccharide, wobei ihre Extraktionsausbeute etwa 60% beträgt.

Folglich wird versucht, die Fraktion 0,25 M/l NaCl mittels Affinitätschromatographie mit Hilfe von Concanavalin A (Con A), einem Lektin, das sich reversibel an Moleküle bindet, die α-D-Mannopyranosyl- und α-D-Glykopyranosyl-Residuen enthalten, zu raffinieren.

So können die Proteine und die Mannoproteine dieser speziellen Fraktion 0,25 M/l NaCl voneinander getrennt werden.

Der Extrakt 0,25 M/l NaCl (60 mg) wird in 1 ml Citratpufferlösung pH 5 gelöst und auf die Kolonne der Con A-Sepharose® gegeben.

Nach dem Waschen mit der Pufferlösung, um die Proteine zu eluieren, wird diese einer Lösung von α-D-Mannosid mit 0,5 M/l unterzogen.

Die Mannoproteine werden aus dem Gel eluiert. Fraktionen von 3 ml werden aufgefangen, und die Absorptionsanalyse bei 280 nm ergibt die durch die Kurve von Fig. 6 gegebenen Resultate.

Die Fraktionen, die jeweils einer Spitze entsprechen, werden zusammengestellt, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.

Jede dieser Fraktionen wird in einer Menge von 25 g/hl zugesetzt.

Der Wärmetest ergibt die Resultate von Fig. 7.

Die zurückgehaltene Fraktion wird mittels 1'-α-D-Mannosid 0,5 M/l eluiert.

Diese Fraktion sowie die übrigen werden nach Proteinen und Polysacchariden aufgeteilt.

Die aktive Fraktion stellt 15% der MEE's dar.

Diese Fraktion enthält 8% Proteine und 90% Mannose.

Wie zuvor kann eine Gel-Elektrophorese (SDS PAGE) durchgeführt werden, die zeigt, daß das Mannoprotein, das für die Proteinstabilität der Weißweine verantwortlich ist, eine Molekülmasse von 31,8 kDa oder MP 32 besitzt. Es ist das einzige Protein, dessen Konzentration sich im Verlauf der Raffination erhöht.

Molekülmassen KDa

Die Kapillarelektrophorese bestätigt, daß das MP 32 mit 2% in den MEG und mit 14% in den MEE's auftritt; siehe Fig. 9.

Was die Tartrat-Stabilisierung anbelangt, so werden die Mannoproteine durch Flüssigkeitschromatographie bei hohem Druck mit molekularer Siebung entsprechend ihrer Größe in zwei Fraktionen getrennt, die gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet werden.

Die erhaltenen Fraktionen P1 und P2 werden in verschiedenen Mengen einem Weißwein zugesetzt. Die behandelten Weine werden einem Kältetest unterzogen und die Kaliumkonzentration ermöglicht eine Schätzung der Tartrat- Kristallisation.

Es wird angemerkt, daß nach der Analyse die MEE die Kristallisation von Kaliumtartrat ab 15 g/hl verhindern. Die erste Fraktion P1 erzielt keine Hemmung dieser Kristallisation, hingehen ermöglicht die Fraktion P2 eine Tartrat- Stabilisierung mit einer Menge von 5 g/hl.

Die Analyse der in den verschiedenen Fraktionen enthaltenen Proteine und Polysaccharide führt zu folgenden Ergebnissen:

Die Fraktion P2, die eine Tartrat-Stabilisierung erlaubt, wird mittels Affinitätschromatographie mit Hilfe von Concanavalin A (Con A) in zwei Fraktionen getrennt, eine zurückgehaltene Fraktion (FR) und eine weitere, auf dem Lektin nicht zurückgehaltene Fraktion (FNR), die aufgefangen, dialysiert und gefriergetrocknet werden.

Nachdem diese in verschiedenen Mengen einem Wein zugesetzt worden sind, bestätigt sich, daß die nicht zurückgehaltene Fraktion (FNR) kein Verhindern der Kristallisation der Salze der Weinsäure ermöglicht.

Die zurückgehaltene Fraktion (FR) hingegen ermöglicht in einer Menge von 1,25 g/hl, die Kristallisation zu verhindern.

Die Zusammensetzung der aktiven Fraktionen kann erneut analysiert werden.

Folglich enthält die aktive Fraktion 2,5% Proteine und 97,5% Polysaccharide.

Es empfiehlt sich daher, mittels Gelelektrophorese die molekularen Produkte der raffinierten Fraktionen zu bestimmen.

Molekülmassen in kDa Kilodaltons

Die aktive Fraktion enthält folglich nur vier Mannoproteine, deren Molekülmassen 41,6; 31,8; 17,2; 15,2 kDa betragen.

Das einzige Protein, dessen Konzentration sich erhöht, ist dasjenige mit 41,6 kDa. Es ist folglich das Mannoprotein, das für die Tartrat-Stabilisierung verantwortlich ist.

Nun kann aber dieses Molekül nur und ausschließlich mittels eines Komplexes von β-(1-3) und β-(1-6)-Glukanasen aus der Zellwand von Hefen extrahiert werden.

Dies erlaubt zu erklären, warum die mittels enzymatischer Digestion extrahierten Mannoproteine dieses zweifache Stabilisierungsvermögen gegenüber Weinen besitzen und warum sie einen so großen Vorteil darstellen, wenn in Erinnerung gerufen wird, daß die in diesem Verfahren eingesetzten Produkte bereits bei den für diesen Nahrungsmittelsektor verantwortlichen Organisationen zugelassen sind.


Anspruch[de]

1. Behandlung eines Weins im Hinblick auf seine Stabilisierung gegenüber Tatrat-Salzen und Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß sie darin besteht, dem Wein Mannoproteine zuzufügen, die aus Hefewänden durch enzymatische Digestion mittels einer Mischung aus β-1-3- und β-1-6-Glukanasen extrahiert werden.

2. Behandlung eines Weins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe zur Gattung der Saccharomyzene cerevisiae gehört.

3. Behandlung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die im Wein verwendete Menge der Mannoproteine kleiner als 30 g/hl ist.

4. Verfahren zum Extrahieren von Mannoproteinen durch enzymatische Digestion von Hefen für die Ausführung der Behandlung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß:

- die Hefewände in wäßriger Umgebung in Gegenwart von β-1-3- und β-1-6 Glukanasen inkubiert werden,

- die Festkörperstoffe getrennt werden,

- die flüssige Phase insbesondere durch Ultrafiltrierung konzentriert wird.

5. Verfahren zum Extrahieren von Mannoproteinen durch enzymatische Digestion von Hefen für die Ausführung der Behandlung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzlicher Schritt darin besteht, das erhaltene Produkt insbesondere durch Gefriertrocknung oder Zerstäubung zu trocken, um beispielsweise die Handhabung zu erleichtern.

6. Mannoprotein, das durch das Verfahren nach Anspruch 4 oder 5 erhalten wird, für die Ausführung der Behandlung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse durch Flüssigkeitschromatographie bei hohem Druck mit molekularer Siebung das Vorhandensein einer charakteristischen Spitze (Y) zeigt, daß die Analyse durch SDS-PAGE-Elektrophorese das Vorhandensein zweier Proteine mit 41600 und 31800 Daltons zeigt und daß die Analyse durch Kapillar-Elektrophorese das Vorhandensein einer charakteristischen Spitze, die dem Mannoprotein mit 31800 Daltons entspricht, zeigt.







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