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Dokumentenidentifikation DE69613305T2 02.05.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0768384
Titel Verbesserte enzymatische Kupplungsreaktion von N-geschützte L-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester
Anmelder Holland Sweetener Co. V.o.F., Maastricht, NL
Erfinder Harada, Tsuneo, Shinnanyo-shi, Yamaguchi-ken, JP;
Irino, Shigeaki, Kumage-gun, Yamaguchi-ken, JP;
Kunisawa, Yukio, Shinnanyo-shi, Yamaguchi-ken, JP;
Oyama, Kiyotaka, Ohta-ku, Tokyo, JP
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 69613305
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.09.1996
EP-Aktenzeichen 962026530
EP-Offenlegungsdatum 16.04.1997
EP date of grant 13.06.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.05.2002
IPC-Hauptklasse C12P 21/02

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung Bereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von N- geschütztem L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch enzymatisches Koppeln einer N-geschützten L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester in einer wässerigen Lösung mit Bildung eines Niederschlags unter Verwendung eines Thermolysin-ähnlichen Proteaseenzyms. Die Erfindung betrifft ebenfalls solch einkontinuierliches Verfahren zur Herstellung von N-geschütztem L- Aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch enzymatisches Koppeln einer N- geschützten L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester in einer wässerigen Lösung mit Bildung eines Niederschlags unter Verwendung eines Thermolysin-ähnlichen Proteaseenzyms.

Beschreibung des verwandten Stands der Technik

Aspartam, der α-Dipeptidester L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (hiernach auch als APM bezeichnet), ist ein wichtiger, synthetischer, kalorienarmer Süssstoff, welcher etwa 200 mal so süss wie Zucker ist und ein aussergewöhnlich gutes Geschmacksmuster aufweist, ohne beispielsweise einem bitteren Nachgeschmack. Der Süssstoff wird als solcher in einer grossen Bandbreite an Produkten verwendet, wie alkoholfreien Getränken, Süsswaren, Tafelsüssstoffen, pharmazeutischen Produkten und ähnlichem.

Aspartam kann durch verschiedene bekannte Wege hergestellt werden. US-Patent Nr. 4212945 beschreibt die enzymatische Kopplungsumsetzung einer N-geschützten L-Asparaginsäure (X-Asp) und L- oder DL-Phenylalaninmethylester (PM) in einem wässerigen Medium mit Bildung eines Niederschlags in Anwesenheit eines Thermolysinenzyms. In diesem Fall ist der Niederschlag eine Additionsverbindung von X-APM (dem Kopplungsprodukt von X-Asp und PM) und PM. Bestimmte Niederschläge sind daher als Zwischenstoffe in der Herstellung von Aspartam brauchbar. Bildung eines Niederschlags während der enzymatischen Kopplungsumsetzung ist vorteilhaft, da das Gleichgewicht der Kopplungsumsetzung dadurch in Richtung des gewünschten Kopplungsprodukts verschoben wird.

Es ist bekannt, dass wenn enzymatische Kopplungsumsetzung unter Rühren durchgeführt wird, die Enzymwirksamkeit merklich verringert wird und Rückgewinnung von wirksamem Enzym daher nicht zufriedenstellend ist. Um solch einen Nachteil zu überwinden, ist in der offenbarten japanischen Patentanmeldung Nr. 55-19051 vorgeschlagen worden, die enzymatische Kopplungsumsetzung ohne Rühren durchzuführen, also sozusagen statisch. Jedoch ist dieses Verfahren nachteilig, da der Niederschlag von Produkt die Bildung eines mehr oder wenig vollständig erstarrten Umsetzungsgemisches ergibt und die Rückgewinnung von Enzym, welches in den verwickelten Kristallen gefangen ist, sehr schwierig ist.

Für die Rückgewinnung des Enzyms sind verschiedene Verfahren bekannt: (i) ein Verfahren, in welchem das Umsetzungsgemisch nach der Umsetzung filtriert wird, um den festen Niederschlag aus der wässerigen Phase zu isolieren und zurückzugewinnen, welche nicht umgesetztes Ausgangsmaterial und Enzym enthält; (ii) ein Verfahren, in welchem ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zu dem Umsetzungsgemisch zugegeben wird, welches in der Lage ist, den Niederschlag zu lösen und zu extrahieren, so dass der ursprüngliche Niederschlag aus der organischen Phase zurückgewonnen wird und das Enzym aus der wässerigen Phase (offenbarte japanische Patentanmeldung Nr. 54-11295) oder so, dass die organische Phase selektiv durch einen selektiven Durchlässigkeitsfilm passieren kann (JP-A-60- 118190); und (iii) ein Verfahren, in welchem ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel mit niedriger Löslichkeit für den Niederschlag zu dem Umsetzungssystem zugegeben wird, nachdem die Kopplungsumsetzung fast vollendet ist, und der Niederschlag durch Fest-Flüssig-Trennung isoliert wird, wonach des Enzym aus der wässerigen Phase zurückgewonnen wird (EP-A- 0075160, japanische Patentanmeldung Nr. 2-12238). Das niedergeschlagene Produkt wird dann durch Schritte in APM umgewandelt, welche die Entfernung der Schutzgruppe durch per se bekannte Verfahren einschliessen. Das zurückgewonnene Enzym wird vorzugsweise in der nächsten Kopplungsumsetzung wiederverwendet.

Jedoch ist in allen Fällen oben die Enzymrückgewinnung aus den Umsetzungsaufschlämmungen usw. nicht zufriedenstellend. Es ist bei der Rückgewinnung von Enzym beobachtet worden, dass starke Enzymdeaktivierung während und nach der Kopplungsumsetzung unter Verwendung eines Thermolysin-ähnlichen Proteaseenzyms stattfindet. Die Leistungsfähigkeit solch eines Enzyms ist somit unzureichend, was wirtschaftlich ein ernstes Problem darstellt. Darüber hinaus erfordern alle oben erwähnten Verfahren eine chargenweise enzymatische Kopplungsumsetzung. Dementsprechend gibt es einen starken Bedarf zum Vorsehen eines Verfahrens, welches die Wirkungen von Enzymdeaktivierung während und nach der Kopplungsumsetzung deutlich verringert (ohne deutlich negative Wirkungen auf die Kopplungsumsetzung selbst), und welches es darüberhinaus ermöglichen würde, das Verfahren zur enzymatischen Kopplung von X-Asp und PM auf eine kontinuierliche Weise durchzuführen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder haben detaillierte Untersuchungen bezüglich der Deaktivierung von Thermolysin-ähnlichem Proteaseenzym während und nach der Kopplungsumsetzung durchgeführt. Das Lösen dieses Problems durch gewöhnliche Methoden, wie zum Beispiel durch Kontrollieren oder Anpassen der Rührbedingungen, Umsetzungstemperatur und Umsetzungszeit erwiesen sich als sehr schwierig.

Überraschender Weise ist nun herausgefunden worden, dass es möglich ist, das Verfahren zur Herstellung von N-geschütztem L-Aspartyl-L- phenylalaninmethylester durch enzymatisches Koppeln einer N-geschützten L- Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester in einer wässerigen Lösung mit Bildung eines Niederschlags unter Verwendung eines Thermolysinähnlichen Proteaseenzyms zu verbessern, falls ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zugegeben wird zu und vermischt wird mit dem Umsetzungssystem, während der Bildung des Niederschlags im Laufe der Kopplungsumsetzung, und bevor die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 85% erreicht hat, wobei das organische Lösungsmittel eine relativ hohe Affinität für den Niederschlag aufweist und ausgewählt wird aus der Gruppe der aromatischen Kohlenwasserstoffe, C&sub3;&submin;&sub6;-Ketone, C&sub3;&submin;&sub6;Alkohole, C&sub1;&submin;&sub6;-Kohlenwasserstoffhalogenide und C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;-Estern, oder Gemischen daraus.

Dieses Ergebnis ist unter anderem überraschend, da es weitestgehend akzeptiert ist, dass Zugabe eines organischen Lösungsmittels dazu neigt, die enzymatische Wirksamkeit des verwendeten Enzyms merklich zu verringern. Die Erfinder haben nun herausgefunden, dass Zugabe eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, selbst wenn es in geringen Mengen angewendet wird, während des Verlaufs der enzymatischen Kopplungsumsetzung von X-Asp und PM zu deutlicher Verbesserung der Leistungsfähigkeit des verwendeten Enzyms führt, in dem Rückgewinnung von wirksamem Enzym erhöht wird, ohne irgendwelchen wesentlichen negativen Effekte auf die Kopplungsumsetzung selbst. Zusätzlich wurde überraschenderweise herausgefunden, dass Kristallpartikel, die während der Kopplungsumsetzung gebildet werden, grösser und dicker sind, als wenn kein organisches Lösungsmittel zugegeben wird; dies ist in dem benötigten Fest- Flüssig-Trennungsschritt vorteilhaft.

Somit wird das Verfahren zur Herstellung von N-geschütztem L- Aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch enzymatisches Koppeln einer N- geschützten L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester in einer wässerigen Lösung mit Bildung eines Niederschlags unter Verwendung eines Thermolysin-ähnlichen Proteaseenzyms wesentlich verbessert.

Ohne sich selbst auf eine bestimmte Theorie festzulegen, glauben die Erfinder nun, dass die verbesserte Leistungsfähigkeit des Enzyms eine Folge von einer Kombination der folgenden Faktoren sein kann: (i) in der Abwesenheit des organischen Lösungsmittels widerfährt dem fortschreitend während des Verlaufs der Umsetzung gebildeten Niederschlag Adsorption von Enzym; dieser Effekt scheint während einer statischen Kopplungsumsetzung sehr ausgeprägt zu sein; und (ii) in der Abwesenheit des organischen Lösungsmittels findet ernsthafte Deaktivierung des Enzyms in adsorbierier Form unter mechanischen Einflüssen von Rühren statt, wenn die Viskosität des Umsetzungssystems dazu neigt, sich stark während der mittleren und letzten Stufen der Kopplungsumsetzung zu erhöhen. Beide Effekte können die Leistungsfähigkeit des Enzyms stark beeinflussen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von N-geschütztem L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester durch enzymatisches Koppeln einer N-geschützten L-Asparaginsäure und L- oder DL- Phenylalaninmethylester in einer wässerigen Lösung mit Bildung eines Niederschlags unter Verwendung eines Thermolysin-ähnlichen Proteaseenzyms, wobei ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zugegeben wird zu, und vermischt wird mit dem Umsetzungssystem während der Bildung des Niederschlags im Verlauf der Kopplungsumsetzung und bevor die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 85% erreicht hat, das organische Lösungsmittel eine relativ hohe Affinität für den Niederschlag aufweist, und ausgewählt wird aus der Gruppe der aromatischen Kohlenwasserstoffe, C&sub3;&submin;&sub6;-Ketone, C&sub3;&submin;&sub6;-Alkohole, C&sub1;&submin; &sub6;-Kohlenwasserstoffhalogenide und C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;-Ester, oder Gemischen daraus.

Wie hierin verwendet, bedeutete wässerige Lösung ein Lösung in Wasser. Wie hierin verwendet, bedeutet Thermolysin-ähnliches Proteaseenzym ein neutrales Metallproteaseenzym mit Peptid-Kopplungswirksamkeit bei der Bildung von X-APM, zum Beispiel das nprM-Gen von Bacillus stearothermorphilus (Kubo, J. Gen. Microbiol. 134, 1883-92 (1988)) oder von Bacillus thermoproteolyticus, oder geeignete Mutanten davon; diese Enzyme sind im Handel erhältlich, z. B. von Amano und von Daiwa. Als zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren geeignete L-Asparaginsäure N-schützende Gruppen können zum Beispiel Benzyloxycarbonyl, Benzyl, Acetyl, Formyl, p- Methoxybenzyloxycarbonyl und t-Butoxycarbonyl genannt werden. Vorzugsweise wird Benzyloxycarbonyl ("Z") als die N-schützende Gruppe verwendet. Die Umsetzungstemperatur während der enzymatischen Kopplungsumsetzung liegt üblicherweise im Bereich von 5 bis 50ºC.

Die mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, die während der Bildung von Niederschlag im Verlauf der Kopplungsumsetzung zu dem Reaktionssystem zugegeben und damit vermischt werden müssen, bilden eine zweite flüssige Phase unter den Umsetzungsbedingungen (z. B. bei der Konzentration von Reaktanten, Salz usw., wie vorhanden) und sollten eine relativ hohe Affinität für den Niederschlag aufweisen. Eine relativ hohe Affinität für den Niederschlag, wie es hier verwendet wird, ist so gemeint, dass das organische Lösungsmittel, falls es in kleinen Mengen zu dem wässerigen Umsetzungssystem zugegeben wird, vorzugsweise dazu neigt, die Niederschlagspartikel zu umgeben. Das organische Lösungsmittel kann ein gutes Lösungsmittel für den Niederschlag sein, wenn es in grossen Mengen verwendet wird, aber es wird bevorzugt, dass die Löslichkeit des Niederschlags in dem organischen Lösungsmittel bei der gewählten Temperatur eher niedrig ist. Geeignete Beispiele für organische Lösungsmittel, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol oder Toluol, C&sub3;&submin;&sub6;- Ketone, wie Methylisobutylketon (MIBK) oder Diisobutylketon, C&sub3;&submin;&sub6;-Alkohole, wie Isopropanol und t-Butanol, C&sub1;&submin;&sub6;-Kohlenwasserstoffhalogenide, wie Chloroform oder 1,3-Dichlorpropan und C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;-Ester ebenso, wie Gemische daraus. Organische Lösungsmittel mit einer höheren Affinität für den Niederschlag werden bevorzugt. Toluol hat die höchste Affinität für den Niederschlag, und wird daher am meisten bevorzugt. MIBK wird ebenfalls bevorzugt, da dieses Lösungsmittel in sogar noch geringeren Mengen angewendet werden kann als Toluol, und sehr gute Trennung der wässerigen und organischen Schichten ergibt, und die Kristallpartikel sehr gross sind.

Gemäss der vorliegenden Erfindung sollte das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel zugegeben werden zu und vermischt werden mit dem Umsetzungssystem während der Bildung des Niederschlags im Verlauf der Kopplungsumsetzung, also nachdem sich etwas Niederschlag bereits gebildet hat. Zugeben und Vermischen ist wichtig um sicherzustellen, dass das organische Lösungsmittel bevorzugt die niedergeschlagenen Partikel umgibt. Es ist überraschend, dass sehr grosse Kristallpartikel während des Verlaufs der Kopplungsumsetzung gebildet werden.

Gemäss der vorliegenden Erfindung braucht nur eine kleine Menge des organischen Lösungsmittels zu dem Aufschlämmungsgemisch des Umsetzungssystems zugegeben werden, um gute Ergebnisse zu erzielen. Die Menge an zu verwendendem Lösungsmittel ist jedoch nicht streng begrenzt. Der Fachmann wird leicht in der Lage sein herauszufinden, welche Menge für den gewünschten Zweck geeignet ist; dies wird, unter anderem, von der Wahl des organischen Lösungsmittels abhängen. Vorzugsweise beträgt die Menge an organischem Lösungsmittel, welche während der Kopplungsumsetzung zugegeben wird, 0,01 bis 1,0 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von X-Asp und PM, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird. Im allgemeinen wird die Menge an X-Asp und PM, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird, im Bereich von 10 bis 30 Gew.-% des gesamten Umsetzungssystems liegen. Falls grössere Mengen an organischem Lösungsmittel verwendet werden, kann eine unerwünschte Senkung der Umsetzungsrate und Inaktivierung von Enzym stattfinden, und mehr Niederschlag wird sich lösen und somit schwierigeres Aufarbeiten des Umsetzungsgemisches erfordern.

Zugabe zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch des mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels wird spätestens begonnen, wenn die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 85% erreicht hat, weil zu dem Zeitpunkt die Deaktivierungseffekte des Enzyms schon irreparabel gross sind und die Viskosität der Aufschlämmung zu einem sehr hohen Wert gestiegen sein wird, was eine niedrige Enzymrückgewinnung ergibt. Bevorzugterweise sollte Zugabe und Vermischen begonnen werden, bevor eine Umwandlung von etwa 75% erreicht worden ist.

Andererseits sollten Zugabe und Vermischen nicht begonnen werden, bevor die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 10% erreicht hat, zu welchem Zeitpunkt sich ausreichend Niederschlag gebildet haben wird. Es wird bevorzugt, die Zugabe und das Vermischen des mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels sogar bei einem späteren Stadium zu beginnen, vorzugsweise wenn die Umsetzung etwa 25% oder 30% erreicht hat und sogar noch bevorzugterweise, wenn sie etwa 50% erreicht hat. In den frühesten Stadien der Umsetzung, z.B. bevor die Umwandlung etwa 30% erreicht hat, ist die Adsorption des Enzyms auf den Niederschlag noch ziemlich niedrig und es wird bevorzugt, die Enzymwirksamkeit während dieses Stadiums auf den höchst möglichen Stand zu halten, also ohne eine Senkung der Umsetzungsrate aufgrund der Anwesenheit des organischen Lösungsmittels. Falls das organische Lösungsmittel in dem Umsetzungsgemisch schon von Anbeginn der Kopplungsumsetzung in dem Umsetzungsgemisch vorhanden wäre, würde das Ausgangsmaterial PM bevorzugt zu der organischen Phase transferiert, was zu unerwünschtem Senken der Umsetzungsrate und/oder zusätzlichem Einspeisen von PM und pH-Kontrolle führen würde.

Wenn das gemäss der Erfindung ausgewählte Lösungsmittel Toluol oder Methylisobutylketon ist, wird Zugeben zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch vorzugsweise begonnen, wenn die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 30% bis 75% erreicht hat, um die besten gemeinsamen Ergebnisse bezüglich Umsetzungsrate und Enzymrückgewinnung zu erreichen. In Fällen, wo relativ hohe Konzentrationen an Reaktanten in der Kopplungsumsetzung verwendet werden, wird Zugeben und Vermischen vorzugsweise in dem unteren Teil des besagten 30% bis 75% Umwandlungsbereichs begonnen, z. B. von etwa 30% bis 60%. Bei relativ niedrigen Konzentrationen an Reaktanten wird die Zugabe und das Vermischen des organischen Lösungsmittels vorzugsweise begonnen, nachdem die Umwandlung etwa 50% bis 75% erreicht hat.

Toluol wird vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 0,5 Gewichtsanteilen zugegeben, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von X-Asp und PM, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird.

Methylisobutylketon kann in sogar noch kleineren Mengen als Toluol angewendet werden, und wird vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 0,3 Gewichtsanteilen zugegeben, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von X-Asp und PM, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird.

Die Temperatur zu dem Zeitpunkt, an dem das organische Lösungsmittel zu dem Umsetzungssystem zugegeben wird, ist nicht besonders eingegrenzt, vorausgesetzt, dass sie nicht die Umsetzung selbst beeinträchtigt, welche wie oben angezeigt, üblicherweise im Bereich von 5 bis 50ºC liegt.

Nach der Kopplungsumsetzung werden die organische Phase und der Niederschlag durch bekannte Verfahren von der Enzym enthaltenden wässerigen Phase getrennt, welche ebenfalls den Hauptanteil der Rückstände von nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien enthält; die letztere Phase kann im Prinzip in einem weiteren Kopplungsumsetzungsverfahren wiederverwendet werden, falls gewünscht mit Ergänzung von frischem Enzym. Nach der Umsetzung kann das Enzym durch bekannte Verfahren wie Filtration, Extraktion usw. zurückgewonnen werden. Der Niederschlag und in der organischen Phase gelöstes X-APM können in das gewünschte Produkt APM umgewandelt werden.

Das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel, welches zu dem Umsetzungssystem zugegeben und damit vermischt wird, kann auf einmal oder allmählich zugeben werden, entweder in Portionen oder kontinuierlich, wie die Umsetzung fortschreitet. Kontinuierliche Zugabe und Vermischen wird insbesondere bevorzugt, falls die Kopplungsumsetzung, wie es nun durch die vorliegende Erfindung durchführbar gemacht worden ist, auf kontinuierliche Weise durchgeführt wird. Die Kopplungsumsetzung kann somit Chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Kontinuierlicher Betrieb kann in einem Reaktor oder in einer Anzahl an Reaktoren in Reihe stattfinden (also in einem Multireaktorverfahren).

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel kontinuierlich zugegeben zu und vermischt mit dem Umsetzungssystem eines kontinuierlich betriebenen enzymatischen Kopplungsverfahrens, während Niederschlag gebildet wird und bevor die Umwandlung der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung zuerst etwa 85% erreicht hat. In solch einem kontinuierlichen Verfahren für die enzymatische Kopplung wird ein stabiles Stadium in dem Kopplungsreaktor oder Reaktoren durch gleichzeitige und (halb)-kontinuierliche Zugabe frischer wässeriger Lösung von Ausgangsmaterial (und Zuführen von Enzym) erreicht, und Entnehmen einer Menge an Aufschlämmung aus dem/den Reaktor(en), welche etwa gleich jener der zugeführten wässerigen Lösung ist. Falls ein Multireaktorverfahren gewählt wird, wird das organische Lösungsmittel bevorzugt kontinuierlich in den ersten und/oder weiter(en) Reaktor(en) des Multireaktorsystems eingespeist.

Die durchschnittliche Menge an organischem Lösungsmittel, welche pro Stunde während der Kopplungsumsetzung zugegeben wird, gemäss der vorliegenden Erfindung in einem kontinuierlichen Kopplungsverfahren, beträgt vorzugsweise von 0,01 bis 1,0 Gewichtsanteile, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von X-Asp und PM, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wird. In dem kontinuierlichen Verfahren wird Zugabe des organischen Lösungsmittels zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch spätestens begonnen, wenn die Umwandlung der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung zuerst (also während der Inbetriebnahme des kontinuierlichen Verfahrens) etwa 85% erreicht hat, insbesondere nicht bevor es zuerst etwa 10% erreicht hat.

Sehr vorteilhafte Ergebnisse werden in einem kontinuierlichen Kopplungsverfahren erzielt, wenn das zugegebene organische Lösungsmittel Toluol oder Methylisobutylketon ist, und Zugabe des organischen Lösungsmittels zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch begonnen wird, wenn die Umwandlung der Kopplungsumsetzung zuerst etwa 30% bis 75% erreicht hat.

Falls das verwendete organische Lösungsmittel Toluol ist, wird es vorzugsweise in einer durchschnittlichen Menge pro Stunde von 0,2 bis 0,5 Gewichtsanteilen zugegeben, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von X-Asp und PM, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wird. Falls das organische Lösungsmittel MIBK ist, wird es vorzugsweise in einer durchschnittlichen Menge pro Stunde von 0,1 bis 0,3 Gewichtsanteilen zugegeben, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von X-Asp und PM, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wird.

Toluol und/oder MIBK werden bevorzugt in den ersten (und/oder weitere) Reaktor(en) eines kontinuierlichen Multireaktorverfahrens eingespeist. Dies wird insbesondere durchgeführt, falls die Umwandlung in dem ersten Reaktor bei etwa 50% oder höher gehalten wird, weil dies das Erreichen von sehr hohen Umwandlungen von etwa 90-95% oder höher in dem Multireaktorverfahren erlaubt.

Die vorliegende Erfindung wird detaillierter durch die folgenden Beispiele erklärt werden, welche jedoch nicht so beabsichtigt sind, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.

In den folgenden Beispielen und Vergleichsversuchen wurden Umwandlungen, kalkuliert auf Basis von verwendetem Z-Asp, durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer TSK-Gel 2000SWTM Säule der Tosoh Corporation bestimmt. Zu diesem Zweck wurden kleine Proben aus dem Umsetzungsgemisch in regelmässigen Intervallen entnommen, wobei die letzte Probe aus der endgültigen Umsetzungsgemischsuspension entnommen wurde. Für die Beispiele wurden Angaben von Kristallabmessungen durch mikroskopische Bewertung (bei 100x Vergrösserung) von Proben gesammelt, welche während und nach der Umsetzung entnommen wurden, und/oder durch Laserstrahlmessung des Mittelwerts (M.V.) der Partikelgrössenverteilung unter Verwendung eines Microtruck FRA Instruments von Leads & Northrup. Die Kristallgrössen, auf die in den Beispielen Bezug genommen werden, repräsentieren M.V.-Werte und machen somit eine Angabe bezüglich durchschnittlicher Länge und Dicke.

Der Rühr-Torsionsmoment der Umsetzungsgemischsuspension wurde durch Verwendung eines Rührers bestimmt, welcher mit einem Torsiometer ausgestattet war. Der Endtorsionsmoment ist der Torsionsmoment am Ende des Versuchs. Für den Enzym-Retentionsprozentsatz wurden aus der Aufschlämmung am Ende der Kopplungsumsetzung Proben entnommen und durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (hplc) analysiert, die Wirksamkeit des verbleibenden Enzyms wurde dann als ein Prozentsatz der Wirksamkeit des ursprünglichen Enzympräparats beim Beginn der Umsetzung berechnet. Dies wurde durch hplc an einer TSK-Gel Phenyl-5Pw RPT"" Säule von Tosoh Corporation bestimmt.

Beispiel 1

1930 g einer Lösung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure (Z-Asp; 2,0 mol; 534 g) in Wasser (1396 g), 2989 g einer Lösung aus DL- Phenylalaninmethylester (DL-PM; 5,0 mol; 895 g) in Wasser (2094 g) und 146 g einer 22% (Gew.) wässerigen Natriumhydroxidlösung wurden in einen 20 I Glasreaktor gefüllt, ausgestattet mit einem Rührer und temperiert bei 40ºC. Zu diesem Gemisch wurde eine Enzymlösung zugegeben, weiche durch Lösen von 240 g Natriumchlorid, 7,5 g Calciumchloriddihydrat und 30 g rohem Thermolysin (Thermoase PS-160, Handelsname von Daiwa Chemical Co.) in 2200 g destilliertem Wasser hergestellt worden war. Die enzymatische Kopplungsumsetzung wurde dann bei 40ºC unter Rühren durchgeführt.

Während der Kopplungsumsetzung schlug sich das Additionsprodukt von α-N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester und D-Phenylalaninmethylester (Z-APM. D-PM) nieder. Nach 11 Stunden Umsetzung, wobei die Umwandlung der Umsetzung (berechnet nach Z- Asp) etwa 55% erreicht hatte, wie durch hplc bestimmt, wurden 176 g Toluol (also 0,145 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zu dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umwandlung durch hplc beobachtet werden konnte; zu diesem Zeitpunkt waren 18 Stunden seit Beginn der Umwandlung vergangen.

Der Torsionsmoment des Umsetzungsgemisches wurde während der Umsetzung unter Verwendung eines Rührers, ausgestattet mit einem Torsiometer bestimmt; der Endtorsionsmoment betrug 169 Ncm. Ferner wurde die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM als 92,2% berechnet. Der Enzym-Retentionsprozentsatz betrug 81,5%. Durch Bewertung von Proben, welche kurz vor Zugabe von Toluol und am Ende der Umsetzung genommen wurden, wurde beobachtet, dass grosse Kristallpartikel des Niederschlags nach Zugabe von Toluol gebildet wurden. Die durchschnittliche Kristallgrösse (M.V.) betrug 22 um.

Vergleichsversuch A

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausser dass 32 g Thermolysin verwendet wurden, und dass kein Toluol zugegeben wurde. In diesem Vergleichsversuch kam die enzymatische Umsetzung nach 17 Stunden Umsetzung zu einem Halt.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und dessen Endtorsionsmoment wurde als 224 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 93,5% berechnet. Der Enzym-Retentionsprozentsatz betrug jedoch nur 34,7%. Aus mikroskopischer Bewertung von Proben, welche nach 11 und 17 Stunden genommen wurden, wurde beobachtet, dass die durchschnittliche Grösse der Kristalle viel kleiner als 10 um war.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, ausser dass nach 11 Stunden Umsetzung 353 g Toluol (also 0,29 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zu dem Umsetzungssystems auf einmal zugegeben wurden. Die Umwandlung der Umsetzung zum Zeitpunkt der Toluolzugabe hatte etwa 69% erreicht. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umwandlung beobachtet werden konnte; zu diesem Zeitpunkt waren 19 Stunden seit dem Beginn der Umsetzung vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 80 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 93,9% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 89,9%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 65 um.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, ausser dass die Zugabe von 353 g Toluol nach 13 Stunden Umsetzung durchgeführt wurde. Die Umwandlung der Umsetzung zum Zeitpunkt der Toluolzugabe hatte etwa 82% erreicht. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu diesem Zeitpunkt waren 19 Stunden seit dem Beginn der Umsetzung vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 135 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 93,5% berechnet. Der Enzym-Retentionsprozentsatz betrug 82,9%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 100 um.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, ausser dass 353 g Methylisobutylketon (MIBK) anstelle von Toluol zugegeben wurden; die Zugabe fand nach 11 Stunden Umsetzung auf einmal statt und die Umwandlung der Umsetzung zu dem Zeitpunkt hatte etwa 69% erreicht. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 22 Stunden seit dem Beginn der Umsetzung vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 78 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 92,5% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 89%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 53 um.

Beispiel 5

1929 g einer Lösung aus Z-Asp (2,0 mol; 534 g) in Wasser (1395 g), 3153 g einer Lösung aus DL-PM (5,0 mol; 895 g) in Wasser (2258 g) und 150 g einer 22% (Gew.) wässerigen Natriumhydroxidlösung wurden in einen 20 I Glasreaktor gefüllt, ausgestattet mit einem Rührer und temperiert bei 40ºC. Zu diesem Gemisch wurde eine Enzymlösung zugegeben, welche durch Lösen von 200 g Natriumchlorid, 7,0 g Calciumchloriddihydrat und 42 g Protease TDTM (Produkt von Amano Pharmaceutical Co.) in 2050 g destilliertem Wasser hergestellt worden war. Die enzymatische Kopplungsumsetzung wurde dann bei 40ºC unter Rühren durchgeführt.

Während der Kopplungsumsetzung schlug sich Z-APM. D-PM nieder. Nach 8 Stunden Umsetzung, wobei die Umwandlung der Umsetzung (berechnet nach Z-Asp) etwa 65% erreicht hatte, wurden 176 g eines 90/10 Gew./Gew. Gemisches aus MIBK und Toluol (also 0,145 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PMI) zu dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umwandlung durch hplc beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 16 Stunden seit Beginn der Umwandlung vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 84 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 91,8% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 86,5%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug etwa 30 um.

Vergleichsversuch B

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt, ausser dass 32 g Protease TDTM verwendet wurden und kein MIBK/Toluol zugegeben wurde. In diesem Vergleichsversuch kam die enzymatische Umsetzung nach 16 Stunden Umsetzung zu einem Halt.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 243 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 92,1% berechnet. Der Enzym-Retentionsprozentsatz betrug jedoch 62,7%. Die durchschnittliche Kristallgrösse war viel kleiner als 10 um.

Beispiel 6

286 g einer Lösung aus Z-Asp (0,4 mol; 107 g) in Wasser (179 g), 598 g einer Lösung aus DL-PM (1,0 mol; 179 g) in Wasser (419 g) und 29,2 g einer 22% (Gew.) wässerigen Natriumhydroxidlösung wurden in einen 2 I Glasreaktor gefüllt, ausgestattet mit einem Rührer und temperiert bei 40ºC. Zu diesem Gemisch wurde eine Enzymlösung zugegeben, welche durch Lösen von 48d Natriumchlorid, 1,5 g Calciumchloriddihydrat und 16 g rohem Themiolysin (Thermoase PS-160TM von Daiwa Chemical Co.) in 440 g destilliertem Wasser hergestellt worden war. Die enzymatische Kopplungsumsetzung wurde dann bei 40ºC unter Rühren durchgeführt.

Während der Kopplungsumsetzung schlug sich Z-APM. D-PM nieder. Nach 3 Stunden Umsetzung, wobei die Umwandlung der Umsetzung (berechnet nach Z-Asp) etwa 55% erreicht hatte, wurden 90 g Toluol (also 0,31 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL- PM) zu dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umwandlung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 9 Stunden seit Beginn der Umwandlung vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 2,0 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 96,3% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz wurde als 99,3% bestimmt. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 114 um.

Beispiel 7

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, ausser dass nach 3 Stunden Umsetzung 60 g Toluol (also 0,21 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zum dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben wurden. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 9 Stunden vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 5,7 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 96,2% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 92,7%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 46 um.

Beispiel 8

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, ausser dass nach 3 Stunden Umsetzung 30 g Toluol (also 0,1 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zum dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben wurden. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 9 Stunden vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 11 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 96,2% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 86,3%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 20 um.

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, ausser dass nach 3 Stunden Umsetzung 60 g MIBK (also 0,21 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zum dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben wurden. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 9 Stunden vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 0,1 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 95,8% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 94,1%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 48 um.

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 9 wurde wiederholt, ausser dass nach 3 Stunden Umsetzung 90 g MIBK (also 0,31 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zum dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben wurden. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 9 Stunden vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 2,1 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 93,8% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 94,1%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 71 um.

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 9 wurde wiederholt, ausser dass nach 3 Stunden Umsetzung 30 g MIBK (also 0,1 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM) zu dem Umsetzungssystem auf einmal zugegeben wurden. Die Umsetzung wurde unter Rühren fortgesetzt, bis keine signifikante weitere Umsetzung beobachtet werden konnte; zu dem Zeitpunkt waren 9 Stunden vergangen.

Die Umsetzungsgemischsuspension wurde dann gesammelt und deren Endtorsionsmoment wurde als 3,0 Ncm befunden; die molare Ausbeute an niedergeschlagenem Z-APM. D-PM wurde als 93,8% berechnet. Der Enzym- Retentionsprozentsatz betrug 87,5%. Die durchschnittliche Kristallgrösse betrug 24 um.

Beispiel 12 (kontinuierliche Arbeitsweise)

Ein erster Reaktor (Glas; 3 l; ausgestattet mit einem Rührer, temperiert bei 40ºC) wurde mit wässeriger Lösung aus jeweils Z-Asp (0,5 mol; 133,5 g in 338,5 g Wasser), DL-PM (1,25 mol; 224 g in 562 g Wasser) und 25 Gew.-% Natriumhydroxid (35 g Lösung) gefüllt, wonach Mischen stattfand. Eine wässerige Enzymlösung, welche 22,5 g Protease TDTM (Amano Pharmaceutical Co.), 63 g Natriumchlorid und 0,64 g Calciumchloriddihydrat in 621 g Wasser enthielt, wurde dazu zugegeben, um 2000 g Umsetzungsgemisch zu erhalten. Die Umsetzung wurde für 3 Stunden fortgesetzt und eine Z-Asp Umwandlung von 62% wurde erreicht.

In der Zwischenzeit wurde separat eine Lösung aus Z-Asp, DL- PM und Natriumhydroxid Ausgangsmaterialien (mit der gleichen Zusammensetzung wie der Inhalt des ersten Reaktors, bevor die Enzymlösung eingeführt wurde), als auch eine frische Enzymlösung mit der gleichen Zusammensetzung, wie die obige Protease TDTM-Lösung in ausreichenden Mengen hergestellt, um so in der Lage zu sein, ein vereinigtes, frisches Umsetzungsgemisch (mit gleicher Zusammensetzung wie die anfänglichen 2000 g an Umsetzungsgemisch) bei einer Rate von 667 g/Stunde einzuspeisen. Als besagte vereinigte Einspeisung zu dem ersten Reaktor begonnen wurde, wurde gleichzeitig Umsetzungsgemisch bei der gleichen Rate wie die Einspeisung aus dem ersten Reaktor in einen zweiten Reaktor entnommen, welcher ebenfalls gerührt und bei 40ºC betrieben wurde. Gleichzeitig wurde eine Einspeisung von MIBK in den zweiten Reaktor bei einer Rate von 13,3 g/Stunde eingeführt(also 0,11 Gewichtsanteile bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL-PM, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wurde).

Nach etwa 3 Stunden Einspeisen von Rohstoffen in den ersten Reaktor und Entnehmen von Umsetzungsgemisch aus dem ersten Reaktor in den zweiten Reaktor bei gleichzeitigem Einspeisen von MIBK dazu, wurde ebenfalls Aufschlämmung aus dem zweiten Reaktor in ein Aufnahmegefäss bei etwa der gleichen Rate, wie die Einspeisung entnommen. Nach einer durchschnittlichen Verweilzeit von 6 Stunden in den beiden Reaktoren erreichte die Kopplungsumsetzung annähernd ein Gleichgewicht in dem Aufnahmegefäss.

Dies Umsetzungssystem konnte leicht für mehr als 72 Stunden nach Beginn der Umsetzung betrieben werden. Relevante Ergebnisse in dem ersten und zweiten Reaktor nach 14 Stunden waren:

Die durchschnittliche Endgrösse der Kristalle wurde auf 150 um oder höher veranschlagt.

Beispiel 13

Beispiel 12 wurde wiederholt, ausser das die mittlere Verweilzeit in dem ersten und in dem zweiten Reaktor nun 4 Stunden betrug, welches durch Reduzieren der Menge an Einspeisung auf 500 g/Std. erreicht wurde, und dass Toluol bei einer Einspeisungsrate von 25 g/Std. in den ersten Reaktor und einer Einspeisungsrate von 5 g/Std. in den zweiten Reaktor anstelle von MIBK verwendet wurde. Die Einspeisungsrate von Toluol entspricht 0,42 Gewichtsanteilen bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von Z-Asp + DL- PM, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wurde.

Nach 27 Stunden Umsetzung wurden die folgenden Ergebnisse in dem ersten und dem zweiten Reaktor erhalten:

Die durchschnittliche Endgrösse der Kristalle wurde auf 200 um oder höher veranschlagt.

Vergleichsversuch C

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, ausser dass kein organisches Lösungsmittel zu dem/den (zweiten) Reaktor(en) zugeführt wurde. Die Ergebnisse nach 24 Stunden Umsetzung waren wie folgt:

Die durchschnittliche Endgrösse der Kristalle wurde auf etwa 10 um veranschlagt. Die obigen Ergebnisse können in Form von Tabellen wie folgt zusammengefasst werden:

A. Für chargenweise Ausführungsformen:
B. Für kontinuierliche Ausführungsformen


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von N-geschütztem L-Aspartyl-L- phenylalaninmethylester durch enzymatisches Koppeln einer Ngeschützten L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester in einer wässerigen Lösung mit Bildung eines Niederschlags unter Verwendung eines Thermolysin-ähnlichen Proteaseenzyms, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zugegeben wird zu, und vermischt wird mit dem Umsetzungssystem während der Bildung des Niederschlags im Verlauf der Kopplungsumsetzung und bevor die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 85% erreicht hat, das organische Lösungsmittel eine relativ hohe Affinität für den Niederschlag aufweist, und ausgewählt wird aus der Gruppe der aromatischen Kohlenwasserstoffe, C&sub3;&submin;&sub6;-Ketone, C&sub3;&submin;&sub6;-Alkohole, C&sub1;&submin;&sub6;-Kohlenwasserstoffhalogenide und C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;-Ester, oder Gemischen daraus.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an organischem Lösungsmittel, welche während der Kopplungsumsetzung zugegeben wird, 0,01 bis 1,0 Gewichtsanteile, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe der N-geschützten L- Asparaginsäure und dem L- oder DL-Phenylalaninmethylester beträgt, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird.

3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Zugabe des organischen Lösungsmittels zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch nicht begonnen wird, bevor die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 10% erreicht hat.

4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Toluol oder Methylisobutylketon ist, und Zugabe des organischen Lösungsmittels zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch begonnen wird, wenn die Umwandlung der Kopplungsumsetzung etwa 30% bis 75% erreicht hat.

5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Toluol ist, und in einer Menge von 0,2 bis 0,5 Gewichtsanteilen zugegeben wird, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von N-geschützer L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird.

6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Methylisobutylketon ist, und in einer Menge von 0,1 bis 0,3 Gewichtsanteilen zugegeben wird, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von N-geschützer L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester, welche in der Kopplungsumsetzung verwendet wird.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel kontinuierlich zugegeben wird zu und vermischt wird mit dem Umsetzungssystem eines kontinuierlich betriebenen Kopplungsverfahrens, während Niederschlag gebildet wird, und bevor die Umwandlung der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung zuerst etwa 85% erreicht hat.

8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel kontinuierlich in den ersten und/oder weitere Reaktor(en) eines kontinuierlichen Multireaktor- Kopplungsverfahrenssystems eingespeist wird.

9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des durchschnittlich pro Stunde während der Kopplungsumsetzung zugegebenen organischen Lösungsmittels 0,01 bis 1,0 Gewichtsanteile, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von N-geschützer L-Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester beträgt, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wird.

10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, dass Zugabe des organischen Lösungsmittels zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch nicht begonnen wird, bevor die Umwandlung der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung zuerst etwa 10% erreicht hat.

11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7-10, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Toluol oder Methylisobutylketon ist und Zugabe des organischen Lösungsmittels zu und Vermischen mit dem Umsetzungsgemisch begonnen wird, wenn die Umwandlung der Kopplungsumsetzung zuerst etwa 30% bis 75% erreicht hat.

12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7-11, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Toluol ist, und in einer durchschnittlichen Menge pro Stunde von 0,2 bis 0,5 Gewichtsanteilen, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von N-geschützer L- Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester zugegeben wird, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wird.

13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7-12, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Methylisobutylketon ist und in einer durchschnittlichen Menge pro Stunde von 0,1 bis 0,3 Gewichtsanteilen, bezogen auf einen Gewichtsanteil der Summe von N-geschützer L- Asparaginsäure und L- oder DL-Phenylalaninmethylester zugegeben wird, welche durchschnittlich pro Stunde in der kontinuierlichen Kopplungsumsetzung verwendet wird.

14. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die N-geschützte L-Asparaginsäure N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginsäure ist.







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