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Dokumentenidentifikation DE69614498T2 23.05.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0789073
Titel Herstellung von Tryptophan mittels dem Bakterium Escherichia coli
Anmelder Degussa AG, 40474 Düsseldorf, DE
Erfinder Camakaris, Dr., Helen, Eaglemont 3084, AU;
Cowan, Dr., Peter, Brighton 3186, AU;
Pittard, Prof., James, Research 3095, AU
DE-Aktenzeichen 69614498
Vertragsstaaten AT, DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.06.1996
EP-Aktenzeichen 961098027
EP-Offenlegungsdatum 13.08.1997
EP date of grant 16.08.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.05.2002
IPC-Hauptklasse C12N 1/21
IPC-Nebenklasse C12P 13/22   C12N 1/20   C12N 15/52   

Beschreibung[de]
1. Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Tryptophan mit dem Bakterium Escherichia coli.

Die Erfindung stellt einen Wirt und ein Verfahren zum Vermehren dieses Wirts bereit, so dass Plasmide in Abwesenheit von Antibiotika beständig aufrechterhalten werden können, was zu einer hohen Produktivität von Tryptophan bei der Fermentation führt. Es bietet bedeutende Verbesserungen gegenüber bisherigen Verfahren und produziert Tryptophan, das keinerlei Verunreinigungen durch Tyrosin und Phenylalanin enthält, wodurch die Aufarbeitung vereinfacht wird.

4. Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Es gibt heute zahlreiche Beispiele für die genetische Manipulation von Mikroorganismen zur Herstellung von Stämmen, die bestimmte Aminosäuren effizient überproduzieren.

In Fachkreisen wird die Notwendigkeit einer Beeinflussung normaler Regulationskreisläufe allgemein anerkannt, die die Expression von Genen für Biosynthese- Stoffwechselwege steuern, um Mutanten zu selektieren, deren Enzyme keiner Feedback-Hemmung mehr unterliegen, und um Enzyme zu deaktivieren, die das erwünschte Produkt abbauen, wenn ein Erfolg bei der Produktion bestimmter Aminosäuren erzielt werden soll. Es wurde auch als nützlich befunden, die Kopiezahl bestimmter biosynthetischer Gene in der Zelle zu erhöhen, indem zusätzliche Genkopien auf Plasmiden in die Zelle eingebracht werden. Diese allgemeinen Prinzipien sind in Tribe, D.E. und J. Pittard. (1979). Appl. Environ. Microbiol. 38: 181-190, zu finden, vor allem ihre Beziehung zur Tryptophan-Produktion.

Andere Fachkräfte hatten zuvor ein temperaturempfindliches trpR Allel isoliert und gezeigt, dass es erhöhte trp Operonenzymniveaus bei höheren Temperaturen aufwies (Ito. K., S. Hiraga und T. Yura (1969), J. Bacteriol. 99, 279-286). Jan. E. D. Mou und S. Tsay (1995, Dev. Cent. Biotechnology, TW-A-258753, ein Zwischendokument) hatten ebenfalls gezeigt, dass eine Integration mehrerer Kopien eines feedback-resistenten trp Operons zu einer mäßigen Zunahme der Trypthophan-Synthese führt.

Dort werden auch die Bedeutung der Feedback-Hemmung der ersten Enzyme im aromatischen Weg (die DAHP-Synthasen) und des ersten Enzyms im terminalen Tryptophanweg sowie die Notwendigkeit einer Inhibitionsaufhebung demonstriert.

Ebenso ist seit langem bekannt, dass eine Inaktivierung des trpR Repressorproteins notwendig ist, das die Expression der Gene des Tryptophanoperons reprimiert. Dies wird in der oben genannten Publikation erörtert.

Im Falle der Tryptophangene in E. coli gibt es ein zweites Regelungssystem mit der Bezeichnung Attenuation. Selbst in trpR Zellen regelt Tryptophan, oder vielmehr beladene Tryptophanyl-tRNA, die Expression des Tryptophanoperons. Wenn beladene Tryptophanyl-tRNA im Überschuss vorhanden ist, endet die Transkription der mRNA für die trp Operon-Gene, bevor die Sequenzen erreicht werden, die die biosynthetischen Enzyme kodieren, in etwa neun von zehn Transkripten (Yanofsky, C. (1981) Nature (London) 289: 751-758). Diese vorzeitige Beendigung der Transkription kann durch verschiedene genetische Manipulationen verhindert werden, wie z.B. durch Klonieren der trp Gene hinter einem heterologen Promotor oder durch Deletieren des Attenuator-Ortes. Tribe und Pittard (Appl. 4 Environ. Microbiol. (1979). 38: 181-190) berichteten von einer anderen Strategie zur Überwindung von Attenuation, bei der sie eine Mutante verwendeten, die ein teilweise defektes Tryptophanyl-tRNA-Synthetaseenzym enthielt.

Andere Fachkräfte haben trpS Mutanten mit defekter Tryptophanyl-tRNA-Synthetase isoliert, die teilweise in Bezug auf Attenuation defekt sein können (Doolittle, W. F. und C. Yanofsky (1968), J. Bacteriol. 95, 1283-1294, Ito. K., S. Hiraga und T. Yura (1969), genetics 61, 521-538).

Wenn Plasmide, die die Strukturgene für das trp Operon enthalten, in eine Zelle eingeführt werden, in der die Expression dieser trp Gene nicht mehr geregelt wird und keine starke Selektion für die plasmidkodierten Funktionen vorhanden ist, dann führt eine nachfolgende Vermehrung dieser Zelle und ihrer Nachkommenschaft häufig zu einem Plasmidverlust aus der Population. Wenn der Ausgangswirt ein Tryptophan-Prototroph ist, vermehren sich Zellen, die das Plasmid verloren haben, schneller als Zellen, die es behalten, genauso wie Zellen, bei denen genetische Ereignisse (wie Deletionen oder Insertionen) die Expression der auf dem Plasmid vorhandenen trp Gene reduziert oder verhindert haben. Über eine Reihe von Generationen werden solche defekten Zellen (Segreganten und Mutanten) zu den vorherrschenden Mitgliedern der Population, und wenn diese Population die Basis für eine Fermentation ist, dann missglückt die Fermentation.

Es wurden verschiedene Strategien zur Stabilisierung der Plasmidvererbung vorgeschlagen. Ein häufig angewendetes Verfahren besteht darin, ein Gen für Antibiotikaresistenz auf dem Plasmid aufzunehmen und Antibiotika zur Fermentationsbouillon zuzugeben. Dieses Verfahren ist jedoch kostspielig und stellt möglicherweise ein Umweltrisiko dar. Strategien unter Verwendung eines Wirts mit defekter Biosynthese irgendeiner Verbindung, die zur Vermehrung benötigt wird, sowie eines Plasmids, das ein Gen enthält, das den Mutantendefekt komplementiert, kamen früher zur Anwendung (z.B. in Anderson et al., US-Patent 4,371,614), allerdings können sich Segreganten ansammeln, da sie die Synthese des Nährstoffs über mehrere Generationen fortsetzen (phänotypische Verzögerung). Wenn der Bedarf dem sich ansammelnden Nährstoff entspricht, können Segreganten auch von dem sich angesammelten Nährstoff gespeist werden. Es wurde eine begrenzte Verbesserung mit Wirten erreicht, die einen Transportdefekt aufweisen, jedoch wurde sie nur unter Bedingungen mit geringem Tryptophangehalt im Medium erreicht (Imanaka, japanische Patentoffenbarung A Nr. 3-43074).

Es besteht weiterhin Bedarf an Mikroorganismen, die in der Lage sind, hohe Tryptophankonzentrationen zu produzieren. Dies steht mit dem Bedarf an einem Verfahren zum Stabilisieren der Plasmidvererbung in den genannten Mikroorganismen in Verbindung.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Diese und andere Ziele der Erfindung, die aus dem Folgenden besser nachvollziehbar werden, werden dadurch erzielt, dass folgendes bereitgestellt wird: E.coli K-12- Stämme mit Produktivität für Tryptophan, die in ihrem Genom ein mutiertes Gen umfassen, das teilweise defekte Tryptophanyl-tRNA-Synthetase-kodiert, und das eine temperaturbedingte Tryptophan-Auxotrophie in den Wirt und weitere Mutationen auf dem Chromosom einführt, die die durch aroP, mtr und tnaB kodierten Transportsysteme deaktivieren, wobei solche Stämme ein trpE Allel enthalten, das Anthranilat-Synthase kodiert, die gegenüber Feedback- Hemmung bei hohen Tryptophankonzentrationen resistent ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung wurde mit ein Verfahrens zur Herstellung von L-Tryptophan durch Fermentation gelöst, umfassend das Kultivieren eines Bakteriums wie zuvor beschrieben unter unterschiedlichen Vermehrungs- und Produktionsbedingungen und das Wiedergewinnen von produziertem L-Tryptophan von dem Kulturmedium.

4. Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen Prozess für die Herstellung hoher L-Tryptophankonzentrationen durch Fermentation unter Verwendung von E.coli K-12-Stämmen bereit.

Diese Stämme mit L-Tryptophan-Produktivität umfassen in ihrem Genom ein mutiertes Gen, das teilweise defekte Tryptophanyl-tRNA-Synthetase kodiert und eine temperaturbedingte Tryptophan-Auxotrophie in den Wirt und weitere Mutationen auf dem Chromosom einführt, die die durch aroP, mtr und tnaB kodierten Transportsysteme deaktivieren, und werden mit einem Plasmid transformiert, das ein Tryptophan-Operon enthält, das Anthranilat-Synthase kodiert, die von Feedback-Hemmung durch Tryptophan befreit ist.

Wie in Abschnitt 2 beschrieben, gibt es im Zusammenhang mit Stämmen, die einen bestimmten Nährstoff überproduzieren, ein Problem, wenn die Stabilitätsbeibehaltung alleine davon abhängig ist, dass der Wirt den überproduzierten Nährstoff benötigt, da sich Segreganten weiterhin vermehren werden, zum Ersten aufgrund von phänotypischer Verzögerung und zum Zweiten, da sie ohne weiteres Von dem angesammelten Nährstoff gespeist werden. Selbst wenn der Wirtsstamm in Bezug auf den aktiven Transport des Nährstoffes einen Defekt hat, wird die Selektion nur dann gelingen, wenn die Nährstoffkonzentration relativ gering ist. In Fig. 1 ist zu sehen, dass bei einer Tryptophankonzentration von beispielsweise 1 mM oder höher ein Tryptophan-Auxotroph, der unfähig ist, aktiv Tryptophan zu transportieren, sich trotzdem mit einer normalen Verdopplungszeit vermehrt. Diese Tryptophankonzentration von 1 mM oder etwa 0,2 g/l wird schnell erreicht, wenn ein tryptophan-produzierender Stamm vermehrt wird, so dass die Selektion nach Plasmidstabilität unter Produktionsbedingungen rasch verloren geht.

Wir haben entdeckt, dass trp&supmin; Stämme mit einer 4 Mutation wie insbesondere trpS378, die das Tryptophanyl- tRNA-Synthetaseenzym teilweise inaktiviert, sehr hohe Konzentrationen an Tryptophan in der Zelle benötigen. Fig. 1 zeigt, dass, wenn die Transportnegativmutante auch diese trpS378 Mutation enthält, selbst bei 30ºC wenigstens 5 mM Tryptophan für eine gute Vermehrung benötigt werden. Dies bedeutet, dass bis zu dem Zeitpunkt, da die Tryptophankonzentration in dem Medium 1 g/l erreicht, alle durch Plasmidverlust produzierten Segreganten einen Vermehrungsnachteil haben. Diese Voraussetzung von sehr hohen Tryptophankonzentrationen für eine gute Vermehrung von Segreganten stellt eine bedeutende Verbesserung dar, da die Selektion nach Retention des Plasmids nicht nur während der Vermehrung des Impfguts beibehalten wird, sondern auch während des größten Teils der Vermehrungsphase während der letzten Fermentation. Durch diese Kombination von Transportnegativmutationen und insbesondere trpS378 werden Tryptophanerträge im Vergleich zu trpS&spplus; Transportnegativ- Kombinationen wesentlich erhöht. Die genannten Mutationen deaktivieren vorzugsweise die durch aroP, mtr und tnaB kodierten Transportsysteme. Zu typischen Stämmen gehören unter anderem solche, die die mutierten Allele enthalten, gekennzeichnet durch aroP579, mtr-24 und tnaA1.

Anhand separater Experimente unter Verwendung eines überproduzierenden Stammes mit dem trpS378 Allel und eines Plasmids mit trpE476DCBA, das feedback-resistente Anthranilatsynthase kodiert, haben wir gezeigt, dass das temperaturempfindliche Allel trpS378 bei ausgewählten Temperaturen effektiv verwendet werden kann, um entweder Stabilität oder Produktivität zu begünstigen. Wir haben gefunden, dass Produktionsstämme, die trpS378 enthalten, bei etwa 30ºC stabiler sind als bei etwa 37ºC. Bei etwa 37ºC nimmt die Produktivität zu und die Stabilität nimmt ab. In Fig. 2 sind die Ergebnisse für den Produktionsstamm JP6015/pMU91 enthalten.

Das Stabilitätsniveau, das in diesem Fall durch serA&spplus;/- Komplementation bereitgestellt wird, kann durch die Wahl einer Inkubationstemperatur wesentlich erhöht werden. Für andere Stämme werden ähnliche Ergebnisse erzielt.

Wir haben ebenfalls festgestellt, dass die Produktivität bei 30ºC durch die Zugabe von Hefeextrakt weiter verringert wird, sodass die Tryptophankonzentration einen Wert zwischen 0,2 und 0,3 g/l nicht übersteigt. Dies führt zu einer bedeutenden Erhöhung der Stabilität wie in Fig. 3 gezeigt wird. Einige Stämme bleiben über mehr als 60 Generationen stabil.

Feedback-Hemmung von Anthranilatsynthase

Anthranilatsynthase-Aktivität bei Wildtyp-Stämmen von Escherichia coli ist gegenüber Feedback-Hemmung durch Tryptophan äußerst empfindlich und weist bei Tryptophankonzentrationen von nur 0,02 mM eine Hemmung von etwa 50% auf. Über feedback-resistente Mutanten wurde in verschiedenen Publikationen berichtet, wie z.B. Aiba et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 1182409, Tribe und Pittard. (1979). Applied and Environmental Microbiol. 38: 181-190, Aiba et al. (1982). Applied and Environmental Microbiol. 43: 289-297. In jedem Fall schloss die Isolierung solcher Mutanten eine Selektion nach Beständigkeit gegen Vermehrungshemmung durch Tryptophananaloge ein. Typischerweise behielten Mutanten, die zu Zwecken der Tryptophan-Überproduktion gewählt wurden, etwas Feedback-Hemmung bei, allerdings trat der 50%-Wert bei einer Konzentration von etwa 13 mM und nicht bei 0,02 mM auf (siehe Aiba et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 1182409). Dort, wo Mutanten beschrieben wurden, die eine höhere Feedback-Resistenz erbrachten (50%- Inhibition bei mehr als 20 mM), hatten sie eine verringerte Ansammlung von Tryptophan - zur Folge, möglicherweise aufgrund einer verminderten Aktivität der Feedback- Resistenzenzyme (Aiba et al. (1982). Applied and Environmental Microbiol. 43: 289-297).

Zwei von uns isolierte feedback-resistente Mutanten waren typisch für die, die zuvor bei der Tryptophan- Überproduktion verwendet wurden und die Allele trpE476 und trpE382 enthielten, die Enzyme kodierten, die eine Aktivitätshemmung von weniger als 10% bei 1 mM Tryptophan erbrachten (siehe 2. Beispiel).

Als ein Produktionsstamm mit solchen Mutationen in einem Fermenter verwendet wurde, beobachteten wir, dass bis zum Ende der Fermentation zu jedem Gramm an angesammeltem Tryptophan jeweils etwa 20-60 mg Tyrosin und Phenylalalin vorhanden waren. Zwar stellen diese Aminosäuren eine kleine Fraktion des aromatischen Ertrags dar, doch sind sie Nebenprodukte, die bei der nachgeschalteten Wiedergewinnung von Tryptophan größere Schwierigkeiten verursachen.

Als wir nach der Basis für diese Ansammlung suchten, entdeckten wir, dass bei einer Tryptophankonzentration von 12 g/l (60 mM) diese beiden feedback-resistenten Anthranilatsynthasen zu 60-80% gehemmt wurden. Mit anderen Worten, Enzyme, die bei Konzentrationen von 1 mM resistent schienen, waren unter den tatsächlichen Bedingungen einer industriellen Fermentation nicht in der Lage, wirksam zu funktionieren. Kein Stand der Technik bezieht sich auf Überproduktionsstämme mit Enzymen, die gegenüber Feedback-Hemmung bei den sehr hohen 4 Konzentrationen resistent sind, die voraussichtlich in einem Fermentationsbottich vorhanden sind, während gleichzeitig eine normale Aktivität beibehalten und folglich die Produktivität verbessert wird.

Um dieses Problem in Verbindung mit der Hemmung von Anthranilatsynthase bei hohen Tryptophankonzentrationen zu überwinden, isolierten wir eine neue feedback-resistente Mutante (trpE483), woraus ein Anthranilatsynthaseenzym hervorging, das eine Aktivitätshemmung von weniger als 10% bei Tryptophankonzentrationen von bis zu 13,5 g/l erbrachte (siehe Fig. 4). Als Produktionsstämme mit dem trpE483 Allel konstruiert und in einer Fermentation unter Bedingungen verwendet wurden, die zuvor jeweils etwa 20-60 mg Tyrosin 4 und Phenylalanin pro Gramm Tryptophan produzierten, wurde kein Tyrosin und kein Phenylalanin nachgewiesen und der Tryptophanertrag blieb hoch. Dies steht in deutlichem Gegensatz zu den früheren Ergebnissen, über die von Aiba et al. (Applied and Environmental Microbiol. (1982) 43: 289- 297) in Verbindung mit Anthranilatsynthasemutanten berichtet wurde, die Beständigkeit gegen sehr hohe Tryptophankonzentrationen demonstrierten, bei denen die Tryptophanproduktivität abnahm.

Die Isolierung des trpE483 Allels ging wie im 2. Beispiel beschrieben unter Verwendung eines Plasmids vonstatten, das das trp Operon enthielt. Ein solches, das trp Operon enthaltende, Plasmid kann ohne weiteres anhand bekannter Techniken konstruiert werden, wie z.B. durch Restriktionsenzymabbau, Ligation und Transformation (Maniatis, T., E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. (1982)). Das trp Operon kann von chromosomaler DNA von E. coli oder von dem spezialisierten transduzierenden Phage Φ80pt190h abgeleitet (Hershfield, V. et al. (1974). Proc. Natl. Acad. Bei. USA. 71: 3455-3459) und in irgendeinen aus einer Reihe geeigneter Vektoren eingefügt werden, zu denen unter anderem solche gehören, die von pSC101 abstammen (Cohen, S.N. und A.C. Chang (1977). J. Bacteriol: 132, 734-737), R388 (Datta, N. und R.W. Hedges (1971). J. Gen. Microbiol. 72: 349) usw. Der Vektor kann darüber hinaus das durch ähnliche Techniken klonierte serA&spplus; Gen tragen. Das auf diese Weise konstruierte Plasmid wird dann durch Transformation in den E. coli K-12-Wirt übertragen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Vermehren und Fermentieren der genannten E.coli K-12- Stämme, die eine hohe Produktivität demonstrieren. Wenn Mikroorganismen in Batch-Kultur vermehrt werden, um eine Aminosäure zu produzieren, wird die tatsächliche Produktion der Aminosäure nur während der geringen Anzahl von Generationen benötigt, die im letzten Fermentationsgefäß vorkommen. Bei einem Fermenter mit einer Kapazität von 100.000 l sind möglicherweise nur 5 bis 10 Generationen im letzten Fermentationsgefäß notwendig, wohingegen 50 oder mehr Generationen erforderlich sind, um das Impfgut für dieses Gefäß bereitzustellen.

Die Anwendung der beschriebenen Verfahren unter Verwendung spezifischer genetischer Mutationen in Verbindung mit spezifischen Vermehrungsbedingungen gewährleistet die notwendige Stammstabilität, während gleichzeitig eine maximale Tryptophanproduktivität während der Vermehrung im letzten Fermentationsgefäß ermöglicht wird. Es können selbst ohne die Verwendung eines Antibiotikums in der letzten Fermentation hohe Tryptophanerträge erzielt werden (6. Beispiel). Die Verwendung von JP4735/pMU3028 führt zu einer hohen Tryptophan-Produktivität ohne signifikante Tyrosin- und Phenylalaninbildung.

Die folgenden E. coli K-12-Stämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) in Braunschweig unter dem Budapester Vertrag hinterlegt:

JP7847 mit der Beitrittsnummer DSM10119

JP6006 mit der Beitrittsnummer DSM10118

JP6768/pMU3018 mit der Beitrittsnummer DSM10120

JP6768/pMU3025 mit der Beitrittsnummer DSM10121

JP4735/pMU3028 mit der Beitrittsnummer DSM10122

JP6015/pMU91 mit der Beitrittsnummer DSM10123.

1. Beispiel ISOLIERUNG VON TEMPERATUREMPFINDLICHEM TRYPTOPHAN- AUXOTROPHEN MIT MUTATIONEN IM trpS GEN

Ein Stamm Escherichia coli K-12, KA56 (galE&supmin;, thi&supmin; (Russell, R.R.B. und A.J. Pittard. (1971). J. Bacteriol. 108: 790-798) wurde mit dem Mutagen N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin anhand des Verfahrens von Adelberg, Mandel und Chen behandelt (Biochem Biophys Res Commun. (1965). 18: 788-795). Nach der Behandlung mit dem Mutagen wurden die Zellen gewaschen und in mit Caseinhydrolysat und Glycerol als Kohlenstoff quelle angereichertem Minimalmedium resuspendiert, um ein in diesem Labor entwickeltes 4 Anreicherungsverfahren anzuwenden (Russell, R.R.B. und A.J. Pittard. (1971), J. Bacteriol. 108: 790-798). Nach einigen Stunden der Vermehrung bei 32ºC wurde die Kultur auf 42ºC verlagert, und eine Stunde später wurde Galactose auf eine Endkonzentration von 2% hinzugegeben. Zellen, denen es an Uridin-diphosphat-galactose-4-epimerase (d.h. galE&supmin;) mangelt, die jedoch in der Lage sind, die Enzyme Galactokinase und Galactose-1-phosphat-uridyltransferase als Reaktion auf die Zugabe von Galactose zu synthetisieren, sammeln UDP-galactose an, die eine toxische Wirkung für die Zelle hat und eine Zellauflösung verursacht (Fukasawa, T., und H. Nikaido. (1959), Nature (London). 184: 1168-1169). Zellen, die nicht in der Lage sind, neue 4 Enzyme in Glycerol-Galactose-Caseinhydrolysatmedium bei 42ºC zu synthetisieren, bilden diese Verbindung nicht und werden nicht abgetötet. Unter diesen Überlebenden sind temperaturempfindliche Auxothrope mit Mutationen im trpS Gen zu finden. (Caseinhydrolysat enthält sehr geringe Tryptophankonzentrationen). Nach 5 Stunden bei 42ºC in Anwesenheit von Galactose werden die Zellen wiedergewonnen, gewaschen und entweder (1) zur Nährstoffbouillon bei 32ºC gegeben und auf mittlere Exponentialphase kultiviert oder (2) so auf Nähragarplatten verteilt, dass etwa 200 Kolonien pro Platte erhalten werden, und 48 Stunden lang bei 32ºC inkubiert. Die Kolonien auf den jeweiligen Nähragarplatten werden auf zwei Platten mit MM und MM, angereichert mit L- Tryptophan zu 10&supmin;³M (MM + Trp), repliziert. MM steht für halbstarkes Medium 56 (Monod, Cohen-Bazire und Cohen. (1951). Biochim. Biophys. Acta 1, 585), das mit 1% Oxoid Nr. 1 Agar verfestigt wurde und Glucose und Thiamin enthält. Ein Satz Platten (MM und MM + Trp) wird bei 32ºC, der andere bei 42ºC inkubiert. Kolonien, die sich auf MM bei 32ºC, aber nicht bei 42ºC vermehren können, die sich jedoch auf dem MM+Trp-Medium bei 42ºC vermehren, sind potentielle temperaturempfindliche Tryptophan-Auxotrophe. Um darunter Mutanten mit Veränderungen im trpS Gen zu identifizieren, muss transduzierender P1-Phage auf einer Reihe von Klonen präpariert und aroB&spplus; in eine aroB&supmin; Mutante wie AB2826 transduziert werden (Pittard, J. und B.J. Wallace. (1966), J. Bacteriol. 91: 1494-1508), wobei Aro&spplus; Transduktanten auf MM bei 32ºC selektiert werden. Diese Transduktanten werden dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, sich auf MM und MM + Trp bei 42ºC zu vermehren. Wenn der ursprüngliche Tryptophan-Auxotroph im trpS Gen mutiert ist, benötigen etwa 50% der Aro&spplus; Transduktanten Tryptophan zur Vermehrung bei 42ºC. In einem alternativen Verfahren wird die in einer Nährbouillon vermehrte Kultur, die nach der Galactose-Abtötung präpariert wurde, zum Präparieren eines P1-Lysats verwendet. Dieses Lysat wird wieder mit AB2826 verwendet, um aroB&spplus; Transduktanten auf MM bei 32ºC zu selektieren. Solche Transduktanten werden dann in Bezug auf Klone gescreent, die sich nur auf MM bei 42ºC vermehren können, wenn Tryptophan zum Medium gegeben wird. Fig. 5 zeigt die Vermehrungskurven von zwei Transduktanten, aroB&spplus; trpS378 (JP1451) und aroB&spplus; trpB&spplus; (JP8820), in Glucose- Minimalmedium, das mit verschiedenen Tryptophankonzentrationen angereichert wurde, bei 42ºC. Es ist erkennbar, dass der temperaturempfindliche Phänotyp durch hohe Tryptophankonzentrationen bei der nichtpermissiven Temperatur umgekehrt werden kann.

2. Beispiel SELEKTION EINER MUTANTE VON ANTHRANILATSYNTHASE, RESISTENT GEGEN FEEDBACK-HEMMUNG DURCH SEHR HOHE TRYPTOPHANKONZENTRATIONEN

Das Plasmid pMU3018 (Fig. 6) trägt den trp Promotor, das trpE Gen und einen Teil des trpD Gens auf einem 2,9 kb SmaI HindIII Fragment. pMU3018 stammt von pMU578 ab, das ein Einzelkopie-TpR-Plasmid ist, das eine galK'-lac'ZA Fusion enthält, ähnlich wie der Promotor-Klonierungsvektor pMU575 (Andrews, A.E., B. Lawley und A.J. Pittard. (1991). J. Bacterioli 173: 5068-5078), jedoch mit einem SmaI EcoRI BglII Linker, der den Smal Ort ersetzt, und mit beseitigten DraI Fragmenten, wobei lacY und lacA deletiert sind. Wenn pMU3018 DNA mit diesen beiden Enzymen abgebaut wird und die Fragmente in bei niedriger Temperatur erstarrendes Agarosegel elektrophoretisiert werden, dann ist das Separieren und Reinigendes trpEtrpD' 2,9 kb Fragments und des größeren 13 kb Vektorfragments eine einfache Angelegenheit. Dieses 2,9 kb Fragment wurde mit 50 mM salpetriger Säure 60 Minuten lang anhand des Verfahrens von Ray et al. mutagenisiert (Ray, J.M., C. Yanofsky und R. Bauerle. (1988). J. Bacteriol. 170: 5500-5506), mit der Ausnahme, dass Spermin (1 mM) zum Mutagenesegemisch gegeben wurde. Nach der Mutagenese wurde das Fragment mit dem größeren 13 kb Fragment religiert und die Ligationsprodukte wurden in den Stamm JP6768 transformiert, einem E. coli Stamm, der trpR&supmin; ist, und bei dem das trpE Gen von dem Chromosom deletiert wurde, jedoch trpDCB und A voll funktionsfähig sind (ΔtrpLE1413 (Miozzari, G.F. und C. Yanofsky. (1978), J. Bacteriol. 133: 1457-1466). Etwa 2000 Transformanten wurden auf Luria-Agar mit Trimethoprim selektiert. Diese wurden in Bezug auf eine Vermehrung auf mit dem Tryptophananalog 5-Fluortryptophan zu 15 mM angereichertem Minimalmedium gescreent. Klone, die sich vermehrten, waren potentielle feedback-resistente Mutanten, die in dem Enzym Anthranilatsynthase verändert waren. Die Anthranilatsynthase-Aktivität von jedem dieser Klone wurde in Anwesenheit sehr hoher Tryptophankonzentrationen (13,5 g/l) unter Anwendung des in Cho, K-0. und C. Yanofsky. (1988), J. Mol. Biol. 204: 41-50, beschriebenen Tests untersucht. Ein Klon, dessen Anthranilatsynthase- Aktivität eine Hemmung von weniger als 10% bei diesen äußerst hohen Tryptophanwerten aufwies, wurde unter den resistenten Mutanten identifiziert. Das in diesem Stamm vorhandene mutierte Allel wurde trpE483 genannt. Im Vergleich dazu kodiert das Allel trpE476 eine Anthranilatsynthase mit guter Beständigkeit bei 1 g/l Tryptophan, die jedoch bei 13,5 g/l Tryptophan eine Hemmung von mehr als 60% aufweist. In Fig. 4 wird die Feedback- Sensitivität von Anthranilatsynthase von einem Stamm mit dem Wildtyp-Allel (JP6768/pMU3018) und von Stämmen mit dem trpE483 Allel (JP6768/pMU3025) und mit dem trpE476 Allel (JP6768/pMU3019) verglichen.

Zum Rekonstituieren eines trp Operons mit dem trpE483 Allel wurde das 2,9 kb Fragment, von dem es getragen wurde, mit einem 21kb HindIII SmaI Fragment vom pMU575 Derivat pMU1881 verbunden, das die trpDCBA Gene enthielt. Dies ergab das Plasmid pMU3027. Eine Zusammenfassung ist in Fig. 7 enthalten. Dieses neue trp Operon mit trpE483 wurde anschließend in das pSC101-Derivat pLG339 übertragen (Stoker, N.G. et al (1982), Gene 18, 335-341), das serA&spplus; enthielt, um pMU3028 zu erzeugen (siehe Fig. 8).

Unter Bedingungen, bei denen Stämme mit dem trpE476 Allel Tyrosin und Phenylalanin ansammelten, produzierte der Stamm mit dem trpE483 Allel überhaupt kein nachweisbares Tyrosin (siehe Beispiel 6). Für den Fachkundigen ist es offensichtlich, dass eine Bouillon ohne Nebenprodukte wie z.B. Tyrosin und Phenylalanin bevorzugt für weitere Reinigungsverfahren verwendet wird.

3. Beispiel KONSTRUKTION EINES E. coli STAMMES MIT EINEM TEMPERATUREMPFINDLICHEN trpS ALLEL UND MUTATIONEN, DIE EINEN NORMALEN AKTIVEN TRANSPORT VON TRYPTOPHAN IN DIE ZELLE VERHINDERN

Die Gene, die die verschiedenen Systeme für den aktiven Transport von Tryptophan in E. coli spezifizieren, wurden identifiziert, kloniert und sequenziert (Sarsero, J.P., P.J. Wookey, P. Gollnick, C. Yanofsky und A.J. Pittard (1991), J. Bacteriol. 173: 3231-3234; und Honore, N. und S.T. Cole (1990), Nucleic Acids Research 18: 653). Mutanten mit einem Defekt in jedem einzelnen dieser Systeme (TnaB, Mtr und AroP) wurden ebenfalls beschrieben. Die Expression des TnaB Proteins wird durch eine Mutation im tnaA Gen (tnaAI) verhindert, die einen polaren Effekt auf die tnaB Expression hat (Stewart, V. und C. Yanofsky (1985), J. Bacteriol. 164: 731-740). Dies ist eine besonders nützliche Mutation, da das tnaA Gen, das ebenfalls inaktiviert ist, das Enzym Tryptophanase kodiert, das Tryptophan abbauen könnte. Es wurden verschiedene Mutationen des mtr Gens beschrieben, und Mutanten wurden auf der Basis einer Beständigkeit gegen das Tryptophananalog 5-Methyltryptophan selektiert. Eine solche Mutation mtr-24 wurde ursprünglich von Hiraga beschrieben (Hiraga, S., K. Ito, T. Matsuyama, H. Ozeki und T. Yura (1968), J. Bacteriol. 96: 1880-1881).

Mutanten im allgemeinen aromatischen Transportsystem können ebenfalls durch Selektieren nach Beständigkeit gegen Analoge der aromatischen Aminosäuren isoliert werden. Die Mutation aroP579 wurde von Brown beschrieben (Brown K.D. (1970). J. Bacteriol. 104: 177-188).

Ein Stamm mit einer Mutation im trpS Gen und Mutationen in jedem der Gene für die Tryptophan- Transportsysteme kann ohne weiteres mit dem Transposon Tn10 und Phage-P1-vermittelter Transduktion konstruiert werden. Ein prototropher Stamm, W3110, wurde mit dem λTn10 Transposon λNK370 infiziert und tetracyclin-resistente Kolonien wurden wie von Kleckner, N., D.F. Barker, D.G. Ross und D. Botstein (1978), Genetics 90: 427-450, beschrieben selektiert. Anhand einer P1-Transduktion wurden Isolate erhalten, bei denen Tn10 eng mit aroP519, mtr-24 und tnaA1 verknüpft war. P1-Lysate konnten dann verwendet werden, um diese Mutationen jeweils der Reihe nach in den trpS Stamm einzuführen, in Verbindung mit der Selektion von tetracyclin-empfindlichen Derivaten gemäß dem Verfahren von Bochner, B.R., H.C. Huang, G.L. Shieven und B.N. Ames (1980), J. Bacteriol. 143: 926-1033.

TrpS&spplus; Derivate solcher Mutanten konnten per Transduktion mit einem Lysat von einem trpS&spplus; Klon erhalten werden, mit einer Selektion nach Vermehrung auf Platten mit 0,5 mM Tryptophan bei 42ºC.

4. Beispiel VERGLEICH VON VERMEHRUNGSRATEN VON trpS378 UND trpS&spplus; STÄMMEN MIT DEFEKTEM AKTIVEM TRANSPORT VON TRYPTOPHAN UND DEFEKTER BIOSYNTHESE

Tryptophan Auxotrophe, die das Wildtyp-trpS-Allel besitzen und in der Lage sind, Tryptophan aktiv in die Zelle zu transportieren, vermehren sich in Minimalmedium, das mit Tryptophankonzentrationen von nur 5 · 10&supmin;&sup5; M angereichert ist, mit hoher Geschwindigkeit.

Tryptophan-Auxotrophe mit defektem aktivem Transport von Tryptophan benötigen höhere Konzentrationen (~10&supmin;³ M) für eine optimale Vermehrung, wohingegen Stämme mit der zusätzlichen Mutation trpS378 Konzentrationen von bis zu 5 · 10&supmin;³ M benötigen, bevor eine maximale Vermehrungsrate erreicht wird.

In Fig. 1 wird die Vermehrungsreaktion auf Tryptophan von trpS378 und trpS&spplus; Derivaten eines Tryptophan- Auxotrophen (ΔtrpLE1413) verglichen, der auch Mutationen besitzt, die Mtr, AroP und TnaB Proteine inaktivieren. JP6006 wird abgeleitet von JP4153 durch die Einführung von ΔtrpLE1413 per P1-Transduktion unter Verwendung von Tn10 als ein gekoppelter Marker und die Isolierung eines tetracyclin-empfindlichen Derivats, gefolgt von der Einführung von sac&spplus; durch P1-Transduktion, unter Verwendung eines auf dem sac&spplus; Stamm GA122 vermehrten P1-Lysats (Alaeddinoglu, N.G. und H.P. Charles (1979), J. Gen. Microbiol. 110: 47-59). JP4153 ist aroF363 aroG103(FBR) aroH371(FBR) trpE382(FBR) trpR363 tyrR366 trpS378 aroP579 mtr-24 tna-1. JP7847 ist ein trpS&spplus; Derivat von JP6006, isoliert durch P1-Transduktion.

Zellen wurden in Minimalmedium, das mit verschiedenen Tryptophankonzentrationen angereichert war, bei 30ºC vermehrt. Die Vermehrung wurde anhand der optischen Dichte mit einem Klett-Kolorimeter gemessen, und die Verdopplungszeiten wurden anhand der Exponentialphase jeder Vermehrungskurve errechnet.

5. Beispiel DER EFFEKT DER TEMPERATUR UND DER ZUGABE VON HEFEEXTRAKT AUF DIE STAMMSTABILITÄT UND PRODUKTIVITÄT

Die Stammstabilität kann durch Messen der Produktivität von Tryptophan und Anthranilat von Kulturen in Schüttelkolben getestet werden, wobei alle 24 Stunden serielle 1%-Übertragungen stattfinden. Die Biomasse wird auf etwa 0,4 mg/ml durch die Phosphatkonzentration, das im Hefeextrakt verfügbare Phosphat oder durch eine Kombination der beiden begrenzt. Die Passage durch jeden Kolben der Serie repräsentiert eine 100-fache Erhöhung der Zelldichte bzw. 6,7 Generationen.

Die Tryptophanproduktivität bleibt bei einer Reihe von Kolben typischerweise nahe bei 100% des normalen Wertes für den Stamm, mit einer unwesentlichen Menge an nachweisbarem Anthranilat. In einem Kolben weiter unten in der Serie fällt die Tryptophan-Produktivität allgemein plötzlich auf 40%-50% ab, während gleichzeitig Anthranilat auftritt. Zellzahlen weisen darauf hin, dass der Übergang von hoher Tryptophan-Produktivität ohne Anthranilat zu geringer Tryptophan-Produktivität mit Anthranilat einer Segreganten- oder Mutantenzunahme von 0-10% bis 40-70% entspricht.

Das Medium für jeden Stamm wird von sterilen Vorratslösungen wie folgt hergestellt:

Glucose (20%) oder Saccharose (20%) 10 ml

MOPS Minimalmedium (x10)* 20 ml

(3-(N-Morpholino)propansulfonsäure)

B1 (Thiamin) (0,01%) 0,2 ml

Phosphat (15 mM KH&sub2;PO&sub4;) 2,0 ml

Tetracyclin (10 mg/ml), bei Bedarf 0,2 ml

Steriles destilliertes Wasser 170 ml

*MOPS Minimalmedium (x10) enthält pro Liter: 167,44 g

MOPS, 1,41 g Na&sub3;-Citrat, 2H&sub2;O, 0,13 g FeSO&sub4;·&sub2;O, 19,2 g NH&sub4;Cl, 4,0 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 2,4 g KCl, 0,15 mg CaCl&sub2;·2H&sub2;O und Spurenelemente. (14 ug CoCl&sub2;·6H&sub2;O, 5 ug CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 48 ug H&sub3;BO&sub3;, 57 ug Zn SO&sub4;·7H&sub2;O, 32 ug MnCl&sub2;·4H&sub2;O und 8 ug (NH&sub4;)&sub6; Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4H&sub2;O).

Eine 10-ml-Kultur wird von einem frischen Patch des Teststammes inokuliert und über Nacht unter Schütteln bei 30ºC inkubiert. Das Verfahren von der Transformation bis zu dieser Stufe repräsentiert etwa 34 Generationen, die in die Kalkulationen nicht einbezogen werden. Die Übernachtkultur wird zum Inokulieren des ersten Kolbens in der Serie verwendet.

Es finden 1%-Übertragungen (100 ul in 10 ml) in 24- Stunden-Intervallen statt, bis die Tryptophan-Produktivität der Kultur zurückgeht und gleichzeitig Anthranilsäure erscheint. Unter den Bedingungen dieses Experiments erreichte jede Kultur die stationäre Phase vor ihrer Übertragung, und jeder Kolben repräsentiert etwa 6,7 Generationen. Würden die drastischen Veränderungen bei den Tryptophan- und Anthranilsäurekonzentrationen zum Beispiel im sechsten Kolben auftreten, dann würde die Stabilität als 5 · 6,7 oder 33,5 Generationen registriert. Zum Zeitpunkt der jeweiligen Übertragungen wird die optische Dichte der 24-Stunden-Kultur gemessen, eine Probe wird zentrifugiert und das Supernatant wird durch ein Einwegfilter (Millipore, 0,45 um) unter Verwendung einer Spritze filtriert. Die Konzentration von Tryptophan und Anthranilsäure wird durch HPLC bestimmt.

Messung der Produktivität (Y p/x) in Kolben

Der Teststamm wird bei der erforderlichen Temperatur unter Schütteln vermehrt, und die Produktivität wird nach 24 und nach 48 Stunden gemessen. Das Medium ist das gleiche wie das, das in Stabilitätsversuchen verwendet wird. Eine 10-ml-Kultur wird von einem frischen Patch inokuliert und über Nacht unter Schütteln inkubiert. Damit wird dann der Testkolben inokuliert, der 15 ml des gleichen Mediums enthält. Nach 24 Stunden wird eine Probe genommen. Die optische Dichte wird bei 660 λ mit einem Spektrophotometer gemessen, und das Trockengewicht wird anhand einer Standardkurve errechnet. Die Probe wird zentrifugiert, filtriert, und die Tryptophan-, Tyrosin- und Anthranilsäure-Konzentration wird per HPLC unter Verwendung angemessener Standards gemessen. Die Produktivität (Y p/x) wird als der Tryptophanertrag (g/l) dividiert durch den Ertrag von Biomasse oder Trockengewicht (g/l) definiert.

Der Effekt der Inkubationstemperatur auf die Stabilität und die Produktivität eines Überproduktionsstammes, der das trpS378 Allel enthält, und eines Plasmids, das das trp Operon enthält, das eine feedback-resistente Anthranilatsynthase kodiert, wird in Fig. 2 gezeigt.

Niedrige Temperaturen begünstigen eine hohe Stabilität und eine geringe Produktivität, während höhere Temperaturen die Produktivität auf Kosten der Stabilität fördern. Dies kann in verschiedenen Produktionsstämmen mit unterschiedlichen Primärselektionen demonstriert werden. Die Daten in Fig. 2 beziehen sich auf JP6015/pMU91, und die Primärselektion betrifft Ser*. JP6015 wird von JP4153 abgeleitet (s. 4. Beispiel), und zwar durch die Einführung von sac&spplus; per Transduktion und die Einführung von serA&supmin; per Cotransduktion mit einem eng gekoppelten Tn10 Transposon und die folgende Selektion eines tetracyclin-empfindlichen Derivats. pMU91 ist ein Plasmid, das von pSC101 abstammt (Cohen, S.N. und A.C. Chang (1977), J. Bacteriol. 132: 734- 737), das TcR, trpE476DCBA und serA&spplus; enthält (siehe Fig. 9).

Das trpE476DCBA Allel wurde mit dem spezialisierten transduzierenden Phage Φ80pt190h isoliert (Herschfield, V. et. al (1974), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 3455-3459). Ein trpE Stamm, der Φ80pt190h enthielt, wurde auf Minimalmedium mit 1 mM 5-Methyltryptophan (5MT) plattiert. Ein Pool von Zellen wurde mit UV-Licht dazu gebracht, ein Lysat zu produzieren, das in einer nachfolgenden Transduktion eingesetzt wurde, wobei Trp&spplus;5MTR Transduktanten selektiert wurden. Mehrere davon wurden hinsichtlich Anthranilatsynthase-Aktivität untersucht, und das trpE476DCBA Allel war dadurch gekennzeichnet, dass es eine Anthranilatsynthase mit einer vollen Aktivität von 70% bei 10 mM L-Tryptophan kodierte. Die trp Gene wurden auf einem 7,9 kb XhoI/SalI Fragment in den XhoI Ort von pSC101 kloniert. Das serA&spplus; Gen wurde in den XhoF Ort auf einem 2,9 kb SalI Fragment eingeführt.

Der Effekt der An- oder Abwesenheit von Hefeextrakt auf die Stabilität und die Produktivität kann auch in verschiedenen Tryptophan-Überproduktionsstämmen demonstriert werden. Die Daten in Fig. 3, unter Verwendung von JP6015/pMU91 und einer Ser&spplus; Primärselektion, demonstrieren die Verwendung von Hefeextrakt zur Verringerung der Produktivität und Erhöhung der Stabilität.

6. Beispiel 4 TRYPTOPHANPRODUKTION MIT ESCHERICHIA COLI JP6015/pMU91

Einzelne Kolonien des Escherichia coli K-12-Stammes JP6015/pMU91 wurden auf MM-Agar (siehe 1. Beispiel), der mit Glucose (2 g/l), Hefeextrakt (5 g/l) und Tetracyclin (5 mg/l) angereichert war, durch Inkubation bei 30ºC über einen Zeitraum von 48 Stunden produziert. Eine einzige Kolonie wurde in einer 10-ml-Kultur (100 ml Kolben) durch Inkubation über einen Zeitraum von etwa 16 Stunden bei 30ºC und mit 250 UPM (Umdrehungen pro Minute) weiter vermehrt.

Das Kulturmedium wurde von sterilen Vorratslösungen wie folgt hergestellt:

Glucose (20%) 10 ml

MOPS Minimalmedium (x10) 20 ml (s. 5. Beispiel)

Hefeextrakt (20%) 1 ml

Tetracyclin (10 mg/l) 0,1 ml

Steriles destilliertes Wasser 170 ml

Ein ml dieser Kultur des Escherichia coli K-12-Stammes JP6015/pMU91 wurde in 300 ml eines Impfmediums (Zusammensetzung siehe Tabelle 1) in einem Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von 2000 ml inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC 24 Stunden lang auf einem Rundschüttler mit 150 UPM kultiviert.

70 ml der daraus hervorgehenden Impfkultur wurden in E 700 ml eines Vorfermentationsmediums (Zusammensetzung siehe Tabelle 2) in einem 2-1-Gefäßfermenter inokuliert, und die Kultivierung fand 24 Stunden lang bei 30ºC statt. Der pH- Wert von 6,7 wurde mit 25%iger Ammoniaklösung geregelt; pO&sub2; wurde durch Belüften mit einer Rate von 1/3 vvm und Rühren mit einer Geschwindigkeit zwischen 280 und 380 UPM über 40% gehalten.

Die daraus hervorgehende Vorkultur mit einem O.D.-Wert von 20 (bei 660 nm gemessen) wurde in 6,3 l des Hauptfermentationsmediums (Zusammensetzung siehe Tabelle 3) in einem 10-1-Fermenter inokuliert.

Die Fermentation wurde bei 33ºC mit Belüftung (0,5 vvm) durchgeführt, wobei pO&sub2; über 40% gehalten wurde, indem die Kultur mit 700 bis 1200 UPM gerührt wurde; der pH-Wert wurde mit 25%iger Ammoniaklösung auf 7,0 gehalten. Nach 6,5 Stunden wurde kontinuierlich eine Lösung aus 620 g/l (Gewichtsvolumen) Glucose in die Kultur gegeben, so dass die Glucosekonzentration im Fermenter nicht über 17 g/l stieg. Nach 32 Stunden war die Fermentation abgeschlossen. Die Menge an angereichertem L-Tryptophan und Nebenprodukt L-Phenylalanin und L-Tyrosin wurde mengenmäßig anhand Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 enthalten.

7. Beispiel TRYPTOPHANPRODUKTTON MIT ESCHERICHIA COLI JP4735/pMU3028

Einzelne Kolonien des Escherichia coli K-12-Stammes JP4735/pMU3028 wurden auf mm-Agar (siehe 1. Beispiel), der mit Glucose (2 g/l), Hefeextrakt (5 g/l) und Tetracyclin (2,5 mg/l) angereichert war, durch Inkubation bei 30ºC über einen Zeitraum von 48 Stunden produziert. Eine einzige Kolonie wurde in einer 10-ml-Kultur (100 ml Kolben) durch Inkubation über einen Zeitraum von etwa 16 Stunden bei 30ºC und mit 250 UPM (Umdrehungen pro Minute) weiter vermehrt.

Das Kulturmedium wurde von sterilen Vorratslösungen wie folgt hergestellt:

Glucose (20%) 10 ml

MOPS Minimalmedium (x10) 20 ml (s. 5. Beispiel)

Hefeextrakt (20%) 1 ml

Tetracyclin (10 mg/l) 0,05 ml

Steriles destilliertes Wasser 170 ml

Ein ml dieser Kultur des Escherichia coli K-12-Stammes JP4735/pMU3028 wurde in 300 ml eines Impfmediums (Zusammensetzung siehe Tabelle 1) in einem Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von 2000 ml inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC 24 Stunden lang auf einem Rundschüttler mit 150 UPM kultiviert. 70 ml der daraus hervorgehenden Impfkultur wurden in 700 ml eines Vorfermentationsmediums (Zusammensetzung siehe Tabelle 2) in einem 2-1- Gefäßfermenter inokuliert, und die Kultivierung fand 24 Stunden lang bei 30ºC statt. Der pH-Wert von 6,7 wurde mit 25%iger Ammoniaklösung geregelt; pO&sub2; wurde durch Belüften mit einer Rate von 1/3 vvm und Rühren mit einer Geschwindigkeit zwischen 280 und 380 UPM über 40% gehalten.

Die daraus hervorgehende Vorkultur mit einem O.D.-Wert von 20 (bei 660 nm gemessen) wurde in 6,3 l des Fermentationsmediums (Zusammensetzung siehe Tabelle 3) in einem 10-1-Fermenter inokuliert.

Die Fermentation wurde bei 33ºC mit Belüftung (0,5 vvm) durchgeführt, wobei pO&sub2; über 40% gehalten wurde, indem die Kultur zwischen 700 und 1200 UPM gerührt wurde;

der pH-Wert wurde mit 25%iger Ammoniaklösung auf 7,0 gehalten. Nach 6,5 Stunden wurde kontinuierlich eine Lösung aus 620 g/l (Gewichtsvolumen) Glucose in die Kultur gegeben, so dass die Glucosekonzentration im Fermenter nicht über 27 g/l stieg. Nach 45 Stunden war die Fermentation abgeschlossen. Die Menge an angereichertem L- Tryptophan wurde mengenmäßig mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 enthalten.

Tabelle 1 Zusammensetzung des Impfmediums

Glucose·H&sub2;O 4 g/l

Hefeextrakt 1,1 g/l

Morpholino-Propansulfonsäure 16,7 g/l

Trinatriumcitrat·2H&sub2;O 0,14 g/l

FSO&sub4;·7H&sub2;O 13 mg/l

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,4 g/l

(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,29 g/l

KCl 0,24 g/l

KH&sub2;PO&sub4; 1,05 g/l

Thiaminhydrochlorid 5 mg/l

Tetracyclin 2,5 mg/l

Spurenelemente 2 ml/l

pH-Einstellung auf etwa 7,0 mit 25%igem wässrigem NH&sub4;OH

Die Spurenelement umfassen:

Na&sub2;MoO&sub4;·H&sub2;O 0,15 g/l

H&sub3;BO&sub3; 2,5 g/l

CoCl&sub2;·6H&sub2;O 0,7 g/l

CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,25 g/l

MnCl&sub2;·4H&sub2;O 1,6 g/l

ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 0,3 g/l

Tabelle 2 Zusammensetzung des Vorfermentationsmediums

Glucose·H&sub2;O 27,5 g/l

Hefeextrakt 7,5 g/l

Trinatriumcitrat·2H&sub2;O 1 g/l

FeSO&sub4;·7H&sub2;O 1,1 g/l

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 3,15 g/l

(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 8,65 g/l

KH&sub2;PO&sub4; 0,75 g/l

Thiaminhydrochlorid 24 mg/l

Tetracyclin 2,5 mg/l

K&sub2;SO&sub4; 2,3 g/l

Spurenelemente (siehe Tabelle 1) 2 ml/l E

Tabelle 3 Zusammensetzung des Hauptfermentationsmediums

Glucose·H&sub2;O 27,5 g/l

Trinatriumcitrat·2H&sub2;O 1 g/l

FeSO&sub4;·7H&sub2;O 1,4 g/l

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 3,15 g/l

(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 8,65 g/l

KH&sub2;PO&sub4; 1,5 g/l

K&sub2;SO&sub4; 2,3 g/l

Spurenelemente (siehe Tabelle 1) 4 ml/l

Tabelle 4

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1

Vermehrungsraten von JP7847 (trpS&spplus;) und JP6006 (trpS378) bei 30ºC in Abhängigkeit von der Tryptophankonzentration im Medium. Das Medium ist halbstarker Puffer 56 (Monod, J., G. Cohen-Bazire und M. Cohen (1951), Biochimica et Biophysica Acta 1: 585-599), angereichert mit Thiamin zu 10 ug/ml und Glucose zu 0,2%). Beide Stämme sind Tryptophan-Auxotrophe aufgrund der Deletion ΔtrpLE1413, und beide weisen einen Defekt bei der aktiven Aufnahme von Tryptophan aufgrund der Mutation mtr-24, tna-I und aroP519 auf. Sie sind beide außerdem sac&spplus; aroF363 aroG103 (FBR) trpR363 tyrR366.

Fig. 2

Stabilität und Produktivität eines Tryptophan- Produktionsstammes (JP6015/pMU91) bei einer Vermehrung in Kolben mit unterschiedlichen Temperaturen.

Fig. 3

Stabilität und Produktivität eines Tryptophan- Produktionsstammes (JP6015/pMU91) bei einer Vermehrung in Kolben bei 30ºC in Anwesenheit verschiedener Hefeextraktkonzentrationen.

Fig. 4

Ein Vergleich der Sensitivität gegenüber Feedback-Hemmung in vitro von Anthranilatsynthaseenzymen von einem Stamm mit einem Wildtyp-trpE-Allel (JP6768/pMU3018) und Stämmen mit den Mutationen trpE476 (JP6768/pMU3019) und trpE483 (JP6768/pMU3025).

Fig. 5

Vermehrungskurven bei 42ºC eines aroB&spplus; trpS&spplus; Stammes (JP8820) in Minimalmedium und eines aroB&spplus; trpS378 Stammes (JP1451) in Minimalmedium, angereichert mit verschiedenen Tryptophankonzentrationen.

Fig. 6

Restriktionskarten von pMU3018 (Fig. 6a), pMU3019 (Fig. 6b) und pMU3025 (Fig. 6c). In jedem Fall wird der Vektor (pMU578) in Schwarz dargestellt. pMU3019 wurde ähnlich wie pMU3018 konstruiert, unter Verwendung eines 2,9 kb SmaI/HindIII Fragments, das das 5'-Ende des trp Operons enthielt, aber eher mit trpE476 als dem trpE Wildtyp. pMU3025 wurde von pMU3018 durch Mutagenese wie im 2. Beispiel beschrieben abgeleitet.

Fig. 7

Der Einbau von trpE483 in das trp Operon.

Fig. 8

Restriktionskarte von pMU3028. Der Vektor (pLG339) ist in Schwarz dargestellt. Konstruiert in einem 2-Stufen- Klonierungsverfahren:

(i) ein 2,6 kb Fragment mit serA&spplus; wurde in den SmaI Ort von pLG339 kloniert;

(ii) ein 8,1 kb SalI Fragment, das trpE483DCBA von pMU3027 trug (siehe Fig. 7), wurde in den XhoI Ort des resultierenden Plasmids kloniert.

Fig. 9

Restriktionskarte von pMU91.


Anspruch[de]

1. E.coli-Stämme mit erhöhter Produktivität für L- Tryptophan, die in ihrem Genom ein mutiertes Gen umfassen, das teilweise defekte Tryptophanyl-tRNA- Synthetase kodiert, das, wenn in einem nicht produzierenden Stamm anwesend, durch eine temperaturabhängige Tryptophan-Auxotrophie gekennzeichnet ist, und die weitere Mutationen auf dem Chromosom in einem oder mehreren der Gene haben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mtr, aroP, tnaA oder tnaB, und mit einem Plasmid transformiert werden, das ein Tryptophan-Operon enthält, das Anthranilat-Synthase kodiert, die von Feedback-Hemmung durch Tryptophan befreit ist.

2. E.voli-Stämme nach Anspruch 1, wobei die genannten Mutationen, die zur defekten Tryptophanaufnahme führen, aroP579, mtr-24 und tnaA1 sind.

3. E.coli-Stämme nach Anspruch 1 und 2, wobei das genannte mutierte Gen, das teilweise defekte Tryptophanyl-tRNA-Synthetase kodiert, das trpS378 Allel ist, erhältlich von E.coli JP6006, das bei der DSM (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweig, Deutschland) unter der Beitrittsnummer DSM10118 hinterlegt ist.

4. E.coli-Stämme nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die genannten Stämme mit einem Plasmid transformiert sind, das das Tryptophan-Operon trägt, das ein Anthranilat- Synthaseenzym kodiert, das von Feedback-Hemmung durch Tryptophan befreit ist.

5. E.coli-Stämme nach den Ansprüchen 1 bis 4, die Mutationen in einem oder mehreren Gen(en) haben, ausgewählt aus der Gruppe trpEDCBA - die, wenn in einem nicht produzierenden Stamm anwesend, Tryptophan- Auxotrophie auf eine Zelle übertragen.

6. E.coli-Stamm nach Anspruch 4, wobei das genannte Plasmid pMU3025 ist und das trpE483 Allel trägt, wobei das genannte Plasmid von E.coli JP6768/pMU3025 erhältlich ist, das bei der DSM unter der Beitrittsnummer DSM10121 hinterlegt ist.

7. E.coli-Stamm nach Anspruch 4 und 5, wobei das genannte Plasmid pMU3028 ist und das trp483 Allel, die trpDCBA Gene und serA&spplus; trägt, wobei das genannte Plasmid von E.coli JP4735/pMU3028 erhältlich ist, das bei der DSM unter der Beitrittsnummer DSM10122 hinterlegt ist.

8. E.coli-Stamm nach den Ansprüchen 3, 4 und 5, wobei das genannte Plasmid pMU91 ist und die trpE476 DCBA Gene und serA&spplus; trägt, wobei das genannte Plasmid von E. coli JP6015/pMU91 erhältlich ist, das bei der DSM unter der Beitrittsnummer DSM10123 hinterlegt ist.

9. E.coli-Stämme nach Anspruch 1 bis 8, die Mutationen in einem oder mehreren der folgenden haben: trpR, tyrR, serA, aroG (macht DAHP Synthase (Phe) resistent gegenüber Feedback-Hemmung), aroH (macht DAHP Synthase (Trp) resistent gegenüber Feedback-Hemmung), trpE (macht Anthranilat-Synthase resistent gegenüber Feedback-Hemmung).

10. Verfahren zum Stabilisieren der Charakteristiken von E.coli-Stämmen mit Produktivität für L-Tryptophan nach Anspruch 1, während der Vermehrung von Impfgut, umfassend die folgenden Schritte: Einführen eines mutierten Gens in das Genom von E.coli-Stämmen, das eine teilweise defekte Tryptophanyl-tRNA-Synthetase kodiert, das, wenn in einem nichtproduzierenden Stamm anwesend, durch eine temperaturabhängige Tryptophan- Auxotrophie gekennzeichnet ist, Einführen weiterer Mutationen auf das Chromosom in den Genen aroP, mtr, tnaA oder tnaB und Transformieren mit einem Plasmid, das ein Tryptophan-Operon enthält, das Anthranilat- Synthase kodiert, die von Feedback-Hemmung durch Tryptophan befreit ist, und Kultivieren des genannten Stammes bei niedriger Temperatur.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die genannte Temperatur zwischen 27ºC und 30ºC liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die genannten Mutationen arop579, mtr-24 und tnaA1 sind.

13. Verfahren nach Anspruch 10 und 12, wobei die genannten E.coli-Stämme ein Plasmid tragen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das genannte Plasmid das trpE483 Allel trägt.

15. Verfahren nach Anspruch 10 bis 14, wobei während der Impfgutvermehrung Hefeextrakt zugegeben wird.

16. Verfahren zum Produzieren von L-Tryptophan durch Fermentation, umfassend: Impfgutvermehrung (Kultivierung) von E.coli-Stämmen nach den Ansprüchen 1 bis 9 bei etwa 30ºC, vorzugsweise in Anwesenheit von Hefeextrakt, Begrenzen der Vermehrung durch die Konzentration von verfügbarem Phosphat, in einem angemessenen Nährmedium, und Fermentieren bei einer Temperatur zwischen 33ºC und 37ºC ohne Hefeextrakt und Wiedergewinnen von in der resultierenden Kulturflüssigkeit angesammeltem Tryptophan.

17. Verfahren zum Produzieren von L-Tryptophan nach Anspruch 16, wobei die genannte Fermentation ohne Antibiotika stattfindet.







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