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Dokumentenidentifikation DE69525655T2 12.09.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0800862
Titel ADSORBENT FÜR ENDOTOXINE, TUMOR NEKROSE FAKTOR-ALPHA ODER INTERLEUKINE, METHODE ZUR ENTFERNUNG MITTELS ADSORPTION SOWIE ADSORBER
Anmelder Kanegafuchi Kagaku Kogyo K.K., Osaka, JP
Erfinder HIRAI, Fumiyasu, Hyogo-ken 661, JP;
TANI, Nobutaka, Osaka 545, JP;
YASUDA, Takamune, Hyogo-ken 651-21, JP;
ASAHI, Takashi, Hyogo-ken 655, JP
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69525655
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.12.1995
EP-Aktenzeichen 959393869
WO-Anmeldetag 04.12.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/JP95/02500
WO-Veröffentlichungsnummer 0009620042
WO-Veröffentlichungsdatum 04.07.1996
EP-Offenlegungsdatum 15.10.1997
EP date of grant 27.02.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.09.2002
IPC-Hauptklasse B01J 20/26
IPC-Nebenklasse B01D 15/00   A61M 1/36   C07K 1/14   B01J 47/00   

Beschreibung[de]

Adsorbens für Endotoxin, Tumornekrosefaktor-α oder Interleukine, Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen derselben und Adsorber für dasselbe

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Adsorbens für mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Endotoxin, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukinen (einschließlich Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-8 (IL-8)), ein Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen derselben sowie einen Adsorber für dieselben.

Technischer Hintergrund

Ein Endotoxin, das auf der Oberfläche eines gramnegativen Bakteriums vorhanden ist, ist als repräsentative Substanz bekannt, die infolge von bakterieller Infektion zu einer Entzündung führt. Die Produktion verschiedener Cytokine und/oder aktivierter Komplemente wird durch die Wirkung von Endotoxin gefördert. In der Tat sind die Substanzen, die für die Entzündung durch bakterielle Infektion verantwortlich sind, diese Cytokine und aktivierten Komplemente. Als die wichtigste Substanz unter diesen Cytokinen wird TNF-α angesehen.

Beispielsweise im Fall von Septikämie (Blutvergiftung) bewirkt bakterielle Infektion Endotoxinproduktion und verursacht eine systemische Entzündungsreaktion. Wenn sich dieses Entzündungssymptom verschlimmert, führt es zu Schocksymptomen (septischer Schock) und kann weiter zu ernsten Zuständen wie Organopathie (Organinsuffizienz) und Mehrfachorganopathie führen.

Die Septikämie wird auch durch grampositive Bakterien hervorgerufen. In diesem Fall werden die Cytokine wie TNF-α und dergleichen jedoch sogar ohne Endotoxin produziert. Es wird vermutet, dass diese Cytokine durch verschiedene Stimulationen an den infizierten Stellen produziert werden.

Im Fall von Septikämie ist die Prognose für Patienten, deren Blutkonzentration an TNF-α hoch ist, nicht gut. Daher spiegelt die TNF-α-Konzentration den Schweregrad des Krankheitszustands wieder (Shuchuchiryo, 6, Nr. 2, Seiten 115 bis 123 (1994)).

Beispiele für Verfahren zur Behandlung von Septikämie schließen die Verabreichung von Antibiotika als Maßnahmen gegen die Infektion, die Verabreichung von γ-Globulin, um die Widerstandskraft gegen die Infektion zu aktivieren, und dergleichen ein. Die Mortalitätsrate ist jedoch nach wie vor hoch. Vom medizinischen Standpunkt ist daher die Entfernung von Endotoxin, das das verursachende Agens der Septikämie ist, und TNF-α, einem Cytokin, das Entzündung hervorruft, aus Körperflüssigkeit erwünscht.

Bei andere Krankheiten als Septikämie, an denen TNF-α beteiligt ist, ist zudem bekannt, dass bei entzündlicher Darmerkrankung (IBD), für das eine Abnormität der Immunität als kausales Agens angenommen wird, systemischem Lupus erythematodes (SLE) oder Kawasaki-Krankheit die Konzentration an TNF-α im Blut hoch ist, was mit der Schwere der Krankheit übereinstimmt, und dass bei rheumatoider Arthritis (RA) die Konzentration an TNF-α in der Gelenkinnenhaut ansteigt (Nipponrinsyo, 48, Zusatzausgabe, Seiten 304 bis 311 (1990)). Daher können Verfahren zur Behandlung dieser Krankheiten auch die Entfernung von TNF-α aus Körperflüssigkeit einschließen.

Es ist bekannt, dass Adsorbentien zur Entfernung von Endotoxin verwendet werden. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-16389 offenbart ein Material, bei dem Polymyxin (das ein bekanntes Antidot für Endotoxin ist) auf einem geeigneten Träger fixiert wird. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 3-35974 offenbart ein Adsorbens, bei dem basische funktionelle Stickstoffgruppen und Polymyxin an Vinylpolymer gebunden werden. Hierdurch wird Endotoxin durch Polymyxin zersetzt, und das Abbauprodukt wird durch die funktionellen Stickstoffgruppen adsorbiert. Es sind jedoch mehrere Schritte zur Herstellung eines solchen Adsorbens erforderlich, und Polymyxin (das als Antidot verwendet wird) ist sehr teuer. Die japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 6-211900 offenbart ein Adsorptionsmaterial, das Träger (beispielsweise poröses Glas, Kieselgel, mit porösem organischem Polymer beschichtetes Kieselgel, vernetzte Kohlehydrate und dergleichen) mit geeigneter Porengröße und geeignetem Molekülausschlussbereich umfasst, an die ein Polyanionpolymer gebunden ist. Seine effektive Adsorption von Endotoxin ist jedoch gering.

Es ist auch ein Adsorbens zum Entfernen von TNF-α aus Körperflüssigkeit bekannt. Die japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 6-211900 offenbart beispielsweise ein Adsorptionsmaterial, das poröse Träger umfasst, an die die funktionellen Gruppen einer polyanionischen Kette über kovalente Bindungen gebunden sind. In den dort gegebenen Beispielen wird ein poröser Träger verwendet, an den Dextransulfat gebunden ist. Die Wechselwirkung zwischen dem Material, an das Dextransulfat gebunden ist, und TNF-α ist jedoch schwach. Seine Wirkung besteht daher lediglich in der Verzögerung der Elution, und das Material kann TNF-α nicht adsorbieren. Daher ist dieses Adsorptionsmaterial für den praktischen Einsatz nicht geeignet.

Wie bereits gesagt sind Cytokine sehr wichtige proteinhaltige Substanzen als biophylaktische Faktoren, die an verschiedenen antigenspezifischen oder nicht-spezifischen immunologischen Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Cytokine sind zum Aufrechterhalten der biologischen Homöostase notwendig und unentbehrlich und werden im Fall einer Krankheit, die von Entzündung begleitet ist, in großen Mengen produziert und sind an der Entstehung und der Länge der Pathologie der Krankheit beteiligt.

Interleukine sind als von TNF-α verschiedene Cytokine bekannt.

IL-1β ist ein entzündliches Cytokin, das hauptsächlich durch einen Monozyten und/oder Makrophagen bei Stimulation durch Fremdsubstanzen wie Bakterien produziert wird. 1984 wurde menschliches IL-1β-Gen durch Auron et al. geklont. Wie aus der Tatsache ersichtlich ist, dass IL-1β als endogenes Pyrogen (EP), leukozytischer endogener Mediator (LEM), Lymphozytenaktivierungsfaktor (LAF), B-Zellen-Aktivierungsfaktor (BAF) und dergleichen bezeichnet wurde, bis auf dem zweiten internationalen Lymphokine-Workshop 1979 die standardisierte Bezeichnung Interleukin 1 (IL-1) festgelegt wurde, hat IL-1β zahlreiche biologische Aktivitäten. Obwohl IL-1β, das einer der Hauptmediatoren der Entzündung ist, eine wichtige Rolle bei verschiedenen Reaktionen einschließlich Homöostase eines Organismus im Normalzustand spielt, ist deutlich geworden, dass IL-1β die Zerstörung von Gewebe oder Entstehung und/oder Verschlechterung der Pathologie eines Patienten mit entzündlicher Krankheit herbeiführt, wenn IL-1β im Übermaß oder kontinuierlich für eine längere Zeit durch irgendeinen Mechanismus produziert wird (Biomedica, 9, 1993, Seiten 703 bis 707). Es wurde vorgeschlagen, dass IL-1β insbesondere an pathologischen Zuständen wie dem toxischen Syndrom einschließlich Septikämie, rheumatoide Arthritis (RA), Lyme-Krankheit, Osteoporose, Kawasaki-Krankheit, Gicht, Glomerulonephritis, dilatierte Kardiomyopathie, Endometritis, vorzeitige Wehen, Granulom, akute myelogene Leukämie, Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Leberfibrose, Zirrhose, Alkoholhepatitis und dergleichen (Nipponigakukan, Xytokine -From Foundation to The Latest Information-, 1991, Seiten 13 bis 20, und Seiten 177 bis 187) beteiligt ist. Daher ist ein Verfahren zum spezifischen Unterdrücken von IL-1β erwünscht und wird mit Begeisterung erforscht. Als Vertreter wurden ein Anti-IL-1β-Antikörper, ein Anti-IL-1β-Rezeptorantikörper, ein IL-1-Rezeptorantagonist (IL- 1ra) und dergleichen entwickelt (Igakunoayumi, 167, 1993, Seiten 432 bis 435), und einige von ihnen wurden klinischen Versuchen gegen Septikämie als Zielkrankheit unterzogen. Keines davon ergab jedoch die erwartete Wirkung und ist bisher zur praktischen Anwendung gelangt.

IL-2 ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 15 kDa und wurde früher als T-Zellenwachstumsfaktor (TCGF) bezeichnet. Das Gen für IL-2 wurde von Taniguchi et al. 1983 geklont. Es ist vorgesehen, IL-2 als therapeutisches Agens gegen Krebs zu verwenden, indem IL-2 allein oder für lokale adoptive Immuntherapie verwendet wird, da IL-2 auf T-Zellen eine wachstumsfördernde Aktivität hat.

Alternativ ist aus einem Experiment mit einer transgenen Maus ein Befund erhalten worden, der darauf hindeutet, dass kontinuierlich an einer lokalen Stelle (z. B. der Pankreas) produziertes IL-2 ein potentes kausales Agens für autoimmunen Diabetes mellitus ist (W. R. Health, J. Allison et al., Nature 359, Seite 547, 1992). Es wurde auch berichtet, dass eine Verabreichung von IL-2 zu einer Entwicklung von systemischem Lupus erythematodes (SLE) und/oder RA führte, die beide Autoimmunkrankheiten sind (P. Chazerain, O. Meyer, M.-F. Kahn et al., Ann. Intern. Med., 116, Seite 427, 1992, und U. B. Wandl, M. Nagel- Kiemke, D. May et al., Clin. Immunol. Imunopathol., 65, Seite 70, 1992). Es wird zudem vorgeschlagen, dass IL-2 zusammen mit TNF-α an pathologischen Zuständen beim septischen Schock beteiligt ist (S. Endo, K. Inada, Y. Inoue et al., Circulatory Shock, 38, Seite 264, 1992). Wie gesagt sind die Nebenwirkungen von IL- 2 ernst. Daher ist ein Verfahren zur Unterdrückung der Wirkung von IL-2 erwünscht. Derzeit gibt es jedoch kein wirksames Verfahren zur Unterdrückung der Wirkung von IL-2 bei diesen Krankheiten.

IL-6 wurde ursprünglich als differenzierender Faktor für B- Zellen isoliert. Die Struktur des Gens für IL-6 wurde von Hirano und Kishimoto et al. 1986 bestimmt. Es ist bekannt, dass IL-6 als einer der Hauptmediatoren der Entzündung wirkt, um beispielsweise als Wachstumsfaktor für Myelozytose zu wirken und ein Akute-Phase-Protein in der Leber auszulösen. Es ist gezeigt worden, dass B-Zellen polyklonal durch abnormale Produktion von IL-6 aktiviert werden und dann Plasmazytom hervorgerufen wird, indem eine transgene Maus geschaffen wurde, die einen abnormalen IL-6-Pegel produzierte. Im Allgemeinen ist beobachtet worden, dass die Konzentration von IL-6 im Blut bei vielen Patentien mit akuten entzündlichen Krankheiten, bakterieller Infektion, Virusinfektion, Verbrühung, Myokardinfarkt und dergleichen hoch ist. Der IL-6-Pegel steigt zum Zeitpunkt des Befalls, wie bei Verbrühung oder chirurgischer Operation. Es wurde von einem Fall berichtet, bei dem in der Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit eines Patienten mit akuter bakterieller Meningitis (durch Pneumokokken, Staphylokokken oder Listerien) bis zu 500 ng/ml IL-6 nachgewiesen wurden. IL-6 ist auch in lokalen Entzündungsgeweben oder systemisch bei Patienten mit chronischer Entzündung nachgewiesen worden. Bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten wie RA, Castleman-Syndrom oder Vorhofmyxom wurde eine abnormale Produktion von IL-6 beobachtet, und es wird angenommen, dass dies die Produktion von Proteinen bei Hyper-γ-Globulinämie steuert. Zusätzlich wurde vorgeschlagen, dass IL-6 an Krankheiten wie Krebs des Gebärmutterhalses, AIDS, Alkoholhepatitis, multiplem Myelom, Lennert-T-Lymphom, mesangialer proliferierender Nephritis, Nierenzystom, Psoriasis und Septikämie beteiligt ist (Nipponigakukan, Cytokine -From Foundation to The Latest Information-, 1991, Seiten 177 bis 187). Eine Überschussmenge IL-6 im Körper ist somit nicht bevorzugt. Derzeit gibt es jedoch kein wirksames Verfahren zur spezifischen Unterdrückung der Wirkung von IL-6 bei Patienten mit diesen Krankheiten.

IL-8 wurde als von Monozyt abgeleiteter neutrophiler chemotaktischer Faktor (MDNCF) gereinigt und das Gen für IL-8 wurde auch von Matsushima et al. 1987 geklont. IL-8 ist ein neutrophil-aktivierender Migrationsregulierungsfaktor, der von verschiedenen Typen von Zellen produziert wird. Eine Infiltration von Neutrophilen und Lymphozyten bei Verabreichung von IL-8 intradermal, subkutan oder bei der Arthrose ist in vivo beobachtet worden. Eine kontinuierliche Verabreichung von IL-8 in großer Menge ist für Gewebe sehr schädlich und führt zur Zerstörung von Geweben, wie denjenigen, die bei der Schocklunge (ARDS) in der Alveole beobachtet werden, und zur Zerstörung von Geweben, die die Infiltration von Lymphozyten in großer Menge zu einer Arthrose begleitet. Es ist experimentell gezeigt worden, dass IL-8 an durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierter Dermatitis und an Infiltration von Neutrophilen während der Reperfusion nach Ischämie wesentlich beteiligt ist. Dies ist durch die Tatsache bewiesen worden, dass Zerstörung von Geweben, die die genannte Infiltration von Lymphozyten oder Neutrophilen begleiten kann, fast vollständig gehemmt werden kann, indem ein neutralisierender Antikörper gegen IL-8 verabreicht wird. Außerdem ist eine abnormal hohe Konzentration von IL-8 an Entzündungsstellen oder in peripherem Blut aus Patienten mit Krankheiten wie RA, gichtiger Arthritis, Psoriasis, Kontaktdermatitis, Septikämie, idiopatischer Lungenfibrose, ARDS-Syndrom, IBD, Immunangiitis, Glomerulonephritis, Harnwegsinfektionen, Myokardinfarkt, Asthma, Atemwegsinfektion, perinataler Infektionskrankheit und Abstoßung bei Organtransplantation nachgewiesen worden, verglichen mit derjenigen von normalen Individuen (Menekiyakuri, 12, Nr. 1, Seiten 15 bis 21, 1994). IL-8 wird somit als an diesen Krankheiten beteiligt angesehen. Daher ist eine Überschussmenge an IL-8 in einem Körper nicht bevorzugt. Momentan gibt es jedoch kein effektives Verfahren zur Unterdrückung einer Wirkung von IL-8 bei Patienten mit diesen Krankheiten.

Offenbarung der Erfindung

Als Ergebnis der umfassenden Untersuchungen geeigneter Träger zur Entfernung des oben genannten Endotoxins, TNF-α und/oder Interleukinen haben die Erfinder gefunden, dass Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen für eine derartige Entfernung wirksam ist. Basierend auf dieser Erkenntnis sind die Erfinder zu der vorliegenden Erfindung gelangt.

Die vorliegende Erfindung ist in den angefügten Ansprüchen beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Querschnittansicht eines beispielhaften erfindungsgemäßen Adsorbers für Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine. Die Symbole in der Figur bedeuten jeweils, 1: einen Einlass oder einen Auslass für eine Flüssigkeit, 2: einen Einlass oder einen Auslass für eine Flüssigkeit, 3: ein Adsorbens für Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine, 4 und 5: einen Filter, 6: eine Säule und 7: ein Gefäß.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Eine Lösung bedeutet, wie hier verwendet, eine Flüssigkeit, die Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine enthält, was eine Körperflüssigkeit, eine Kulturflüssigkeit und dergleichen einschließt. Eine Körperflüssigkeit schließt Blut, Plasma, Serum, Aszites, Lymphe, Synovia (Gelenkschmiere), eine fraktionierte Komponente daraus oder andere aus einem Organismus stammende Flüssigkeitskomponenten ein. Eine Kulturflüssigkeit bezieht sich auf eine Kultursuspension, in der Endotoxin und/oder Endotoxin produzierende Mikroorganismen enthalten sind, oder eine Kultursuspension von Zellen, die TNF-α oder Interleukine produzieren, wozu beispielsweise auch ein Überstand einer Kultursuspension oder zertrümmerte Zellen gehören. Eine Kulturflüssigkeit kann beispielsweise ein Überstand einer Kultursuspension, zertrümmerte Zellen oder Überstand derselben sein, die durch Kultur von Zellen, die TNF-α produzieren, oder rekombinante Zellen, die TNF-α-Gen enthalten, erhalten wurden. Eine Kulturflüssigkeit kann auch ein Überstand einer Kultursuspension, zertrümmerte Zellen oder Überstand derselben sein, die durch Kultur von Zellen, die Interleukine produzieren, oder rekombinante Zellen, die Gene für Interleukine enthalten, erhalten wurden.

Endotoxin ist eine Substanz, die auch als Lipopolysaccharid oder Pyrogen bezeichnet wird und aus einem Polysaccharidanteil und einem Lipidanteil (der als Lipid A bezeichnet wird) zusammengesetzt ist, der über 2-Keto-3-deoxyoctonsäure kovalent an einen Polysaccharidanteil gebunden ist. Es wird angenommen, dass die Endotoxinaktivität in dem Lipid-A-Anteil vorhanden ist.

TNF-α ist ein einfaches Protein aus 157 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 17 kDa und existiert im Allgemeinen als Trimer.

IL-1β ist ein Protein aus 153 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 17500, dessen isoelektrischer Punkt 7 bis 8 ist. IL-1β wird durch einen Makrophagen und einen Monozyten produziert und hat verschiedene biologische Aktivitäten, wie die Herbeiführung der Proliferation oder Differenzierung eines Immunozyten, einer Aktivität von endogenem Pyrogen oder die Herbeiführung einer entzündlichen Reaktion (beispielsweise Synthese von Akute-Phase-Entzündungsproteinen in der Leber).

IL-2 ist ein Glykoproptein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 15000 und wird durch eine T-Zelle hergestellt. Es ist bekannt, dass IL-2 Proliferation, Differenzierung oder funktionelle Aktivierung beispielsweise einer T-Zelle, einer B-Zelle, einer NK-Zelle, eines Monozyten oder eines Makrophagen fördert.

IL-6 ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 21 bis 28 kDa und wird sowohl durch eine Nicht-Lymphoidzelle als auch durch eine Lymphoidzelle hergestellt.

IL-8 ist ein Protein aus 72 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von ungefähr 8000 und wird durch einen Makrophagen, einen Fibroblasten und eine vaskuläre Endothelzelle produziert.

Der Begriff Interleukine bedeutet hier Substanzen ausgewählt aus IL-1β, IL-2, IL-6 und IL-8.

Das erfindungsgemäße Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen wird im Allgemeinen als starkes saures Kationaustauschharz verwendet. Es kann beispielsweise ohne Einschränkung in Form von Teilchen, einer Tafel, einem Film oder Fasern vorliegen.

Wenn das Adsorbens in Form von Teilchen vorliegt, ist es nicht bevorzugt, dass es in Form von Feinteilchen vorliegt, und es ist bevorzugt, dass der Durchmesser der Teilchen 200 um oder mehr beträgt. Es kann insbesondere unter einer Bedingung verwendet werden, dass Teilchen ausgeschlossen werden, die zu klein oder zu groß sind, das bedeutet unter der Bedingung, dass die Verteilung der Teilchengröße eingeschränkt wird und die Durchschnittsgröße der Teilchen 200 um bis 1000 um beträgt. Wenn die Durchschnittsgröße der Teilchen kleiner als 200 um ist, kann der Flüssigkeitsfluss unzureichend werden.

Wenn das Adsorbens in Form von Hohlfasern vorliegt, wird das Adsorbens vorzugsweise für Körperflüssigkeit verwendet. Es ist bevorzugt, dass der Innendurchmesser der Hohlfasern 5 um oder mehr beträgt. Wenn der Innendurchmesser weniger als 5 um beträgt, können Zellen in der Körperflüssigkeit möglicherweise nicht glatt passieren. Wenn das Adsorbens in Form von Fasern vorliegt und gepackt (nicht hohl) ist, ist es bevorzugt, dass der Durchmesser 1 um oder mehr beträgt. Wenn der Durchmesser weniger als 1 um beträgt, können Zellen in der Körperflüssigkeit unspezifisch adsorbiert werden.

Wenn das verwendete Adsorbens in eine Säule eingebracht und für Körperflüssigkeit verwendet wird, ist es bevorzugt, dass für ausreichend offene Räume gesorgt wird, dass Zellen in Körperflüssigkeit sie glatt passieren können. Wenn das Adsorbens für eine Kulturflüssigkeit verwendet wird, ist es bevorzugt, dass der Überstand verwendet wird, von dem Zellen oder Rückstände der Zellen entfernt sind.

Um nicht-spezifische Adsorption von Blutzellenkomponenten zu vermeiden, während Blut durch das Adsorbens geleitet wird, kann das Adsorbens beispielsweise mit einem geeigneten Makromolekül wie einem Polymer aus Hydroxyethylmethacrylat beschichtet werden. Diese Beschichtung kann das Adsorbens auch an der Bildung von Feinteilchen hindern.

Es gibt verschiedene Copolymerisationsverfahren, um das erfindungsgemäße Styrol/Divinylbenzolcopolymer zu erhalten, und jedes der Verfahren kann verwendet werden. Typischerweise kann ein Verfahren verwendet werden, bei dem eine geeignete Menge an Divinylbenzol zu Styrol gegeben wird, ein Polymerisationskatalysator (beispielsweise geringe Menge an Benzoylperoxid und Wasser) zugefügt wird, ein Suspensionsmittel wie Bentonit und Alginsäure zugesetzt wird und die Mischung kräftig gerührt wird, um Polymerisation zu ermöglichen.

Es gibt verschiedene Methoden zur Einführung von Sulfonsäuregruppen in erfindungsgemäßes Styrol/Divinylbenzol-Copolymer. Das Verfahren schließt beispielsweise die Behandlung des oben genannten Copolymers mit konzentrierter Schwefelsäure oder Chlorsulfonsäure ein, ist jedoch nicht hierauf beschränkt.

Die Menge an Sulfonsäuregruppen, die in Styrol/Divinylbenzol-Copolymer eingeführt werden, kann als die Ionenaustauschkapazität ausgedrückt werden. In das Copolymer sollten Sulfonsäuregruppen in geeigneter Dichte eingeführt werden, so dass Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine adsorbiert werden. Es ist erwünscht, dass Sulfonsäuregruppen in das Copolymer eingeführt werden, um sicherzustellen, dass vorwiegende Proteine nicht unspezifisch adsorbiert werden. Die Ionenaustauschkapazität des erfindungsgemäßen Adsorbens beträgt vorzugsweise 0,01 bis 5 mÄq/ml, insbesondere 0,1 bis 2 mÄq/ml. Es ist erwünscht, dass die Ionenaustauschkapazität nicht unter 0,01 mÄq/ml liegt, da die Fähigkeit des Adsorbens zum Adsorbieren von Endotoxin, TNF-α und/oder den Interleukinen herabgesetzt sein kann. Wenn andererseits die Ionenaustauschkapazität mehr als 5 mÄq/ml beträgt, ist es schwierig, ein Adsorbens zu erzeugen, das die Fähigkeit zum Adsorbieren von Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukinen behält.

Das erfindungsgemäße Adsorbens kann selbst nur an seiner äußeren Oberfläche Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine adsorbieren. Es ist erwünscht, dass das Adsorbens Poren an seiner Außenseite aufweist, so dass mehr Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine adsorbiert werden, wobei die Größe der Poren ausreicht, damit Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine in sie eintreten können. Die Porengröße schwankt, und die Verteilung kann nach einem Quecksilberporosimetrieverfahren oder Stickstoffadsorptionsverfahren gemessen werden. Zum Adsorbieren von Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukinen ist die Hauptverteilung der Porengröße vorzugsweise 25 bis 2000 Å, insbesondere 50 bis 2000 Å und besonders bevorzugt 100 bis 1000 Å.

Obwohl das erfindungsgemäße Adsorbens wie oben beschrieben Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine sogar nur an seiner äußeren Oberfläche adsorbieren kann, ist erwünscht, dass die Adsorptionsfläche der Oberfläche pro Adsorbens (spezifische Oberfläche) größer ist, um mehr Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine zu adsorbieren. Die spezifische Oberfläche beträgt vorzugsweise 10 m²/g oder mehr, insbesondere 100 m/g oder mehr.

Es gibt zahlreiche Arten von Verfahren zum Absorbieren und Entfernen von Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukinen in einer Flüssigkeit, bei denen das Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen mit der Flüssigkeit kontaktiert wird. Die typischen Verfahren sind beispielsweise wie folgt: Ein Verfahren, bei dem die Flüssigkeit herausgenommen, in beispielsweise einem Beutel aufbewahrt, mit dem Adsorbens gemischt wird, um Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine zu entfernen, und das Adsorbens durch Filtration entfernt wird, um eine von Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukinen freie Flüssigkeit zu erhalten; ein Verfahren, nach dem die Flüssigkeit durch ein Gefäß geleitet wird, in das das Adsorbens eingebracht worden ist, wobei das Gefäß einen Einlass und einen Auslass für die Flüssigkeit hat und am Auslass mit einem Filter ausgestattet ist, durch den die Flüssigkeit geleitet werden kann, wodurch das Adsorbens am Herausfließen gehindert wird. Obwohl jedes der Verfahren verwendet werden kann, ist das letztere Verfahren für das erfindungsgemäße Adsorbens geeignet, da es leicht zu betreiben ist und in der Lage ist, wirksam Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine aus der Flüssigkeit von Patienten mit einem Online-System zu entfernen, bei dem das Gefäß zur Einbeziehung eines extrakorporalen Kreislaufsystems ausgebildet ist.

Als nächstes wird der erfindungsgemäße Adsorber für Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine basierend auf der schematischen Querschnittansicht von Fig. 1 erklärt. Der erfindungsgemäße Adsorber ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt.

Das in Fig. 1 gezeigte Gefäß 7 hat 1: einen Einlass oder einen Auslass für eine Flüssigkeit, 2: einen Einlass oder einen Auslass für eine Flüssigkeit, 3: das erfindungsgemäße Adsorbens für Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine, 4 und 5: Mittel, um das Adsorbens am Ausfließen zu hindern, durch die die Flüssigkeit und die in der Flüssigkeit enthaltene Komponente passieren können, wobei das Adsorbens für Endotoxin, TNF-α und/oder die Interleukine am Herausfließen gehindert wird, und 6: eine Säule. Die Form und das Material des Gefäßes sind nicht speziell begrenzt. Beispielsweise wird jedoch vorzugsweise ein zylindrisches Gefäß mit einer Kapazität von ungefähr 150 bis 400 ml und einem Durchmesser von ungefähr 4 bis 10 cm verwendet.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele spezifisch beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Ein stark saures Kationaustauschharz Diaion HPK-55H (Mitsubishi Kasei Corporation, ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen und Ionenaustauschkapazität von etwa 1 mÄq/- ml) wurde in den Na-Typ umgewandelt und mit physiologischer Salzlösung ins Gleichgewicht kommen gelassen. Dann wurden 0,5 ml dieses Ionenaustauschharzes in ein Teströhrchen gegeben und überschüssige physiologische Salzlösung entfernt. 3 ml Humanserum, das etwa 1000 pg/ml Endotoxin enthielt, wurde zu dem Harz gegeben und die Mischung bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Nach Behandlung des Überstands mit Perchlorsäure wurde die Konzentration des Endotoxins in dem Überstand bestimmt, indem der Limulus-Test mit chromogenem Substrat (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) verwendet wurde.

Vergleichsbeispiel 1

0,5 ml physiologische Salzlösung wurden in ein Teströhrchen gegeben, 3 ml Humanserum, das etwa 1000 pg/ml Endotoxin enthielt, wurde zu der Salzlösung gegeben und die Mischung bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Die Konzentration an Endotoxin in dem Überstand wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.

Ergebnisse Konzentration des Endotoxins in dem Überstand

Beispiel 1 290 pg/ml

Vergleichsbeispiel 1 790 pg/ml

Es wurde gefunden, dass die Endotoxinkonzentration in Beispiel 1 im Vergleich mit derjenigen in Vergleichsbeispiel 1 wesentlich verringert wurde.

Beispiel 2

0,5 ml Ionenaustauschharz, das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde in ein Teströhrchen gegeben und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. 3 ml Humanserum, das etwa 20 ng/ml TNF-α enthielt, wurde zu dem Harz gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Die Konzentration an TNF-α in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Vergleichsbeispiel 2

0,5 ml physiologische Salzlösung wurde in ein Teströhrchen gegeben, 3 ml Humanserum, das etwa 20 ng/ml TNF-α enthielt, wurde zu der Salzlösung gegeben und die Mischung wurde zwei Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration an TNF-α in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Ergebnisse Konzentration des TNF-α in dem Überstand

Beispiel 2 6,8 ng/ml

Vergleichsbeispiel 2 21 ng/ml

Es wurde gefunden, dass die Konzentration an TNF-α in Beispiel 2 im Vergleich mit derjenigen in Vergleichsbeispiel 2 wesentlich verringert wurde.

Beispiel 3

0,5 ml Ionenaustauschharz, das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde in ein Teströhrchen gegeben und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. 3 ml Humanserum, das etwa 1,3 ng/ml IL-1β enthielt, wurde zu dem Harz gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Die Konzentration an IL-1β in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Vergleichsbeispiel 3

0,5 ml physiologische Salzlösung wurde in ein Teströhrchen gegeben, 3 ml Humanserum, das etwa 1,3 ng/ml IL-1β enthielt, wurde zu der Salzlösung gegeben und die Mischung wurde zwei Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration an IL-1β in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Ereebnisse Konzentration des IL-1β in dem Überstand

Beispiel 3 0,4 ng/ml

Vergleichsbeispiel 3 1,1 ng/ml

Es wurde gefunden, dass die Konzentration an IL-1β in Beispiel 3 im Vergleich mit derjenigen in Vergleichsbeispiel 3 wesentlich verringert wurde, und dass IL-1β in der Flüssigkeit effizient adsorbiert und entfernt werden konnte, indem das oben genannte stark saure Kationaustauscherharz verwendet wurde.

Beispiel 4

0,5 ml Ionenaustauschharz, das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde in ein Teströhrchen gegeben und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. 3 ml Humanserum, das etwa 750 pg/ml IL-2 enthielt, wurde zu dem Harz gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Die Konzentration an IL-2 in dem Überstand wurde nach dem ELISA- Verfahren gemessen.

Vergleichsbeispiel 4

0,5 ml physiologische Salzlösung wurde in ein Teströhrchen gegeben, 3 ml Humanserum, das etwa 750 pg/ml IL-2 enthielt, wurde zu der Salzlösung gegeben und die Mischung wurde zwei Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration an IL-2 in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Ergebnisse Konzentration des IL-2 in dem Überstand

Beispiel 4 151 pg/ml

Vergleichsbeispiel 4 705 pg/ml

Es wurde gefunden, dass die Konzentration an IL-2 in Beispiel 4 im Vergleich mit derjenigen in Vergleichsbeispiel 4 wesentlich verringert wurde, und dass IL-2 in der Flüssigkeit effizient adsorbiert und entfernt werden konnte, indem das oben genannte stark saure Kationaustauscherharz verwendet wurde.

Beispiel 5

0,5 ml Ionenaustauschharz, das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde in ein Teströhrchen gegeben und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. 3 ml Humanserum, das etwa 420 pg/ml IL-6 enthielt, wurde zu dem Harz gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Die Konzentration an IL-6 in dem Überstand wurde nach dem ELISA- Verfahren gemessen.

Vergleichsbeispiel 5

0,5 ml physiologische Salzlösung wurde in ein Teströhrchen gegeben, 3 ml Humanserum, das etwa 420 pg/ml IL-6 enthielt, wurde zu der Salzlösung gegeben und die Mischung wurde zwei Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration an IL-6 in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Ergebnisse Konzentration des IL-6 in dem Überstand

Beispiel 5 100 pg/ml

Vergleichsbeispiel 5 360 pg/ml

Es wurde gefunden, dass die Konzentration an IL-6 in Beispiel 5 im Vergleich mit derjenigen in Vergleichsbeispiel 5 wesentlich verringert wurde, und dass IL-6 in der Flüssigkeit effizient adsorbiert und entfernt werden konnte, indem das oben genannte stark saure Kationaustauscherharz verwendet wurde.

Beispiel 6

0,5 ml Ionenaustauschharz, das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde in ein Teströhrchen gegeben und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. 3 ml Humanserum, das etwa 7,4 ng/ml IL-8 enthielt, wurde zu dem Harz gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC zwei Stunden geschüttelt. Die Konzentration an IL-8 in dem Überstand wurde nach dem ELISA- Verfahren gemessen.

Vergleichsbeispiel 6

0,5 ml physiologische Salzlösung wurde in ein Teströhrchen gegeben, 3 ml Humanserum, das etwa 7,4 ng/ml IL-8 enthielt, wurde zu der Salzlösung gegeben und die Mischung wurde zwei Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration an IL-8 in dem Überstand wurde nach dem ELISA-Verfahren gemessen.

Ergebnisse Konzentration des IL-8 in dem Überstand

Beispiel 6 0,2 ng/ml

Vergleichsbeispiel 6 6,3 ng/ml

Es wurde gefunden, dass die Konzentration an IL-8 in Beispiel 6 im Vergleich mit derjenigen in Vergleichsbeispiel 6 wesentlich verringert wurde, und dass IL-8 in der Flüssigkeit effizient adsorbiert und entfernt werden konnte, indem das oben genannte stark saure Kationaustauscherharz verwendet wurde.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Das Adsorbens der vorliegenden Erfindung, das Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfongruppen umfasst, kann verwendet werden, um Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine in einer Flüssigkeit effizient zu adsorbieren und zu entfernen. Die vorliegende Erfindung kann ein wirksames Verfahren zur Unterdrückung der Wirkung von Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukinen bei Patienten mit verschiedenen Krankheiten liefern, deren kausale Mittel Endotoxin, TNF-α und/oder Interleukine sind.


Anspruch[de]

1. Verwendung von Adsorbens, das Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, bei der das verursachende Agens mindestens eine Substanz ausgewählt aus Endotoxin, Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-6 und Interleukin-8 ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Ionenaustauschkapazität des Styrol/Divinylbenzol-Copolymers mit Sulfonsäuregruppen zwischen 0,01 mÄq/ml und 6 mÄq/ml beträgt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der das Adsorbens in ein Gefäß mit einem Einlass und einem Auslass für die Flüssigkeit eingebracht wird.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die Krankheit eine entzündliche Krankheit ist.

5. Verwendung nach Anspruch 3, bei der das Gefäß zur Einbeziehung eines extrakorporalen Kreislaufsystems ausgebildet ist.

6. Ex-vivo-Verfahren zur Entfernung von mindestens einer Substanz ausgewählt aus Endotoxin, Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-6 und Interleukin- 8, bei dem Adsorbens, das Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen umfasst, mit Flüssigkeit kontaktiert wird, die mindestens eine Substanz ausgewählt aus Endotoxin, Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-6 und Interleukin-8 enthält.

7. Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Ionenaustauschkapazität des Styrol/Divinylbenzol-Copolymers mit Sulfonsäuregruppen zwischen 0,01 mÄq/ml und 5 mÄq/ml liegt.

8. Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei dem das Adsorbens in ein Gefäß mit einem Einlass und einem Auslass für die Flüssigkeit eingebracht wird.

9. Verwendung von Adsorbens, das Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäuregruppen umfasst, zur Herstellung eines Gefäßes mit einem Einlass und einem Auslass für Flüssigkeit zur Verwendung zur Entfernung von mindestens einer Substanz ausgewählt aus Endotoxin, Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-6 und Interleukin-8.







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