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Dokumentenidentifikation DE10036068C2 19.09.2002
Titel Verfahren zur enzymatischen Herstellung von seltenen Monosacchariden, insbesondere Tagatose
Anmelder NovaBiotec Dr. Fechter GmbH, 13347 Berlin, DE
Erfinder Groß, Wolfgang, Dr., 14532 Güterfelde, DE;
Stein, Robert, Dr., 10553 Berlin, DE;
Kühl, Bert, 13347 Berlin, DE;
Schlagheck, Bernd, 10715 Berlin, DE
Vertreter Anwaltskanzlei Gulde Hengelhaupt Ziebig & Schneider, 10117 Berlin
DE-Anmeldedatum 17.07.2000
DE-Aktenzeichen 10036068
Offenlegungstag 07.03.2002
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 19.09.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.09.2002
IPC-Hauptklasse C12P 19/02
IPC-Nebenklasse C07H 3/02   
IPC additional class // (C12P 19/02,C12R 1:89)  
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft die rein enzymatische Herstellung von in der Natur selten vorkommenden und chemisch nur durch aufwendige und kostenintensive Verfahren herstellbare Monosaccharide wie beispielsweise Tagatose, Fuculose und Xylulose. Es wurde gefunden, dass diese Monosaccharide enzymatisch in guter Reinheit hergestellt werden können, indem ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird. Möglich wird diese enzymatische Herstellung durch die Verwendung von Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, speziell aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die rein enzymatische Herstellung von in der Natur selten vorkommenden und chemisch nur durch aufwendige und kostenintensive Verfahren herstellbare Monosaccharide wie beispielsweise Tagatose, Fuculose und Xylulose. Es wurde gefunden, dass diese Monosaccharide enzymatisch in guter Reinheit hergestellt werden können, indem ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird. Möglich wird diese enzymatische Herstellung durch die Verwendung von Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, speziell aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria.

D-Tagatose, Fuculose und Xylulose sind in der Natur selten vorkommende Zucker, die in der Lebensmittelindustrie als Füllstoff, als Süßstoff ohne Kalorien oder auch in diätischen Lebensmitteln eingesetzt werden. Auch bei höheren Temperaturen, wie sie z. B. beim Backen auftreten, sind diese Substanzen stabil und bekommen wie Zucker eine braune Färbung.

Daneben ist von D-Tagatose bekannt, dass sie den Geschmack verstärken und das Wachstum von gesundheitsfördernden Bakterien im menschlichen Darmtrakt unterstützen soll (WO 99/43217, WO 99/34689, US 4,786,722.

Bisher werden diese seltenen Monosaccharide durch aufwendige, kostenintensive chemische Herstellungsverfahren erzeugt. So sind u. a. große Wasser- und Säuremengen nötig. US 5,078,796 beschreibt beispielsweise die Herstellung der D-Tagatose durch die Isomerisierung einer Mischung aus D- Galactose, Metallhydroxid, z. B. Ca(OH)2 und Katalysator (anorganische Salze wie z. B. CaCl2) bei niedrigen Temperaturen zu einer intermediären Metallhydroxid-D-Tagatose- Verbindung und anschließende Neutralisierung mit Säure. Das Reaktionsgemisch wird deionisiert, mit Alkohol versetzt und die Tagatose kristallisiert. Molke, deproteinisierte Molke oder Lactose sind mögliche Ausgangsstoffe. D-Galactose wird durch saure oder enzymatische Hydrolyse aus der Lactose freigesetzt. Die chemischen Produktionsmethoden sind nicht nur aufwendig und kostenintensiv, sondern sie sind für die Produktion im industriellen Maßstab auch unter dem Gesichtspunkt des Umweltschutzes nicht zufriedenstellend.

Von D-Tagatose ist bekannt, dass sie auch mikrobiell hergestellt werden kann. Einige Bakterien sind in der Lage, D-Tagatose zu bilden, wenn sie Dulcitol als externe Kohlenstoffquelle vorfinden. So produziert eine Arthrobacter globiformis Kultur unter entsprechenden Anzuchtsbedingungen D-Tagatose innerhalb von ca. 15 Tagen, wenn dem Medium Dulcitol zugesetzt wird (JP 60/248196). Die hohen Kosten, die lange Dauer und die Kontaminationsanfälligkeit der Fermentation machen ein solches Verfahren zur industriellen Herstellung von D-Tagatose ungünstig.

Aus Phytochemistry (1997), Stein et al., ist bekannt, dass eine Dehydrogenase (EC 1.1.1.18) aus roten Algen isoliert werden kann. Dieses Enzym katalysiert die reversible Oxidation von Inositol zu Inosose.

In Plant Physiology (1997) beschreiben Gross et al., dass die Rotalge Galdieria sulphuraria in er Lage ist, verschiedenen Pentosen zu verstoffwechseln und auf diesen zu wachsen. Die Pentosen werden in den Rotalgen durch ein Enzym reduziert, das ein Molekulargewicht von ungefähr 80 kDa aufweist.

Gross und Schnarrenberger offenbaren (Plant and Cell Physiology, 1995), dass die Rotalge Galdieria sulphuraria verschiedene Zucker und Zuckeralkohole als Kohlenstoffquelle nutzen kann. Die einzelnen Stämme der Rotalgen weisen hierbei - je nach äußeren Bedingungen - eine große Variabilität auf. Diese Vielseitigkeit der einzelnen Stämmem macht die Rotalge G. sulphuraria zu einem idealen System, um den Metabolismus von ausgewählten Zuckern und Zuckeralkoholen zu studieren.

Es ist weiterhin bekannt (European Journal of Phycology, 1999, Oesterhelt et al.), dass sich die Aufnahmesysteme in Galdieria sulphuraria für die verschiedenen Zucker in ihrer Substratspezifität teilweise überlappen. Die einzelnen Zuckertransporter können in Hexose-, Polyol- und Pentose- Transporter unterteilt werden. Durch Co-Induktion von verschiedenen Transportern sind die Rotalgen in der Lage, ein weites Spektrum an organischen Kohlenstoffen aufzunehmen, insbesondere um in Phasen der begrenzten Lichtzufuhr zu überleben.

In der US-Patentschrift 4,467,033 wird ein Verfahren zur Oxidation von L-Sorbitol zu L-Fructose beschrieben, wobei mutierte Pseudomonas-Stämme als zuckerumsetzende Mikroorganismen eingesetzt werden. Der Mikroorganismus besitzt u. a. eine D-Iditol Dehydrogenase, die zur Oxidation von L-Sorbitol befähigt ist.

Weiterhin ist aus dem Stand der Technik (Derwent Abstr. 1999 - 61 37 85/53) bekannt, dass Mikroorganismen der taxonomischen Gruppen: Achromobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcus, Morganella, Nocardia, Planococcus, Proteus, Propionibacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Sporosarcina, Staphylococcus und Vibrio in der Lage sind, D-Arabitol zu D-Xylulose umzuwandeln. Die entstehende D-Xylulose kann als Ausgangsstoff für die Herstellung von diätischen Süßstoffen eingesetzt werden.

Bekannt ist weiterhin (Derwent Abstr. 1994 - 00 21 77/01 und Derwent Abstr. 1993 - 13 95 76/17), Zucker, wie beispielsweise L-Tagatose bzw. L-Xylulose mit Hilfe von Alcaligenes denitrificans und Klebsiella spec. u. a. aus billigen Zuckeralkoholen herzustellen. Die Mikroorganismen werden hierfür in einem Medium kultiviert, welches Kaliumhydrogenphosphate, Magnesiumsulfat, Hefeextrakt und Sorbose bzw. Xylitol umfasst.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Herstellungsverfahren für seltene Monosaccharide, insbesondere für D-Tagatose, Fuculose und Xylulose, zu entwickeln, das einfach durchführbar und zur industriellen Herstellung geeignet ist, eine hohe Produktreinheit gewährleistet und kein Recyclen von umweltschädlichen Stoffen erfordert.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein enzymatisches Herstellungsverfahren gelöst, bei dem ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird. Je nach gewünschtem Monosaccharid werden so zur Herstellung von Fuculose Fucitol als Ausgangsstoff eingesetzt, zur Herstellung von Xylulose Arabitol oder Xylitol oder Früchte- oder Gemüseextrakte, die diese enthalten, und zur Herstellung von Tagatose Dulcitol oder ein Dulcitol- haltiger Pflanzenextrakt.

Dulcitol, Fucitol, Arabitol oder Xylitol selbst können wiederum mittels einer Aldose-Reductase aus extremophilen Rotalgen und NADPH durch Reduktion aus Galactose, Fucose, Arabinose oder Xylose erzeugt werden. Galactose muß, da sie praktisch nicht in freier Form in der Natur vorkommt, aus Galactosiden (Galactose-haltige Oligosaccharide) gewonnen werden. Die in den Galactosiden enthaltene Galactose kann durch den Einsatz von Galactosidasen freigesetzt werden (vgl. Abb. 1).

Neu an dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber bisher bekannten Vorgehensweisen ist, daß die Herstellung der seltenen Monosaccharide nicht wie bisher mittels chemischer Verfahren erfolgt, sondern allein auf Umsetzungsreaktionen von Enzymen basiert. Möglich wird dies durch die Verwendung neuartiger Enzyme aus extremophilen Algen, speziell aus Galdieria sulphuraria aus der Gruppe der Rhodophyceen.

Zur Herstellung der seltenen Monosaccharide, insbesondere von Tagatose können erfindungsgemäß auch Galactoside oder ein Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt mit Galactosidase, Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, NADPH und NAD inkubiert und das gewünschte Monosaccharid, z. B. die Tagatose, isoliert und kristallisiert werden. Galactoside sind in der Natur weit verbreitet und kommen z. B. in Leguminosen, vorzugsweise in Soja, Kohl, Zuckerrüben, Ulmaceen oder Knollenziest vor. Stachyose, ein Galactosid aus 2 Galactose-, einer Glucose und einer Fructose-Einheit, und Raffinose (D-Galactose, D- Glucose und D-Fructose) kommen z. B. in Ulmaceen als wichtigste Transportform neben Saccharose vor. Soja oder generell Leguminosensamen enthalten ebenfalls neben Saccharose und Verbascose vor allem viel Stachyose und Raffinose. So enthalten reife Sojabohnen wenig Stärke, dagegen aber 4.1% Stachyose und zusätzlich 1.4% Raffinose. Auch Kohl weist einen hohen Gehalt an Oligosacchariden wie Stachyose und Raffinose auf, ebenso Zuckerrüben. Die bei der Zuckergewinnung aus Zuckerrüben entstehende Melasse hat einen Raffinose-Gehalt von ca. 3%. Spitzenreiter ist Stachys sieboldii Miq. (Knollenziest, Lamiaceae), der 14-18% Stachyose enthält. Als Ausgangsstoff für Galactose kann ebenso Floridisid bzw. Isofloridosid aus Rotalgen eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß können im Verfahren zur Herstellung der seltenen Monosaccharide, insbesondere der Tagatose, als Ausgangsstoffe entweder der Galactosid-haltige Pflanzenextrakt, der nach üblichen Methoden gewonnen wird, oder die Galactoside selbst (z. B. Raffinose, Stachyose oder Melibiose) eingesetzt werden. Um die Galactoside zu extrahieren, können die Pflanzen mit Wasser nach konventionellen Methoden aufgeschlossen werden.

Die in den Galactosiden enthaltene Galactose wird durch Galactosidase freigesetzt. Erfindungsgemäß kann kommerziell erhältliche Galactosidase eingesetzt werden. Es ist auch möglich, Galactosidase aus unterschiedlichen Organismen aufzureinigen. Melone (Citrullus battich und Cucumis melo) Aspergillus niger, Bifidobacterium adolescentis, Mortierella vinacea, Phanerochaete chrysosporium, Thermotoga neapolitana, Pyrococcus furiosus, Penicillium spec., Kaffeebohnen, Phaseolus vulgaris, Aspergillus nidulans, Bacillus stearothermus, Klebsiella spec., Aspergillus ficuum, Aspergillus tamarii, Saccharum officinarum sind mögliche Quellen für Galactosidase. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt wird Galactosidase aus thermo- und acidophilen einzelligen Rotalgen eingesetzt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Tagatose in einem ersten Schritt durch Galactosidase freigesetzte Galactose wird von den erfindungsgemäßen Aldose-Reduktasen aus extremophilen Rotalgen zu Dulcitol umgesetzt, das von den erfindungsgemäßen Polyol-Dehydrogenasen aus extremophilen Rotalgen zu Tagatose verwertet wird.

Andere Monosaccharide wie Fuculose oder Xylulose werden hergestellt, indem Fucitol oder Arabitol bzw. Xylitol oder Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakte, die diese enthalten, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert und die Zucker nachfolgend gereinigt werden. Arabitol und Xylitol kommen natürlich in vielen Früchten und Gemüsen vor, so Xylitol z. B. in Erdbeeren, Pflaumen oder Birnen, Arabitol z. B. in Wein oder Avocado vor. Fucitol kann nach konventionellen Methoden aus der Fucose der Alge Fucus vesiculosis hergestellt werden.

Erfindungsgemäß werden 1 bis 40 g lyophilisierter Pflanzenextrakt in 50 ml Puffer gelöst. Je Galactosidase, Aldosereductase und Polyol-Dehydrogenase sind 1 bis 1.000 U bei Anwesenheit von 0,1 bis 10 mM NADPH und NAD und einem pH- Wert von 5 bis 9 zu inkubieren. Die Inkubation kann bei Temperaturen von 10 bis 50°C über 1 bis 24 h erfolgen.

Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Prozesse mit diesen Enzymen, nämlich der Galactosidase, Aldose- Reduktase und der Polyol-Dehydrogenase aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria besonders vorteilhaft laufen und reine Monosaccharide entstehen. Ganz besonders bevorzugt werden die Enzyme aus dem Stamm MSh von Galdieria sulphuraria, hinterlegt am 12. Juli 2000 unter der Hinterlegungsnummer 1372/1 bei der CCAP in Großbritannien, eingesetzt. Die Hinterlegung bei dieser Hinterlegungsstelle genügt den Anforderungen des Budapester Vertrages.

Die Isolierung, Reinigung und Aktivitätsbestimmung der Enzyme kann nach konventionellen Methoden erfolgen und ist in den Beispielen näher beschrieben. Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß L-Idit- oder L-Fucit-Dehydrogenase als Polyol-DH isoliert und eingesetzt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Tagatose aus Galactosiden oder Galactosid-haltigem Pflanzenextrakt erfolgt die Inkubation mit den drei Enzymen bei 10-50°C, bevorzugt bei ca. 20°C für 1 bis 24 Stunden, bevorzugt für 5-13 Stunden, besonders bevorzugt für 9 Stunden.

Eine gute Ausbeute wird erfindungsgemäß erzielt, wenn z. B. 1 Gew. Teil lyophilisierter Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt mit je 1-100 U, bevorzugt mit 5-20 U, besonders bevorzugt mit ca. 10 U Galactosidase, Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase versetzt wird.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, mit Galactose oder Dulcitol zu starten (vgl. Abb. 1), letzteres speziell aus Rotalgen oder den Celstraceen, dort wiederum bevorzugt aus Euonymus europaea. Dulcitol als direkter Ausgangsstoff für die Synthese kommt nur in wenigen Pflanzen in nennenswertem Umfang vor, wie dem Pfaffenhütchen und einigen Rotalgen. Die Extraktion von Dulcitol kann mit konventionellen Methoden vorgenommen werden.

Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren für seltene Monosaccharide, insbesondere für Tagatose, hat gegenüber den chemischen Verfahren des Standes der Technik den Vorteil, dass Enzyme als Biokatalysatoren aus den von ihnen geförderten Reaktionen wieder unverändert hervorgehen und weder entsorgt, noch aufwendig recycelt werden müssen. Darüberhinaus gewährleisten sie durch ihre Spezifität eine hohe Produktreinheit, die bei Tagatose > 98% beträgt.

Die erfindungsgemäß erhaltene Tagatose eignet sich in besonderem Maße als Glasur für Back- und Genussmittel wie Pralinen, Petit Four oder auch Kuchen.

Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert:

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung von Tagatose

Um Dulcitol oder Galactoside zu extrahieren, können die Pflanzen mit Wasser nach konventionellen Methoden aufgeschlossen werden (z. B. Kugelmühle oder Presse). Die Proben werden deproteinisiert, die wasserlöslichen Galactoside wahlweise durch HPLC an Rezex RSO-Oligosaccharid angereichert, lyophilisiert und in Reaktionspuffer für die enzymatische Umsetzung aufgenommen.

Anzucht von Galdieria sulphuraria

Stamm MSh von Galdieria sulphuraria wurde autotroph in mit auf 5% CO2 angereicherter Luft belüfteten Kulturröhren bei 20°C in mineralischem Medium im Dauerlicht (80 µEm-2s-1; L40 W/30-1 Osram) steril angezogen.

Enzyme

Nach Anzucht der Organismen gemäß konventionellen Methoden wird das jeweilige Enzym aus der Kultur isoliert (s. u.). Das betreffende Enzym kann mit konventionellen Methoden aus den Zellen extrahiert werden. So können Zell-Homogenate durch 2 oder mehrere Techniken wie Ammoniumsulfat-Fällung, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Ionenaustausch- Chromatographie und Gelfiltration gereinigt werden, um Enzym-Präparationen zu erhalten, die nur noch eine elektrophoretisch detektierbare Bande aufweisen oder das Enzym in dem nötigen Reinheitsgrad enthalten. Präparationen der Enzyme können durch Anwendung konventioneller Methoden wie z. B. adsorptive, ionische, kovalente Bindung oder Matrixeinhüllung immobilisiert werden. Diese Produkte können dann wiederholt im Batch-Verfahren oder kontinuierlich nach Einfüllen in Säulen bzw. Membranreaktoren benutzt werden.

Enzymnachweise

Die Aktivität der Polyol-Dehydrogenase wird bestimmt wie folgt: 800 µl 50 mM Tris/HCl, 50 µl 4 mM NAD, 50 µl 1 M Polyol und 100 µl einer angemessenen Enzymextrakt-Lösung werden gemischt und die Bildung von NADH bei 340 nm mit einem Photometer verfolgt.

Die Aldose-Reduktase-Aktivität wird wie folgt bestimmt: In einem Reaktionsansatz, ausgelegt auf ein Volumen von 1 ml, bestehend aus 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.0, 0.3 mM NADPH, 50 mM Galactose und einer geeigneten Menge Enzym-Extrakt, wird mittels eines Photometers die Bildung von NADP verfolgt.

Die Galactosidase-Aktivität wird bestimmt wie folgt: In 1 ml Test-Lösung, bestehend aus 40 mM Hepes-KOH, pH 6.5, einer geeigneten Substrat-Menge p-Nitrophenol α-d-Galactosid und einer geeigneten Menge Enzym-Extrakt wird bei 30°C die Bildung von p-Nitrophenol mittels eines Photometers bei 360 nm verfolgt.

Reinigung der Aldose-Reduktase

Alle Reinigungsschritte wurden bei 0-4°C ausgeführt. In einem Beadbeater (Biospec Products, Bartlesville, OK) wurden 10-20 g Algen mit 50 ml Aufschlußpuffer, bestehend aus 20 mM Kaliumphosphat, pH 8.0 und 2 mM DTT und 0.5 mM EDTA aufgeschlossen. Der Extrakt wurde 60 min bei 37000 × g zentrifugiert, der Überstand auf eine DEAE-Fractogel-Säule (22 × 2,5 cm), equilibriert mit 20 mM Tris-HCl, pH 8.3 und 0.5 mM DTT gegeben. Die Aldose-Reduktase bindet nicht an die Matrix und kann mit 50 ml Puffer eluiert werden. Die ungebundenen Proteine wurden auf eine Hydroxyapatit-Säule (16 × 1,5 cm), equilibriert mit 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, geladen. Nach Spülen mit 30 ml Säulenpuffer wurden die Proteine mit einem linearen Gradienten von 200 ml von 0.1-0.8 M Kaliumphosphat, pH 7.5 eluiert. Die zwei Aktivitäts- Peaks wurden separat über Nacht gegen 2 l 20 mM Hepes-KOH, pH 6.5 und 0.5 mM DTT dialysiert. Die Proben wurden jeweils auf eine Kationenaustauscher-Säule (Econo-Pak High S, Biorad), equilibriert mit 20 mM Hepes-KOH, pH 6.5, geladen. Die Säule wurde mit 10 ml Säulenpuffer gewaschen und Proteine mit einem linearem Gradienten von 0-1.5 M NaCl in Säulenpuffer eluiert.

Fraktionen mit Aldose-Reduktase wurden vereinigt und 1 ml- Aliquots auf eine Gelfiltrations-Säule (Superdex 200 HiLoad, 1,6 × 60 cm, Pharmacia), equilibriert mit 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.0 und 0.25 M NaCl geladen. Proteine wurden isokratisch mit Säulenpuffer eluiert, Fraktionen mit Aldose-Reduktase vereinigt. Die gelelektrophoretische Analyse dieser Proben zeigte nur eine Protein-Bande.

Reinigung der L-Idit-Dehydrogenase

Alle Reinigungsschritte wurden bei 0-4°C ausgeführt. In einem Beadbeater (Biospec Products, Bartlesville, OK) wurden 10-20 g Algen mit 50 ml Aufschlußpuffer, bestehend aus 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 und 1.4 mM β-Mercaptoethanol und 1 g Polyvinylpolypyrrolidon/100 ml aufgeschlossen. Der Extrakt wurde 15 min bei 4000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde für weitere 60 min bei 40000 × g zentrifugiert. Der Rohextrakt wurde auf 10% Ammoniumsulfatsättigung eingestellt und der Ansatz 15 min bei 32000 × g zentrifugiert. Proteine aus dem Überstand wurden durch Erhöhen der Ammoniumsulfat-Sättigung auf 40% gefällt und durch erneutes Zentrifugieren pelletiert. Der resultierende Niederschlag wurde in 20 mM Tris-HCl pH 8.5 aufgenommen und durch 2 h Dialyse gegen diesen Puffer entsalzt. Das Dialysat wurde auf eine DEAE-Fractogel-Säule (2,5 × 20 cm), equilibriert mit 20 mM Tris-HCl, pH 8.5, geladen. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenbettvolumen Säulenpuffer gewaschen und Proteine mit einem linearen Gradienten von 0-150 mM KCl in Säulenpuffer eluiert. Fraktionen mit Polyol- Dehydrogenase wurden vereinigt und 2 h gegen 10 mM Kaliumphosphat, pH 6.8 dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Hydroxyapatit-Säule (1,5 × 16 cm), equilibriert mit 10 mM Kaliumphosphat, pH 6.8 geladen. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenbettvolumen mit dem gleichen Puffer gewaschen und Proteine mit einem aufsteigendem Gradienten von 10-200 mM Kaliumphosphat, pH 6.8 eluiert. Fraktionen mit Polyol-Dehydrogenase-Aktivität wurden vereinigt und 2 h gegen 1 l 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 dialysiert. Das Dialysat wurde mit Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 40% gebracht und auf eine mit 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 und 40% Ammoniumsulfat equilibrierte Decylagarose-Säule (1,5 × 16 cm) gegeben. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenbettvolumen Puffer (s. o.) gewaschen, bevor Proteine mit einem absteigenden Ammoniumsulfat-Gradienten (40-0% Sättigung) in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, eluiert wurden. Fraktionen mit Polyol-Dehydrogenase-Aktivität wurden vereinigt und 1 ml-Aliquots auf eine mit 20 mM Tris HCl, pH 7.5 equilibrierte Gelfiltrations-Säule (Superdex 200 HiLoad, 1,6 × 60 cm, Pharmacia) geladen. Proteine wurden isokratisch mit dem gleichen Puffer eluiert und Fraktionen mit Polyol-Dehydrogenase-Aktivität vereinigt.

Verfahrensdurchführung

50 ml Galactosid-haltiges Ausgangsmaterial (5 g lyophilisierter Pflanzenextrakt (s. o.) gelöst in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.5) wurden mit je 10 U kommerziell erhältlicher Galactosidase aus Apergillus niger oder grünen Kaffeebohnen, aus G. sulphuraria gereinigter Aldose-Reductase (s. o.) und aus G. sulphuraria gereinigter Polyol- Dehydrogenase, 4 mM NADPH und 4 mM NAD versetzt und 9 h bei 20°C inkubiert. Der Reaktions-Ansatz wurde deproteinisiert und Zucker mittels HPLC an einer REZEX RCM-Monosaccharid- Säule, die bei 80°C isokratisch mit destilliertem Wasser eluiert wurde, getrennt. Anhand von Vergleichen mit Zucker- Standards wurde der Tagatose-Peak identifiziert. Die Fraktionen wurden konzentriert und die Tagatose nach konventionellen Methoden kristallisiert.

Reinigung der Tagatose

Die Reaktionsgemische enthalten neben dem gewünschten Produkt auch unerwünschte Substanzen wie weitere Oligosaccharide, Monosaccharide, Zuckeralkohole, etc. Im Allgemeinen können diese durch eine Kombination weniger Aufreinigungstechniken entfernt werden, so z. B. Proteine durch Filtertechniken, unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation, Salze mit Ionenaustauschern in der H- oder OH-Form. Als letzter Schritt können verbleibende Zucker mittels HPLC getrennt werden oder selektiv mit Alkohol oder anderen Lösungsmitteln ausgefällt werden. Chromatographie mit Silica-Gelen produziert ebenfalls hochreine Saccharide. Die gereinigte Tagatose kann dann mit konventionellen Methoden kristallisiert werden.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von seltenen Monosacchariden, dadurch gekennzeichnet, daß ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Polyol-Dehydrogenase aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria eingesetzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Polyol-Dehydrogenase aus dem Stamm MSh, Hinterlegungsnummer CCAP 3172/1 eingesetzt wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß L-Idit- oder L-Fucit-Dehydrogenase eingesetzt wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Fuculose Fucitol oder ein Fucitolhaltiger Pflanzenextrakt eingesetzt wird.
  6. 6. Verfahren nach nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Xylulose Arabitol oder Xylitol oder ein Früchte- oder Gemüseextrakt, der diese enthält, eingesetzt wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Tagatose Dulcitol oder ein Dulcitol-haltiger Pflanzenextrakt eingesetzt wird.
  8. 8. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Tagatose, dadurch gekennzeichnet, daß Galactoside oder ein Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt mit Galactosidase, Aldose-Reduktase aus extremophilen Rotalgen, Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, NADPH und NAD inkubiert werden und das Monosaccharid isoliert wird.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Polyol-Dehydrogenase aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria eingesetzt wird.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Polyol-Dehydrogenase aus dem Stamm MSh, Hinterlegungsnummer CCAP 1372/1 eingesetzt wird.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß L-Idit- oder L-Fucit-Dehydrogenase eingesetzt wird.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Galactoside Floridosid, Isofloridosid, Raffinose, Stachyose oder Melibiose eingesetzt werden.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt aus Leguminosen, Kohl, Zuckerrüben, Ulmaceen oder Knollenziest, eingesetzt wird.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt aus Leguminosen ein Sojaextrakt eingesetzt wird.
  15. 15. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Tagatose, dadurch gekennzeichnet, daß Galactose oder ein Galactose-haltiger Pflanzenextrakt mit Aldose-Reduktase aus extremophilen Rotalgen, Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, NADPH und NAD inkubiert wird und die entstehende Tagatose isoliert wird.






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