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Dokumentenidentifikation DE69621645T2 19.09.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0871443
Titel ZWISCHENVERBINDUNGEN VON FORTGESCHRITTENEN GLYKOSYLIERUNG-ENDPRODUKTEN UND POST-AMADORISCHE INHIBITOR
Anmelder The University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kan., US
Erfinder HUDSON, G., Billy, Omaha Park, US;
TODD, Parvin, Kansas City, US;
KHALIFAH, Gabriel, Raja, Overland Park, US;
BOOTH, Ashley, Aaron, Kansas City, US
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69621645
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.09.1996
EP-Aktenzeichen 969329853
WO-Anmeldetag 11.09.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/14544
WO-Veröffentlichungsnummer 0009709981
WO-Veröffentlichungsdatum 20.03.1997
EP-Offenlegungsdatum 21.10.1998
EP date of grant 05.06.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.09.2002
IPC-Hauptklasse A61K 31/435
IPC-Nebenklasse A61K 31/44   A61K 31/70   A61P 3/10   A61P 9/10   A61P 13/12   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich von fortgeschrittenen Glykosylierungs- Endprodukten (AGEs), deren Bildung, Nachweis, Identifizierung, Inhibierung und Inhibitoren davon.

Proteinalterung und fortgeschrittene Glykosylierungs-Endprodukte

Nichtenzymatische Glykosylierung durch Glukose und andere reduzierende Zucker ist eine wichtige post-translationale Modifikation von Proteinen, die zunehmend mit verschiedenen Pathologien in Zusammenhang gebracht wurde. Irreversible nichtenzymatische Glykosylierung und Kreuzvernetzen durch einen langsamen, Glukose-induzierten Prozeß kann viele der mit Diabetes assoziierten Komplikationen vermitteln. Die mit Diabetes assoziierte chronische Hyperglykämie kann chronische Gewebeschäden verursachen, die zu Komplikationen, wie zum Beispiel Retinopathie, Nephropathie und arteriosklerotischer Erkrankung führen kann. (Cohen und Ziyadeh, 1996, J. Amer. Soc. Nephrol. 7:183-190). Es wurde gezeigt, daß der sich ergebende chronische Gewebeschaden, der mit einer Langzeit-Diabetes Mellitus assoziiert ist, teilweise von einer in situ Immunkomplexbildung durch akkumulierte Immunglobuline und/oder Antigene abstammt, die an langlebige strukturelle Proteine gebunden sind, die eine fortschreitende Glykosylierungs-Endprodukt (AGE) Bildung über nicht-enzymatische Glykosylierung erfahren haben (Brownlee et al., 1983, J. Exp. Med. 158:1739-1744). Als primäres Proteintarget wird extra-zelluläres Matrix-assoziiertes Collagen vermutet. Die nichtenzymatische Glykosylierung von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren kann eine wichtige Rolle in den natürlichen Vorgängen des Alterns spielen. Kürzlich wurde Proteinglykosylierung mit β-Amyloidablagerungen und der Bildung von neurofibrillären Verwachsungen bei Alzheimer-Erkrankung in Zusammenhang gebracht und möglicherweise anderen neurogdegenerativen Erkrankungen, die Amyloidosis einschließen (Colaco und Harrington, 1994, NeuroReport 5:859-861). Von glykosylierten Proteinen konnte ebenfalls gezeigt werden, daß sie toxisch, antigen und in der Lage sind, zelluläre Verletzungsantworten auszulösen, nachdem sie durch spezifische zelluläre Rezeptoren aufgenommen werden (siehe zum Beispiel Vlassara, Bucala & Striker, 1994, Lab. Invest. 70:138-1515; Vlassara et al., 1994, PNAS(USA) 91:

11704-11708; Daniels & Hauser, 1992, Diabetes 41:1415-1421; Brownlee, 1994, Diabetes 43: 836-841; Cohen et al., 1994, Kidney Int. 45: 1673-1679; Brett et al., 1993, Am. J. Path. 143: 1699-1712; und Yan et al., 1994, PNAS(USA) 91: 7787-7791).

Das Auftreten von braunen Pigmenten während des Kochens von Nahrungsmitteln ist ein allgemein erkanntes Phänomen, dessen Chemie 1912 zuerst durch Maillard beschrieben wurde und das anschließend zur Forschung in das Konzept der Proteinalterung geführt hat. Es ist bekannt, daß gelagerte und Hitze-behandelte Nahrungsmittel eine nicht-enzymatische Bräunung erfahren, die durch kreuzvernetzte Proteine gekennzeichnet ist, was deren Bioverfügbarkeit verringert. Es wurde gefunden, daß diese Maillard-Reaktion in vivo ebenfalls auftrat, als gefunden wurde, daß eine Glukose über eine Amadori-Reorganisation an den Amino- Terminus der α-Kette von Hämoglobin angebracht war.

Die vorliegende Beschreibung lehrt einen vorher unbekannten und nicht vorhergesagten Mechanismus der Bildung von Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukten (Maillardprodukten; AGEs) und Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung effektiver Inhibitoren der Post-Amadori AGE Bildung. Die vorliegende Offenbarung zeigt die einmalige Isolierung und kinetische Charakterisierung eines reaktiven Protein- Zwischenprodukts, das in der Lage ist, Post-Amadori AGEs zu bilden und lehrt zum ersten Mal Verfahren, die die spezifische Aufklärung und schnelle quantitative kinetische Untersuchung von "späten" Phasen der Proteinglykosylierungsreaktion ermöglichen.

Im Gegensatz zu solcher "späten" AGE-Bildung wurden die "frühen" Schritte der Glykosylierungsreaktion für mehrere Proteine relativ gut charakterisiert und identifiziert (Harding, 1985, Adv. Protein Chem. 37: 248-334; Monnier & Baynes eds., 1989, The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition (Alan R. Liss, New York); Finot et al., 1990, eds. The Maillard Reaction in Food Processing, Human Nutrition and Physiology (Birkhauser Verlag, Basel)). Von den Glykosylierungsreaktionen ist bekannt, daß sie durch reversible Schiff-Base (Aldimin oder Ketimin) Additionsreaktionen mit Lysin-Seitenketten ε-Amino- und terminalen α-Aminogruppen initiiert werden, gefolgt von im wesentlichen reversiblen Amadori- Neuanordnungen, um Ketoaminprodukte, z. B. 1-Amino-1-desoxy-ketosen aus der Reaktion von Aldosen zu ergeben (Baynes et al., 1989, in The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition, ed. Monnier and Baynes, (Alan R. Liss, New York, pp 43-67). Typischerweise reagieren Zucker anfänglich in ihrer offen-kettigen (nicht den vorherrschenden Pyranose- und Furanosestrukturen) Aldehydo- oder Keto-Formen mit Lysinseitenketten ε-Amino und terminalen α-Aminogruppen durch reversible Schiff-Base Kondensation (Schema I). Die sich ergebenden Aldimin- oder Ketimin-Produkte erfahren dann Amadori-Neuanordnungen, um Ketoamin-Amadoriprodukte zu ergeben, d. h. 1-Amino-1-desoxy-ketosen aus der Reaktion von Aldosen (Means & Chang, 1982, Diabetes 31, Suppl. 3: 1-4; Harding, 1985, Adv. Protein Chem. 37: 248-334). Diese Amadori-Produkte erfahren dann, über eine Zeitdauer von Wochen und Monaten, langsame und irreversible Maillard "Bräunungs" Reaktionen, wobei fluoroseszente und andere Produkte über Neuanordnung, Dehydration, oxidative Fragmentierung und Kreuz-Vernetzungsreaktionen gebildet werden. Diese Post-Amadori-Reaktionen (langsame Maillard "Bräunungs" Reaktionen) führen zu wenig charakterisierten fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukten (AGEs).

Wie mit Amadori und anderen Glykosylierungs-Zwischenprodukten, kann freie Glukose selber oxidative Reaktionen erfahren, die zu der Produktion von Peroxid und hoch reaktiven Fragmenten führen, wie den Dicarbonylen Glyoxal und Glycoaldehyd. Daher war die Aufklärung des Mechanismus der Bildung einer Vielzahl von AGEs extrem komplex, weil die meisten in vitro Untersuchungen bei extrem hohen Zuckerkonzentrationen durchgeführt wurden.

Im Gegensatz zu der relativ gut charakterisierten Bildung dieser "frühen" Produkte, bestand ein klares Fehlen des Verständnisses der Mechanismen der Bildung der "späten" Maillard- Produkte, die in Post-Amadori-Reaktionen hergestellt werden, aufgrund ihrer Heterogenität, langen Reaktionszeiten und Komplexität. Das Fehlen von genauer Information über die Chemie der "späten" Maillard-Reaktion stimulierte die Forschung, fluoreszente AGE- Chromophore zu identifizieren, die von der Reaktion von Glukose mit Aminogruppen von Polypeptiden abstammen. Ein solches Chromophor, 2-(2-Furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H- imidazol (FFI) wurde nach dem nicht-enzymatischen Bräunen von Rinderserumalbumin und Polylysin mit Glukose identifiziert und als repräsentativ für das in den intakten Polypeptiden vorhandene Chromophor postuliert. (Pongor et al., 1984, PNAS(USA) 81: 2684-2688). Spätere Untersuchungen etablierten FFI als einen Artefakt, der während der sauren Hydrolyse für die Analyse gebildet wurde.

Eine Reihe von US-Patenten wurden im Bereich der Inhibierung von Proteinglykosylierung und Kreuz-Vernetzung von Proteinzuckeraminen erteilt, basieren auf der Voraussetzung, daß der Mechanismus solcher Glykosylierung und die Kreuz-Vernetzung über gesättigte Glykosylierung und anschließende Kreuz-Vernetzung von Proteinzuckeraminen über eine einzelne basische und sich wiederholende Reaktion erfolgt. Diese Patente schließen US-Patente 4,665,192; 5,017,696; 4,758,853; 4,908,446; 4,983,604; 5,140,048; 5,130,337; 5,262,152; 5,130,324; 5,272,165; 5,221,683; 5,258,381; 5,106,877; 5,128,360; 5,100,919; 5,254,593; 5,137,916; 5,272,176; 5,175,192; 5,218,001; 5,238,963; 5,358,960; 5,318,982 und 5,334,617 ein. (Alle genannten US-Patente sind hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen).

Der Fokus dieser US-Patente ist ein Verfahren zur Inhibierung der AGE-Bildung, fokussiert auf die Carbonylgruppe des frühen Glykosylierungs-Amadori-Produkts und insbesondere lehrt die gezeigte am meisten effektive Inhibierung die Verwendung von exogen verabreichtem Aminoguanidin. Die Effektivität von Aminoguanidin als ein Inhibitor von AGE-Bildung wird im Augenblick in klinischen Versuchen untersucht.

Die Inhibierung von AGE-Bildung weist eine Brauchbarkeit in den Bereichen von, zum Beispiel, Verderben von Nahrung, tierischer Proteinalterung und der persönlichen Hygiene, wie zum Beispiel der Bekämpfung des Bräunens von Zähnen auf. Einige bemerkenswerte, jedoch quantitativ geringe, fortgeschrittene Glykosylierungs-Endprodukte sind Pentosidin und Nε- Carboxymethyllysin (Sell und Monnier, 1989, J. Biol. Chem. 264: 21597-21602; Ahmed et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 4889-4894).

Die Amadori-Zwischenprodukt- und die nachfolgende Post-Amadori AGE- Bildung, wie durch die folgende Erfindung gelehrt, wird durch die Reaktion mit Aminoguanidin nicht vollständig inhibiert. Daher findet die Bildung der Post-Amadori AGEs, wie durch die vorliegende Offenbarung gelehrt, über einen wichtigen und einmaligen Reaktionsweg statt, der bisher nicht gezeigt wurde oder der sogar vorher nicht einzeln zu belegen war. Es ist ein hoch wünschenswertes Ziel, ein effizientes und effektives Verfahren zu Identifizierung und Charakterisierung von effektiven Post-Amadori AGE-Inhibitoren dieser "späten" Reaktion zu haben. Durch das zur Verfügung stellen von effizienten Screening-Verfahren und Modellsystemen kann kombinatorische Chemie verwendet werden, um Kanditatenverbindungen effektiv zu screenen und dadurch Zeit, Kosten und Aufwand bei der eventuellen Validierung von Inhibitor-Verbindungen stark reduziert werden. Es wäre sehr brauchbar, in vivo-Verfahren zum Modelling und der Untersuchung der Effekte von Post-Amadori AGE-Bildung zu haben, die dann eine effiziente Charakterisierung von effektiven Inhibitoren ermöglichen würden.

Inhibitorische Verbindungen, die biologisch abbaubar und/oder natürlich metabolisiert werden, sind zur Verwendung als Therapeutika wünschenswerter, als hoch reaktive Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen aufweisen können, wie zum Beispiel Aminoguanidin.

Zusammenfassung der Erfindung

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde ein stabiler Post-Amadori fortgeschrittener Glykosylierungs-Endprodukt (AGE) Vorläufer identifiziert, der dann dazu verwendet werden kann, um schnell die Post-Amadori Konversion in Post-Amadori AGEs zu vervollständigen. Dieses stabile Produkt ist ein vermutetes Zucker-gesättigtes Amadori/Schiff-Base Zwischenprodukt, das durch die Reaktion von Zielproteinen mit Ribosezucker erzeugt wurde.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung von stabilen Protein- Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt (AGE)-Intermediaten zur Verfügung gestellt, umfassend Inkubieren von Protein mit Ribose, wobei die Konzentration der Ribose mindestens ungefähr 0,15 M beträgt, für eine ausreichende Zeitdauer, um stabile Protein-Zucker Post-Amadori AGE-Zwischenprodukte zu erzeugen.

Ein Verfahren zur schnellen Erzeugung von antigenem Post-Amadori fortgeschrittenem Glykosylierungs-Endprodukt (AGE), umfassend Freisetzen eines stabilen Protein-Zucker Post- Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt-Zwischenprodukts von inhibitorischen Bedingungen von mindestens ungefähr 0,15 M Ribose durch Entfernen von freiem und reversibel gebundenem Zucker von dem Zwischenprodukt.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung eines effektiven Inhibitors der Bildung von späten Maillard-Produkten zur Verfügung, umfassend: Erzeugen von stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt- Intermediaten durch Inkubieren eines Proteins mit Ribose bei einer ausreichenden Konzentration und für eine ausreichende Zeitdauer, um stabile Post-Amadori AGE-Zwischenprodukte zu erzeugen; In Kontakt bringen der stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt-Zwischenprodukte mit einem Inhibitorkandidaten; Identifizierung der effektiven Inhibierung durch Überwachen der Bildung von Post-Amadori AGEs nach Freisetzung der stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittene Glykosylierungs- Endprodukt-Zwischenprodukte von Zucker induziertem Äquilibrium.

Die vorliegende Erfindung lehrt, daß ein effektiver Inhibitor von Post-Amadori AGE-Bildung über "späte" Reaktionen durch die Fähigkeit identifiziert und charakterisiert werden kann, die Bildung von Post-Amadori AGE-Endprodukten in einem Test zu inhibieren, der umfaßt; Erzeugen von stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs- Endprodukt-Intermediaten durch Inkubieren eines Proteins mit Ribose bei einer ausreichenden Konzentration und für eine ausreichende Zeitdauer, um stabile Post-Amadori AGE- Intermediate zu erzeugen; In Kontakt bringen der stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt-Intermediate mit einem Inhibitorkandidaten; Indentifizieren einer effektiven Inhibierung durch Überwachen der Bildung von Post-Amadori AGEs nach Freisetzung der stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt-Intermediate von Ribose induzierten Äquilibrium.

Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung das schnelle Screenen von Kandidaten Post- Amadori AGE-Bildungsinhibitoren auf Effektivität, wobei die Kosten und Menge von erforderlicher Arbeit für die Entwicklung von effektiven kleinen Molekülinhibitoren von Post- Amadori AGE-Bildung stark verringert werden. Die vorliegende Erfindung lehrt, daß effektive Inhibitoren der Post-Amadori "späten" Reaktionen der AGE-Bildung Derivate von Vitamin B&sub6; und Vitamin B&sub1; einschließen, wobei in der bevorzugten Ausführungsform die spezifischen Spezies Pyrdoxamin und Thiaminpyrophosphat sind.

Die vorliegende Erfindung lehrt neue Verfahren zur schnellen Induktion von Diabetes, wie zum Beispiel Pathologien in Ratten, umfassend Verabreichen von Ribose an das entsprechende Tier. Weiterhin wird die Verwendung der identifizierten Inhibitoren Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in vivo zur Verfügung gestellt, um Post-Amadori AGE-induzierte pathologische Zustände zu inhibieren.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen angegeben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6; Derivaten auf die AGE- Bildung in Rinderserumalbumin (BSA) darstellen. Fig. 1A Pyridoxamin (PM); Fig. 1B Pyridoxalphosphat (PLP); Fig. 1C Pyridoxal (PL); Fig. 1D Pyridoxin (PN).

Fig. 2 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1;-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung bei Rinderserumalbumin zeigen. Fig. 2A Thiaminpyrophosphat (TPP); Fig. 2B Thiaminmonophosphat (TP); Fig. 2C Thiamin (T); Fig. 2D Aminoguanidin (AG).

Fig. 3 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6;-Derivaten auf die AGE- Bildung bei menschlichem Methämoglobin (Hb) darstellen. Fig. 3A Pyridoxamin (PM); Fig. 3B Pyridoxalphosphat (PLP); Fig. 3C Pyridoxal (PL); Fig. 3D Pyridoxin (PN).

Fig. 4 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1;-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung bei menschlichem Methämoglobin zeigen. Fig. 4A Thiaminpyrophosphat (TPP); Fig. 4B Thiaminmonophosphat (TP); Fig. 4C Thiamin (T); Fig. 4D Aminoguanidin (AG).

Fig. 5 zeigt einen Balkendiagramm-Vergleich der Inhibierung der Glykosylierung von Ribonuklease A durch Thiaminpyrophosphat (TPP), Pyridoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG).

Fig. 6A zeigt einen Graphen der Kinetik der Glykosylierung von RNase A (10 mg/ml) durch Ribose, wie durch ELISA überwacht. Fig. 6B zeigt einen Graphen, der die Abhängigkeit von reziproken Halbwertszeiten auf Ribosekonzentration bei pH 7,5 zeigt.

Fig. 7 zeigt zwei Graphen, die einen Vergleich von nicht unterbrochener und unterbrochener Glykosylierung von RNase durch Glukose (7B) und Ribose (A), wie durch ELISA nachgewiesen, zeigt.

Fig. 8 zeigt zwei Graphen, die die Kinetiken der Zunahme von Pentosidinfluoreszenz (arbiträre Einheiten) während nicht unterbrochener und unterbrochener Ribose-Glykosylierung von RNase zeigen. Fig. 8A nicht-unterbrochene Glykosylierung in Anwesenheit von 0,05 M Ribose. Fig. 8B unterbrochene Glykosylierung nach 8 und 24 Stunden Inkubation.

Fig. 9 zeigt einen Graphen, der die Kinetiken von reaktivem Zwischenprodukt-Anhäufung zeigt.

Fig. 10 sind Graphen der Post-Amadori Inhibierung der AGE-Bildung durch Ribose. Fig. 10A zeigt Daten, wobei Aliquots in Inhibitor enthaltenden Puffern zur Zeit 0 verdünnt wurden. Fig. 10B zeigt Daten, wobei Proben bei 24 h unterbrochen wurden und dann in Inhibitor enthaltende Puffern verdünnt wurden.

Fig. 11 ist ein Graph, der die Abhängigkeit der anfänglichen Bildungsrate von antigenem AGE vom pH im Anschluß an die Unterbrechung der Glykosylierung zeigt.

Fig. 12 zeigt zwei Graphen, die den Effekt von pH Sprüngen auf ELISA nachgewiesene AGE-Bildung nach unterbrochener Glykosylierung zeigen. Unterbrochene Proben, die 12 Tage bei 37ºC in pH 5,0 Puffer belassen wurden, ergaben wesentliche AGEs (33%; Fig. 12B), wenn der pH auf 7,5 verändert wurde, im Vergleich zu der normalen Kontrollprobe, die nicht niedrigem pH ausgesetzt wurde (Fig. 12A).

Fig. 13 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6;-Derivaten auf die AGE-Bildung während nicht unterbrochener Glykosylierung von Ribonuklease A (RNase A) durch Ribose zeigen. Fig. 13A Pyridoxamin (PM); Fig. 13B Pyridoxal-5'-phosphat(PLP); Fig. 13C Pyridoxal (PL); Fig. 13D Pyridoxin (PN).

Fig. 14 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1;-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung während nicht unterbrochener Glykosylierung von Ribonuklease A (RNase A) durch Ribose zeigen. Fig. 14A Thiaminpyrophosphat (TPP); Fig. 14B Thiaminmonophosphat (TP); Fig. 14C Thiamin (T); Fig. 14D Aminoguanidin (AG).

Fig. 15 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6;-Derivaten auf die AGE-Bildung während nicht unterbrochener Glykosylierung von Rinderserumalbumin (BSA) durch Ribose zeigen. Fig. 15A Pyridoxamin (PM); Fig. 15B Pyridoxal-5'-phosphat (PLP); Fig. 15C Pyridoxal (PL); Fig. 15D Pyridoxin (PN).

Fig. 16 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1;-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung während nicht unterbrochener Glykosylierung von Rinderserumalbumin (BSA) durch Ribose darstellen. Fig. 16A Thiaminpyrophosphat (TPP); Fig. 16B Thiaminmonophosphat (TP); Fig. 16C Thiamin (T); Fig. 16D Aminoguanidin (AG).

Fig. 17 ist eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6;-Derivaten auf die AGE- Bildung während nicht unterbrochener Glykosylierung von menschlichem Methämoglobin (Hb) durch Ribose zeigt. Fig. 17A Pyridoxamin (PM); Fig. 17B Pyridoxal-5'-phosphat (PLP); Fig. 17C Pyridoxal (PL); Fig. 17D Pyridoxin (PN).

Fig. 18 zeigt eine Serie von Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1;-Derivaten auf Post- Amadori AGE-Bildung nach unterbrochener Glykosylierung durch Ribose zeigen. Fig. 18A BSA und Pyridoxamin (PM); Fig. 18B BSA und Pyridoxal-5'-phosphat (PLP); Fig. 18C BSA und Pyridoxal (PL); Fig. 18D RNase und Pyridoxamin (PN).

Fig. 19 sind Graphen, die den Effekt von Thiaminpyrophosphat auf Post-Amadori AGE- Bildung nach unterbrochener Glykosylierung durch Ribose zeigen. Fig. 19A RNase, Fig. 19B BSA.

Fig. 20 sind Graphen, die den Effekt von Aminoguanidin auf Post-Amadori AGE-Bildung nach unterbrochener Glykosylierung durch Ribose zeigen. Fig. 20A RNase, Fig. 20B BSA.

Fig. 21 zeigt einen Graph, der den Effekt von Nα-Acetyl-L-Lysin auf Post-Amadori AGE- Bildung nach unterbrochener Glykosylierung durch Ribose darstellt.

Fig. 22 sind Balkendiagramme, die einen Vergleich von Post-Amadori Inhibierung der AGE-Bildung durch Thiaminpyrophosphat (TPP); Pyridoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG) nach unterbrochener Glykosylierung von RNase (Fig. 22A) und BSA (Fig. 22B) durch Ribose zeigen.

Fig. 23 ist ein Balkendiagramm, das die Effekte von Ribosebehandlung in vivo allein auf Rattenschwanz-Manschetten-Blutdruck zeigt. Die Behandlung erfolgte mit 0,05 M, 0,30 M, und 1 M Ribose (R), injiziert für 1, 2 oder 8 Tage (D).

Fig. 24 zeigt ein Balkendiagramm, das die Effekte von Ribosebehandlung in vivo allein auf die Rattenkreatininausscheidung (Ausscheidung pro 100 g Körpergewicht) zeigt. Die Behandlung war mit 0,05 M, 0,30 M und 1 M Ribose (R) injiziert für 1, 2 oder 8 Tage (D).

Fig. 25 zeigt ein Balkendiagramm, das die Effekte von Ribosebehandlung in vivo allein auf Rattenalbuminurie (Albumineffusionsrate) zeigt. Die Behandlung war mit 0,30 M und 1 M Ribose (R), injiziert für 1, 2 oder 8 Tage (D).

Fig. 26 zeigt ein Balkendiagramm, das die Effekte von Inhibitorbehandlung in vivo mit oder ohne Ribose auf Rattenschwanz-Manschetten-Blutdruck zeigt. Die Behandlungsgruppen waren: 25 mg/100 g Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 25 oder 250 mg/100 g Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/100 g Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder mit 1 M Ribose (R).

Fig. 27 zeigt ein Balkendiagramm, das die Effekte von Inhibitorbehandlung in vivo mit oder ohne Ribose auf die Rattenkreatininausscheidung (Ausscheidung pro 100 g Körpergewicht) zeigt. Die Behandlungsgruppen waren: 25 mg/100 g Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 25 oder 250 mg/100 g Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/100 g Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder mit 1 M Ribose (R).

Fig. 28 ist ein Balkendiagramm, das die Effekte von Inhibitorbehandlung in vivo ohne Ribose und Ribose alleine auf Ratten-Albuminurie (Albumin-Effusionsrate) zeigt. Die Behandlungsgruppen waren: 25 mg/100 g Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 250 mg/100 g Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/100 g Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder Behandlung mit 1 M Ribose (R) für 8 Tage (D). Die Kontrollgruppe erfuhr keine Behandlung.

Fig. 29 zeigt ein Balkendiagramm, das die Effekte von Inhibitorbehandlung in vivo mit 1 M Ribose auf die Rattenalbuminurie (Albumineffusionsrate) zeigt. Die Behandlungsgruppen waren: 25 mg/100 g Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 25 und 250 mg/100 g Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/100 g Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder Behandlung mit 1 M Ribose (R) für 8 Tage (D) allein. Die Kontrollgruppe erfuhr keine Behandlung.

Fig. 30A zeigt Schema 1, das ein Diagramm der AGE-Bildung von Protein zeigt. Fig. 30B zeigt Schema 2, eine chemische Struktur von Aminoguanidin. Fig. 30C zeigt Schema 3, chemische Strukturen für Thiamin, Thiamin-5'-phosphat und Thiaminpyrophosphat. Fig. 30D zeigt Schema 4, chemische Strukturen von Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'- phosphat und Pyridoxal. Fig. 30E zeigt Schema 5, eine Darstellung der Kinetiken der AGE- Bildung. Fig. 30F zeigt Schema 6, eine Darstellung der Kinetiken von AGE-Bildung und Zwischenproduktbildung.

Fig. 31 zeigt ein 125 MHz C-13 NMR Resonanzspektrum von Ribonuklease Amadori- Intermediat, hergestellt durch 24 HR-Reaktion mit 99% [2-C13]-Ribose.

Genaue Beschreibung Tiermodelle für Proteinalterung

Alloxan-induzierte diabetische Lewis-Ratten wurden als ein Modell zur Proteinalterung verwendet, um die in vivo Effektivität von Inhibitoren der AGE-Bildung zu demonstrieren. Die Korrelation, die demonstriert wird, ist zwischen Inhibierung von später Diabetes-verwandter Pathologie und effektiver Inhibierung der AGE-Bildung (Brownlee, Cerami, and Vlassara, 1988, New Eng. J. Med. 318 (20): 1315-1321). Die Streptozotocin-Induktion der Diabetes in Lewis-Ratten, New-Zealand weißen Kaninchen mit induzierter Diabetes und genetisch diabetischen BB/Worcester-Ratten wurde ebenfalls verwendet, wie beschrieben in, zum Beispiel U.S.-Patent 5,334,617 (durch Bezugnahme aufgenommen). Ein hauptsächliches Problem mit diesen Modellsystemen ist die lange Zeitdauer, die benötigt wird, um AGE verwandte Verletzung zu demonstrieren und daher Verbindungen auf AGE-Inhibierung zu testen. Zum Beispiel wurden 16 Wochen Behandlung für die Rattenstudien, die in U.S. Patent 5, 334,617 beschrieben wurden, benötigt und 12 Wochen für die Kaninchenuntersuchungen. Daher wäre es hoch wünschenswert und brauchbar, ein Modellsystem für die AGE verwandte diabetische Pathologie zu haben, die sich in einer kürzeren Zeitdauer manifestieren wird, was einen effizienteren und schnelleren Nachweis der AGE verwandten Verletzung und die Effektivität von Inhibitoren der Post-Amadori AGE-Bildung ermöglicht.

Antikörper gegen AGEs

Ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der AGE-Bildung ist die Verwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für AGEs sind, die durch die Reaktion von verschiedenen Zuckern mit einer Vielzahl von Target-Proteinen hervorgerufen wurden. Die Antikörper werden auf die sich ergebende Spezifität für AGEs gescreent, die unabhängig von der Art der Proteinkomponente des AGE ist (Nakayama et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 162: 740-745; Nakayama et al., 1991, J. Immunol. Methods 140: 119- 125; Horiuchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 7329-7332; Araki et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 10211-10214; Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133-5138). Solche Antikörper wurden verwendet, um die AGE-Bildung in vivo und in vitro zu verfolgen.

Thiamin - Vitamin B&sub1;

Das erste Mitglied des zu identifizierenden Vitamin B Komplexes, Thiamin, ist praktisch frei von pharmakodynamischen Handlungen, wenn in gewöhnlichen therapeutischen Dosen verabreicht; und sogar von hohen Dosen war es nicht bekannt, daß sie einen Effekt aufweisen. Thiaminpyrophosphat ist die physiologisch aktive Form von Thiamin und wirkt hauptsächlich im Carbohydrat-Stoffwechsel als ein Coenzym bei der Decarboxylierung von α-keto-Säuren. Tabletten von Thiaminhydrochlorid sind in Mengen, die jeweils von 5 bis 500 mg reichen, erhältlich. Thiaminhydrochlorid-Injektionslösungen sind erhältlich, die 100 bis 200 mg/ml enthalten.

Zur Behandlung von Thiamin-Defizienz werden intravenöse Dosen von so viel wie 100 mg/l parenteraler Flüssigkeit gewöhnlich verwendet, wobei die typische Dosis von 50 bis 100 mg verabreicht wird. Von der GI-Absorption von Thiamin wird geglaubt, daß sie auf 8 bis 15 mg pro Tag begrenzt ist, jedoch durch orale Verabreichung in getrennten Dosen zusammen mit Nahrungsmitteln erhöht werden kann.

Wiederholte Verabreichung von Glucose kann Thiamin-Defizienz in unterernährten Patienten herbeiführen und dies wurde während der Korrektur von Hyperglykämie bemerkt.

Überraschenderweise hat die vorliegende Erfindung gefunden, wie durch in vitro Tests gezeigt, daß die Verabreichung von Thiaminpyrophosphat bei Spiegeln oberhalb dessen, was normalerweise im menschlichen Körper gefunden wird oder für die diätetische Therapie verabreicht wird, ein effektiver Inhibitor der Post-Amadori antigenen AGE-Bildung ist, und das diese Inhibierung vollständiger ist, als diejenige, die durch die Verabreichung, von Aminoguanidin möglich ist.

Pyridoxin - Vitamin B&sub6;

Vitamin B&sub6; ist typischerweise in Form von Pyridoxinhydrochlorid in über-den-Tresen Präparationen erhältlich, die von vielen Quellen erhältlich sind. Zum Beispiel enthalten Beach Pharmaceuticals Beelith-Tabletten 25 mg Pyridoxinhydrochlorid, was zu 20 mg von B&sub6; äquivalent ist, andere Herstellungen schließen Marlyn Heath Care Marlyn Formula 50 ein, die 1 mg an Pyridoxin HCl enthalten und Marlyn Formula 50 Mega Forte die 6 mg an Pyridoxin HCl enthalten, Wyeth Ayerst Stuart Prenatal® Tabletten, die 2,6 mg Pyridoxin HCl enthalten, J&J-Merck Corp. Stuart Formula® Tabletten, die 2 mg an Pyridoxin HCl enthalten und die CIBA Consumer Sunkist Kinder-kaubaren Multivitamine, die 1,05 mg von Pyridoxin HCl enthalten, 150% der U.S. RDA für Kinder in einem Alter von 2 bis 4 und 53% der U.S. RDA für Kinder in einem Alter über 4 Jahre und Erwachsene (Physician's Desk Reference for nonprescription drugs, 14th edition (Medical Economics Data Production Co., Montvale, N. J., 1993)).

Es gibt drei verwandte Formen von Pyridoxin, die sich in der Art der Substitution an dem Kohlenstoffatom in Position 4 des Pydridinnukleus unterscheiden: Pyridoxin ist ein primärer Alkohol, Pyridoxal ist das entsprechende Aldehyd und Pyridoxamin enthält eine Aminomethylgruppe an dieser Position. Jede dieser drei Formen kann durch Säuger nach Konversion durch die Leber in Pyridoxal-5'-phosphat, die aktive Form des Vitamins verwendet werden. Es wurde lang geglaubt, daß diese drei Formen in ihren biologischen Eigenschaften äquivalent sind und sie wurden durch den Stand der Technik als äquivalente Formen von Vitamin B&sub6; behandelt. Das Council on Pharmacy and Chemistry hat dem Vitamin den Namen Pyridoxin zugeteilt.

Der zu Pyridoxin am meisten aktive Antimetabolit ist 4'-Desoxypyridoxin, für das die Antimetaboliteaktivität als auf der in vivo Bildung von 4'-Desoxypyridoxin-5'-phosphat beruhend angesehen wurde, einen kompetitiven Inhibitor von verschiedenen Pyridoxalphosphatabhängigen Enzymen. Die pharmakologischen Aktionen von Pyridoxin sind begrenzt, da es keine wesentlichen pharmkodynamischen Handlungen nach entweder oraler oder intravenöser Verabreichung hervorruft und es weist eine niedrige akute Toxizität auf, wobei es wasserlöslich ist. Es wurde vorgeschlagen, daß sich Neurotoxizität entwickelt, nach verlängerter Aufnahme von so wenig wie 200 mg von Pyridoxin pro Tag. Physiologisch, als ein Coenzym, ist Pyridoxinphosphat an verschiedenen metabolischen Transformationen von Aminosäuren beteiligt, einschließlich der Decarboxylierung, Transaminierung und Racemisierung, sowie in enzymatischen Schritten im Stoffwechsel von Schwefel-enthaltenden und Hydroxy- Aminosäuren. Im Fall der Transaminierung wird Pyridoxalphosphat zu Pyridoxaminphosphat durch die Donoraminosäure aminiert und das gebundene Pyridoxaminphosphat wird dann zu Pyridoxalphosphat durch die Akzeptor α-keto-Säure deaminiert. Daher ist von Vitamin B Komplex bekannt, eine essentielle Nahrungsergänzung zu sein, die an spezifischen Abbau von Aminosäuren beteiligt ist. Für eine allgemeine Zusammenfassung des Vitamin B- Komplexes, siehe The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, ed. Gilman, Rall, Nies, and Taylor (Pergamon Press, New York, 1990, pp. 1293-4; pp. 1523-1540).

Überraschenderweise hat die vorliegende Erfindung entdeckt, daß effektive Dosierungen der metabolisch transitorischen Pyridoxalamino-Form von Vitamin B&sub6; (Pyridoxamin), bei Spiegeln oberhalb derer, die normalerweise im menschlichen Körper gefunden werden, ein effektiver Inhibitor von Post-Amadori antigener AGE-Bildung ist und das diese Inhibierung vollständiger sein kann, als diejenige, die durch die Verabreichung von Aminoguanidin möglich ist.

Bildung von stabilem Amadori/Schiff-Base Zwischenprodukt

Die typische Untersuchung der Reaktion eines Proteins mit Glucose um AGEs zu bilden, war diejenige durch ELISA unter Verwendung von Antikörpern, die gegen antigene AGEs gerichtet waren, und der Nachweis der Produktion eines Säure-stabilen fluoreszenten AGE, Pentosidin, durch HPLC, nach Säurehydrolyse. Glycosylierung von Zielproteinen (d. h. BSA oder RNase A) mit Glucose und Ribose wurden durch Überwachung der ELISA-Reaktivität von polyklonalem Kaninchen anti-Glucose-AGE-RNase und anti-Glucose-AGE-BSA Antikörpern verglichen. Das Antigen wurde durch Reagieren von 1 M Glucose mit RNase für 60 Tage und BSA für 90 Tage erzeugt. Die Antikörper (R618 und R479) wurden gescreent und zeigten Reaktivität mit nur AGEs und nicht dem Protein, außer für das Träger-Immunogen.

Beispiel 1 Thiaminpyrophosphat und Pyridoxamin inhibieren die Bildung von antigenen fortgeschrittenen Glycosylierungsendprodukten von Glucose: Vergleich mit Aminoguanidin

Von einigen B&sub6;-Vitameren, insbesondere Pyridoxalphosphat (PLP) wurde kürzlich vorgeschlagen, daß sie als "kompetitive Inhibitoren" der frühen Glycosylierung handeln, da sie als Aldehyde selber Schiff-Basenaddukte mit Proteinaminogruppen bilden können (Khatami et al., 1988, Life Sciences 43: 1725-1731) und daher die Menge von Aminen begrenzen, die für die Glucose-Anheftung frei sind. Jedoch ist die Effektivität bei der Begrenzung der anfänglichen Zuckeranheftung keine Vorhersage der Inhibierung der Konversion von jeglichen Amadori-Produkten, die zu AGEs gebildet werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt Inhibitoren von "späten" Glycosylierungsreaktionen, wie durch ihre Effekte auf die in vitro Bildung von antigenen AGEs gezeigt (Booth et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Com. 220: 113-119).

Chemikalien - Rinder pankreatische Ribonuklease A (RNase) war von chromatographisch reinem, Aggregatfreiem Grad von Worthington Biochemicals. Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V, fettsäurefrei), menschliches Methämoglobin (Hb), D-Glucose, Pyridoxin, Pyridoxal, Pyridoxal-5'-phosphat, Pyridoxamin, Thiamin, Thiaminmonophosphat, Thiaminpyrophosphat und Ziegen alkalische Phosphatase-konjugierter anti-Kaninchen IgG waren alle von Sigma Chemicals. Aminoguanindinhydrochlorid wurde von Aldrich Chemicals erworben.

Nicht unterbrochene Glycosylierung mit Glucose - Rinderserumalbumin, Ribonuklease A und menschliches Hämoglobin wurden mit Glucose bei 37ºC in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 enthaltend 0,02% Natriumazid, inkubiert. Das Protein, Glucose (bei 1,0 M) und die wahrscheinlichen Inhibitoren (bei 0,5, 3, 15 und 50 mM) wurden gleichzeitig in das Inkubationsgemisch eingeführt. Die Lösungen wurden im Dunkeln in bedeckelten Röhrchen gehalten. Aliquots wurden abgenommen und sofort gefroren, bis sie durch ELISA am Schluß der Reaktion analysiert wurden. Die Inkubationen waren für 3 Wochen (Hb) oder 6 Wochen (RNase, BSA).

Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGE-Proteine

Die Immunogen-Präparation folgte früheren Protokollen (Nakayama et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 162: 740-745; Horiuchi et al., 1991, J. Biof Chem. 266: 7329-7332; Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133-5138). Kurz, wurde ein Immunogen durch Glycosylierung von BSA (R479-Antikörper) oder RNase (R618-Antikörper) bei 1,6 g Protein in 15 ml für 60-90 Tage unter der Verwendung von 1,5 M Glucose in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5, der 0,05% Natriumazid bei pH 7,4 und 37ºC enthielt, hergestellt. New-Zealandweiße männliche Kaninchen von 8-12 Wochen wurden durch subkutane Verabreichung von einer 1 ml Lösung, die 1 mg/ml von glycosyliertem Protein in Freunds Adjuvans enthielt, immunisiert. Die primäre Injektion verwendete das vollständige Adjuvans und drei Boosts wurden in drei Wochen-Intervallen mit Freunds unvollständigen Adjuvans durchgeführt. Den Kaninchen wurde drei Wochen nach dem letzten Boost Blut abgenommen. Das Serum wurde durch Zentrifugation von geronnenem Gesamtblut gesammelt. Die Antikörper sind AGEspezifisch, wobei sie mit entweder den nativen Proteinen (außer für den Träger) oder mit Amadori-Zwischenprodukten nicht reaktiv waren. Die polyklonalen anti-AGE-Antikörper haben sich als ein sensitives und wertvolles analytisches Werkzeug für die Untersuchung der "späten" AGE-Bildung in vitro und in vivo erwiesen. Die Art des dominanten antigenen AGE- Epitops oder Haptens verbleibt zweifelhaft, obwohl es kürzlich vorgeschlagen wurde, daß das Protein-Glycosylierungsprodukt Carboxymethyllysin (CmL) ein dominantes Antigen für einige Antikörper sein kann (Reddy et al., 1995, Biochem. 34: 10872-10878). Frilhere Studien konnten keine ELISA Reaktivität mit Modell-CmL Verbindungen zeigen (Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133-5138).

ELISA-Nachweis von AGE-Produkten - Das allgemeine Verfahren von Engvall (1981, Methods Enzymol. 70: 419-439) wurde verwendet, um die ELISA durchzuführen. Typischerweise wurden glycosylierte Proteinproben auf ungefähr 1,5 ug/ml in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer von pH 9,5 bis 9,7 verdünnt. Das Protein wurde über Nacht bei Raumtemperatur auf 96- Tüpfel Polystyrolplatten durch Pipettieren von 200 ul der Proteinlösung in jedem Tüpfel (0,3 ug/Tüpfel) beschichtet. Nach Beschichten wurde das Protein von den Tüpfeln mit einer Kochsalzlösung gewaschen, die 0,05% Tween-20 enthielt. Die Tüpfel wurden dann mit 200 ul von 1% Casein in Carbonatpuffer für 2 h bei 37ºC blockiert, gefolgt von Waschen. Kaninchen anti-AGE-Antikörper wurden auf einen Titer von ungefähr 1 : 350 in Inkubationspuffer verdünnt und für 1 h bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Waschen. Um Hintergrundablesungen zu minimieren, wurden die Antikörper R479, die dazu verwendet wurden glycosylierte RNase nachzuweisen, gegen glycosyliertes BSA erzeugt und Antikörper R618, die dazu verwendet wurden, um glycosyliertes BSA und glycosyliertes Hb nachzuweisen, wurden gegen glycosylierte RNase erzeugt. Ein alkalischer Phosphatase-konjugierter Antikörper gegen Kaninchen- IgG wurde dann als der sekundäre Antikörper bei einem Titer von 1 : 2000 oder 1 : 2500 (in Abhängigkeit von der Charge) hinzugefügt und für 1 h bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Waschen. Die p-Nitrophenylphosphat-Substratlösung wurde dann zu den Platten hinzugefügt (200 ul/Tüpfel), wobei die Absorption des freigesetzten p-Nitrophenolats bei 410 nm mit einem Dynatech MR 4000 Mikroplattenlesegerät verfolgt wurde.

Kontrollen, die unmodifiziertes Protein enthielten, wurden routinemäßig eingeschlossen und ihre Ablesungen wurden abgezogen, wobei die Abweichungen normalerweise vernachlässigbar waren. Die Gültigkeit der Verwendung des ELISA-Verfahrens bei der quantitativen Untersuchung der Kinetiken der AGE-Bildung hängt von der Linearität des Tests ab (Kemeny & Challacombe, 1988, ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, John Wiley & Sons, Chichester, U. K.). Kontrollexperimente wurden zum Beispiel durchgeführt, um zu zeigen, daß der lineare Bereich für RNase unter einer Beschichtungskonzentration von ungefähr 0,2- 0,3 mg/Tüpfel liegt.

Ergebnisse

Fig. 1A-D zeigt Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6; Derivaten auf Post-Amadori AGE- Bildung bei mit Glucose glycosyliertem Rinderserum Albumin zeigen. BSA (10 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Anwesenheit und Abwesenheit der verschiedenen angezeigten Derivate in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 bei 37ºC für 6 Wochen inkubiert. Aliquots wurden durch ELISA unter der Verwendung von R618 anti-AGE-Antikörpern getestet. Die Konzentrationen der Inhibitoren waren 3, 15 und 50 mM. In den Figuren verwendete Inhibitoren (1A) Pyridoxamin (PM); (1B) Pyridoxalphosphat (PLP); (1C) Pyridoxal (PL); (1D) Pyridoxin (PN).

Fig. 1 (Kontrollkurven) zeigt, daß die Reaktion von BSA mit 1,0 M Glucose nach 40 Tagen langsam und unvollständig ist, sogar bei der hohen Zuckerkonzentration die verwendet wurde um die Reaktion zu beschleunigen. Das gleichzeitige Einschließen von verschiedenen Konzentrationen von verschiedenen B&sub6;-Vitameren beeinträchtigte die Bildung von Post-Amadori antigenen AGEs deutlich (Fig. 1A-D). Pyridoxamin und Pyridoxalphosphat unterdrückten die Post-Amadori antigene AGE-Bildung sogar bei den niedrigsten getesteten Konzentrationen stark, während Pyridoxal oberhalb von 15 mM effektiv war. Pyridoxin war bei den höchsten getesteten Konzentrationen leicht effektiv.

Fig. 2 A-D sind Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1; Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf Post-Amadori AGE-Bildung in Rinderserumalbumin zeigen. BSA (10 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Anwesenheit und Abwesenheit des verschiedenen angezeigten Derivats in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 bei 37ºC für 6 Wochen inkubiert. Aliquots wurden durch ELISA unter der Verwendung von R618 anti-AGE Antikörpern getestet. Die Konzentrationen der Inhibitoren waren 3, 15 und 50 mM. Die in den Figuren verwendeten Inhibitoren (2A) Thiaminpyrophosphat (TPP); (2B) Thiaminmonophosphat (TP); (2C) Thiamin (T); (2D) Aminoguanidin (AG).

Von den verschiedenen B&sub1;-Vitameren, die ähnlich getestet wurden (Fig. 2A-D) war Thiaminpyrophosphat bei allen getesteten Konzentrationen effektiv (Fig. 2C), wohingegen Thiamin und Thiaminmonophosphat nicht inhibitorisch waren. Als am meisten signifikant ist bemerkenswert, die Abnahme in den finalen Spiegeln von gebildeten AGEs, die mit Thiaminpyrophosphat, Pyridoxalphosphat und Pyridoxamin beobachtet wurden zu beachten. Aminoguanidin (Fig. 2D) ergab einige Inhibierung von Post-Amadori AGE-Bildung bei BSA, jedoch weniger, als die oben genannten Verbindungen. Ähnliche Untersuchungen wurden mit menschlichen Methämoglobin und Rinder-Ribonuklease A durchgeführt.

Fig. 3A-D sind Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub6; Derivaten auf Post-Amadori AGE- Bildung in menschlichem Methämoglobin zeigen. Hb (1 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Anwesenheit und Abwesenheit des verschiedenen angezeigten Derivats in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 bei 37ºC für 3 Wochen inkubiert. Aliquots wurden durch ELISA unter der Verwendung von R618 anti-AGE-Antikörpern getestet. Die Konzentrationen der Inhibitoren waren 0,5, 3, 15 und 50 mM. In den Figuren verwendete Inhibitoren (3A) Pyridoxamin (PM); (3B) Pyridoxalphosphat (PLP); (3C) Pyridoxal (PL); (3D) Pyridoxin (PN).

Es wurde früher berichtet, daß Hb eines diabetischen Patienten eine Komponente enthält, die an anti-AGE-Antikörper bindet und es wurde vorgeschlagen, daß dieses glycosylierte Hb (genannt Hb-AGE, nicht zu verwechseln mit HbAlc) dazu brauchbar sein könnte, ein Langzeit- Aussetzen gegenüber Glucose zu messen. Die in vitro Inkubation von Hb mit Glucose produzierte antigene AGEs mit einer offensichtlich schnelleren Rate, als mit BSA beobachtet. Jedoch zeigten die verschiedenen B&sub6; (Fig. 3A-D) und B&sub1; (Fig. 4A-C) Vitamere dieselben inhibitorischen Trends bei Hb, wobei Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat die am effektivsten Inhibitoren in jeder ihrer jeweiligen Familien waren. Signifikant inhibierte Aminoguanidin bei Hb nur die Rate der Post-Amadori AGE-Bildung und nicht die finalen Spiegel von gebildeten Post-Amadori AGE (Fig. 4D).

Bei RNase lag die Rate der Post-Amadori antigenen AGE-Bildung durch Glucose in der Mitte zwischen der von Hb und BSA, jedoch wurde das Ausmaß der Inhibierung innerhalb jeder Vitamerserien aufrecht erhalten. Wiederum waren Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat effektiver als Aminoguanidin (Fig. 5).

Fig. 4A-D sind Graphen, die den Effekt von Vitamin B&sub1; Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die Post-Amadori AGE-Bildung bei menschlichem Methämoglobin zeigen. Hb (1 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Anwesenheit und Abwesenheit des verschiedenen angegebenen Derivats in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 bei 37ºC für 3 Wochen inkubiert. Aliquots wurden unter der Verwendung von R618 AGE-Antikörpern durch ELISA getestet. Die Konzentrationen der Inhibitoren waren 0,5, 3, 15 und 50 mM. In den Figuren verwendete Inhibitoren (4A) Thiaminpyrophosphat (TPP); (4B) Thiaminmonophosphat (TP); (4C) Thiamin (T); (4D) Aminoguanidin (AG).

Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich der Inhibierung der Glycosylierung von Ribonuklease A durch Thiaminpyrophosphat (TPP), Pyrodoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG) zeigt. RNase (1 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose (glc) in Anwesenheit und Abwesenheit des verschiedenen angegebenen Derivats in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 bei 37ºC für 6 Wochen inkubiert. Aliquots wurden unter der Verwendung von R479 anti-AGE- Antikörpern durch ELISA untersucht. Die angegebenen Prozent-Inhibierung wurden von den ELISA Ablesungen in der Anwesenheit und Abwesenheit der Inhibitoren bei einem 6 Wochen-Zeitpunkt errechnet. Die Konzentrationen der Inhibitoren waren 0,5, 3, 15 und 50 mM.

Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, daß bestimmte Derivate von B&sub1; und B&sub6; Vitaminen in der Lage sind, die "späte" Post-Amadori AGE-Bildung zu inhibieren. Einige dieser Vitamere inhibierten die finalen Spiegel von produzierten Post-Amadori AGE erfolgreich, im Gegensatz zu Aminoguanidin, was vermuten läßt, daß sie größere Interaktionen mit Amadori oder Post-Amadori- Vorläufern aufweisen, als zu antigenen AGEs. Die Amadori und Post-Amadori-Intermediate stellen eine wichtige Verbindung dar, wo der "klassische" Sytheseweg der nichtenzymatischen Glycosylierung anfängt, im wesentlichen irreversibel zu werden (Schema 1). In früheren Inhibierungsstudien wurde die "Glycosylierung" entweder als gebildete Schiff-Base (nach Reduktion mit markiertem Cyanoborhydrid) oder als gebildetes Amadori-Produkt (nach Säureausfällung unter der Verwendung von markiertem Zucker) gemessen. Solche Tests ergeben keine Information auf die Inhibierung von Post-Amadori-Konversionsschritten zu "späten" Post-Amadori AGE-Produkten, da solche Schritte zu keiner Veränderung in der Menge von markiertem Zucker führen, der an die Proteine angebracht ist. Andere "Glycosylierungs"- Tests beruhten auf der Zuckerinduzierten Zunahme von nicht-spezifischer Proteinfluoreszenz, jedoch kann dieses auch durch Dicarbonyl-oxidative Fragmente von freien Zuckern, wie zum Beispiel Glycoaldehyd oder Glyoxal induziert werden (Hunt et al., 1988, Biochem. 256: 205-212), unabhängig von der Amadori-Produktbildung.

Im Fall von Pyridoxal (PL) und Pyridoxalphosphat (PLP) unterstützen die Daten den einfachen Mechanismus der Inhibierung, der die kompetitive Schiff-Basekondensation von diesen Aldehyden mit Proteinaminogruppen an Glycosylierungsstellen einschließt. Aufgrund der internen Hemiacetalbildung in Pyridoxal, jedoch nicht in Pyridoxalphosphat, wird eine stärkere Inhibierung von Post-Amadori AGE-Bildung durch PLP durch diesen kompetitiven Mechanismus erwartet. Dies wird in der Tat in den Daten beobachtet (Fig. 1B, 1C, Fig. 3B, 3C). Die Inhibierung durch Pyridoxamin ist nötigerweise unterschiedlich, da. Pyridoxamin eine Aldehydgruppe fehlt. Jedoch ist Pyridoxamin ein Kandidatenamin, der potentiell in der Lage ist eine Schiff-Baseverbindung mit den Carbonylen von offen-kettigen Zuckern mit Dicarbonylfragmenten, mit Amadori-Produkten oder Post-Amadori-Intermediaten zu bilden. Der Mechanismus der Inhibierung von B&sub1;-Verbindungen ist nicht offensichtlich. All diese Formen enthalten eine Aminofunktion, so daß die deutlich Effizienz nur der Pyrophosphatform als eine wichtige Voraussetzung für eine stark negative Ladung vermuten läßt.

Eine signifikante unerwartete Beobachtung ist, daß das Ausmaß der Inhibierung durch Aminoguanidin und einige der anderen Verbindungen in späten Phasen der Reaktion deutlich geringer ist, als während der frühen Startphase. Dies läßt einen verschiedenen Wirkmechanismus von dem von Pyrodoxamin und Thiaminpyrophosphat vermuten, was vermuten läßt, daß das therapeutische Potential dieser Verbindungen durch die Co-Verabreichung mit Aminoguanidin verstärkt werden wird.

Beispiel 2 Kinetiken von nicht-enzymatischer Glycosylierung: Paradoxe Inhibierung durch Ribose und leichte Isolierung von Proteinintermediat zur schnellen Post-Amadori AGE-Bildung

Während hohe Konzentrationen von Glucose verwendet werden, um die nicht-enzymatische Glycosylierung von Proteinen zu verursachen, konnte paradoxerweise gefunden werden, daß Ribose bei hohen Konzentrationen inhibitorisch für die Post-Amadori AGE-Bildung bei Ribonuklease ist, indem es auf die Post-Amadori "späten" Phasen der Glycosylierungsreaktion wirkt. Dieser unerwartete inhibitorische Effekt läßt vermuten, daß die "frühen" reaktiven Intermediate, vermutlicherweise Amadori-Produkte, unter geringer Bildung von "späten" Post- Amadori AGE-Produkten (AGEs); Maillard-Produkten) akkumuliert werden körnen.

Die Untersuchung in dieses Phänomen hinein hat gezeigt: (1) die Fähigkeit, Bedingungen zu für die kinetische Isolierung der/des Amadori (oder Post-Amadori) glycosylierten Intermediat(s) definieren; (2) die Fähigkeit, die schnellen Kinetiken der Anhäufung von solch einem Intermediat zu untersuchen; (3) die Fähigkeit, die überraschend schnellen Kinetiken der Konversion von solchen Intermediaten zu AGE-Produkten in Abwesenheit von freiem oder reversibel gebundenem Zucker zu untersuchen; (4) die Fähigkeit, diese Intermediate dazu zu verwenden, die Inhibierung von Post-Amadori-Schritten von AGE-Bildung zu untersuchen und zu charakterisieren, was daher ein neues System zur Untersuchung des Reaktionsmechanismus und der Effizienz von potentiellen Mitteln zur Verfügung stellt, die die AGE-Bildung blockieren könnten; und (5) mit diesem Wissen ist es auch weiterhin möglich, ¹³C NMR zu verwenden, um die reaktiven Intermediate zu untersuchen und ihre Konversion in verschiedene Kandidaten-AGEs zu überwachen (Khalifah et al., 1996, Biochemistry 35(15): 4645- 4654).

Chemikalien und Materialien - wie in Beispiel 1 oben

Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGEs - wie in Beispiel 1 oben

ELISA-Nachweis von AGE-Produkten - wie in Beispiel 1 oben

Aminosäureanalyse - Die Aminosäureanalysen wurden an der Biotechnologie- Unterstützungs-Einrichtung des Kansas University Medical Center durchgeführt. Die Analysen wurden nach Hydrolyse von glycosyliertem Protein (reduziert mit Natriumcyanborhydrid) mit 6 N HCl bei 110ºC für 18-24 h durchgeführt. Phenylisothiocyanat wurde zur Derivatisierung verwendet und PTH-Derivate wurden durch reverse-Phase HPLC auf einem Applied Biosystem Aminosäureanalyzer (420A Derivatisierer, 130A Trennungssystem, 920A Datenanalysesystem) analysiert.

Pentosidin reverse-Phase HPLC-Analyse - Die Pentosidin-Produktion in RNase wurde durch HPLC quantifiziert (Sell & Monnier, 1989, J. Biol. Chem. 164: 21597-21602; Odetti et al., 1992, Diabetes 41: 153-159). Ribose-modifizierte Proteinproben wurden in 6 N HCl für 18 h bei 100ºC hydrolysiert und dann in einer Speed Vac getrocknet. Die Proben wurden dann wieder gelöst und Aliquots wurden in 0,1% Trifluoressigsäure aufgenommen und durch HPLC auf einem Shimadzu-System unter der Verwendung einer Vydac C-18-Säule, die mit 0,1% TFA äquilibriert war, analysiert. Ein Gradient von 0-6% Acetonitril (0,1% in TFA) wurde in 30 Minuten bei einer Flußrate von ungefähr 1 ml/min gelaufen. Das Pentosidin wurde bei 335 nm Anregungs-/385 nm Emissionsfluoreszenz nachgewiesen und seine Elutionszeit wurde durch Lauf eines synthetisierten Standards bestimmt. Aufgrund der erwarteten sehr kleinen Spiegeln von Pentosidin (Grandhee & Monnier, 1991, J. Biol. Chem. 266: 11649- 11653; Dyer et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 11654-11660), wurde kein Versuch unternommen, die absoluten Konzentrationen zu quantifizieren. Nur relative Konzentrationen wurden von den Peak-Bereichen bestimmt.

Glycosylierungs-Modifikationen - Die Modifikation mit Ribose oder Glucose wurde allgemein bei 37ºC in 0,4 M Phosphatpuffer von pH 7,5 durchgeführt, der 0,02% Natriumazid enthielt. Die hohe Pufferkonzentration wurde bei 0,5 M Ribosemodifikationen immer verwendet. Die Lösungen wurden in bedeckelten Röhrchen gehalten und nur dazu geöffnet, um zeitliche Aliquots zu entfernen, die unmittelbar eingefroren wurden, um später die verschiedenen Analysen durchzuführen. "Unterbrochene Glycosylierung"-Experimente wurden durch zuerst Inkubieren von Protein mit der Ribose bei 37ºC für 8 oder 24 h, gefolgt von sofortiger und extensiver Dialyse gegen gelegentliche kalte Pufferwechsel bei 4ºC durchgeführt. Die Proben wurden dann durch schnelles Erwärmen auf 37ºC bei Abwesenheit von externer Ribose reinkubiert. Aliquots wurden zu verschiedenen Intervallen für die spätere Analyse abgenommen und eingefroren. Aufgrund des niedrigem Molekulargewichts von RNase wurden die Proteinkonzentrationen nach der Dialyse nochmals gemessen, auch wenn Dialyseröhrchen mit niedrigen Molekulargewichts-Ausschluß verwendet wurden. Ein alternatives Verfahren wurde ebenfalls erfunden (siehe unten), bei dem die Unterbrechung durch einfache 100-fache Verdünnung von Reaktionsgemischen, die 0,5 M Ribose enthielten, erhalten wurde. Die Proteinkonzentrationen wurden von UV-Spektren abgeschätzt. Die Differenz in der molekularen Extinktion zwischen dem Peak (278 nm) und dem Tiefstpunkt (250 nm) wurde für RNase Konzentrationsbestimmungen verwendet, um die generelle Zunahme in der UV-Absorption zu kompensieren, die die Glycosylierung begleitet. Zeit-abhängige UV-Differenzspektralstudien wurden durchgeführt, um die Beiträge der Glycosylierung zu dem UV-Spektrum zu charakterisieren.

Datenanalyse und numerische Simulationen von Kinetiken

Kinetische Daten wurden routinemäßig an monoexponentiale oder biexponentiale Funktionen unter der Verwendung von nicht linearen Verfahren der kleinsten Annäherung angepaßt. Die kinetischen Mechanismen der Schemata 5-6 wurden durch numerische Simulationen der differenziellen Gleichungen der Reaktion untersucht. Beide Simulationen und die Anpassung an beobachtete kinetische Daten wurden mit dem SCIENTIST 2,0 Software-Packet (Micromath, Inc.) durchgeführt. Bestimmung der ersichtlichen Halbwertszeiten (Fig. 6B) von den kinetischen Daten, die an zwei-exponentielle Funktionen angepaßt wurden (Fig. 6A), wurde mit der "solve"-Funktion der MathCAD 4,0 Software (MathSoft, Inc.) durchgeführt.

Ergebnisse Vergleich der Glycosylierung durch Glucose und Ribose

Die Reaktion von RNase A mit Ribose und Glucose wurde hauptsächlich mit ELISA-Assays verfolgt, unter der Verwendung von R479 Kaninchen AGE-spezifischen Antikörpern, die gegen Glucose-modifiziertes BSA entwickelt wurden. Zu einem geringeren Ausmaß wurde die Produktion von Pentosidin, dem einzigen bekannten säurestabilen fluoreszenten AGE durch HPLC im Anschluß an Säurehydrolyse quantifiziert. Vorläufige Untersuchungen unter der Verwendung von 0,05 M Ribose bei 37ºC zeigten, daß die Rate von der antigenen AGE- Bildung leicht anzusteigen scheint (ungefähr 2-3 fach, wie durch die ersichtlichen Halbwertszeiten gemessen), während der pH von 5,0 auf 7,5 angehoben wird, mit einer offensichtlichen kleinen Induktionsperiode am Beginn der Kinetiken in allen Fällen. Die Glycosylierung von RNase mit 0,05 M Ribose bei pH 7,5 (Halbwertszeit nahe 6,5 Tagen) scheint insgesamt eine Größenordnung schneller zu sein, als die der Glycosylierung mit 1,0 M Glucose (Halbwertszeit mehr als 30 Tage; siehe Fig. 7B, durchgehende Linie). Die letztgenannten Kinetiken zeigten auch eine kleine Induktionsperiode, jedoch ein unvollständiges Auslaufen sogar nach 60 Tagen, was es schwer machte, eine richtige Halbwertszeit abzuschätzen.

Als die Abhängigkeit der Kinetiken von der Ribose-Konzentration bei pH 7,5 untersucht wurde, wurde ein sehr unerwartetes Ergebnis erhalten. Die Rate der Reaktion nahm anfänglich mit ansteigender Ribosekonzentration zu, jedoch klang die Reaktionsrate bei Konzentrationen oberhalb von 0,15 M ab und nahm dann signifikant ab (Fig. 6A). Eine Darstellung der Abhängigkeit der reziproken Halbwertszeit auf die Konzentration an Ribose (Fig. 6B) zeigt, daß hohe Ribosekonzentrationen paradoxerweise inhibitorisch für Post-Amadori antigene AGE-Bildung sind. Dieser ungewöhnliche jedoch konsistente Effekt wurde als unabhängig von Veränderungen in der Konzentration von entweder Puffer (2-fach) oder RNase (10-fach) gefunden und er wurde nicht durch Affinitätsreinigung des R479-Antikörpers auf einer Säule von immobilisierter AGE-RNase verändert. Er liegt ebenfalls nicht an Effekten von Ribose auf den ELISA-Test selber. Der gemessene inhibitorische Effekt durch Ribose auf Post-Amadori AGE-Bildung liegt wahrscheinlich nicht an Riboseinterferenz mit der Antikörpererkennung der AGE antigenen Stellen auf Protein in dem ELISA-Test. Vor dem ersten Kontakt mit dem primären anti-AGE-Antikörper auf den ELISA-Platten, wurde das glycosilierte Protein über 1000-fach verdünnt, ausgiebig mit Tween-20 nach Absorption gewaschen und mit einer 1% Casein-Beschichtung blockiert, gefolgt von weiterem Waschen mit Tween- 20.

Kinetiken der Bildung von Post-Amadori antigenen AGEs durch "unterbrochene Glycosylierung"

Im Hinblick auf die kleine gesehene Induktionsperiode wurde ein Versuch unternommen, um zu bestimmen, ob einige Akkumulation während der Reaktion eines frühen Vorläufers, wie zum Beispiel einem Amadori-Intermediat vorhanden war, das in der Lage ist, die ELISAnachweisbaren Post-Amadori antigenen AGEs zu produzieren. RNase wurde bei pH 7,5 und 37ºC mit einer hohen Ribosekonzentration von 0,5 M glycosiliert und die Reaktion wurde nach 24 h durch sofortiges Abkühlen auf 4ºC und Dialyse gegen verschiedene Wechsel von kaltem Puffer über eine Zeitdauer von 24 h, um freie und reversible gebundene (Schiff-Base)- Ribose zu entfernen, unterbrochen. Solch eine Ribose-freie Probe wurde dann schnell auf 37ºC ohne Wiederhinzugabe von jeglicher Ribose erwärmt und Proben für die Post-Amadori AGE-Bildung wurden über mehrere Tage hinweg genommen. Die AGE Antigen Produktion von dieser 24 h "unterbrochenen Glycosylierungs"-Probe ist durch die gestrichelte Linie und die offenen Dreiecke in Fig. 7A dargestellt, wobei die Zeit, die in der kalten Dialyse verbracht wurde, nicht eingeschlossen ist. Eine nicht unterbrochenen Kontrolle (durchgehende Linie und gefüllte Kreise) ist ebenfalls zum Vergleich gezeigt. Dramatisch unterschiedliche Kinetiken von Post-Amadori antigener AGE-Bildung sind in den zwei Proben ersichtlich. Die Kinetiken der AGE-Antigenproduktion der Ribose-freien unterbrochenen Probe zeigen nun (1) monoexponentiale Kinetiken mit keiner Induktionsperiode, (2) eine stark verstärkte Rate der antigenen AGE-Bildung, mit bemerkenswerten Halbwertszeiten in der Größenordnung von 10 h und (3) Produktion von Spiegeln von Antigenen, vergleichbar zu denjenigen, gesehen bei langen Inkubationen in dauernder Anwesenheit von Ribose (siehe Fig. 6A). Gleichfalls signifikant zeigen die Daten auch, daß vernachlässigbares AGE-Antigen während der kalten Dialyseperiode gebildet wurde, wie durch den kleinen Unterschied zwischen dem offenen Dreieck und den gefüllten Kreispunkten zur Zeit 1 Tag in Fig. 7A gezeigt. Sehr wenig, falls überhaupt, AGE wurde durch das "Unterbrechungs"-Verfahren selber gebildet. Diese Beobachtungen zeigen, daß ein voll kompetentes isolierbares Intermediat oder Vorläufer zu antigenen AGE während des 24 h Kontakts mit Ribose vor der Entfernung des freien und reversible gebundenen Zuckers erzeugt wurde.

Proben, die nach nur 8 h unterbrochen wurden, produzierten eine finale Menge von AGE- Antigen, die ungefähr 72% der 24 h unterbrochenen Probe war. Proben von RNase, glycosiliert mit nur 0,05 M Ribose und unterbrochen bei 8 h durch kalte Dialyse und. Reinkubation bei 37ºC zeigten weniger als 5% Produktion von ELISA-reaktivem Antigen nach 9 Tagen. Die Unterbrechung bei 24 h produzierte jedoch ein schnellen Anstieg von ELISA-Antigen (ähnlich zu Fig. 7A) auf einen Spiegel, der ungefähr 50% von demjenigen war, der in der nicht unterbrochenen Anwesenheit von 0,05 M Ribose produziert wurde.

Dieselben allgemeinen Unterbrechungseffekte wurden ebenfalls mit anderen Proteinen (BSA und Hämoglobin) gesehen. Außer für einen irgendwie unterschiedlichen absoluten Wert der Ratenkonstanten und der Menge von antigenen AGEs, die während der 24 h 0,5 M Ribose- Inkubation gebildet wurden, wurde dieselbe dramatische Zunahme der Rate der AGE- Antigenbildung nach Entfernen von 0,5 M Ribose beobachtet.

Die Glycosylierung ist sehr viel langsamer mit Glucose als mit Ribose (beachte den Unterschied in den Zeitskalen zwischen Fig. 7A und Fig. 7B). Jedoch, anders als im Fall mit Ribose, produzierte die Unterbrechung nach 3 Tagen der Glycosylierung bei 1,0 M Glucose eine vernachlässigbare Ansammlung von Vorläufer zu ELISA-reaktiven AGE-Antigenen ( Fig. 7, gestrichelte Kurve).

Kinetiken von Pentosidinbildung

Die den ELISA-Tests unterzogenen Proben wurden auch auf die Produktion von Pentosidin, einem Säure-stabilen AGE getestet. Der Gehalt von Pentosidin wurde für dieselben RNase- Proben gemessen, die auf Antikörperreaktivität durch ELISA analysiert wurden. Die Glycosylierung durch Ribose im 4,0 M Phosphatpuffer bei pH 7,5 produzierte Pentosidin in RNase A, das durch Fluoreszenz nach Säurehydrolyse quantifiziert wurde. Fig. 8A zeigt, daß unter nicht unterbrochenen Bedingungen 0,05 M Ribose eine fortschreitende Zunahme an Pentosidin produziert. Jedoch, wenn die Glycosylierung unter "unterbrochenen" Bedingungen unter der Verwendung von 0,5 M Ribose durchgeführt wird, wird eine dramatische Zunahme in der Rate der Pentosidinbildung unmittelbar nach Entfernen von überschüssiger Ribose (Fig. 8B) gesehen, die ähnlich ist zu, jedoch leicht scheller ist als, die Kinetiken des Auftretens von antigenen AGEs (Fig. 7A). Eine größere Menge von Pentosidin wurde ebenfalls mit 24 h Unterbrechung, verglichen mit 8 h, produziert. Reproduzierbare Unterschiede zwischen den Kinetiken der Bildung von Pentosidin und antigenen AGEs können ebenfalls bemerkt werden. Eine signifikante Menge von Pentosidin wird während der 24 h Inkubation gebildet und auch während der kalten Dialyse, was zu einem Sprung der gestrichelten vertikalen Linie in Fig. 8B führt. Unsere Beobachtungen zeigen daher, daß sich ein Pentosidinvorläufer während der Riboseglycosilierung akkumuliert, der nach der Riboseentfernung schnell Pentosidin produzieren kann (vergleiche Odetti et al., 1992, Diabetes 41: 153-159).

Rate der Anhäufung der/des reaktiven Intermediate(s)

Die "unterbrochene Glycosylierung"-Experimente, die oben beschrieben wurden, zeigen, daß ein Vorläufer oder Vorläufer zu beiden Post-Amadori antigenen AGEs und Pentosidin während Glycosylierung mit Ribose akkumuliert werden kann. Die Kinetiken der Bildung von diesen Intermediats können unabhängig durch eine Variation der wie oben beschriebenen Experimente verfolgt und quantifiziert werden. Die Menge von erzeugtem Intermediat in RNase zu verschiedenen Kontaktzeiten mit Ribose kann durch das maximale Ausmaß getestet werden, in dem es antigenes AGE nach Unterbrechung produzieren kann. Zu variablen Zeiten nach dem Beginn der Glycosylierung wird die freie und reversibel gebundene Ribose durch Dialyse im Kalten oder durch schnelle Verdünnung (siehe unten) entfernt. Ausreichende Zeit (5 Tage, was mehrere Halbwertszeiten gemäß zu Fig. 7A darstellt) wird dann ermöglicht, nach Erwärmen auf 37ºC zur maximalen Entwicklung von Post-Amadori antigenen AGEs. Die ELISA-Ablesungen 5 Tage nach jedem Unterbrechungspunkt, die eine maximale AGE- Entwicklung darstellen, würden dann proportional zu der zum Zeitpunkt der Unterbrechung vorhandenen Intermediatkonzentration sein.

Fig. 9 zeigt solch ein Experiment, wobei die Kinetiken von Intermediatansammlung für RNase A in Anwesenheit von 0,5 M Ribose gemessen wurden (gefüllt Symbole und Kurve). Zum Vergleich ist die Menge von vor der Riboseentfernung vorhandenem ALGE ebenfalls gezeigt (offene Symbole und gestrichelte Linien). Wie erwartet (vergleiche Fig. 7A), wird wenig AGE vor der Entfernung (oder Verdünnung) von Ribose gebildet, so daß die ELISA- Ablesungen nach dem 5 Tag sekundärer Inkubationsperioden meist ein Maß von nach der Riboseentfernung gebildetem AGE sind. Die Ergebnisse in Fig. 9 zeigen, daß die Rate der Anhäufung von Intermediat in 0,5 M Ribose exponentiell und sehr schnell ist, mit einer Halbwertszeit von ungefähr 3,3 h. Dies ist ungefähr 3-fach schneller als die beobachtete Rate der Konversion des Intermediats zu antigenen AGEs nach Unterbrechung (offene Symbole und gestrichelte Kurve Fig. 7A).

In diesen Experimenten wurde die Entfernung von Ribose zu jeder Unterbrechungszeit durch 100-fache Verdünnung erhalten und nicht durch Dialyse. Einfache Verdünnung reduzierte die Konzentration von Ribose von 0,05 M auf 0,005 M. Es wurde unabhängig bestimmt (Fig. 6A), daß wenig AGE in diesen Zeitabschnitt mit der restlichen 5 mM Ribose produziert wird. Dieser Verdünnungsansatz wurde primär durch den Bedarf an quantitativer Punkt-zu-Punkt- Genauigkeit bestimmt. Solche Genauigkeit hätte nicht durch das Dialyseverfahren erreicht werden können, das unabhängig für jede Probe zu jedem Unterbrechungspunkt ausgeführt würde. Unsere Ergebnisse zeigen, daß Verdünnung äquivalent zu Dialyse war.

Ein unabhängiges Kontrollexperiment (siehe Fig. 10 unten) zeigte, daß die sofortige 100- fache Verdünnung nahezu identische Ergebnisse zu dem Dialyseverfahren ergab. Diese Kontrollexperimente zeigen, daß das reversible Ribose-Protein-Bindungs-(Schiff-Base Äquilibrium auf dieser Zeitskala sehr schnell ist. Dies steht in Übereinstimmung mit den Daten von Bunn und Higgins (1981, Science 213: 222-224), die zeigten, daß die Halbwertszeit der Schiff-Basebildung 0,5 M Ribose in der Größenordnung von ein paar Minuten liegen sollte. Die 100-fache schnelle Verdünnungsmethode, um Ribose zu reduzieren, ist ein gültiges Verfahren, wo quantitative Genauigkeit essentiell ist und nicht durch mehrfache Dialyse von vielen Proben erhalten werden kann.

Direkte Inhibierung von Post-Amadori AGE-Bildung von dem Iniermediat durch Ribose und Glucose

Die Zunahme in der Rate der AGE-Bildung nach Unterbrechung und Zuckerverdünnung läßt vermuten, beweist jedoch nicht, daß hohe Konzentrationen von Ribose die Reaktion an oder nach dem ersten "stabilen" Intermediat, vermutlicherweise dem Amadori-Derivat (in Schema I eingekästelt), inhibieren. Ein Test darauf wurde dann durch Untersuchen des Effekts von der direkten Zugabe von Ribose auf die Post-Amadori-Reaktion durchgeführt. RNase wurde zuerst für 24 h in 0,5 M Ribose inkubiert, um das Intermediat herzustellen. Zwei Protokolle wurden dann durchgeführt, um eine mögliche Inhibierung der Post-Amadori-Bildung auf antigene AGEs durch verschiedene Konzentrationen von Ribose zu messen. Im ersten Experiment wurde die 24 h ribierte Probe einfach 100-fach in Lösungen verdünnt, die verschiedene finale Konzentrationen von Ribose in einem Bereich von 0,005 M bis 0,505 M (Fig. 10A) enthielten. Die Rate und das Ausmaß der AGE-Bildung können klar als durch zunehmende Ribosekonzentration abnehmend gesehen werden. Signifikant scheinen die Kinetiken bis zu der höchsten Konzentration von 0,5 M Ribose exponentiell zu sein und nicht die Induktionsperiode zu zeigen, die bei nicht unterbrochener Glycosylierung (Fig. 6A und 7A) bei hohen Ribose-Konzentrationen auftritt.

Ein zweites Experiment (Fig. 10B) wurde ebenfalls durchgeführt, in dem die 24 h unterbrochene Probe extensiv in der Kälte dialysiert wurde, um freie und reversibel gebundene Ribose freizusetzen, sowie jede inhibitorischen Produkte, die sich während der 24 h Inkubation mit Ribose gebildet haben könnten. Im Anschluß an dieses wurden Aliqots 100-fach in verschiedenen Konzentrationen von frisch hergestellter Ribose verdünnt, und die Bildung von antigenen AGE-Produkten wurde wie oben verfolgt. Diese Ergebnisse waren nahezu zu dem Experiment von Fig. 10A identisch, wo der Dialyseschritt ausgelassen wurden. In beiden Fällen wurde die Rate und das Ausmaß der AGE-Bildung durch zunehmende Konzentrationen von Ribose verringert, und die Kinetiken scheinen exponentiell mit keiner Induktionsperiode zu sein.

Die Frage, ob Glucose oder andere Zucker auch die Bildung von AGEs aus dem reaktiven Intermediat, das durch unterbrochene Glycosylierung in 0,5 M Ribose erhalten wurde, inhibieren können, wurde ebenfalls untersucht. Die Effekte von Glucose bei Konzentrationen von 1,0-2,0 M wurden getestet (Daten nicht gezeigt). Glucose war klar nicht so inhibitorisch, wie Ribose. Wenn die 24 h unterbrochene Riboseprobe 100-fach in diese Glucoselösungen verdünnt wurde, wurde die Menge von antigenem AGE, daß gebildet wurde, um ungefähr 30% verringert, jedoch gab es nur geringe Abnahme in der ersichtlichen Ratenkonstante. Wiederrum schienen die Kinetiken exponentiell zu sein.

Effekt von pH auf Post-Amadori-Kinetiken der AGE-Bildung

Das unterbrochene Glycosylierungsverfahren wurde verwendet, um die pH-Abhängigkeit der Post-Amadori-Kinetiken der AGE-Bildung von dem reaktiven Intermediat zu untersuchen. In diesen Experimenten wurde RNase A zuerst für 24 h mit 0,5 M Ribose bei pH 7,5 reagiert, um das reaktive Intermediat zu erzeugen. Die Kinetiken des Abbaus des Intermediats zu AGEs wurden dann durch ELISA gemessen. Fig. 11 zeigt, daß ein extrem weiter pH- Bereich von 5,0-9,5 erhältlich war, wenn die Kinetiken durch Ausgangsraten gemessen wurden. Eine bemerkenswerte glockenförmige Abhängigkeit wurde beobachtet, die anzeigt, daß die Kinetiken der antigenen AGE-Bildung bei sowohl sauren als auch alkalischen pH- Bereichen abnahmen, mit einem Optimum nahe pH 8.

Ein einzelnes "pH-Sprung"-Experiment wurde ebenfalls mit der pH 5,0-Probe, die oben untersucht wurde, die die langsamste Rate der antigenen AGE-Bildung aufwies, durchgeführt. Nach 12 Tagen bei 37ºC in pH 5,0-Puffer wurde der Puffer schnell auf 7,5 eingestellt und die antigene AGE-Bildung wurde durch ELISA überwacht. Innerhalb des experimentellen Fehlers zeigte die Probe identische Kinetiken (dieselbe Ratenkonstante erster Ordnung) der AGE- Bildung zu unterbrochenen Glycosylierungsproben, die direkt bei pH 7,5 untersucht wurden (Fig. 12). In diesem Experiment konnten die relativen Mengen von antigenen AGE nicht direkt auf derselben ELISA-Platte verglichen werden, jedoch schien die pH-Sprungprobe wesentliche, obwohl irgendwie verringerte, Spiegel von antigenen AGEs gebildet zu haben. Diese Ergebnisse zeigen, daß Intermediate frei von AGE hergestellt werden können und bei pH 5 zur späteren Untersuchung der Konversion zu AGEs gelagert werden könnten.

Inhibierung von Post-Amadori AGE-Bildung durch Aminoguanidin

Die Effizienz von Aminoguanidin wurde durch dieses unterbrochene Glycosylierungsverfahren getestet, d. h., durch Testen seines Effekts auf die Post-Amadori-Bildung von antigenen AGEs nach Entfernung von überschüssiger und reversibel gebundener Ribose. Fig. 20A zeigt, daß Aminoguanidin moderate Effekte auf das Blockieren der Bildung von antigenen AGEs in RNase unter diesen Bedingungen hat, mit geringer Inhibierung unterhalb von 50 mM. Ungefähr 50% Inhibierung wird nur bei oder oberhalb von 100-250 mM erhalten. Beachte nochmals, daß in diesen Experimenten das Protein gegenüber Aminoguanidin nur nach Unterbrechung und Entfernen von freier und reversibel gebundener Ribose ausgesetzt wurde. Vergleichbare Ergebnisse wurden ebenfalls mit der unterbrochenen Glycosylierung von BSA (Fig. 20B) erhalten.

Aminosäureanalyse von unterbrochenen Glycosylierungsproben

Die Aminosäureanalyse wurde an RNase nach 24 h Kontakt mit 0,5 M Ribose (nicht dialysiert) durchgeführt, nach extensiver Dialyse der 24 h glycosilierten Probe und nach 5 Tagen von Inkubation der letztgenannten Probe bei 37ºC. Diese Bestimmungen wurden nach Natriumcyanborhydrid-Reduktion durchgeführt, was die auf Lysinen oder der terminalen Aminogruppe vorhandene Schiff-Base reduziert. Alle drei Proben, normalisiert auf Alanin (12 Reste), zeigten denselben restlichen Lysingehalt (4,0 ± 0,5 von den anfänglichen 10 in RNase). Dieses zeigt, daß nach 24 h Kontakt mit 0,5 M Ribose die meisten der gebildeten Schiff- Basenaddukte zu Amadori- oder folgenden Produkten konvertiert wurden. Keine Arginin- oder Histidinreste wurden durch Modifikation verloren.

Diskussion

Die Verwendung von schnell reagierender Ribose und die Entdeckung seiner reversiblen Inhibierung von Post-Amadori-Schritten erlaubten die Aufteilung und Bestimmung der Kinetiken von verschiedenen Schritten der Proteinglycosilierung in RNase. Die meisten früheren kinetischen Studien der Protein "glycosilierung" wurden aktuell auf die "frühen" Schritte der Schiff-Basebildung und das anschließende Amadori Rearrangement begrenzt. Einige kinetische Studien wurden durchgeführt, die mit synthetisierten Fructosylaminen, d. h. kleinen Modell-Amadori-Verbindungen von Glucose begannen (Smith and Thornally, 1992, Eur. J. Biochem. 210: 729-739, und die darin zitierten Referenzen), jedoch waren solche Untersuchungen, mit wenigen Ausnahmen, bis heute nicht mit Proteinen möglich. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist die Demonstration durch Monnier (Odetti et al., 1992, supra), das BSA, partiell mit Ribose glycosiliert, schnell Pentosidin nach Ribose-Entfernung produzieren kann. Die größere Reaktivität von Ribose hat sich auch als ein wesentlicher Vorteil bei der quantitativen Definition des Zeitverlaufs der AGE-Bildung erwiesen. Es ist zu bemerken, daß Glucose und Ribose beide in der Lage sind, ähnliche AGE-Produkte zu produzieren, wie zum Beispiel Pentosidin (Grandhee & Monnier, 1991, supra; Dyer et al. 1991, supra), und einige ¹³C NMR Modell-Verbindungsarbeit wurde mit ADP-Ribose durchgeführt (Cervantes-Laurean et al., 1993, Biochemistry 32: 1528-1534). Die vorliegende Arbeit zeigt, daß antigene AGE-Produkte von Ribose vollständig mit anti-AGE-Antikörpern, die gegen Glucose-modifizierte Proteine gerichtet sind, kreuzreagieren, was vermuten läßt, daß Ribose und Glucose ähnliche antigene AGEs produzieren. Die primären kinetischen Unterschiede, die zwischen diesen zwei Zuckern beobachtet wurden, liegen möglicherweise eher an relativen Unterschieden in den Ratenkonstanten von Schritten, die zu Post-Amadori AGE-Bildung führen, als im Mechanismus.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen eine deutliche und paradoxe Inhibierung der insgesamten AGE-Bildung durch hohe Konzentrationen von Ribose (Fig. 6), die in früheren Untersuchungen nicht vorgeschlagen wurde. Diese Inhibierung ist in der Hinsicht, daß sie durch Dialyse von anfänglich modifiziertem Protein (Fig. 7A) oder durch einfache 100-fache Verdünnung (wie in Fig. 11 verwendet) entfernt wird. Die Experimente von Fig. 10 zeigen, daß sie nicht an der Anhäufung von dialysierbaren inhibitorischen Intermediaten während der anfänglichen Glycosylierung liegt, weil die Dialyse von 24 h modifiziertem Protein, gefolgt von der Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von frischer Ribose, dieselbe Inhibierung induziert. Die Daten von Fig. 10A, B zeigen, daß die Inhibierung durch reversible und schnelle Interaktion von Ribose mit Proteinintermediat, das reaktive Amadori-Produkte enthält, auftritt. Die Inhibierung läßt sich unwahrscheinlich auf die frühe Stufe der Bildung von Amadori-Produkt anwenden, aufgrund der schnellen Rate der Bildung des vermuteten Amadori-Intermediats, die in dem Experiment von Fig. 9 bestimmt wurde. Die Identifizierung des reaktiven Intermediats als ein Amadori-Produkt wird durch die durchgeführte Aminosäureanalyse (nach Natriumcyanborhydrat-Reduktion) vor und nach Dialyse an dem 24 h Unterbrechungspunkt gut unterstützt. Der unveränderte restliche Lysingehalt zeigt, daß alle entladbaren Schiff-Basen bereits 24 h Zeit irreversibel konvertiert wurden (vermutlicherweise durch Amadori-Rearrangement).

Die sekundäre Ribosesuppression der "späten", jedoch nicht der "frühen" Glycosylierungsschritte verstärkt die Anhäufung eines voll-kompetenten reaktiven Amadori-Intermediats, das wenig AGE enthält, signifikant. Seine Isolierung durch das Unterbrechungsverfahren ist von Wichtigkeit für kinetische und strukturelle Studien, weil es einem erlaubt, Untersuchungen in der Abwesenheit von freien oder Schiff-Base gebundenen Zucker und deren damit zusammenhängenden Reaktion und Komplikationen durchzuführen. Zum Beispiel wurden die Post- Amadori-Konversionsraten zu antigenem AGE und Pentosidin-AGE-Produkten gemessen (Fig. 7A, offene Symbole und Fig. 8B) und als viel schneller gezeigt (t 1/2 ~ 10 h) als in den Gesamtkinetiken unter nicht unterbrochenen Bedingungen (Fig. 6A und Fig. 8A) wiedergegeben. Die schnelle Bildung von Pentosidin, die gemessen wurde, scheint mit einem früheren unterbrochenen Riboseexperiment an BSA durch Odetti et al. (1992, supra) konsistent. Weil Ribose und Derivate, wie zum Beispiel ADP-Ribose normale Metaboliten sind, lassen die wie hier gesehenen sehr hohen Raten der AGE-Bildung vermuten, daß sie als Quellen von potentieller Glycosylierung in verschiedenen zellulären Kompartimenten ernsthafter betrachtet werden sollten (Cervantes-Laurean et al., 1993, supra), obwohl ihre Konzentrationen weit unterhalb denjenigen der weniger reaktiven Glucose liegen.

Eine andere neue Anwendung der Isolierung von Intermediat ist die Untersuchung der pH- Abhängigkeit dieser komplexen Reaktion. Das ungewöhnliche glockenförmige pH-Profil, das für die Post-Amadori AGE-Bildung (Fig. 11) gesehen wurde, steht in deutlichem Kontrast zu der milden pH-Abhängigkeit der Gesamtreaktion. Die letztgenannten Kinetiken spiegeln einen zusammengesetzten Effekt des pH auf alle Schritte in der Reaktion wieder, einschließlich Schiff-Base- und Amadori-Produkt-Bildung, die beide eine einzelne ph-Abhängigkeit haben könnten. Diese Komplexität wird besonders gut durch Studien von Hämoglobin- Glycosylierung verdeutlicht (Lowery et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 11611-11618). Das glockenförmige pH-Profil läßt vermuten, beweist jedoch nicht, die Beteiligung von zwei ionisierenden Gruppen. Falls dies wahr ist, lassen die Daten die Teilnahme einer zweiten Aminogruppe vermuten, wie zum Beispiel von einem benachbarten Lysin, bei der Bildung von dominanten antigenen AGEs. Die beobachteten pH-Profile und die pH-Sprungbeobachtungen, die beschrieben wurden, lassen vermuten, daß eine brauchbare Route zur Isolierung und Beibehaltung des reaktiven Intermediats durch die schnelle Verringerung des pH auf nahezu 5,0 nach 24 h Unterbrechung wäre.

Die kinetischen Untersuchungen stellen neue Einsichten in die Mechanismen der Aktion von Aminoguanidin (Guanylhydrazin) zur Verfügung, einem durch Cerami und Mitarbeiter vorgeschlagenen AGE-Inhibitor, mit Amadori-Intermediaten zu kombinieren (Brownlee et al., 1986, supra). Dieses vorgeschlagene pharmakologische Mittel befindet sich nun in Phase III klinischen Versuchen auf mögliche therapeutische Effekte bei der Behandlung von Diabetes (Vlassara et al., 1994, supra). Jedoch ist sein Mechanismus der AGE-Inhibierung möglicherweise ziemlich komplex, da er multifunktional ist. Als ein nukleophiles Hydrazin kann es reversibel zu aktiven Carbonylen addieren, einschließlich Aldehydcarbonylen von offenkettiger Glucose und Ribose (Khatami et al., 1988, Life Sci. 43: 1725-1731; Hirsch et al., 1995, Carbohyd. Res. 267: 17-25) sowie Ketocarbonylen von Amadori-Verbindungen. Es ist ebenfalls eine Guanidiumverbindung, die hoch reaktive Dicarbonyl- Glycosylierungsintermediate, wie zum Beispiel Glyoxal und Glucosone, abfangen kann (Chen & Cerami, 1993, J. Carbohyd. Chem. 12: 731-742; Hirsch et al., 1992, Carbohyd. Res. 232: 125-130; Ou & Wolff, 1993, Biochem. Pharmacol. 46: 1139-1144). Das unterbrochene Glycosylierungsverfahren ermöglichte die Untersuchung von Aminoguanidineffizienz auf nur Post-Amadori-Schritte der AGE-Bildung. Gleichfalls wichtig ermöglichte es Untersuchungen in der Abwesenheit von freiem Zucker oder Dicarbonyl-reaktiven Fragmenten von freiem Zucker (Wolff & Dean, 1987, Biochem. J. 245: 243-250; Wells-Knecht et al., 1995, Biochemistry 34: 3702-3709), die mit Aminoguanidin kombinieren können. Die Ergebnisse von Fig. 20 zeigen, daß Aminoguanidin bestenfalls nur einen moderaten Effekt auf die Post-Amadori AGE-Bildungsreaktionen aufweist, wobei 50% Inhibierung oberhalb von 100-250 mM erhalten werden. Die Effizienz ergibt sich daher vorherrschend von entweder der Inhibierung von frühen Schritten der Glykosylierung (Shiff-Basebildung) oder vom Abfangen hochreaktiver Dicarbonyle, die während der Glykosylierung erzeugt werden. Im Gegensatz zu den anfänglichen Ansprüchen, scheint es nicht die AGE-Bildung durch Komplexieren der Amadori- Intermediate zu inhibieren.

Die Verwendung von unterbrochener Glykosylierung ist nicht auf kinetische Studien begrenzt. Die unterbrochene Glykosylierung kann strukturelle Untersuchungen von glykosylierten Proteinen und die Identifizierung von unbekannten AGEs unter der Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel ¹³C NMR, die dazu verwendet wurde, um Amadori-Addukte von RNase nachzuweisen, zu vereinfachen (Neglia et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 14279- 14283; 1985, J. Biol. Chem. 260: 5406-5410). Die kombinierte Verwendung von strukturellen und kinetischen Ansätzen sollte ebenfalls von besonderem Interesse sein. Zum Beispiel, obwohl die Identität der dominanten antigenen AGEs, die mit den polyklonalen Antikörpern reagieren, unsicher bleibt, sollten Kandidaten-AGEs, wie zum Beispiel das kürzlich vorgeschlagene (Carboxymethyl)lysin (Reddy et al., 1995, Biochemistry 34: 10872-10878; vergl. Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133-5138) dieselben Kinetiken der Bildung von dem reaktiven Intermediate aufweisen, wie wir sie beobachtet haben. Die Erhältlichkeit des unterbrochenen Kinetiken-Ansatzes wird ebenfalls helfen, die Wichtigkeit des Amadori- Synethesewegs für die Bildung von diesem AGE nachzuweisen. Ähnlich sollte die Überwachung der unterbrochenen Glykosylierungsreaktion durch Techniken, wie zum Beispiel ¹³C NMR, Resonanzen von anderen Kandidaten antigenen AGEs identifizieren, als solche, die ähnliche Kinetiken des Auftretens zeigen. Tabelle I listet die ¹³C NMR Peaks des Amadori- Intermediats von RNase auf, das durch Reaktion mit C-2 angereicherter Ribose hergestellt wurde. Der "downfield" Peak nahe 205 ppm liegt möglicherweise an dem Carbonyl des Amadori-Produkts. In allen Fällen wird die Fähigkeit, überschüssige freie und Shiff- Basenzucker durch unterbrochene Glykosylierung zu entfernen, die Isolierung, Identifizierung und strukturelle Charakterisierung erheblich vereinfachen.

Tabelle I listet die Peaks auf, die dem Post-Amadori-Intermediat aufgrund ihrer invarianten oder abnehmenden Intensität über die Zeit hinweg zugeordnet wurden. Die Peak-Positionen sind als ppm downfield von TMS aufgeführt.

Tabelle I 125MHz C-13 NMR Resonanzen von Ribonuklease Amadori-Intermediat, hergestellt durch 24 HR-Reaktion mit 99% [2-C13]Ribose

Ribonuklease A wurde für 24 h mit 0,5 M Ribose 99% angereichert an C-2, reagiert, wonach überschüssige und Shiff-Base gebundene Ribose durch extensive Dialyse in der Kälte entfernt wurde. Die Probe wurde dann auf 37ºC zurückerwärmt, unmittelbar bevor ein 2 h NMR-Scan aufgenommen wurde. Die Signale von RNase, reagiert mit natürlich vorkommender Ribose unter identischen Bedingungen, wurden dann von dem NMR-Spektrum abgezogen. Daher resultieren alle gezeigten Peaks auf angereichertem C-13, das von der C-2-Position abstammte. Einige der Peaks stammen von Abbauprodukten des Intermediats und diese können durch die Zunahme in der Peak-Intensität über die Zeit hinweg identifiziert werden. Fig. 31 zeigt das erhaltene NMR-Spektrum.

Beispiel 3 In vitro Inhibierung der Bildung von antigenem fortgeschrittenem Glykosylfierungs-Endprodukten (AGEs) durch Derivate von Vitaminen B&sub1; und B&sub6; und Aminoguanidin. Die Inhibierung von Post-Amadori Kinetiken unterscheidet sich von der von Gesamtglykosylierung

Das unterbrochene Glycosylierungs-Verfahren zur Verfolgung von Post-Amadori Kinetiken der AGE-Bildung erlaubt die schnelle quantitative Untersuchung von "späten" Phasen der Glykosylierungsreaktion. Wichtiger Weise erlaubt dieses Verfahren die Durchführung von Inhibierungsstudien, die frei von Reaktionswegen der AGE-Bildung sind, die von glycoxidativen Produkten von freiem Zucker oder Schiff-Base (Namiki Syntheseweg) sind, wie in Schema I gezeigt. Daher ermöglicht das unterbrochene Glykosylierungsverfahren die schnelle und einmalige Identifizierung und Charakterisierung von Inhibitoren von "späten" Phasen der Glykosylierung, die zu antigener AGE-Bildung führen.

Unter dem untersuchten Vitamin B&sub1; und B&sub6; Derivaten sind Pyridoxamin und Thiaminphosphat einmalige Inhibitoren des Post-Amadori Reaktionswegs der AGE-Bildung. Wichtiger Weise wurde gefunden, daß die Effizienz der Inhibierung der gesamten Glykosylierung von Protein, in Anwesenheit von hohen Zuckerkonzentrationen, keine Vorhersage für die Fähigkeit ist, die Post-Amadori-Schritte der AGE-Bildung zu inhibieren, wenn der freie Zucker entfernt wird. Daher, während Pyridoxamin, Thiaminphosphat und Aminoguanidin potente Inhibitoren der AGE-Bildung bei der insgesamten Glykosylierung von Protein durch Glukose sind, unterschiedet sich Aminoguanidin von den anderen zweien darin, daß es kein effektiver Inhibitor von Post-Amadori AGE-Bildung ist. Aminoguanidin verlangsamt die Anfangsrate der AGE-Bildung durch Ribose unter nicht unterbrochenen Bedingungen deutlich, hat jedoch keinen Effekt auf die finalen Spiegel von produzierten antigenen AGEs. Die Untersuchung von verschiedenen Proteinen (RNase, BSA und Hämoglobin) bestätigte, daß die Inhibierungsergebnisse im allgemeinen nicht für das verwendete Proteine spezifisch sind, obwohl es individuelle Variationen in den Raten der AGE-Bildung und Inhibieruüg gibt.

Chemikalien und Materialien - Wie in Beispiel 1 oben.

Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGEs.

Wie in Beispiel 1 oben.

ELISA-Nachweis von AGE-Produkten - Wie in Beispiel 1 oben.

Nicht-unterbrochene Ribose-Glykosylierungstests - Rinderserumalbumin, Ribonuklease A und menschliches Hämoglobin wurden mit Ribose bei 37ºC in 0,4 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5, enthaltend 0,02% Natriumazid, inkubiert. Das Protein (10 mg/ml oder 1 mg/ml), 0,05 M Ribose und voraussichtliche Inhibitoren (bei 0,5, 3, 15 und 50 mM) wurden gleichzeitig in das Inkubationsgemisch eingeführt. Die Lösungen wurden im Dunkeln in zugedeckelten Röhrchen gehalten. Aliquots wurden abgenommen und sofort eingefroren, bis sie durch ELISA am Schluß der Reaktion analysiert wurden. Die Inkubation waren für 3 Wochen (Hb) oder 6 Wochen (RNase, BSA). Die Glykosylierungsreaktionen wurden auf konstanten pH während der Dauer der Experimente überwacht.

Unterbrochene (Post-Amadori) Ribose-Glykosylierungstests

Die Glykosylierung wurde zuerst durch Inkubieren von Protein (10 mg/ml) mit 0,5 M Ribose bei 37ºC in 0,4 M Phosphatpuffer bei pH 7,5, enthaltend 0,2% Natriumazid für 24 h in der Abwesenheit von Inhibitoren durchgeführt. Die Glykosylierung wurde dann durch Entfernen von überschüssigem und reversibel gebundenem (Schiff-Base) Zucker durch extensive Dialyse gegen häufige kalte Pufferwechsel bei 4ºC unterbrochen. Die glykosylierten Intermediat- Proben, die maximale Mengen von Amadori-Produkt und wenig AGE enthielten (abhängig vom Protein) wurden dann schnell auf 37ºC ohne erneutes Hinzufügen von Ribose erwärmt. Dies initierte die Umwandlung von Amadori-Zwischenprodukten zu AGE-Produkten in der Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen (typischerweise 3, 15 und 50 mM) von möglichen Inhibitoren. Aliquots wurden zu verschiedenen Intervallen zur späteren Analyse abgenommen und eingefroren. Die Lösungen wurden in zugedeckelten Röhrchen gehalten und nur geöffnet, um zeitlich abgestimmte Aliquots zu entfernen, die unmittelbar eingefroren wurden um später die verschiedenen Analysen durchzuführen.

Numerische Analyse von kinetischen Daten

Kinetische Daten (Zeit-fortschreitende Kurven) wurden routinemäßig an mono- oder biexponentielle Funktionen unter der Verwendung von nicht linearen Verfahren der besten Annäherung unter der Verwendung von entweder SCIENTIST 2.0 (MicroMath, Inc.) oder ORIGIN (Microcal, Inc.) Software angepaßt, die Benutzer-definierte Funktionen und die Kontrolle von Parametern erlaubt, auf die iteriert werden soll. Die Standardabweichungen der Parameter der angepaßten Funktionen (aufgängliche und finale Ordinatenwerte und Ratenkonstanten) wurden als Maß der Genauigkeit der Anpassungen zurückerhalten. Ungefähre Halbwertszeiten für biexponentielle Kinetikanpassungen wurden mit der "solve"-Funktion von MathCad Software (MathSoft, Inc.) bestimmt.

ERGEBNISSE Inhibierung der Gesamtkinetiken der AGE-Bildung von Ribose durch Vitamin B&sub6;-Derivate.

Die inhibitorischen Effekte von Vitamin B&sub1; und B&sub6; Derivaten auf die Kinetiken der antigenen AGE-Bildung wurden durch für AGEs spezifische polyklonale Antikörper evaluiert. Ausgangs-Inhibierungsstudien wurden an der Glykosylierung von Rinderribonuklease A (RNase) in der kontinuierlichen Anwesenheit von 0,05 M Ribose durchgeführt, was diejenige Konzentration von Ribose ist, bei der die Rate der AGE-Bildung nahezu maximal ist. Fig. 13 (Kontrollkurven, gefüllte Dreiecke) zeigt, daß die Bildung von antigenen AGEs auf RNase, wenn mit 0,05 M Ribose inkubiert, relativ schnell ist, mit einer Halbwertszeit von ungefähr 6 Tagen unter diesen Bedingungen. Pyridoxal-5'-phosphat (Fig. 13B) und Pyridoxal (Fig. 13C) inhibierten die Rate der AGE-Bildung auf RNase bei Konzentrationen von 50 mM und 15 mM signifikant. Überraschenderweise inhibierte Pyridoxin, die Alkoholform von Vitamin B&sub6; auch die AGE-Bildung auf RNase (Fig. 13D) moderat. Von den untersuchten B&sub6; Derivaten war Pyridoxamin bei 50 mM der beste Inhibitor der "finalen" von auf RNase gebildeten AGE über die 6-Wochen Zeitperiode hinweg, die überwacht wurde (Fig. 13A).

Inhibierung der Gesamtkinetiken von AGE-Bildung von Ribose durch Vitamin B&sub1; Derivate

Alle der B&sub1; Vitamere inhibierten die antigene AGE-Bildung auf RNase bei hohen Konzentrationen, jedoch scheint die Inhibierung komplexer, als für die B&sub6; Derivate (Fig. 14A-C). Im Fall von Thiaminpyrophosphat als dem Inhibitor (Fig. 14A) schienen sowohl die Rate der AGE-Bildung und die finalen Spiegel von produziertem AGE bei dem Plateau verringert. Im Fall von Thiaminphosphat als dem Inhibitor (Fig. 14B) und Thiamin (Fig. 14C) schien wenig Effekt auf die Rate der AGE-Bildung vorhanden zu sein, jedoch eine substantielle Abnahme in den finalen Spiegeln von gebildetem AGE in Anwesenheit der höchsten Konzentration von Inhibitor. Im allgemeinen zeigte Thiaminpyrophosphat bei den untersuchten geringeren Konzentrationen eine größere Inhibierung, als die anderen zwei Verbindungen.

Inhibierung der Gesamtkinetiken der AGE-Bildung von Ribose durch Aminoguanidin

Die Inhibierung der AGE-Bildung durch Aminoguanidin (Fig. 14D) war deutlich unterschiedlich von der, die in den B&sub1; und B&sub6; Experimenten gesehen wurde. Ansteigende Konzentration von Aminoguanidin ließ die Rate der AGE-Bildung bei RNase abnehmen, reduzierte jedoch nicht den finalen Spiegel von gebildetem AGE. Der finale Spiegel von gebildetem AGE nach den 6-Wochen war für alle getesteten Konzentrationen von Aminoguanidin nahezu identisch zu dem der Kontrolle.

Inhibierung der Gesamtkinetiken der AGE-Bildung in Serumalbumin und Hämoglobin von Ribose

Vergleichende Studien wurden mit BSA und menschlichem Methämoglobin (Hb) durchgeführt, um zu bestimmen, ob die beobachtete Inhibierung Protein-spezifisch war. Die verschiedenen Derivate von Vitamin B&sub6; (Fig. 15A-D) und Vitamin B&sub1; (Fig. 16A-C) zeigten ähnliche Inhibierungstrends, wenn mit BSA wie mit RNase inkubiert, wobei Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat die am meisten effektiven Inhibitoren der Familie sind. Pyridoxin versagte, die AGE-Bildung auf BSA zu inhibieren (Fig. 15D). Pyridoxalphosphat und Pyridoxal (Fig. 15B-C) inhibierten die Rate der AGE-Bildung meistens, jedoch nicht die finalen Spiegel von gebildetem AGE. Pyridoxamin (Fig. 15A) zeigte einige Inhibierung bei niedrigeren Konzentrationen und schien bei der höchsten getesteten Konzentration die finalen Spiegel von gebildetem AGE effektiver zu inhibieren, als jedes der anderen B&sub6; Derivate. Im Fall von B&sub1; Derivaten war das Gesamtausmaß der Inhibierung von AGE-Bildung mit BSA (Fig. 16A-C) weniger als das mit RNase beobachtete (Fig. 14A-C). Höhere Konzentrationen von Thiamin und Thiaminpyrophosphat inhibierten die finalen Spiegel von gebildeten AGEs, ohne die Rate der AGE-Bildung groß zu beeinträchtigen (Fig. 16C). Aminoguanidin zeigte wiederum dieselben inhibitorischen Effekte mit BSA, wie mit RNase gesehen (Fig. 16D), wobei die Rate der AGE-Bildung verlangsamt zu sein schien, ohne die finalen Spiegel von gebildetem AGE signifikant zu beeinträchtigen.

Die Kinetiken der AGE-Bildung wurde ebenfalls unter der Verwendung von Hb in Anwesenheit der B&sub6; und B&sub1; Vitaminderivate und Aminoguanidin untersucht. Die ersichtlichen absoluten Raten der AGE-Bildung waren mit Hb signifikant höher als mit entweder RNase oder BSA. Jedoch zeigten die getesteten Inhibitoren ein im wesentlichen ähnliches Verhalten. Die Effekte der Vitamin B&sub6;-Derivate sind in Fig. 17 gezeigt. Pyridoxamin zeigte die größte Inhibierung bei Konzentrationen von 3 mM und darüber (Fig. 17A) und war am meisten effektiv, wenn mit Pyridoxalphosphat (Fig. 17B), Pyridoxal (Fig. 17C) und Pyridoxin (Fig. 17D) verglichen. Im Fall der B&sub1;-Vitaminderivate (Daten nicht gezeigt) waren die inhibitorischen Effekte ähnlicher zu den BSA Inhibierungstrends, als zu RNase. Die Inhibierung war bei den höchsten getesteten Konzentrationen (50 mM) nur moderat, wobei sie ungefähr 30- 50% für alle drei B&sub1;-Derivate betrug. Die primäre Manifestation der Inhibierung war bei der Verringerung der finalen Spiegel von gebildetem AGE.

Inhibierung durch Vitamin B&sub6;-Derivate der Kinetiken von Post-Amadori Ribose AGE-Bildung

Unter der Verwendung des unterbrochenen Glycosylierungsmodells, um auf die Inhibierung der "späten" Post-Amadori AGE-Bildung zu testen, wurden Kinetiken durch Inkubation von isolierten Amadori-Intermediaten von entweder RNase oder BSA bei 37ºC in der Abwesenheit von freier oder reversibel gebundener Ribose untersucht. Ribosezucker, der anfangs dazu verwendet wurde die Intermediate herzustellen, wurde durch kalte Dialyse nach einer anfänglichen Glycosylierungsreaktionperiode von 24 h entfernt. Nachdem es der AGE-Bildung erlaubt wurde, weiter fortzuschreiten, ist die Bildung von AGE relativ schnell (Halbwertszeiten von ungefähr 10 h) in Abwesenheit jeglicher Inhibitoren. Fig. 18 zeigt die Effekte von Pyridoxamin (Fig. 18A), Pyridoxalphosphat (Fig. 18B) und Pyridoxal (Fig. 18C) auf die Post- Amadori-Kinetiken von BSA. Pyridoxin produzierte keine Inhibierung (Daten nicht gezeigt).

Ähnliche Experimente wurden an RNase durchgeführt. Pyridoxamin verursachte eine fast vollständige Inhibierung der AGE-Bildung mit RNase bei 15 mM und 50 mM (Fig. 18D). Pyridoxal zeigte keine signifikante Inhibierung bei 15 mM (die Höchste getestete), jedoch zeigte Pyridoxalphosphat signifikante Inhibierung bei 15 mM. Pyridoxalphosphat ist dafür bekannt, in der Lage zu sein das aktive Zentrum von RNase Affinitäts- zu markieren (Raetz and Auld, 1972, Biochemistry 11:2229-2236).

Bei BSA, anders als bei RNase, wird eine signifikante Menge von antigenem AGE während der 24 h anfänglichen Inkubation mit RNase gebildet (25-30%) wie durch die höheren ELISA-Ablesungen nach Entfernen der Ribose zur Zeit Null für Fig. 18A-C belegt. Für beide BSA und RNase scheint sich die Inhibierung, wenn gegeben eher als eine Abnahme in den finalen Spiegeln von gebildetem AGE zu manifestieren, als in einer Abnahme in der Bildungsrate von AGE.

Inhibierung der Kinetiken von Post-Amadori Ribose AGE-Bildung durch Vitamin B&sub1;-Derivate

Thiaminpyrophosphat inhibierte die AGE-Bildung effizienter, als die anderen B&sub1;-Derivate, mit sowohl RNase als auch BSA (Fig. 19). Thiamin zeigte keinen Effekt, während Thiaminphosphat einigen mittleren Effekt zeigte. Wie bei den B&sub6;-Tests, war die Post-Amadori- Inhibierung am deutlichsten als eine Abnahme in den finalen Spiegeln von gebildetem AGE manifestiert.

Effekte von Aminoguanidin und Nα-Acetyl-L-lysin auf die Kinetiken von Post-Amadori Ribose AGE-Bildung

Fig. 20 zeigt die Ergebnisse der Tests von Aminoguanidin auf die Inhibierung von Post- Amadori AGE-Bildungskinetiken mit sowohl BSA als auch RNase. Bei 50 mM war die Inhibierung ungefähr 20% im Fall von BSA (Fig. 20B) und weniger als 15% mit RNase (Fig. 20A). Die Möglichkeit der Inhibierung durch einfache Amino-enthaltende Funktionalitäten wurde ebenfalls unter der Verwendung von Nα-Acetyl-L-lysin (Fig. 21) untersucht, das lediglich eine freie Nε-Aminogruppe enthält. Nα-Acetyl-L-lysin bei bis zu 50 mM versagte, jegliche signifikante Inhibierung von AGE-Bildung zu zeigen.

Diskussion

Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, daß Aminoguanidin ein anscheinend potenter Inhibitor von vielen Manifestationen von nicht-enzymatischer Glycosylierung ist (Brownlee et al., 1986; Brownlee, 1992, 1994, 1995). Die inhibitorischen Effekte von Aminoguanidin auf verschiedene Phänomene, die durch reduzierende Zucker induziert werden, werden weithin als ein Beweis der Beteiligung von Glycosylierung an vielen solchen Phänomenen betrachtet. Aminoguanidin ist vor kurzem in eine zweite Runde von Phase III klinischen Versuchen (als Pimagedin) zur Linderung der Komplikationen von Diabetes, die auf Glycosylierung von Bindegewebeproteinen aufgrund von hohen Spiegeln von Zucker beruhend betrachtet werden, eingetreten.

Daten von der kinetischen Untersuchung von nicht unterbrochener "langsamer" AGE-Bildung von RNase, induziert durch Glucose (Beispiel 1), bestätigten, daß Aminoguanidin ein effektiver Inhibitor ist und identifizierten weiterhin eine Zahl von Derivaten von Vitamin B&sub1; und B&sub6; als gleich oder leicht höher effektive Inhibitoren. Jedoch schien die Inhibierung durch Aminoguanidin unerwarteterweise in ihrem Effekt bei den späteren Phasen der AGE- Bildungsreaktion abzunehmen. Aufgrund der Langsamkeit der Glycosylierung von Protein mit Glucose konnte diese überraschende Beobachtung nicht voll untersucht werden. Weiterhin wurde es vorgeschlagen, daß es Fragen über die Langzeitstabilität von Aminoguanidin gibt (Ou and Wolff, 1993, supra).

Die Analyse unter der Verwendung der sehr viel schnelleren Glycosylierung durch Ribose ermöglichte eine vollständige Beobachtung und Quantifizierung des gesamten Zeitverlaufs von AGE-Bildung während nicht-unterbrochene Glycosylierung von Protein. Die Verwendung von unterbrochener Glycosylierung ermöglichte eine einmalige weitere Isolierung und Untersuchung von nur Post-Amadori antigener AGE-Bildung in der Abwesenheit von freier und reversibel gebundener (Schiff-Base)-Ribose. Der Vergleich der Daten von diesen zwei Ansätzen mit den früheren Glucose-Glycosylierungskinetiken hat neue Einsichten in die Mechanismen und Effektivität von verschiedenen Inhibitoren zur Verfügung gestellt. Fig. 22 zeigt Balkendiagramme, die zusammengefaßte Vergleichsdaten von Prozent-inhibierung bei definierten Zeitpunkten unter der Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Inhibitor darstellen. Fig. 22A stellt die Daten für die Inhibierung nach unterbrochener Glycosylierung von RNase AGE-Bildung in Ribose dar. Fig. 22B stellt die Daten für Inhibierung nach unterbrochener Glycosylierung von BSA-AGE-Bildung durch Ribose dar.

Die Gesamtergebnisse zeigen unzweifelhaft, daß Aminoguanidin die Rate von Post-Amadori antigener AGE-Bildung in der Anwesenheit von Zucker verlangsamt, jedoch wenig Effekt auf die finale Menge von gebildetem Post-Amadori AGE hat. Daher können Beobachtungen, die auf lediglich die anfänglichen "frühen" Phasen der AGE-Bildung begrenzt sind, die eine Effizienz als ein Inhibitor anzeigen, in der Tat, im Hinblick auf die wahre Effizienz der Inhibierung von Post-Amadori AGE-Bildung irreführend sein. Daher gibt die Fähigkeit, einen vollen Verlauf der Reaktion unter der Verwendung von Ribose und unterbrochener Glycosylierung zu beobachten, ein vollständigeres Bild der Effizienz der Inhibierung der Post-Amadori AGE- Bildung.

Beispiel 4 Tiermodell und Untersuchung von in vivo Effekten von AGE-Bildung/Inhibitoren

Hyperglykämie kann in Ratten (innerhalb von ein oder zwei Tagen) durch Verabreichung von Streptozocin (auch bekannt als Streptozotocin, STZ) oder Alloxan schnell induziert werden. Dies hat sich zu einem verbreiteten Modell für Diabetes Melitus entwickelt. Jedoch entwickeln diese Ratten eine Nephropathie nur nach vielen Monaten der Hyperglykämie und normalerweise gerade vor dem Tod durch Endphase Nierenerkrankung (ESRD). Es wird geglaubt, daß diese Pathologie durch die irreversible Glucose-chemische Modifikation von langlebigen Proteinen, wie zum Beispiel Collagen der basalen Membran, verursacht wird. STZ-diabetische Ratten zeigen Albuminurie sehr spät nach der Induktion von Hyperglykämie, bei ungefähr 40 Wochen, normalerweise gerade vor dem Tod.

Aufgrund der dramatisch schnellen Effekte von Ribose, die in den Beispielen oben in vitro gezeigt wurden, wurde versucht, die Effekte von Riboseverabreichung an Ratten und die mögliche Induktion von AGEs durch die schnelle Ribose-Glycosylierung zu untersuchen. Von dieser Untersuchung wurde ein Rattenmodell zur beschleunigten Ribose induzierten Pathologie entwickelt.

Effekte von sehr kurzzeitiger Riboseverabreichung in vivo Phase I Protokoll

Zwei Gruppen von sechs Ratten wurde jeweils an einem Tag entweder verabreicht:

a. 300 mM Ribose (zwei intraperitoneale Infusionen, 6-8 Stunden auseinander, jede 5% des Körpergewichts als ml); oder

b. 50 mM Ribose (eine Infusion).

Die Ratten wurden für 4 Tage mit keiner weiteren Riboseverabreichung gehalten, wobei sie zu dieser Zeit getötet wurden und die folgenden physiologischen Messungen durchgeführt wurden: (i) anfängliches und finales Körpergewicht; (ii) finale Phase Nierengewicht; (iii) anfängliche und finaler Schwanz-Manschetten-Blutdruck; (iv) Kreatininausscheidung pro 100 g Körpergewicht.

Albuminfiltrationsraten wurden nicht gemessen, da keine schnellen Veränderungen anfänglich angenommen wurden. Die nachfolgende Erfahrung mit STZ diabetischen Ratten zeigt, daß die Albuminurie sich sehr spät (vielleicht 40 Wochen) nach der Induktion von Hyperglykämie und gerade bevor die Tiere sterben entwickelt.

Nierenphysiologie-Ergebnisse

a. Finales Körpergewicht und finales Einzelnierengewicht war dasselbe für niedrige und hohe Ribose-Behandlungsgruppen.

b. Der Schwanz-Manschetten-Blutdruck stieg von 66 ± 4 auf 83 ± 3 bei Ratten die mit niedriger Ribose (1 · 50 mM) behandelt wurden und von 66 ± 4 auf 106 ± 5 für Ratten, die mit hoher Ribose (2 · 300 mM) behandelt wurden. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von Fig. 23 gezeigt.

c. Die Kreatininausscheidung, als cc pro 100 g Körpergewicht war (erwarteter Normalbereich ungefähr 1,0-1,2) in einer Dosis-abhängigen Weise auf 0,87 ± 0,15 für die Niedrig-Ribosegruppe verringert und nahezu noch 30% weiter ab auf 0,62 ± 0,13 für die Hoch-Ribosegruppe. Diese Ergebnisse sind im Balkendiagramm von Fig. 24 gezeigt.

Phase I Schlußfolgerung

Eine Ein-Tages-Ribosebehandlung verursachte eine Dosis-abhängige Hypertension, und eine Dosis-abhängige Abnahme in der glomerularen Ausscheidungsfunktion manifestierte sich 4 Tage später. Dies sind signifikante Stoffwechselveränderungen von Diabetes, die bei STZ- diabetischen Ratten nur viel später gesehen werden. Dieses Phänomen kann als auf Ribose irreversibler chemischer Modifikation (Glucosylierung) von Protein in vivo vermutet betrachtet werden.

Effekt von Aussetzen gegenüber höheren Ribosekonzentrationen für eine längere Zeit Phase II Protokoll

Gruppen von Ratten (3-6) wurde intraperitoneal 0,3 M "niedrige Ribose-Dosis" (LR) oder 1,0 M "hohe Ribose-Dosis" (HR) durch zweimal tägliche Injektionen für entweder (i) 1 Tag, (ii) eine "Kurzzeit" (S) von 4 Tagen oder (iii) eine "Langzeit" (L) von 8 Tagen verabreicht. Zusätzlich wurden diese Konzentrationen von Ribose in das Trinkwasser eingeschlossen.

Nierenphysiologie-Ergebnisse

a. Schwanz-Manschetten-Blutdruck stieg in allen Gruppen von Ribose-behandelten Ratten an, was die Phase I-Ergebnisse bestätigte (Fig. 23).

b. Kreatinin-Ausscheidung nahm in allen Gruppen in einer Ribose-Dosis-abhängigen und Zeit-abhängigen Weise ab (Fig. 24).

c. Die Albumin-Effusionsrate (AER) stieg in einer Ribose-abhängigen Weise bei 1-Tag und 4-Tag Exposition signifikant an. Jedoch zeigte sie einiges Absinken an Tag 8 relativ zu Tag 4 in der Hochdosisgruppen, jedoch nicht in der Niedrigdosisgruppe. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von Fig. 25 gezeigt.

d. Die Kreatinin-Ausscheidung pro 100 g Körpergewicht nahm für beide niedrig- und hoch-Ribosegruppen in ungefähr demselben Ausmaß auf eine zeitabhängige Weise (Fig. 24) ab.

Phase II Schlußfolgerung

Ein Aussetzen gegenüber Ribose für so wenig wie 4 Tage führt zur Hypertension und renaler Dysfunktion, wie durch sowohl abnehmende Kreatinin-Ausscheidung und zunehmende Albuminfiltration manifestiert. Diese Veränderungen sind typisch für Diabetes und werden in STZ-diabetischen Ratten zu viel späteren Zeitpunkten gesehen.

Intervention durch zwei neue therapeutische Verbindungen und Aminoguanidin Phase III Protokoll

Sechzig Ratten wurden in 9 verschiedene Gruppen randomisiert, einschließlich denjenigen, die für 8 Tage 1 M Ribose, in Anwesenheit und Abwesenheit von Aminoguanidin, Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat, wie folgt ausgesetzt wurden:

Kontrollgruppen:

(i) keine Behandlung;

(ii) hohe Dosis (250 mg/kg Körpergewicht) von Pyridoxamin ("Verbindung-P");

(iii) hohe Dosis (250 mg/kg Körpergewicht) von Thiaminpyrophosphat ("Verbindung-T" oder "TPP"); und

(iv) niedrige Dosis (25 mg/kg Körpergewicht) von Aminoguanidin ("AG").

Testgruppen:

(i) nur 1 M Ribose-Kochsalz (2 · 9 cc täglich IP für 8 Tage);

(ii) Ribose plus niedrige Dosis ("LP") von Pyridoxamin (25 mg/kg Körpergewicht, injiziert als 0,5 ml mit 9 cc Ribose);

(iii) Ribose plus hohe Dosis ("HP") von Pyridoxamin (250 mg/kg Körpergewicht, injiziert als 0,5 ml mit 9 cc Ribose);

(iv) Ribose plus hohe Dosis ("HT") von Thiaminpyrophosphat (250 mg/kg Körpergewicht, injiziert als 0,5 mg mit 9 cc Ribose); und

(v) Ribose plus niedrige Dosis von Aminoguanidin (25 mg/kg Körpergewicht, injiziert als 0,5 ml mit 9 cc Ribose).

Anders als Phase II wurde keine Ribose im Trinkwasser verabreicht. Die intervenierenden Verbindungen wurden für einen Tag vor der Einführung von Ribose vor-verabreicht.

Nierenphysiologische Ergebnisse

a. Der Blutdruck war sehr leicht erhöht durch die drei Verbindungen allein (Kontrollgruppe); Ribose-erhöhter BP wurde nicht durch die co-Verabreichung von Verbindungen gelindert. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von Fig. 26 gezeigt.

b. Kreatinin-Ausscheidung in Kontrollen war unverändert, außer für TPP, das sie verringerte.

c. Die Kreatinin-Ausscheidung war normalisiert, wenn Ribose mit niedriger Dosis (25 mg/kg) von entweder Aminoguanidin oder Pyridoxamin co-verabreicht wurde. Diese Ergebnisse sind im Balkendiagramm von Fig. 27 gezeigt.

d. Hohe Konzentrationen (250 mg/kg) von Pyridoxamin und TPP zeigten nur teilweisen Schutz gegen die Ribose-induzierte Abnahme bei der Kreatinin-Ausscheidung (Fig. 27).

e. Die Albumin-Effusionsrate (AER) wurde durch Ribose erhöht, sowie durch hohe Dosen von Pyridoxamin und TPP und niedrigen Dosen von Aminoguanidin in der Abwesenheit von Ribose. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von Fig. 28 gezeigt.

f. Die normale Albumin-Effusionsrate wurde durch die co-Verabreichung von niedrigen Dosen von sowohl Aminoguanidin und Pyridoxamin wiederhergestellt. Diese Ergebnisse sind im Balkendiagramm von Fig. 29 gezeigt.

Phase III Schlußfolgerungen

Wie durch die zwei Indizes der renalen Funktion gemesssen, waren Pyridoxamin und Aminoguanidin beide bei 25 mg/kg offensichtlich effektiv und so gleichermaßen, bei der Vorbeugung der Ribose-induzierten Abnahme bei der Kreatinin-Ausscheidung und Ribose- induzierten milden Zunahme an Albuminurie.

(i) Thiaminpyrophosphat wurde nicht bei 25 mg/kg getestet; (ii) Thiaminpyrophosphat und Pyridoxamin bei 250 mg/kg waren teilweise effektiv bei der Vorbeugung der Abnahmen der Kreatinin-Ausscheidung, aber möglicherweise nicht bei der Vorbeugung der milden Proteinurie; (iii) bei diesen sehr hohen Konzentrationen und in der Abwesenheit von Ribose produzierte Thiaminpyrophosphat allein eine Abnahme bei der Kreatinin-Ausscheidung und beide produzierten milde Zunahmen bei Albuminurie.

Zusammenfassung Nierenfunktion und Diabetes

Persistente Hyperglykämie bei Diabetes mellitus führt zu diabetischer Nephropathie in vielleicht einem Drittel von menschlichen Patienten. Klinisch wird diabetische Nephropathie definiert durch die Anwesenheit von:

1. Abnahme der renalen Funktion (beeinträchtigte glomerulare Ausscheidung)

2. eine Zunahme in urinärem Protein (beeinträchtigte Filtration)

3. die gleichzeitige Anwesenheit von Hochdruck.

Die renale Funktion hängt vom Blutfluß (nicht gemessen) und der glomerolaren Ausscheidung ab, die durch entweder die Inulin-Ausscheidung (nicht gemessen) oder KreatininAusscheidung gemessen werden kann. Die glomerulare Permeabilität wird durch die Albuminfiltrationsrate gemessen, jedoch ist dieser Parameter ziemlich variabel. Er ist auch eine Log- Verteilungsfunktion: eine hundertfache Zunahme bei der Albuminexkretion stellt lediglich eine zweifache Abnahme der Filtrationskapazität dar.

Ribose diabetisches Rattenmodell

Durch die oben genannten Kriterien scheint Ribose sehr schnell Manifestationen von diabetischer Nephropathie zu induzieren, wie durch Hypertension, Kreatinin-Ausscheidung und Albuminurie wiedergespiegelt, obwohl die Letztere nicht groß ist. In den etablierten STZ diabetischen Ratten, wird Hyperglykämie leicht in 1-2 Tagen etabliert, wobei jedoch klinische Manifestationen von diabetischer Nephropathie sehr spät auftreten, vielleicht so spät wie 40 Wochen für Albuminurie. Im allgemeinen ist Albuminurie von Tag zu Tag und von Tier zu Tier hoch variabel, obwohl, anders als Menschen, die meisten STZ-Ratten schließlich eine Nephropathie entwickeln.

Intervention durch Verbindungen

Unter der Verwendung der Ribose-behandelten Tiere scheint Pyridoxamin bei 25 mg/kg Körpergewicht zwei der drei Manifestationen, die normalerweise zu Diabetes zugeordnet werden, effektiv vorzubeugen, nämlich die Beeinträchtigung der Kreatinin-Ausscheidung und die Albuminfiltration. Dies tat es genauso effektiv wie Aminoguanidin. Die Effektivität von Thiaminpyrophosphat war nicht offensichtlich, es sollte jedoch betont werden, daß dieses an seiner Verwendung bei erhöhten Konzentrationen von 250 mg/kg Körpergewicht liegen kann. Pyridoxamin würde als sehr viel weniger effektiv erscheinen, wenn lediglich die Ergebnisse bei 250 mg/kg Körpergewicht berücksichtigt würden.

Effekt der Verbindungen allein

Ingesamt schienen die Ratten die Verbindungen gut zu tolerieren. Nierengewichte waren nicht bemerkenswert und wenig Hochdruck entwickelte sich. Die physiologischen Effekte der Verbindungen wurden nur bei 250 mg/kg getestet. Thiaminpyrophosphat, jedoch nicht Pyridoxamin schien die Kreatinin-Ausscheidung bei dieser Konzentration zu verringern. Beide schienen die Albuminurie leicht zu erhöhen, wobei diese Messungen möglicherweise die am wenigsten verlässlichen waren.

Menschliche Verabreichung

Ein typischer erwachsener Mensch von durchschnittlicher Größe wiegt zwischen 66-77 kg. Typischerweise können diabetische Patienten dazu neigen übergewichtig sein und können über 112 kg aufweisen. Die empfohlenen diätetischen Erfordernisse für einen erwachsenen Mann von zwischen 66-77 kg wie 1989 überarbeitet, erforderten 1,5 mg Thiamin pro Tag und 2,0 mg Vitamin B&sub6; pro Tag (Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16th edition (Merck & Co., Rathaway, N. J., 1992) pp 938-939).

Auf Basis des Rattenmodellansatzes würde ein Bereich von Dosierungen für die Verabreichung von Pyridoxamin oder Thiaminpyrophosphat, von dem vorhergesagt wird, daß er bei der Inhibierung der Post-Amadori AGE-Bildung effektiv ist und daher damit in Zusammenhang stehende Pathologien inhibieren würde in den Bereich von 1 mg/100 g Körpergewicht bis 200 mg/100 g Körpergewicht fallen. Der geeignete Bereich, wenn mit Aminoguanidin coverabreicht, würde ähnlich sein. Berechnet für einen durchschnittlichen Erwachsenen von 75 kg kann der Bereich (bei 10 mg/1 kg Körpergewicht) ungefähr 750 mg bis zu aufwärts 150 g (bei 2 g/1 kg Körpergewicht) betragen. Dies wird natürlicherweise gemäß dem einzelnen Patienten variieren.

Die vorliegende Erfindung kann in anderen Formen ausgeführt werden oder in anderen Weisen durchgeführt werden, ohne sich von dem Geist oder den wesentlichen Charakteristika davon zu entfernen. Die vorliegende Offenbarung und die aufgezählten Beispiele sind daher als in all ihren Bezügen als verdeutlichend und nicht begrenzend zu betrachten, wobei der Bereich der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche angezeigt wird und alle Äquivalenzen als darin umfaßt vorgesehen sind. Der Durchschnittsfachmann würde in der Lage sein, äquivalente Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu erkennen und in der Lage sein, solche Ausführungsformen unter der Verwendung der Lehre der vorliegenden Offenbarung und lediglich Routineexperimenten durchzuführen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Erzeugung von stabilen Protein-Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Produkt-(AGE)-Intermediaten, umfassend Inkubieren von Protein mit Ribose, wobei die Konzentration der Ribose mindestens ungefähr 0,15 M beträgt, für eine ausreichende Zeitdauer, um stabile Protein-Zucker Post-Amadori AGE- Zwischenprodukte zu erzeugen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ribose bei einer Konzentration von 0,15 M bis 10 M Ribose vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein für 1 Stunde bis 60 Tage der Ribose ausgesetzt wird.

4. Verfahren zur schnellen Erzeugung von antigenem Post-Amadori fortgeschrittenem Glycosylierungs-Endprodukt (AGE), umfassend Freisetzen eines stabilen Protein- Zucker Post-Amadori fortgeschrittenen Glycosylierungs-Zwischenprodukts aus inhibitorischen Bedingungen von mindestens 0,15 M Ribose durch Entfernen von freiem und reversibel gebundenem Zucker von dem Zwischenprodukt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Verfahren zur Freisetzung aus inhibitorischen Bedingungen ausgewählt ist aus Freisetzung durch schnelle Verdünnung der Zuckerkonzentration, Freisetzen durch Dialyse von Zucker und schneller Einstellung des pH.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das stabile Zwischenprodukt durch das Verfahren nach Anspruch 1 erzeugt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei die inhibierende Ribose bei einer Konzentration von 0,15 M bis 10 M Ribose vorliegt.

8. Verfahren zur schnellen Erzeugung eines Ratten-Modells für Diabetes mit End-Phase Post-Amadori AGE in Zusammenhang stehender Pathologie, umfassend Verabreichen von Ribose an eine Ratte.

9. Verfahren zur Identifizierung eines effektiven Inhibitors der Bildung von späten Maillard-Produkten, umfassend: Erzeugen von stabilen Protein-Zucker Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs-Endprodukt-Intermediaten wie in Anspruch 1; in Kontakt bringen der stabilen Protein-Zucker Amadori fortgeschrittenen Glykosylierungs- Endprodukt-Intermediate mit einem Inhibitorkandidaten; Freisetzen des stabilen Intermediats aus den stabilisierenden Bedingungen, wie in Anspruch 4 angegeben, und Verfolgen der Bildung von Post-Amadori AGE, um effektive Inhibitoren zu identifizieren.

10. Verwendung von Thiaminpyrophosphat zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Post-Amadori AGE-Bildung.

11. Verwendung von Pyridoxamin zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Post-Amadori AGE-Bildung.

12. Verwendung von Pyridoxamin in Kombination mit Aminoguanidin zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Post-Amadori AGE-Bildung.

13. Verwendung von Thiaminpyrophosphat in Kombination mit Aminoguanidin zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Post-Amadori AGE-Bildung.

14. Verwendung von Aminoguanidin in Kombination mit einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe von Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Post-Amadori AGE-Bildung.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Medikament zur Verwendung bei Behandlung eines Individuums auf Protein-Kreuz-Vernetzung vorgesehen ist.

16. Verwendung von Pyridoxamin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung eines Zustands ausgewählt aus Albuminurie, Poteinurie, beeinträchtigter glomerularer Ausscheidung, beeinträchtigter Kreatinin-Ausscheidung und diabetischer Nephropathie.







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B Arbeitsverfahren; Transportieren
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