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Dokumentenidentifikation DE69803205T2 19.09.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 1019095
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FACIAL METALL TRICARBONYL VERBINDUNGEN UND IHRE ANWENDUNG ZUR MARKIERUNG VON BIOSUBSTRATEN
Anmelder Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Mo., US
Erfinder ALBERTO, Roger, CH-8400 Winterthur, CH;
SCHIBLI, Roger, CH-5232 Villingen PSI, CH;
EGLI, Andre, CH-8712 Stäfa, CH
Vertreter Arnold und Kollegen, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69803205
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.04.1998
EP-Aktenzeichen 989185012
WO-Anmeldetag 21.04.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/07979
WO-Veröffentlichungsnummer 0009848848
WO-Veröffentlichungsdatum 05.11.1998
EP-Offenlegungsdatum 19.07.2000
EP date of grant 16.01.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.09.2002
IPC-Hauptklasse A61K 51/04
IPC-Nebenklasse C01G 45/04   C07F 13/00   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Facial-Metall-Tricarbonylverbindungen und weiter koordinierten Facial-Metall-Tricarbonylverbindungen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Facial-Metall-Tricarbonylverbindungen zur Markierung biologisch wirksamer Substrate und anderer Liganden sowie ein Kit zur Herstellung von Facial-Metall-Tricarbonylverbindungen oder weiter koordinierten Facial-Metall-Tricarbonylverbindungen.

Der Einsatz von Metallkomplexen, zusammen mit zahlreichen verschiedenen Radionukliden, ist im Bereich der Nuklearmedizin zu einem wichtigen diagnostischen und in jüngerer Zeit auch therapeutischen Hilfsmittel geworden. Die Metallkomplexe werden häufig an ein biologisch wirksames Substrat gekoppelt, das als Zielführungsmittel wirkt. Eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Metall-Markierung biologisch wirksamer Substrate, wie Proteine, Peptide, Zucker oder kleine biologisch wirksame Verbindungen, umfasst die Stabilisierung des M(V)=O-Anteils von (radioaktiven) Metallen der Gruppe 7B des Periodensystems mit unterschiedlichen vierzähnigen Liganden. Nach der Reduktion wird der M(V)=O-Anteil übergangsweise mit einer größeren Menge eines Hilfsliganden wie Glucoheptonate stabilisiert, der anschließend gegen den Chelatbildner, der an dem zu markierenden System hängt, ausgetauscht wird. Dieses Verfahren hat sich in vielen Fällen als erfolgreich erwiesen, weist jedoch einige wesentlichen Nachteile auf wie das Erfordernis einer hohen Zähnigkeit, die Sperrigkeit der Liganden und die Schwierigkeit solche Liganden herzustellen und anzubringen.

Im Stand der Technik (Alberto et al., J. Nucl. Biol. Und Med. 1994, 38, 388-90) ist bekannt, dass Facial-Metall-Tricarbonyl-Komplexe mit radioaktiven Metallen der Gruppe 7B des Periodensystems sehr praktische Ausgangsmaterialien für Substitutionsreaktionen in organischen Lösungsmitteln und auch Wasser sind, da diese Verbindungen in Wasser über Wochen stabil sind, selbst wenn sie Luft ausgesetzt werden. Die Verbindungen wären daher zur Markierung biologisch wirksamer Verbindungen, wie Aminosäuren, Peptide, Proteine, Zucker und Rezeptorbindungsmoleküle sehr geeignet. Ein bislang wesentlicher Nachteil dieser Verbindungen ist jedoch, dass man sie nur durch Hochtemperatur-Carbonylierungsreaktionen und mit Hilfe des luftentzündlichen und toxischen und daher gefährlichen Reduktionsmittels BH&sub3; gewinnen konnte (Alberto et al., Low CO Pressure Synthesis of (NEt)&sub2;[MX&sub3;(CO)&sub3;] (M = Tc, Re) and its Substitution Behaviour in Water and Organic Solvents; Technetium in Chemistry and Nuclear Medicine, No 4, Cortina International, Milano, 1994).

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Facial- Metall-Tricarbonylverbindungen aus (radioaktiven) Metallen der Gruppe 7B mit Hilfe leicht erhältlicher und wenig-toxsicher Ausgangsmaterialien bei gemäßigten Temperaturen und einem normalen Druck für CO in einer angemessenen Zeit und mit hoher Ausbeute bereitzustellen.

Ein solches Verfahren wäre ein starkes Hilfsmittel, das man zur Synthese diagnostischer und therapeutischer Mittel einsetzen kann, insbesondere zur Synthese diagnostischer und therapeutischer Mittel, die von radioaktiven Metallen mit kurzer Halbwertszeit abstammen, so dass man diese markierten Verbindungen auch in schlecht ausgestatteten Krankenhauslabors verwenden kann. Wird das oben genannte Diagnosemittel mit einem Radionuklid markiert, kann es durch die sogenannte Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT und SPET) nachgewiesen werden; wird es mit einem paramagnetischen Metallatom markiert, kann es durch Magnetresonanzdarstellung nachgewiesen werden.

Die oben genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel

ac-[M(CO)&sub3;(OH&sub2;)&sub3;]&spplus; (I) gelöst,

worin M für Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re steht,

durch Umsetzen eines Metalls in der Permetallatform (MO&sub4;&supmin; -Form) mit Kohlenmonoxid und einem Reduktionsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch aus einer Base, einem wasserlöslichen, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziierten Reduktionsmittel, und wahlweise einem Stabilisator in einem wasserhaltigen Lösungsmittelsystem, das eine Lösung des Metalls in der Permanganat-, Pertechnetat- oder Perrhenatform enthält, in Gegenwart von Kohlenmonoxid gelöst wird.

Das Metall ist vorzugsweise 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re, da diese Radionuklide, wenn sie in diagnostischen oder therapeutischen Mitteln eingesetzt werden, den Vorteil haben, dass sie in sehr geringen Konzentrationen verwendet werden können, was das Risiko der Toxizität möglichst gering hält.

Der Begriff "nicht wesentlich durch Wasser dissoziiert" bedeutet, dass beim Zugeben der Permanganat-, Pertechnetat- oder Perrhenatlösung in Wasser die Geschwindigkeit der Zersetzungsreaktion des Reduktionsmittels mit Wasser gleich null oder sehr gering ist im Vergleich zu der Reaktion des Reduktionsmittels mit dem Permanganat-, Pertechnetat oder Perrhenat, so dass die Reaktion mit dem Permetallat abgeschlossen wird, solange noch genug Reduktionsmittel vorliegt.

Es ist sehr überraschend, dass man eine quantitative Reduktion von Permetallaten in wasserhaltigen Lösungsmittelsystemen bei gemäßigten Temperaturen und in einer angemessenen Zeit mit Reduktionsmitteln erzielen kann, die nukleopihil sind und im allgemeinen als weniger reaktiv als das im Stand der Technik bekannte elektrophile Reduktionsmittel BH&sub3; erachtet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich leicht nur durch Mischen der Permetallat-Lösung mit den anderen Reagenzien in Gegenwart von Kohlenmonoxid durchführen. Die Permetallat- Lösung kann wahlweise Halogenid-Ionen zur Elution des Permetallats von einem Entwickler enthalten. Das Kohlenmonoxid kann durch Verwenden eines geschlossenen Systems mit einer Atmosphäre, die eine ausreichend Menge Kohlenmonoxid enthält, bereitgestellt werden oder durch Durchleiten von Kohlenmonoxidgas durch die Lösung.

Die verwendete Base ist vorzugsweise eine anorganische Base, ausgewählt aus der Gruppe aus stabilen Hydroxiden und Carbonatsalzen wie NaOH, KOH, NaHCO&sub3;, Na&sub2;CO&sub3;, KHCO&sub3;, K&sub2;CO&sub3;, Ca(OH)&sub2; und Mg(OH)&sub2;. Am meisten bevorzugt ist Na&sub2;CO&sub3;. Die Base wird in einem Molverhältnis, bezogen aus das Reduktionsmittel, von zwischen 0,1 und 2, vorzugsweise in einem Molverhältnis von etwa 0,35 zugegeben.

Die Reaktion kann mit oder ohne Stabilisator durchgeführt werden. Als Stabilisator kann Gentisat (2,5-Dihydroxybenzoat), Glucoheptonat, Citrat oder Tartrat verwendet werden. Der bevorzugte Stablisator ist Tartrat, z. B. NaK-Tartrat. Der Stabilisator wird zu dem Reaktionsgemisch in einer solchen Menge zugegeben, dass er in einer höheren Konzentration vorliegt als das zu reduzierende Metall.

Für die Reduktion können mehrere Reduktionsmittel verwendet werden, wie das Borhydrid- Anion (BH&sub4;&supmin;) oder ein substituiertes Borhydrid-Anion, worin bis zu drei der Wasserstoffatome im Borhydrid-Anion unabhängig durch inerte Substituenten ersetzt wurden. Beispiele der inerten Substituenten sind Alkoxy- oder Alkylcarbonyloxygruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und Cyanogruppen. Das Gegenion der Reduktionsgruppe kann ein Metall der Gruppe 1A oder 2A des Periodensystems oder Zink oder ein Ammonium- oder tetrasubstituiertes Ammonium- oder tetrasubstituiertes Phosphoniumion sein, worin die vier Substituenten jeweils unabhängig Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkylgruppen oder Alkoxyalkylgruppen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Arylgruppen sind.

Das bevorzugte Reduktionsmittel ist das Borhydrid-Anion, insbesondere in Form von Verbindungen wie Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumborhydrid und Zinkborhydrid. Das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Natriumborhydrid.

Das Reduktionsmittel wird mit dem Permetallat in einem Molverhältnis über 3 eingesetzt. Die Reduktionsreaktion kann bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 100ºC durchgeführt werden. Die bevorzugte Reaktionstemperatur ist etwa 75ºC. Das Erwärmen des Reaktionsgemischs kann auf übliche Weise erfolgen, aber auch durch Mikrowellenerwärmung. Die Reaktion kann auch durch Zuführen von Ultraschall erfolgen, z. B. indem die Reaktionen bei Raumtemperatur in einem Ultraschallbad durchgeführt werden, was normalerweise zur gleichen Reaktionsgeschwindigkeit bei einer geringeren Temperatur führt.

Die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (I) eignet sich sehr gut für die Markierung biologisch wirksamer Verbindungen, wie Aminosäuren, Peptide, Proteine, Zucker, kleine Rezeptorbindungsmoleküle oder Zellen.

Beispiele für Peptide, die markiert werden können, sind Wachstumsfaktoren, Somatostatin, Bombesin, Insulin, LHRH, Gastrin, Gastrin-freisetzendes Peptid, Thyrotropin-freisetzendes Hormon, Thyrotropin, Prolactin, vasoaktives intestinales Peptid (VIP), hypophysäres Adenylatcyclase-aktivierendes Polypeptid (PACAP), Angiotensin, Neurotensin, Interferone, IL-1, IL-4 und IL-6, monoklonale Antikörper sowie Analoge und Derivate davon. Nach der Markierung mit einer geeigneten Markierungssubstanz können diese Peptide beispielsweise zum Nachweis und zur Lokalisierung oder Behandlung maligner Tumoren beim Menschen verwendet werden.

Beispiel von Zuckern, die markiert werden können, sind Glucose und Deoxyglucose und Derivate dieser Verbindungen.

Kleine Rezeptorbindungsmoleküle sind definiert als nicht-peptidförmige Moleküle, die an einer Rezeptor binden und üblicherweise ein Molekulargewicht unter etwa 500 Dalton haben.

Beispiele kleiner Rezeptorbindungsmoleküle, die markiert werden können, sind Sustanzen für das serotonerge System wie beschrieben in WO 96/30054 oder Substanzen für das dopaminerge System (z. B. Racloprid, β-CIT, Lisurid), für das cholinerge System (z. B. Epibatidin), für das glutaminerge System (z. B. Mematin) oder für das Benzodiazepin-System (z. B. Flumazenil, Iomazenil). Beispiele metabolisch aktiver Moleküle, die markiert werden können, sind DOPA, Tyrosin, mIBG, MAO-I und Analoge davon.

Beispiele für Zellen, die markiert werden können, sind rote und weiße Blutkörperchen.

Als Ergebnis der Markierung eines (biologisch wirksamen) Substrats mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhält man eine weiter koordinierte Verbindung der allgemeinen Formel

ac-[M(CO)&sub3;(X)&sub2;L&sub1;]n (II)

ac-[M(CO)&sub3;(X)L&sub2;]n (III) oder

ac-[M(CO)&sub3;L&sub3;]n (IV),

worin:

M für Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re steht,

L&sub1; für einen einzähnigen Liganden steht,

L&sub2; aus der Gruppe bestehend aus einem zweizähnigen Liganden und zwei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

L&sub3; aus der Gruppe bestehend aus einem dreizähnigen Liganden, einem einzähnigen Liganden und einem zweizähnigen Liganden, und drei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

X für H&sub2;O oder einem Halogenidion steht;

n für die Summe der Ladungen der Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3; und X, erhöht um eine +-Ladung, steht.

Nach der Markierungsreaktion ist der Ligand X üblicherweise H&sub2;O. Einen der H&sub2;O-Liganden kann man jedoch durch ein Halogenid-Ion, falls erhältlich, ersetzen, um die Ladung des Komplexes zu neutralisieren. Dies ist häufig der Fall bei Verbindungen der allgemeinen Formel (III).

Wenn der Ligand L&sub1;, L&sub2; oder L&sub3; vor und/oder nach der Markierung mit der Facial-Metall- Tricarbonylverbindung das biologisch wirksame Molekül ist, liefert die vorliegende Erfindung leichten Zugang zu Verbindungen, die direkt als diagnostische oder therapeutische Mittel eingesetzt werden können.

Beispiele einzähniger Liganden, die unter die Definition von L&sub1;, L&sub2; und L&sub3; fallen, sind (biologisch wirksame) Substrate, welche Gruppen wie Phosphine, Isonitrile, Nitrile, Imidazole, Thioether und Pyridin-artige aromatische Amine enthalten.

Beispiele zweizähniger Liganden, die unter die Definition von L&sub2; und L&sub3; fallen, sind (biologisch wirksame) Substrate mit Pyridin-, Imidazol- oder Pyrazolgruppen, wie Histidin, Histamin, funktionalisierte Imidazolsysteme, zweizähnige Thioether, zweizähnige Isocyanide, Schiff'sche Basen-artige Liganden und Picolinsäure.

Beispiele dreizähniger Liganden, die unter die Definition von L&sub3; fallen, sind Trispyrazolylborat, Tris-pyrazolylmethan, Tris-immidazolylborat, Tris-pyrazolylmethan, 1,4,7- Trithiacyclononan (9-anS&sub3;) und Triazacyclononan (9-anN&sub3;), Histidin, Methionin, Cystein, das an der Thiolgruppe derivatisiert ist, so dass ein Thioether entsteht und Cyclopentadienyl- Derivate.

In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein die radioaktiv markierte biologisch wirksame Verbindung in einem Schritt herzustellen. Diese Aufgabe kann erfindungsgemäß gelöst werden mit einem Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel

ac-[M(CO)&sub3;(X)&sub2;L&sub1;]n (II),

ac-[M(CO)&sub3;(X)L&sub2;]n (III) oder

ac-[M(CO)&sub3;L&sub3;]n (IV),

worin:

M für Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re steht,

L&sub1; für einen einzähnigen Liganden steht,

L&sub2; aus der Gruppe bestehend aus einem zweizähnigen Liganden und zwei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

L&sub3; aus der Gruppe bestehend aus einem dreizähnigen Liganden, einem einzähnigen Liganden und einem zweizähnigen Liganden, und drei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

X für H&sub2;O oder einem Halogenidion steht;

n für die Summe der Ladungen der Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3; und X, erhöht um eine +-Ladung, steht;

dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch aus einer Base, den Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3;, einem wasserlöslichen, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziierten Reduktionsmittel und wahlweise einem Stabilisator in einem wasserhaltigen Lösungsmittelsystem, das eine Lösung des Metalls in der Permanganat-, Pertechnetat- oder Perrhenatform enthält, in Gegenwart von Kohlenmonoxid und wahlweise in Gegenwart eines Halogenids gelöst wird.

Insbesondere im Fall radioaktiv markierter Verbindungen ist es häufig im Zusammenhang mit den häufig schlechten Lagerfähigkeiten der radimarkierten Verbindungen und/oder der Halbwertszeit des verwendeten Radionuklids nicht möglich, die gebrauchsfertige Verbindung dem Benutzer zur Verfügung zu stellen. In diesen Fallen wird der Benutzer die Markierungsreaktion mit dem Metall im Krankenhaus oder Labor durchführen. Für diesen Zweck werden die verschiedenen Reaktionskomponenten dem Benutzer häufig in Form eines sogenannten "Kits" zur Verfügung gestellt. Es ist offensichtlich, dass die zur Durchführung der Reaktion erforderlichen Veränderungen so einfach wie möglich sein sollten, so dass der Benutzer aus dem Kit mit den ihm zur Verfügung stehenden Einrichtungen die radioaktiv markierte Zusammensetzung herstellen kann. Die Erfindung betrifft daher auch ein Kit zur Herstellung einer markierten Zusammensetzung, wobei die markierte Zusammensetzung die Verbindung der Formel (I) als Markierungsmittel enthält.

Ein solches erfindungsgemäßes Kit zur Markierung eines biologisch wirksamen Substrats umfasst (i) ein wasserlösliches, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziiertes Reduktionsmittel, (ii) eine Base, (iii) gegebenenfalls einen Stabilisator und/oder Chelatbildner und (iv) gegebenenfalls ein oder mehrere inerte pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Formulierungsmittel und/oder Hilfsmittel, wobei mindestens eine der Komponenten (i) bis (iv) in einem Behälter mit einer Atmosphäre gelagert wird, die eine ausreichende Menge Kohlenmonoxid enthält, und die Komponenten (i) bis (iv) gegebenenfalls unabhängig kombiniert werden können, und (v) Gebrauchsanweisungen mit einer Anleitung zur Umsetzung der Kit-Komponenten mit einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe aus Mn, 99mTc ¹&sup8;&sup8;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re in Form einer Permetallat-Lösung.

Es ist die Leistung der Erfindung einen einfachen Weg zur Herstellung von Facial-Metall- Tricarbonylverbindungen innerhalb eines annehmbaren Zeitrahmens im Vergleich zur Halbwertszeit der beteiligten radioaktiven Isotope und mit hohen Ausbeuten bereitzustellen, so dass ein Kit zur Markierung biologisch wirksamer Substrate mit den Facial-Metall-Tricarbonylverbindungen hergestellt werden kann.

In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein ein biologisch wirksames Substrat einzufügen, so dass man ein Kit zur Herstellung einer radiopharmazeutischen Zusammensetzung erhält.

Wahlweise wird die biologisch wirksame Verbindung durch Umsetzen des Liganden mit der Facial-Metall-Tricarbonylverbindung gebildet.

Ein solches Kit zur Herstellung einer diagnostischen und therapeutischen pharmazeutischen Zusammensetzung, gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform, umfasst (i) ein geeignetes Substrat zur Markierung mit einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe aus Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re, (ii) ein wasserlösliches, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziiertes Reduktionsmittel, (iii) eine Base, (iv) gegebenenfalls einen Stabilisator und/oder Chelatbildner und (v) gegebenenfalls ein oder mehrere inerte pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Formulierungsmittel und/oder Hilfsmittel, wobei mindestens eine der Komponenten (i) bis (v) in einem Behälter mit einer Atmosphäre gelagert wird, die eine ausreichende Menge Kohlenmonoxid enthält, und die Komponenten (i) bis (v) gegebenenfalls unabhängig kombiniert werden können, und (vi) Gebrauchsanweisungen mit einer Anleitung zur Umsetzung der Kit-Komponenten mit dem Metall in Form einer Permetallat-Lösung. Die Herstellung der diagnostischen und therapeutischen pharmazeutischen Zusammensetzung mit Hilfe des oben genannten Kits, umfassend ein (biologisch wirksames) Substrat kann nach zwei alternativen Ausführungsformen erfolgen. Gemäß der ersten Ausführungsform wird die Facial-Metall-Tricarbonylverbindung zuerst hergestellt und dann mit dem zu markierenden Substrat umgesetzt. In der zweiten Ausführungsform wird der Reduktionsschritt in Gegenwart des zu markierenden Substrats durchgeführt, was direkt zu der markierten Verbindung führt.

Die Erfindung wird nun sehr ausführlich anhand nachstehender spezifischer Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: Synthese von [99mTC(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; aus wässriger Lösung

In einem verschließbaren 10 ml-Gefäß wurden folgende Chemikalien zusammengebracht: 5,5 mg NaBH&sub4;, 4,0 mg Na&sub2;CO&sub3; und 20,0 mg NaK-Tartrat. Das Gefäß wurde mit einem Serum-Stopper verschlossen und mit Hilfe einer Spritze 10 Minuten mit Kohlenmonoxidgas durchspült. 3 ml einer 0,9%-igen NaCl-Lösung aus einem Mo-99/Tc-99m-Generator mit einer Aktivität von etwa 100 mCi wurden über die Scheidewand zugegeben und das Gefäß über 30 Minuten auf 75ºC erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Produkt wurde durch TLC auf üblichen Merck-Kieselgelplatten, mit Methanol/konz. HCl = 99/1 als mobile Phase, aufgetrennt und die Kieselgelplatten anschließend mit Hilfe eines Radioaktivitäts-Scanners untersucht. Die Ausbeute der Reduktion von Pertechnetat zu facial- [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; war > 95% gemäß TLC. Nach Neutralisierung der Lösung mit einer PBS-Lösung (Phosphatpuffer (pH = 7,4, Kochsalzlösung 0,9%)) erhielt man eine neutrale physiologische Lösung, die zum Markieren geeignet war.

Tabelle 1 zeigt, dass Lösungen von [99mTC(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; mit einer Aktivität bis zu 700 mCi unter verschiedenen Reaktionsbedingungen gewonnen werden können.

Tabelle 1 Herstellung von [99mTc(OH&sub2;)3(CO)&sub3;]&spplus; unter verschiedenen Reaktionsbedingungen

* Die Aktivität wurde nicht genau bestimmt, lag jedoch immer zwischen 50 und 200 mCi

** Die Aktivität wurde nach Verdünnen auf 1% bestimmt

*** 4,0 mg Ca(OH)Z wurde als Base anstelle von 4,0 mg Na&sub2;CO&sub3; verwendet

Beispiel 2: Synthese von Komplexen der Zusammensetzung [99mTcL(CO)&sub3;] 2.1 Synthese von [99mTc(his)(CO)&sub3;] über [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus;

Nach Abschluss der Reaktion wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden 0,1 umol Histidin zu der Lösung mit pH 7,4 zugegeben. Gemäß TLC war die Reaktion nach 1 Stunde abgeschlossen.

Werden 0,01 umol Histidin bei Raumtemperatur zugegeben, dauert die Reaktion bis zum Abschluss 5-10 Stunden; bei 70ºC erfolgt die Reaktion in unter 1 Stunde.

2.2 Direkte Synthese von [99mTc(his)(CO)&sub3;]

Der Versuch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Gleichzeitig mit der Zugabe des Generatoreluats in das kalte Reaktionsgefäß wurden 0,03 umol Histidin in das kalte Reaktionsgefäß gegeben. Nach 30 Minuten Erwärmen wurde [99mTc(his)(CO)&sub3;] laut TLC in fast quantitativer Ausbeute gewonnen.

2.3 Synthese von (99mTc((lys-gly-(his)&sub5;)(CO)&sub3;]&spplus; über [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus;

Nach Abschluss der Reaktion wie in Beispiel 1 beschrieben wurden 500 umol des Octapeptids lys-gly-gly-(his)&sub5; zu der Lösung zugegeben. Gemäß TLC war die Reaktion nach 1 Stunde abgeschlossen. Wurden 300 umol lys-gly-gly-(his)&sub5; zugegeben, benötigt die Reaktion bis zum Abschluss 3 Stunden.

2.4 Zusammenfassung der Herstellung weiterer Komplexe der Zusammensetzung [99mTcL(CO)&sub3;]

Das [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und neutralisiert. Der Ligand (siehe Fig. 1) wurde zugegeben bei nachstehender Komplexierungszeit und -temperatur und in der Menge und Konzentration wie in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 zeigt die Ausbeuten, wie sie durch TLC-Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden und die Möglichkeit die Reaktion in einem Ein-Topf-Verfahren durchzuführen.

Tabelle 2 Herstellung von [99mTcL(CO)&sub3;] mit verschiedenen Liganden und unter verschiedenen Reaktionsbedingungen

* 50 ul 10&supmin;³M Ligand 1, dann 50 ul 10&supmin;²M Glucose

** 15 min Ultraschall r.t.

*** Nach der Reaktion wurde das Produkt 23 h bei 37ºC gelagert und schien stabil zu sein

**** Möglichkeit, die Synthese als Ein-Topf-Verfahren durchzuführen

Von der Verbindung, die aus dem Liganden 5 gewonnen wurde (siehe nachstehende Formel), wurde das ¹H-NMR-Spektrum vor und nach der Komplexbildung mit "kaltem" [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; aufgezeichnet.

A: aromatischer Bereich des NMR-Spektrums vor der Komplexbildung:

¹H-NMR(CDCl&sub3;)[r.t., δ in ppm] = 8,75 (1H, d)(a), 8,36 (1H, s)(e), 8,14 (1H, d)(d), 7,99 (1H, t) (b), 7,55 (1H, m)(c), 6,07 (1H, s)(f).

B: aromatischer Bereich des NMR-Spektrums nach der Komplexbildung:

¹H-NMR(CDCl&sub3;)[r.t., δ in ppm] = 9,12 (1H, d)(a), 8,51 (1H, s)(e), 8,37 (1H, t)(b), 8,19 (1H, d) (d), 7,87 (1H, m)(c), 6237 (1H, s)(f).

Beispiel 3: Markierung von Antikörpern mit (99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; 3.1 Die Markierung in Abhängigkeit von der Konzentration

Die Markierungskinetik wurde als Funktion der Mab-Konzentration untersucht. Eine Konzentration über 2-3 mg/ml ergab eine quantitative Markierung nach 2 Stunden, wobei eine Konzentration unter 1 mg gemäß TLC eine Ausbeute von 40-50% ergab.

3.2 Biologische Aktivität in vitro des markierten monoklonalen Antikörpers 35 (Mab-35)

Es wurde eine Menge [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; wie in Beispiel 1 hergestellt zur Markierung von 1,2 mg Mab-35 verwendet. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde der Mab über eine Ausschluss-Gelchromatographiesäule der Größe PD-10 aufgetrennt, mit einer Ausbeute von 38%. Der markierte Mab wurde einem Lindmo-Test unterzogen (T. Lindmo, P. A. Brunn, Methods in Enzymology 1986, 121, 678), der 100% biologische Wirksamkeit zeigte.

Beispiel 4: Markierung von His-Neurotensin(8-13) mit (99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus;

0,9 ml [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; wie in Beispiel 1 hergestellt wurden mit 0,1 ml 10&supmin;³M His- Neutrotensin(8-13) (HRRPYIIL) gemischt und in einem verschlossenen Röhrchen 1 Stunde bei 75ºC gehalten. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt. Wie aus der Umkehrphasen-Säulen-HPLC ersichtlich, betrug die Ausbeute > 95%. Der Kd-Wert dieser Verbindung auf die Dickdarmkrebszellen HT29 war 1,0 nM.

Beispiel 5: Markierung des Proteinfragments recombinantes scFv mit 6 · His-tag mit [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus;

0,1 ml [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; wie in Beispiel 1 hergestellt wurden mit 0,1 ml 1 M MES-Puffer, pH 6,2, und 0,1 ml 150 uM scFv-6 · His gemischt und 20 min bei 37ºC gehalten. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einer Sephadex® G-25 Superfine Größentrennungs-Säule aufgetrennt. Die üblichen Aufnahmen von 99mTc waren 70% bis 84%, mit biologischen Aktivitäten (gemessen mit dem Lindmo-Test aus Beispiel 3) reichten von 57% bis 90%. Die Kd-Werte wurden nicht signifikant durch die Aufnahme von 99mTc verändert: Messung durch BIAcore von nicht-markiertem scFv: 0,5 · 10&supmin;&sup8;M, 99mTc-markiertes scFv: 1 · 10&supmin;&sup8;M; ¹²&sup5;I- markiertes scFv: 4 · 10&supmin;&sup8;M.

Beispiel 6: Markierung von Biotin mit [99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus;

[99mTc(OH&sub2;)&sub3;(CO)&sub3;]&spplus; wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. 1,300 ul einer 10&supmin;³M Biotin-Hydrazin-Pyridin-Lösung wurde zu 2 ml der Tc-Carbonyl-Verbindung zugegeben und 2 Stunden bei 50ºC inkubiert, wobei eine Tc-markierte Verbindung mit einer Reinheit von 50 % entstend. Die Verbindung wurde über eine äquilibrierte (5 ml MeOH/H&sub2;O = 1/1) SepPac- Säule gereingigt durch Laden der Säule und Eluieren der Nebenprodukte mit 2 ml H&sub2;O und dann mit 4 ml MeOH/H&sub2;O = 1/1, gefolgt von der Elution des gewünschten Produkts mit 2 ml MeOH. Die Endreinheit der Verbindung war 98%. Stabilitätskontrolle: keine Zersetzung in Methanol nach 24 Stunden; 32% Zersetzung in PBS-Puffer nach 24 Stunden. Ergebnisse von Bindungstests an Streptavidin-Kügelchen: 0,5% unspezifische Bindung und 81% spezifische Bindung.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel

ac-[M(CO)&sub3;(OH&sub2;)&sub3;]&spplus; (I),

worin M für Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re steht,

durch Umsetzen eines Metalls in der Permetallatform mit Kohlenmonoxid und einem Reduktionsmittel,

dadurch gekennzeichnet,

dass ein Gemisch aus einer Base, einem wasserlöslichen, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziierten Reduktionsmittel, und wahlweise einem Stabilisator in einem wasserhaltigen Lösungsmittelsystem, das eine Lösung des Metalls in der Permanganat-, Pertechnetat- oder Perrhenatform enthält, in Gegenwart von Kohlenmonoxid gelöst wird.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel

ac-[M(CO)&sub3;(X)&sub2;L&sub1;]n (II),

ac-[M(CO)&sub3;(X)L&sub2;]n (III) oder

ac-[M(CO)&sub3;L&sub3;]n (IV),

worin:

M für Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re steht,

L&sub1; für einen einzähnigen Liganden steht,

L&sub2; aus der Gruppe bestehend aus einem zweizähnigen Liganden und zwei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

L&sub3; aus der Gruppe bestehend aus einem dreizähnigen Liganden, einem einzähnigen Liganden und einem zweizähnigen Liganden, und drei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

X für H&sub2;O oder einem Halogenidion steht;

n für die Summe der Ladungen der Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3; und X, erhöht um eine +-Ladung, steht;

dadurch gekennzeichnet,

dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), hergestellt nach Anspruch 1, mit den Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3;, wahlweise in Gegenwart eines Halogenids, umgesetzt wird.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel

ac-[M(CO)&sub3;(X)&sub2;L&sub1;]n (II),

ac-[M(CO)&sub3;(X)L&sub2;]n (III) oder

ac-[M(CO)&sub3;L&sub3;]n (IV),

worin:

M für Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re steht,

L&sub1; für einen einzähnigen Liganden steht,

L&sub2; aus der Gruppe bestehend aus einem zweizähnigen Liganden und zwei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

L&sub3; aus der Gruppe bestehend aus einem dreizähnigen Liganden, einem einzähnigen Liganden und einem zweizähnigen Liganden, und drei einzähnigen Liganden ausgewählt ist;

X für H&sub2;O oder einem Halogenidion steht;

n für die Summe der Ladungen der Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3; und X, erhöht um eine +-Ladung, steht;

dadurch gekennzeichnet,

dass das Gemisch aus einer Base, den Liganden L&sub1; oder L&sub2; oder L&sub3;, einem wasserlöslichen, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziierten Reduktionsmittel und wahlweise einem Stabilisator in einem wasserhaltigen Lösungsmittelsystem, das eine Lösung des Metalls in der Permanganat-, Pertechnetat- oder Perrhenatform enthält, in Gegenwart von Kohlenmonoxid und wahlweise in Gegenwart eines Halogenids gelöst wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden L&sub1;- L&sub3; biologisch wirksame Substanzen sind oder davon abstammen, die aus der Gruppe aus Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Zucker, kleine Rezeptorbindungsmoleküle und Körperzellen ausgewählt sind.

5. Verfahren zur Markierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Protein ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Base eine anorganische Base ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe aus NaOH, KOH, NaHCO&sub3;, Na&sub2;CO&sub3;, KHCO&sub3;, K&sub2;CO&sub3;, Ca(OH)&sub2; und Mg(OH)&sub2;.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von der Base zu dem Reduktionsmittel zwischen 0,1 und 2, vorzugsweise etwa 0,35 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 6-7, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel aus der Gruppe aus Borhydridanion und substituierten Borhydridanion, wobei bis zu drei der Wasserstoffatome, die das Borhydridanion enthält, durch inerte Substituenten ersetzt wurden, ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel ein Borhydridanion ist, das von einem Salz, ausgewählt aus der Gruppe aus Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumborhydrid und Zinkborhydrid, abstammt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel Natriumborhydrid ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von Reduktionsmittel zu Permetallat mindestens 3 beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 3 und 6-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur zwischen 20ºC und 100ºC liegt und vorzugsweise etwa 75ºC beträgt.

13. Kit zur Herstellung einer Markierungszusammensetzung, umfassend (i) ein wasserlösliches, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziiertes Reduktionsmittel, (ii) eine Base, (iii) gegebenenfalls einen Stabilisator und/oder Chelatbildner und (iv) gegebenenfalls ein oder mehrere inerte pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Formulierungsmittel und/oder Hilfsmittel, wobei mindestens eine der Komponenten (i) bis (iv) in einem Behälter mit einer Atmosphäre gelagert wird, die eine ausreichende Menge Kohlenmonoxid enthält, und die Komponenten (i) bis (iv) gegebenenfalls unabhängig kombiniert werden können, und (v) eine Gebrauchsanweisung mit einer Anleitung zur Umsetzung der Kit-Komponenten mit einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe aus Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re in Form einer Permetallat-Lösung.

14. Kit zur Herstellung einer diagnostischen oder therapeutischen pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend (i) ein geeignetes Substrat zur Markierung mit 5 einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe aus Mn, 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re, (ii) ein wasserlösliches, aber nicht wesentlich durch Wasser dissoziiertes Reduktionsmittel, (iii) eine Base, (iv) gegebenenfalls einen Stabilisator und/oder Chelatbildner und (v) gegebenenfalls ein oder mehrere inerte pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Formulierungsmittel und/oder Hilfsmittel, wobei mindestens eine der Komponenten (i) bis (v) in einem Behälter mit einer Atmosphäre gelagert wird, die eine ausreichende Menge Kohlenmonoxid enthält, und die Komponenten (i) bis (v) gegebenenfalls unabhängig kombiniert werden können, und (vi) eine Gebrauchsanweisung mit einer Anleitung zur Umsetzung der Kit-Komponenten mit dem Metall in Form einer Permetallat-Lösung.







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