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Dokumentenidentifikation DE69804334T2 19.09.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 1019842
Titel STEUERUNG VON NUKLEINSÄURE-AMPLIFIKATIONSVERFAHREN EINSCHLIE LICH DER POLYMERASE-KETTENREAKTION
Anmelder Molecular Sensors Ltd., Wiltshire, GB
Erfinder CLARKSON, John Michael, Bradford-upon-Avon, Wiltsh. BA151 JS, GB;
COBB, Benjamin David, Bradford-upon-Avon, Wiltsh. BA15 1JS, GB
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69804334
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.10.1998
EP-Aktenzeichen 989465620
WO-Anmeldetag 05.10.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/GB98/02989
WO-Veröffentlichungsnummer 0009918516
WO-Veröffentlichungsdatum 15.04.1999
EP-Offenlegungsdatum 19.07.2000
EP date of grant 20.03.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.09.2002
IPC-Hauptklasse G06F 15/18
IPC-Nebenklasse C12Q 1/68   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Optimierung von Zyklusbedingungen, die zum Steuern von Polymerase-Kettenreaktionen verwendet werden.

Die Optimierung der Temperatursteuerung, die für die PCR-Amplifikation verwendet wird, erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung der Reaktionsbedingungen. Die komplexe Natur der Reaktion und die Wechselwirkungen zwischen wesentlichen Reaktionskomponenten bewirken, dass herkömmliche kinetische Analyseverfahren nicht ohne weiteres angewandt werden können, um optimale Zyklusbedingungen vorherzusagen. Das hier beschriebene Verfahren löst diese Probleme durch Vorhersagen des Pegels der Amplifikation unter Verwendung einer neuen Kombination aus "Grey-box"-Modellierung, genetischen Algorithmen und neuronalen Netzwerken, um den Pegel der Amplifikation für bestimmte Sätze von Zyklusbedingungen zu modellieren und vorherzusagen. Dies kann dazu verwendet werden, festzustellen, welche Teile des Temperaturprofils die größte Auswirkung auf die Reaktion haben. Genetische Algorithmen werden verwendet, um die Auswirkungen zu modellieren, welche Änderungen des Temperaturprofils auf die Amplifikation haben. Diese Algorithmen können anschließend verwendet werden, um Temperaturzyklen zu definieren, welche eine erhöhte Reaktionsleistung ergeben. Durch Verknüpfen dieses Modellierungsverfahrens mit einer Online-Überwachung des Amplifikationsverfahrens ist eine Echtzeitoptimierung von Reaktionen möglich. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Qualitätskontrolle empfindlicher Methoden wie eine Diagnostik auf PCR-Basis.

Das US-Patent Nr. 4683195 (Mullis et al., Cetus Corporation) beschreibt ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäure durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Kurze Oligonukleotidsequenzen mit einer Länge von üblicherweise 10-40 Basenpaaren werden für flankierende Regionen auf jeder Seite der Zielsequenzen, die amplifiziert werden sollen, vorgesehen. Diese Primer werden im Überschuss zu der Zielsequenz-DNA zugegeben. Ein geeigneter Puffer, Magnesiumchloridionen, eine thermostabile Polymerase und freie Nukleotide werden ebenfalls zugegeben.

Ein Thermozyklusverfahren wird eingesetzt, um die DNA in der Regel millionenfach zu amplifizieren. Die Amplifikation wird durch einen Temperaturzyklus erleichtert. Die Ziel- DNA wird zu Beginn bei 95ºC denaturiert und anschließend allgemein auf Werte zwischen 40ºC und 60ºC abgekühlt, um ein Hybridisieren der Primer an die voneinander getrennten Stränge zu ermöglichen. Die Temperatur wird auf die optimale Temperatur der Polymerase (im Allgemeinen 72ºC) angehoben, welche den Primer verlängert, wobei die Zielsequenz kopiert wird. Diese Reihe von Vorgängen wird wiederholt (gewöhnlich 20- bis 40-mal). Während der ersten paar Zyklen werden Kopien der Zielsequenz hergestellt. Während nachfolgender Zyklen werden Kopien von Kopien hergestellt, wobei die Amplifikation der Zielsequenz exponentiell zunimmt.

Aufgrund der komplexen Wechselwirkungen zwischen den Reaktionskomponenten ist eine mathematische Beschreibung der PCR unter Verwendung einer herkömmlichen kinetischen Notation nicht möglich (siehe "A simple procedure for optimising the polymerase chain reaction (PCR) using modified Taguchi methods" Cobb und Clarkson, (1994) Nucleic Acids Research, Band 22, Nr. 18, S. 3801-3805). Es wurde gezeigt, dass Mg²&spplus; und Desoxynukleotidtriphosphate die Effizienz des Priming und der Verlängerung durch Veränderung der Kinetik der Hybridisierung und der Dissoziation von Primer-Templat- Duplices bei Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Verlängerungstemperaturen beeinflussen. Diese Komponenten sind auch an der Veränderung der Effizienz, mit der die Polymerase solche Duplices erkennt und verlängert, beteiligt. Die Konzentrationen von Mg²&spplus; und Desoxynukleotidtriphosphaten, die für eine optimale Amplifikation erforderlich sind, hängen weitgehend von den Ziel- und Primersequenzen ab, wobei die Nukleotide am 3'-Ende des Primers eine wesentliche Auswirkung auf die Effizienz der Mismatch- Verlängerung haben. Bestimmte Mismatch-Nukleotidkombinationen können unter bestimmten Reaktionsbedingungen effizienter amplifiziert werden als andere. Das Vorhandensein von überschüssigem Mg²&spplus; in einer Reaktion kann zur Akkumulation von unspezifischen Amplifikationsprodukten führen und ungenügende Konzentrationen verringern die Produktausbeute. Außerdem binden Desoxynukleotidtriphosphate quantitativ Mg²&spplus;- Ionen, so dass jede Modifizierung der dNTP-Konzentration eine kompensatorische Anpassung von MgCl&sub2; erfordert.

Die PCR-Optimierung erfordert herkömmlicherweise die wiederholte Anpassung wichtiger Reaktionsparameter mittels Versuch und Irrtum. Auf diese Weise optimierte Reaktionen sind im Allgemeinen nicht robust und anfällig für kleine Abweichungen des Temperaturprofils und/oder kleinere Schwankungen der Zusammensetzung des Reaktionsgemisches. Die Komplexität und in einem gewissen Grad die Unbestimmtheit der Reaktion bewirkt, dass eine Modellierung schwierig ist. Soweit Modelle vorgeschlagen wurden, wie z. B. in "Polymerase chain reaction engineering" Hsu et al., (1997), Biotechnology and Bioengineering, Band 55, Nr. 2, S. 359-366, wurden wichtige Reaktionselemente außer Acht gelassen. Wichtig ist, dass aktuelle Modelle davon ausgehen, dass die Denaturierung, Verlängerung und Hybridisierung bei festen Temperaturen in dem Zyklus stattfinden, hauptsächlich aufgrund der Art und Weise, in welcher die Thermocycler mit festen Temperaturen für jeden dieser grundlegenden Vorgänge programmiert sind. Dies ist jedoch eine übermäßige Vereinfachung, da die Geschwindigkeit bzw. Rate dieser Vorgänge temperaturabhängig ist, so dass sie in einem breiten Temperaturbereich stattfinden.

Theoretisch sollte die Amplifikation von spezifischen Templatsequenzen eine exponentielle Funktion aufweisen, d. h. unter perfekten Bedingungen verdoppelt sich die Menge des amplifizierten Templates nach jedem Zyklus der Reaktion. Die Zuverlässigkeit und Rate der Amplifikation wird jedoch durch eine komplexe Wechselwirkung zwischen den Reaktionskomponenten gesteuert, so dass das theoretische Optimum niemals erreicht wird. Unter normalen Bedingungen wird die Akkumulation des Produkts während der späteren Zyklen begrenzt, da die Anzahl der Duplices für die Verlängerung die Enzymaktivität in der Reaktion übersteigt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Akkumulation des Produkts linear. Hinzu kommt die thermische Inaktivierung der Polymerase bei längerer Einwirkung von Temperaturen über 80ºC. Die Amplifikation kann durch sorgfältige Berücksichtigung der Hybridisierungstemperaturen, Hybridisierungszeiten und Hybridisierungsanstiege optimiert werden. Es ist möglich, zum Vermeiden eines unspezifischen Primings die Hybridisierungstemperatur zu erhöhen, indem man die Anstiegsrate anpasst, um die verringerte Primingrate zu kompensieren. Dies vergrößert den Zyklusbereich, in welchem eine exponentielle Akkumulation der Zielsequenz erfolgt. Die Primingrate und der Temperaturbereich, in dem das Priming stattfindet, hängen von der Menge an freiem Mg²&spplus; ab.

Eine ähnliche Optimierung der Denaturierungszeiten und -anstiege hat eine Auswirkung auf die Amplifikation, da die Taq-Polymerase bei übermäßiger Einwirkung der hohen Denaturierungstemperaturen (in der Regel ≥ 94ºC während 1 min bis 5 min) denaturiert wird (siehe: "Kinetics of inactivation for thermostable DNA polymerase enzymes" Mohapatra und Hsu (1996), Biotechnology Techniques, Band 10, S. 569-572). Wenngleich die Polymerase normalerweise im Überschuss zugegeben wird, haben aufeinanderfolgende Denaturierungsschritte in der PCR eine erhebliche Auswirkung auf den Betrag der Polymerasedenaturierung. Außerdem führen diese Temperaturbedingungen zu einer Depurinierung des DNA-Templates (in der Regel alle 2 Kb bei 94ºC min&supmin;¹). Da die Denaturierung erfolgt, bevor und nachdem die eingestellte Denaturierungstemperatur erreicht wurde (in der Regel denaturiert DNA mit zunehmender Geschwindigkeit zwischen 70ºC und 90ºC) kann eine Modifizierung der Anstiegszeiten verwendet werden, um die Zeiten bei 94ºC zu begrenzen.

Polymerasen wie etwa Taq sind gut charakterisiert worden. Sie weisen eine klassische Temperaturabhängigkeit mit einer allmählichen Zunahme der Verlängerungsrate bei höheren Temperaturen auf. Die Aktivität erreicht ein Optimum (in der Regel 70ºC), wonach die Aktivität schart abfällt (in der Regel ≥ 80ºC). Eine Verlängerung erfolgt über einen ausgedehnten Temperaturbereich. Es ist möglich, die Verlängerungszeiten unter Berücksichtigung des Gesamtbetrages der Verlängerung über diesen Bereich zu verringern. Zum Beispiel ergibt sich ein erheblicher Betrag der Verlängerung bei ca. 60ºC. Oligonukleotide, welche bei dieser Temperatur hybridisieren, werden sofort verlängert. Die Verlängerungszeiten können verringert oder in einigen Fällen vollständig weggelassen werden.

Die vorliegende Erfindung trachtet danach, eine Optimierung der Zyklusbedingungen zu ergeben, die zum Steuern von Polymerase-Kettenreaktionen verwendet werden.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Optimieren von Zyklusbedingungen, die zum Steuern einer Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bereit gestellt, wie es in Anspruch 1 angegeben ist.

Die bevorzugte Ausführungsform stellt ein Verfahren bereit, welches eine intelligente Steuerung der PCR gestattet. Dies wird durch Modellieren und Vorhersagen von Amplifikationspegeln durch eine neue Kombination der Zuweisung von Zugehörigkeitsfunktionen (die Verknüpfung von Reaktionsvorgängen mit der Temperatur), genetischen Algorithmen und künstlichen neuronalen Netzwerken erreicht. Hierbei leitet die Zugehörigkeitskomponente eine genaue Definition für die verschiedenen Reaktionsparameter ab und stellt sie bereit, welche den Betrag der Amplifikation für eine bestimmte Reaktion bestimmt. Genetische Algorithmen werden verwendet, um die optimalen Zeiten für jeden Schritt des Temperaturzyklus zu bestimmen. Die neuronale Netzwerkkomponente wird anschließend verwendet, um die Zugehörigkeitsregeln und Zugehörigkeitsfunktionen zu verstärken. Nach einem anfänglichen Training kann das neuronale Netzwerk dazu verwendet werden, die Zugehörigkeitsfunktionen zu aktualisieren, während es mehr aus seinen Eingangssignalen lernt. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, die optimalen Reaktionsbedingungen genau vorherzusagen (Fig. 1).

Vorzugsweise wird das Verfahren verwendet, um Protokolle von einem Thermocycler zu einem anderen zu übertragen, wobei die relativen Beiträge der Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung zuerst berechnet werden, wobei das thermische Verhalten des Ausgangscyclers berücksichtigt wird, und anschließend auf den Zielcycler übertragen werden, wobei die Unterschiede des Verhaltens der Cycler berücksichtigt werden.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist nachstehend, und zwar nur beispielhaft, unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen beschrieben, worin:

Fig. 1 eine schematische Wiedergabe einer "intelligenten" Thermocyclersteuerung unter Verwendung von Zugehörigkeitsfunktionen für bestimmte Reaktionsvorgänge und genetischen Algorithmen zum Vorhersagen der Amplifikationspegel für festgesetzte Zyklusbedingungen ist;

Fig. 2 zeigt die Vorhersage von Amplifikationspegeln unter Verwendung eines selbstlernenden Steuerungsverfahrens;

Fig. 3 zeigt eine sigmoidale Zugehörigkeitsfunktion für die Templat-Denaturierung;

Fig. 4 zeigt Beispiele für das Modellieren einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von Zugehörigkeitsfunktionen für die Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung;

Fig. 5a ist eine schematische Darstellung der Schlüsselvorgänge bei dem bevorzugten genetischen Algorithmus;

Fig. 5b zeigt die Arbeitsweise des genetischen Algorithmus von Fig. 5a;

Fig. 6a und 6b zeigen jeweils Beispiele für einen Einpunkt- und einen Zweipunkt- Crossover;

Fig. 7 ist eine schematische Darstellung eines Knotens in einem künstlichen neuronalen Netzwerk und eines aus drei Schichten bestehenden künstlichen neuronalen Netzwerks;

Fig. 8 zeigt eine sigmoide Transferfunktion mit sigmoiden Zunahmen von 0,25 bis 2,00 und

Fig. 9 bis 15 zeigen die Ergebnisse mit Bezug auf das bevorzugte Verfahren.

In jüngster Zeit wurden neue Technologien zum Überwachen des Fortschreitens einer PCR in Echtzeit beschrieben (z. B. fluorogene 5'-Nuklease-Chemie - PE Applied Biosystems und Ethidiumbromidfluoreszenz (siehe "Kinetic PCR analysis Real-time monitoring of DNA amplification reactions" Higuchi et al., (1993), Biotechnology, Band 11, S. 1026-1030). Wenngleich diese Verfahren die Quantifizierung des im Lauf einer Reaktion gebildeten Produktes gestatten, ergibt sich der Hauptnutzen einer Echtzeitüberwachung aus Algorithmen, die eine optimale Amplifikation genau vorhersagen und aufrecht erhalten können. Das in dieser Anmeldung beschriebene Verfahren kann in Verbindung mit Produktnachweissystemen verwendet werden, um eine dynamische Echtzeitsteuerung von PCRs zu ergeben; wobei Zyklusbedingungen kontinuierlich aktualisiert werden, während die Reaktion abläuft, und eine optimale Leistung aufrecht erhalten wird.

Die PCR-Bedingungen erfordern allgemein eine sorgfältige Beachtung, um den Pegel der Amplifikation zu optimieren. Da die Polymerase-Kettenreaktion jedoch komplex ist, können herkömmliche kinetische Analyseverfahren nicht ohne weiteres eingesetzt werden, um die optimalen Bedingungen vorherzusagen. Hinzu kommt die komplexe Wechselwirkung zwischen den Reaktionskomponenten. Die bevorzugte Ausführungsform trachtet danach, die herkömmlicherweise mit der PCR-Optimierung verbundenen Probleme durch Vorhersagen des Pegels der Amplifikation durch Berechnen des Betrages der Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung über den gesamten Bereich der Temperaturen in dem Zyklusprofil zu lösen. Unter Verwendung einer neuen Kombination von "Grey-box"-Modellierung, welche Zugehörigkeitsfunktionen auf jeden dieser Vorgänge anwendet, von genetischen Algorithmen und künstlichen neuronalen Netzwerken kann der Pegel der Amplifikation vorhergesagt werden. Eine Analyse der durch das neuronale Netzwerk erzeugten Gewichte kann anschließend verwendet werden, um Reaktionsoptima im Hinblick auf die Zeit, die jeder der Zyklusvorgänge benötigt, zu definieren. Das Verfahren kann folgendermaßen beschrieben werden:

i. Eine Grey-box-Modellierung wird verwendet, um optimale Hybridisierungs-, Verlängerungs- und Denaturierungstemperaturen und den Temperaturbereich, in dem diese Vorgänge erfolgen, zu definieren.

ii. Zugehörigkeitsfunktionen werden auf jeden dieser Vorgänge angewandt, um den Pegel der Amplifikation über einen vorgegebenen Zyklus vorherzusagen.

iii. Genetische Algorithmen werden verwendet, um optimale Zeiten für jede dieser Stufen zu bestimmen.

iv. Neuronale Netzwerke können verwendet werden, um den vorhergesagten Pegel der Amplifikation zu bestätigen und/oder zu modifizieren.

v. Eine Echtzeitüberwachung kann verwendet werden, um das Verfahren weiter zu verfeinern.

Diese Vorgehensweise stellt die Grundlage einer PCR-spezifischen Steuerungssoftware dar, welche auf die Standardisierung der Thermocyclersteuerung angewandt werden kann, und ist die erste Beschreibung eines intelligenten Steuerungsverfahrens für die PCR-Optimierung.

Definieren von Zugehörigkeitsfunktionen

Die Grundlage des bevorzugten Verfahrens umfasst das Umwandeln von wichtigen Elementen der PCR (Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung) in eine Reihe von Zugehörigkeitsfunktionen. Eine "Grey-box"-Modellierung der Reaktion wird zu Beginn verwendet, um die Reihe von Zugehörigkeitsfunktionen und Regeln für die verschiedenen Parameter zu erzeugen, welche die Reaktionsleistung beeinflussen; d. h. Faktoren, welche die Templat-Denaturierung, die Primerhybridisierung und die Verlängerung des Primer/Templat-Duplexes beeinflussen. Eine Regelbasis wird verwendet, um diese Vorgänge mit bestimmten Temperaturen in dem Amplifikationszyklus zu verbinden. Genaue Werte für jede Reaktionsvariable werden verwendet, um den Pegel der Amplifikation über einzelne oder mehrere Zyklen vorherzusagen. Durch die Verwendung von Zugehörigkeitsfunktionen ist es möglich, die PCR dynamisch zu modellieren und Änderungen der Rate der verschiedenen Prozesse über den gesamten Temperaturzyklus zu berücksichtigen und nicht auf bestimmten Stufen wie bei herkömmlichen Modellierungsverfahren.

Man kann davon ausgehen, dass die PCR drei grundlegende Vorgänge umfasst; nämlich die Denaturierung des doppelsträngigen Templates, die Hybridisierung der Primer an das einzelsträngige denaturierte Templat und die Polymerisation dieser Duplices. Die Geschwindigkeit bzw. Rate, mit der diese Prozesse stattfinden, ist temperaturabhängig. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Elementen in der Reaktion sind zusätzliche Regulatoren der Rate und Optima. Die "Grey-box"-Modellierung dieser Prozesse ermöglicht, dass Zugehörigkeitsfunktionen für diese Vorgänge mit bestimmten Temperaturen verbunden werden (Fig. 2). Genetische Algorithmen können verwendet werden, um die jeder Stufe zugewiesene Zeit (t1...t6) zu modifizieren, um die Amplifikation zu optimieren und die Auswirkungen von Wechselwirkungen der Komponenten, der Inaktivierung, der Depurinierung usw. zu begrenzen. Das neuronale Netzwerkelement wird dazu verwendet, festzustellen, welche Anfangszeiten verwendet werden sollen, um die Zeit zu verringern, die zum Berechnen der Stufenoptima erforderlich ist.

Denaturierungs-Zugehörigkeitsfunktionen

Die Denaturierung des DNA-Templates kann durch eine sigmoidale Schmelzkurve wiedergegeben werden. Die Denaturierungstemperatur dieses Templates definiert die Temperatur, bei der die Hälfte der DNA denaturiert ist. Unterhalb von 70ºC erfolgt nur wenig Denaturierung. Das Anheben der Temperatur über diesen Wert führt zu einer deutlichen Zunahme der Denaturierungsrate. Diese hohen Temperaturen sind auch mit einer Zunahme der Rate der Enzyminaktivierung und der Depurinierung des Templates verbunden. Hauptsächlich findet die Denaturierung in einem Bereich von Temperaturen während des Ablaufs des Zyklus statt; d. h. während des Anstiegs auf, des Abstiegs von und während der zugewiesenen Denaturierungstemperatur. Die Denaturierungszeiten können durch Berechnen der Rate der Denaturierung vor, während und nach dem Erreichen der angegebenen Denaturierungstemperatur erheblich verringert werden. Dies minimiert den Pegel der Enzyminaktivierung und das Ausmaß der Templat-Depurinierung. Folglich kann die Effizienz der Amplifikation erhöht werden.

Kooperative Wechselwirkungen zwischen den durch Wasserstoffbrückenbindungen aufgestapelten Basenpaaren des doppelsträngigen Templates werden während des Schmelzens zunehmend unterbrochen, bis die zwei Stränge vollständig getrennt sind. Zugehörigkeitsfunktionen (MDenaturierung) für die Templat-Denaturierung können deshalb durch eine sigmoidale Kurve (Fig. 3) mit der Zunahme qDenatunomng und dem Mittelpunkt S(X)Denaturierung definiert werden, welche durch die vorhergesagte Tm und die optimale Denaturierungstemperatur der Templatmoleküle definiert ist. Die Zunahme qDenaturierung und der Mittelpunkt S(X)Denaturierung werden als Modifikatoren der neuronalen Netzwerkkomponente verwendet. Verallgemeinerte Kurven können auch verwendet werden, um Zugehörigkeiten für die Denaturierung zu definieren (z. B. boolesche, trapezoidale, dreieckige und kinetische). In der Regel weist natürliche DNA mit AT- und GC-Basenpaaren Tm-Werte von 72ºC auf. Poly(AT)-Template weisen Tm-Werte von ca. 60ºC auf und Poly(GC)-Template weisen Tm Werte von ca. 90ºC auf.

Hybridisierungs-Zugehörigkeitsfunktionen

Die Hybridisierungs-Zugehörigkeit definiert die Rate der Hybridisierung des Primers an das Templat. Anfänglich wird die Priming-Temperatur Tp (oder Tm - 5ºC) verwendet, um eine optimale Hybridisierung je nach der Länge des Primers zu definieren. In der Regel werden Tp und Tm anhand einer der folgenden Gleichungen berechnet:

- Tp = [22 + 1,46·(2·GC + AT)]

- Tm = 81,5 + 16,6·{(log&sub1;&sub0;[J&spplus;]) + 0,41·(%G + C) - (600/l) - 0,63(%FA)}

- Tm = 81,5 + 16,6·{(log&sub1;&sub0;[J&spplus;]) + 0,41·(%G + C) - 675/l}

- Tm = [(A + T)·2ºC] + [(G + C)·4ºC]

wobei J&spplus; die Konzentration von einwertigen Kationen bedeutet, I die Oligonukleotidlänge ist und FA Formamid ist. Zugehörigkeitsfunktionen für die Hybridisierung (MHybridisierung) werden durch sigmoidale Kurven (Fig. 3) wiedergegeben, deren Maxima durch die Tp oder Tm -5ºC der Primer definiert sind. Verallgemeinerte Kurven können ebenfalls verwendet werden, um Zugehörigkeiten zu definieren (z. B. boolesche, trapezoidale, dreieckige und kinetische). Die Temperaturbereiche, in denen eine Hybridisierung stattfindet, hängen von der Konzentration an freien Magnesiumionen in dem Reaktionsgemisch ab. Der Mittelpunkt S(X)Hydridisierung und die Zunahme qHybridisierung definieren den Temperaturbereich, in dem die Hybridisierung stattfindet und sind mit der Konzentration an freien Mg²&spplus;-Ionen in der Reaktion stark verbunden. Die Zunahme qHybridisierung und der Mittelpunkt s(x)Hybridisierung werden als Modifikatoren der neuronalen Netzwerkkomponente verwendet.

Verlängerungs-Zugehörigkeitsfunktionen

Die Abhängigkeit der Tag-Aktivität von der Temperatur ist bereits von anderen Arbeitsgruppen ausführlich beschrieben worden (siehe "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile THERMUS aquaticus", Chien et al., (1976). Journal of Bacteriology, Band 127, Nr. 3, S. 1550-1557). Zugehörigkeitsfunktionen für die Polymerisation von Duplices werden durch eine Kurve wiedergegeben, deren Maximum durch das Temperaturoptimum definiert ist. Dieses hängt von der speziellen verwendeten Polymerase ab und liegt allgemein im Bereich von ca. 70ºC. Verallgemeinerte Kurven können auch verwendet werden, um Zugehörigkeiten zu definieren (z. B. boolesche, trapezoidale, dreieckige und Glockenkurven).

Fig. 4 zeigt die Werte von Reaktionszugehörigkeiten MDenaturierung, MHybridisierung und MVenängerung über einen einzelnen PCR-Zyklus für Probenrohrtemperaturen zum Zeitpunkt t Sekunden. Die Einstellung der Zeit t zwischen und während dieser Zyklusvorgänge kann verwendet werden, um den Betrag der erzielten Amplifikation zu optimieren. Faktoren, welche die Amplifikation verringern (z. B. die Depurinierung, die Inaktivierung der Taq-Polymerase usw.) werden durch das Optimierungsverfahren verringert, da eine Optimierung eine Verringerung dieser Vorgänge voraussetzt. Neuronale Netzalgorithmen werden verwendet, um festzustellen, welcher dieser Vorgänge den größten Einfluss auf das Ergebnis der Reaktion hat.

Bestimmung von optimalen Profilzeiten unter Verwendung von genetischen Algorithmen

Da Änderungen von einer der Zeiten, die für die Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung festgesetzt werden, den Pegel der Amplifikation ändern, sind Strategien für eine Reaktionsoptimierung nicht offensichtlich oder erfordern eine hohe Rechnerleistung. Das hier beschriebene Verfahren verwendet auf einzigartige Weise genetische Algorithmen, um diese Probleme zu lösen. Eine Population von potentiellen Lösungen für das Problem wird aufrecht erhalten und wiederholt aktualisiert und zwar in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Evolution, d. h. der Selektion, Mutation und/oder Rekombination (Crossover). Die Rekombination wählt Paare von Lösungen in der Population (Eltern) aus und erzeugt eine Folge neuer Lösungen (Kinder) durch Kombination von Elementen ihrer Eltern, die anschließend in eine neue Population von Lösungen eingefügt werden. Das Prinzip der Selektion verlangt, dass "gute" Lösungen gegenüber "schlechten" Lösungen bevorzugt ausgewählt werden. Dies wird durch Definition einer Tauglichkeitsfunktion erreicht, die jeder Lösung eine Zahl zuordnet, je nachdem wie "gut" sie ist. Selektion garantiert, dass sich nur Lösungen (Chromosomen) mit bester Tauglichkeit in zukünftige Populationen fortpflanzen. Mutation wird verwendet, um Lösungen in der Population ohne Interaktion mit dem Rest der Population zu modifizieren. Genetische Algorithmen suchen daher nach Sätzen von Allelen, die zusammen gute Lösungen (co-adaptierte Allele) erzeugen.

Es gibt keine allgemeine Definition genetischer Algorithmen. Sie können durch eine Abstraktion der Arbeit von Holland dargestellt werden (siehe "Adaptation in natural and artificial systems". Holland, (1975). The University of Michigan Press; Ann Arbor). Ein Schema des genetischen Algorithmusses, der bei diesem Prozess verwendet wird, ist in Fig. 5 wiedergegeben und wird durch die folgenden Schritte verkörpert;

i. Initialisierung. Die anfängliche Population von Chromosomen (typischerweise n = 25...100) wird entweder zufällig oder durch "Mischung" eines Eingangschromosoms erzeugt, das von dem später beschriebenen künstlichen neuronalen Netzwerkelement erzeugt wird. Dies vermindert die von dem Algorithmus benötigte Zeit für die Suche eines Optimums.

ii. Bewertung. Die Tauglichkeit jedes Chromosoms wird bewertet. In diesem Fall wird der Betrag der Amplifikation unter Verwendung der zuvor beschriebenen Zugehörigkeitsfunktionen und der Zykluszeiten, die einzelnen Chromosomen zugeordnet sind, berechnet. Diesen werden anschließend Tauglichkeitsfunktionen zugeordnet, die numerisch die Leistungsfähigkeit jedes Chromosoms codieren.

iii. Verwertung. Chromosomen mit dem höchsten Tauglichkeitswert (d. h. der höchsten vorhergesagten Amplifikation für die kürzeste Schrittzeit) werden ein- oder mehrfach in einem Untermengenpaar in halb-zufälliger Weise angeordnet. Zwei Chromosomen werden willkürlich aus der Population herausgenommen. Das Chromosom mit dem höchsten Tauglichkeitswert wird in einem Untermengenpaar angeordnet. Beide Chromosomen werden der Population wieder zugeführt, und der Selektionsprozess wird wiederholt, bis das Untermengenpaar vollständig ist. Dadurch ist sichergestellt, dass Chromosomen mit niedriger Tauglichkeit aus der paarbildenden Population entfernt werden. Die Wahrscheinlichkeit der Auswahl als Elternteil entspricht anteilsmäßig der normalisierten Chromosomtauglichkeit. Dies bedeutet, dass bessere Chromosomen im Allgemeinen mehr Kinder erzeugen werden. Die Zufallseigenschaft des Prozesses bedeutet, dass gelegentlich schlechte Lösungen Kinder erzeugen werden. Die Hinzufügung einer Elitismus- Funktion ist ebenfalls vorteilhaft. Dabei wird die einzelne beste Lösung jeder Elterngeneration unverändert in die Kindergeneration kopiert; alle anderen Kinder werden in normaler Weise erzeugt.

IV. Untersuchung. Dazu werden Rekombinations- und Mutationsoperatoren verwendet, um Chromosomen in der nächsten Chromosomgeneration zu verändern (Fig. 5). Zwei Chromosomen von dem Untermengenpaar werden zufällig ausgewählt und zu einem Paar zusammengefügt. Die Wahrscheinlichkeit der Paarbildung ist eine steuerbare Funktion, der im Allgemeinen ein hoher Wert ( 0,90) zugeordnet wird. Ein Rekombinationsoperator wird verwendet, um Gene zwischen zwei Elternchromosomen zur Erzeugung zweier Kinder auszutauschen. In Fig. 5 ist eine Population aus drei Individuen gezeigt. Jedem ist eine Tauglichkeitsfunktion F zugeordnet. Basierend auf diesen Tauglichkeiten ordnet die Selektionsphase dem ersten Individuum 0 Kopien, dem zweiten 2 Kopien und dem dritten 1 Kopie zu. Nachdem genetische Selektionsoperatoren nach der Wahrscheinlichkeit angewendet werden; wird bei dem ersten Individuum das erste Bit von 1 auf 0 mutiert, und ein Crossover kombiniert die zweiten beiden Individuen zu neuen. (Verändert aus Forrest (1993). Science, Bd. 261, S. 872-878).

Die Rekombination kann Ein-Punkt- und/oder Zwei-Punkt-Crossover umfassen (Fig. 6). Wo ein Ein-Punkt-Crossover verwendet wird, wird ein Crossoverpunkt entlang des Chromosoms ausgewählt, und die Gene bis zu dem Punkt werden zwischen beiden Eltern ausgetauscht. Wo ein Zwei-Punkt-Crossover auftritt, werden zwei Crossoverpunkte ausgewählt, und die Gene zwischen den beiden Punkten ausgetauscht. Andere Crossoveralgorithmen, wie ein Teilabbildungscrossover (PMX), ein order-Crossover (OX) und ein Zykluscrossover (CX) können ebenfalls verwendet werden. Alle Kinder werden durch Crossover zweier Eltern erzeugt; zwei Kinder werden gleichzeitig erzeugt. Die Kinder ersetzen anschließend die Eltern in der nächsten Generation. Die Mutation einzelner Gene ist eine andere steuerbare Funktion. Mutationsraten wird im Allgemeinen eine niedrige Wahrscheinlichkeit ( 0,001) zugeordnet und können durch (N*LI2)&supmin;¹ definiert werden, wobei N die Populationsgröße darstellt und L die Länge des Chromosoms angibt.

V. Diese Folge von Ereignissen wird für eine feste Anzahl von Generationen wiederholt, bis Konvergenz auftritt. Eine Überbevölkerungs-Erneuerung kann verwendet werden, um das Problem vorzeitiger Konvergenz zu vermindern. Ein Kind wird mit einer Anzahl vorhandener Eltern verglichen und ersetzt ein Elternteil, das ihm am meisten ähnlich ist. Im Wesentlichen ersetzt eine Überbevölkerungs-Emeuerung gleiches mit gleichem, dies erlaubt Unterpopulationen, verschiedene Teile des genetischen Suchraums zu erobern. Dies ist besonders bei multimodalen Suchräumen nützlich, bei denen es eine Anzahl verstreuter Tauglichkeitsmaxima gibt.

Die Grundstruktur des verwendeten genetischen Algorithmusses kann folgendermaßen formalisiert werden;

Initialisiere Population

Bewerte Chromosomen

Berechne normalisierte Tauglichkeit

Gib Statistik über die Population aus

Für jede nachfolgende Generation

{

Erzeuge und bewerte Kandidatenersetzungen

Ersetze Anzahlen der Populationen mit Kandidaten

Bewerte unveränderte Mitglieder wiederholt

Normalisiere Tauglichkeit

Gib Statistik über die Population aus

}

Jede Zeit in dem Zyklusprofil (Allele; t&sub1;...t&sub6;) wird in Bits I = {0,1} gemäß der Min/Max-Zeit, die für bestimmte Stufen im Zyklus zulässig ist, und der erforderlichen Zeitauflösung (Tabelle 1)¹ umgewandelt. Diese werden anschließend zusammen gruppiert, um Bitstrings (Chromosome) zu bilden, die das gesamte Zeitprofil eines einzelnen Zyklusses darstellen. Zu Beginn wird eine zufällige Population von Strings gemäß den minimalen und maximalen Zeiten, die für jede Stufe zulässig sind, erzeugt. Das neuronale Netzwerk kann nach dem Training verwendet werden, um Anfangszeiten gemäß den Zugehörigkeitsfunktionen einzustellen, die den Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Verlängerungs-Schritten zugeordnet sind (Anmerkung: eine traditionelle binäre Codierung hat den Nachteil, dass unter bestimmten Umständen alle Bits verändert werden müssen, um die Zahl um 1 zu verändern. Dies macht es für ein Individuum schwierig, das sich nah an einem Optimum befindet, sich durch Mutation weiter anzunähern. Die Verwendung von Gray Codes wird bevorzugt, da die Erhöhung oder Erniedrigung jeder Zahl um 1 immer eine Ein-Bit-Veränderung darstellt.)

Tabelle 1: Bitdatencodierung tn der Zeit, die von dem Thermocycler zur Erwärmung von der Hybridisierung (72ºC) zur Denaturierung (94ºC) benötigt wird. Die maximal zulässige Zeit wird auf 120 Sekunden eingestellt (5ºC sek&supmin;¹-Anstieg).

Die minimalen Zeiten für jeden Vorgang in dem Zyklus liegen durch die Leistungsfähigkeit des Thermocyclers fest. Im Allgemeinen werden minimale Anstiegsgeschwindigkeiten zwischen 0,5ºC sek&supmin;¹ und 1ºC sek&supmin;¹ eingestellt. Maximale Anstiegsgeschwindigkeiten müssen im Allgemeinen nicht höher als 5ºC sek&supmin;¹ eingestellt werden. Die maximale Zeit für Zyklusvorgänge hängt demnach von der Anstiegsgeschwindigkeit und dem Temperaturunterschied zwischen aufeinanderfolgenden Schritten ab.

Die Amplifikation wird unter Verwendung der Zeitprofile, die jedem Chromosom in der Population zugeordnet sind, und den zuvor beschriebenen Zugehörigkeitsfunktionen modelliert. Ein Tauglichkeitswert wird basierend auf der maximal erreichten Amplifikation unter Verwendung der kürzestmöglichen Zeit und unter Aufrechterhaltung einer minimalen Einwirkung von Extremen des Temperaturprofils, die fehlerhaftes Priming (Mispriming), Inaktivierung und Depurinierung begünstigen, gebildet. Unter bestimmten Umständen kann es vorteilhaft sein, andere Tauglichkeitsmerkmale zu definieren (z. B. mit RAPDs, differenzielle Anzeige usw. kann es notwendig sein, Mispriming-Ereignisse zu fördern). Sobald alle Individuen in der Population bewertet wurden, werden ihre Tauglichkeiten als Basis für die Auswertung und Verwertung verwendet, um Chromosome für nachfolgende Selektionsrunden auszuwählen. Nach einer bestimmten Anzahl von Iterationen sind die optimalen Zeitprofile mit hoher Häufigkeit in der Chromosomenpopulation vertreten.

Auswahl des neuronalen Netzwerkes

Diese Anwendung verwendet ein feed-forward-Neuronales Netzwerk mit einer Eingangsschicht, einer oder mehreren Zwischenschichten (hidden layer) und einer Ausgangsschicht (Fig. 7). Jeder Knoten besitzt eine Reihe gewichteter Eingänge wi, die externe Signale oder die Ausgabe anderer Knoten darstellen. Die Anzahl der Zwischenknoten ist ein einstellbarer Parameter. Die Summe der gewichteten Eingänge wird unter Verwendung einer nicht linearen Sigmoidal-Transformationsfunktion transformiert;

wobei f(x) einen Bereich von 0 bis 1 hat, x die gewichtete Summe der Eingänge darstellt und q die Zunahme ist. Eine Modifikation von q verändert die Form der Kurve. Ein kleiner Wert von q gibt der Sigmoidal-Funktion eine steile Steigung (z. B. g = 1,0). Ein großer Wert für q dagegen gibt der Kurve eine flache Steigung (z. B. g = 2,0). Eingaben stellen Übergangszeiten für temperaturgesteuerte Vorgänge und die Temperaturbereiche dieser Vorgänge dar (Fig. 8). Es gibt für jede Variable einen Eingangsknoten. Die Eingangsknoten übertragen die gewichteten Eingangssignale zu den Knoten in den Zwischenschichten. Eine Verbindung zwischen Knoten i in der Eingangsschicht und Knoten j in der Zwischenschicht wird durch den Gewichtungsfaktor wji dargestellt. Daher gibt es einen Vektor von Gewichten wj für jeden der J Knoten in der Zwischenschicht. Diese Gewichte werden beim. Trainingsprozess eingestellt. Jede Schicht besitzt außerdem eine Voreinstellungseingang, um sich an nicht-Null-Versätze in den Daten anzupassen. Der Wert dieser Voreinstellung ist anfangs immer auf Null gesetzt. In dem Gewichtsvektor ist ein Ausdruck enthalten, um die Voreinstellung mit der entsprechenden Schicht zu verknüpfen. Dieses Gewicht wird ebenfalls während der Trainingszeit eingestellt. Andere Funktionen (Tan h, sin, Kosinus, linear, usw.) können verwendet werden.

Während eines anfänglichen Trainingsverfahrens wird dem Netzwerk in iterativer Weise eine Folge von Eingangsmustem mit ihren entsprechenden erwarteten Ausgaben zugeführt, wobei die Gewichte angepasst werden. Dies wird fortgeführt, bis der gewünschte Wahrnehmungspegel zwischen erwarteten und beobachteten Ausgaben erreicht wurde. Es können unterschiedliche Lemalgorithmen verwendet werden, jedoch ist die Backpropagation der aktuell bevorzugte Algorithmus. Der Fehler in der erwarteten Ausgabe wird unter Verwendung der verallgemeinerten Delta-Regel durch das Netzwerk zurückgeführt, um die Einstellung der Gewichte zu bestimmen (siehe "Parallel distributed processing explorations in the microstructure of cognition". Teil 1. Rumelhart und McClelland, (1986). MIT Press: Cambridge, MA). Der Ausgabeschichtausdruck ist gegeben durch;

δpk = (tpk - opk)opk(1 - opk)

wobei δpk der Fehlerterm für die Beobachtungen p am Ausgangsknoten k ist, tpk die erwartete Ausgabe für die Beobachtungen p ist und opk die aktuelle Knotenausgabe ist. opk (1-opk) ist aus der Sigmoidal-Funktion abgeleitet. Der Fehlerterm am Knoten j der Zwischenschicht ist aus der Sigmoid-Funktion, die mit der Summe der Produkte der Ausgangsfehlerterme und der Gewichte in der Ausgangsschicht multipliziert wird, abgeleitet;

δpj = opj{1-opj) δpkWkj

Die Fehlerterme der Ausgabe und der Zwischenschichten werden durch das Netzwerk über Anpassung der Gewichte der entsprechenden Schichten zurückgeführt. Gewichtsanpassungen oder Delta-Gewichte werden berechnet gemäß;

ΔWji(n) = ηδpjopi + αΔWji(n - 1)

wobei Δwj, die Änderung des Gewichts zwischen dem Knoten j in der Zwischenschicht und dem Knoten i in der Eingangsschicht darstellt, η die Lernrate ist, δpj der Fehlerterm für Beobachtung p am Knoten j der Zwischenschicht ist, opi die beobachtete Ausgabe des Knotens i der Eingangsschicht der Beobachtung p ist und α die Eigendynamik ist.

Die Ausdrücke n und n-1 beziehen sich jeweils auf die aktuelle Iteration und die vorhergehende Iteration. Die Zuführung des gesamten Satzes von p Trainingsbeobachtungen wird wiederholt, wenn die Anzahl der Iterationen n p überschreitet. Ein ähnliches Verfahren wird zur Anpassung der Gewichte verwendet, die die Zwischenschichten der Knoten mit der nächsten Zwischenschicht verbinden und zwischen der letzten Zwischenschicht und der Ausgangsschicht. Allen Gewichten werden anfänglich Zufallswerte vor dem Training zugewiesen.

Die neuronalen Netzwerkalgorithmen werden verwendet, um Zugehörigkeitsfunktionen Zeitprofilen zuzuordnen, die jede Amplifikationsstufe definieren. Nach dem Training kann dieses Verfahren verwendet werden, um den Amplifikationspegel mit einem hohen Genauigkeitsgrad vorherzusagen. Ein Vergleich der vorhergesagten Amplifikationspegel mit einer Echtzeitüberwachung kann verwendet werden, um die Reaktionen weiter zu optimieren.

Die Verfahren, die von B. D. COBB, J. M. CLARKSON: "A simple procedure for optimising the polymerase chain reaction (PCR) using modified Taguchi methods", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1994, Bd. 22, Nr. 18, Seiten 3801-3805 beschrieben wurden, geben schnelle Verfahren zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener Reaktionskomponenten auf den Amplifikationspegel an, der von einer Reaktion erhalten wird. Dies kann verwendet werden, um das neuronale Netzwerkelement dieses Prozesses zu trainieren. Das neuronale Netzwerk entnimmt Schlüsselinformation aus der Reaktion, um Amplifikationspegel vorherzusagen. Ein Netzwerk mit fünf Eingängen und zwei Zwischenschichten wurde unter Verwendung eines 5, 5, 3, 1 -Formates verwendet, um die Amplifikation aus Hybridisierungstemperatur-, Templat-, Primer-, dNTP- und Mg²&spplus;- Konzentrationsdaten vorherzusagen. 27 Trainingsreaktionen wurden unter Verwendung der in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

Tabelle 2: Reaktionsbedingungen-Amplifikationspegel, die zum Trainieren eines aus vier Schichten bestehenden neuronalen Netzwerks mit 5 Eingangsknoten, 2 Zwischenschichten mit 5 und 3 Knoten und einer einzigen Ausgangsschicht verwendet wurden.

Dem Betrag der Amplifikation, der aus jeder dieser Reaktionen erhalten wurde, wurde ein Wert basierend auf einem System von 0 bis 5 zugewiesen. Diese Daten wurden verwendet, um ein neurales Netzwerk unter Verwendung der Backpropagation und sigmoidaler Übertragungsfunktionen zu trainieren, obwohl dieser Prozess nicht auf diese Übertragungsfunktionen und Lernalgorithmen eingeschränkt ist. Die Fig. 9 bis 15 zeigen die Ausgabe des neuralen Netzwerks während des Trainings und wie sich jede der Eingaben auf eine der anderen bezieht. Gemäß diesen Daten ist die optimale Temperatur für die Reaktion eindeutig bei ca. 50ºC. Netzwerkinformation ist in den Tabellen 3 bis 5 beschrieben. (N. B. genetische Datenalgorithmen können verwendet werden, um Reaktionsoptimas durch Überprüfung eines weiten Bereichs von Eingangssignalen und Auswahl der maximalen Ausgaben zu definieren).

Tabelle 3: Netzwerk-Trainingsinformation

Netzwerkname: kein Name

Anzahl der Schichten: 4

Eingangsschicht:

Knoten: 5

Übertragungsfunktion: Linear

Zwischenschicht 1:

Knoten: 5

Übertragungsfunktion: Sigmoid

Zwischenschicht 2:

Knoten: 3

Übertragungsfunktion: Sigmoid

Ausgangsschicht:

Knoten: 1

Übertragungsfunktion: Sigmoid

Verbindungen: FULL

Trainingsinformation:

Iterationen: 775

Trainingsfehler: 0,002895

Lernrate: 0,111424

Eigendynamikfaktor: 0,800000

Fast-Prop Coef: 0,000000

Eingangsknotendatei: C:/Qnet97t/samples/PCR Input.txt

Eingangsstartspalte: 1

Normalisiere Eingaben: JA

Ausgangsknotendatei: C:/Qnet97t/samples/PCR Output.txt

Ausgangsstartspalte: 1

Normalisiere Ausgaben: JA

Trainingsmuster: 27

Überprüfungsmuster: 0

Tabelle 4: Trainingsziele und vorhergesagte Ausgaben für PCR-Amplifikation unter Verwendung eines aus vier Schichten bestehenden Neuronalen Netzes.

Tabelle 5: Netzwerkgewichte und Anpassungsdeltas. Netzwerkgewichte und aktuelle Einstellungsdeltas

Netzwerkname: KEIN NAME

Iteration: 10000

Anwendungen

Gegenwärtig ist die größte Herausforderung für PCR-Methoden die Entwicklung einer "intelligenten" Geräteausstattung, welche das Profil der Temperaturzyklen steuern kann, um den Pegel der Amplifikation zu optimieren. Gegenwärtig erfordert dies einen hohen technischen Aufwand, um die Zyklusbedingungen zu definieren. Optima werden durch wiederholte Versuch und Irrtum-Experimente herausgefunden. Dies ist aufwändig im Hinblick auf die Laborzeit, die Zeit der Bedienungsperson und die Verbrauchsgüter. Es werden nur selten optimale Bedingungen gefunden und falls suboptimale Bedingungen verwendet werden, ist die anschließende Interpretation und/oder Analyse der Amplifikationsergebnisse schwierig.

Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um die Thermozyklusbedingungen durch eine intelligente Steuerung der Zyklusbedingungen zu optimieren. Es nutzt die Tatsache aus, dass die Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung nicht auf festgelegte Temperaturen in dem Zyklus beschränkt sind, sondern sich über einen Bereich von Temperaturen in dem Profil erstrecken. Das Modellieren dieser Vorgänge über den gesamten Zyklus ermöglicht die Optimierung der Zeiten, die für jeden Vorgang zulässig sind. Fehlerhaftes Priming, Inaktivierungs- und Depurinierungsvorgänge werden infolge der Optimierung verringert, indem die Einwirkung von Bedingungen, welche diese Vorgänge fördern, herabgesetzt wird. Dieses Verfahren kann dadurch weiter verfeinert werden, dass der Unterschied zwischen der Block- und der Probentemperatur berücksichtigt wird. Es gibt eine beträchtliche Verzögerung zwischen den beiden, was eine erhebliche Auswirkung auf den Pegel der Amplifikation hat.

Einzelheiten über das Reaktionsgemisch, die Konzentration von Mg²&spplus;, dNTP, die Primersequenz, Templatdaten usw. werden verwendet, um die Zugehörigkeitsfunktionen zu definieren. Die Reaktionsdaten und die vorhergesagte Templatgröße werden verwendet, um die Reaktion zu modellieren und den Pegel der Amplifikation zu bestimmen. Genetische Algorithmen werden verwendet, um das Zeitprofil der Zyklen zu optimieren. Dies beseitigt das Erfordernis einer Programmierung durch das Bedienungspersonal und ergibt einen Rahmen für eine Programmstandardisierung.

Eine Kombination einer Online-Überwachung der Amplifikation mit diesem Verfahren kann verwendet werden, um optimale Amplifikationsbedingungen in Echtzeit dynamisch aufrecht zu erhalten. Dies findet besondere Verwendung in diagnostischen Anwendungen, bei denen die Aufrechterhaltung der Integrität der Amplifikation ein wichtiger Faktor für die Qualitätskontrolle ist. Ein Vergleich der erwarteten und der erzielten Amplifikation kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Reaktionsleistung gefährdet ist. Diese Information kann verwendet werden, um entweder die Zyklusbedingungen zu aktualisieren, um eine optimale Amplifikation aufrecht zu erhalten, und/oder um den Anwender auf das Problem hinzuweisen.

Zu zukünftigen Herausforderungen für Nukleinsäureamplifikations-Technologien (NAA- Technologien) gehören die Dezentralisierung von Analyseeinrichtungen in Krankenhauslaboratorien, mit denen hohe Kosten im Hinblick auf den Laborraum und den Einsatz von technischem Bedienungspersonal verbunden sind, hin zu einer Anwendung vor Ort (z. B. in lokalen Gesundheitszentren). Damit geht eine Reihe von Problemen einher. Ungünstige Betriebsbedingungen, Unterschiede bei der Probenaufbereitung und Fehler des Bedienungspersonals verändern allesamt die Amplifikation und die anschließende Interpretation der Daten. Das Erfordernis von robusten Amplifikationsbedingungen und Qualitätskontrollverfahren, welche Änderungen der Betriebsumgebung kompensieren, fördert die Akzeptanz von Diagnostika auf PCR-Basis.

Als qualitativer Test müssen wichtige Leistungscharakteristika verstanden und für jede Anwendung definiert werden. Die Art der Probe und das klinische Umfeld kann die Interpretation von NAA-Tests beeinflussen. Falschnegative PCR-Ergebnisse sind häufig die Folge der Anwesenheit von Inhibitoren in der klinischen Probe, von Änderungen der Betriebsumgebung oder von Fehlern des Bedienungspersonals. Falschpositive Ergebnisse können von einer Kontamination der Reagenzien mit Zielsequenzen herrühren. Die Empfindlichkeitsgrenze (z. B. die Empfindlichkeit gegenüber der Anzahl der Genkopien, der Hybridisierungstemperatur usw.) und die Zone mit schlechter Reproduzierbarkeit in der Umgebung dieser Grenze kann anhand der PCR-Leistungscharakteristika definiert werden. Diese Charakteristika ergeben zusammen mit der Art der Probe und dem klinischen Verwendungszweck des Tests einen Rahmen, in dem eine Qualitätskontrolle in Erwägung gezogen werden kann. Unsere Anwendung stellt die Grundlage für das Aufrechterhalten einer optimalen Amplifikation dar, wobei rasch die Faktoren ermittelt werden, welche die Ausschlussgrenzen für bestimmte Amplifikationen steuern.

Reaktionen, die durch unser Verfahren optimiert sind, weisen eine inhärent erhöhte Robustheit auf. Dieses Verfahren kann deshalb als Grundlage eines standardisierten Optimierungsverfahrens verwendet werden. Die Robustheit gegenüber Variablen wie der Variation der Leistung des Zyklusgeräts, usw. steigern die Spezifität und Empfindlichkeit. Außerdem kann eine große Menge an Information unter Verwendung dieser Methode gewonnen werden, welche die Grundlage für eine stringente Qualitätskontrolle der Reaktionsleistung ergibt. Wichtige Information über die Leistung des Thermocyclers, eine Variation wesentlicher Komponenten des Reaktionsgemisches, die Betriebsumgebung und den Pegel des Nukleinsäurematerials, das für den Test bereit gestellt wird, kann aus einer begrenzten Anzahl von Reaktionen erhalten werden. Von Bedeutung ist, dass das bevorzugte Verfahren ein Mittel zum "Einbauen" der Fähigkeit liefert, unter verschiedenen Bedingungen zu arbeiten. Es gestattet auch eine Rückkopplungs- Optimierung nachfolgender Tests durch kontinuierliches Überwachen der Leistung des Testverfahrens.

Die Offenbarung in der britischen Patentanmeldung Nr. 9720926.6, von der diese Anmeldung die Priorität beansprucht, und in der Zusammenfassung, die dieser Anmeldung beigefügt ist, ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Optimieren von Zyklusbedingungen, die zum Steuern einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verwendet werden, durch:

Zuweisen normalisierter Zugehörigkeitswerte zu Denaturierungs-, Hybridisierungs- (Annealing) und Verlängerungs-Vorgängen, wobei der relative Beitrag von jedem Vorgang in Abhängigkeit von der Probentemperatur und der Zeit für einen einzelnen PCR-Zyklus festgelegt wird;

Definieren von Populationen von Bit-String-Chromosomen, wobei jedes Chromosom das gesamte Zeitprofil (t&sub1;-t&sub6;) eines einzelnen PCR-Zyklus darstellt; und

Entwickeln der Populationen unter Verwendung von genetischen Algorithmen, wodurch die optimalen Zeiten, die erforderlich sind, um jeden Vorgang zu vervollständigen, durch Modellieren der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Zeitprofile und der Zugehörigkeitswerte bestimmt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei neuronale-Netzwerk-Algorithmen verwendet werden, um die Zugehörigkeitswerte den Zeitprofilen (t&sub1;-t&sub6;) zuzuordnen und um die PCR-Amplifikation mittels eines dafür vorhergesagten Pegels zu bestätigen und/oder zu modifizieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die relativen Beiträge der Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung durch die Zuweisung von Zugehörigkeitswerten berechnet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Zugehörigkeitswerte verwendet werden, um die relativen Beträge der Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung zu bestimmten Zeitpunkten oder über eine Reihe von Zeitpunkten zu bestimmen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei genetische Algorithmen verwendet werden, um die optimalen Zeiten für die Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung zu bestimmen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren verwendet wird, um Zeiten zu standardisieren, die für PCR-Protokolle verwendet werden, oder um PCR-Protokolle zu optimieren.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren verwendet wird, um Protokolle von einem Thermocycler zu einem anderen zu übertragen, wobei die relativen Beiträge der Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung zuerst berechnet werden, wobei das thermische Verhalten des Ausgangscyclers berücksichtigt wird, und anschließend auf den Zielcycler übertragen werden, wobei die Unterschiede des Verhaltens der Cycler berücksichtigt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine Online-Überwachung verwendet wird, um Rückkopplungsinformation über die Leistung einer Reaktion bereitzustellen, um eine Feineinstellung der berechneten Zykluszeiten zu ermöglichen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ein neuronales Netzwerk verwendet wird, um Information über optimale Zyklusbedingungen zu erlangen.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein neuronales Netzwerk verwendet wird, um den berechneten Pegel der Amplifikation zu berechnen, zu bestätigen oder zu modifizieren.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein neuronales Netzwerk verwendet wird, um quantitative Vorhersagen der DNA-Amplifikationspegel für einen bestimmten Satz von Reaktionskriterien zu machen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei Trainingseingaben für das neuronale Netzwerk Daten aus einer orthogonalen Matrix sind und Ausgaben den quantitativen Pegel der Amplifikation darstellen, der von einer zugehörigen PCR erhalten wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei eine orthogonale Matrix verwendet wird, um die Anzahl der Trainingseingaben für das neuronale Netzwerk zu verringern.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die relativen Beiträge der Reaktionskomponenten und Zyklusparameter für die DNA-Amplifikation bestimmt werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Abweichung von vorhergesagten Optima als Qualitätsanzeige beim Identifizieren von Veränderungen der Systemleistung verwendet wird.

16. System zum Optimieren von Zyklusbedingungen, die zum Steuern einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verwendet werden, umfassend eine Verarbeitungseinrichtung, die in der Lage ist, normalisierte Zugehörigkeitswerte für Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Verlängerungsvorgänge zuzuweisen, wobei der relative Beitrag von jedem Vorgang in Abhängigkeit von der Probentemperatur und der Zeit für einen einzelnen PCR-Zyklus festgelegt wird; Mittel zum Definieren von Populationen von Bit-String-Chromosomen, wobei jedes Chromosom das gesamte Zeitprofil (t&sub1;-t&sub5;) eines einzelnen PCR-Zyklus darstellt; und Mittel zum Entwickeln der Populationen unter Verwendung von genetischen Algorithmen, um die optimalen Zeiten, die erforderlich sind, um jeden Vorgang zu vervollständigen, durch Modellieren der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Zeitprofile und der Zugehörigkeitswerte zu bestimmen.

17. System wie in Anspruch 16 beansprucht, das außerdem Mittel umfasst, die neuronale-Netzwerk-Algorithmen zum Zuordnen der Zugehörigkeitswerte zu den Zeitprofilen (t&sub1;-t&sub6;) und zum Bestätigen und/oder Modifizieren der PCR-Amplifikation über den dafür vorhergesagten Pegel bereitstellen.







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