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DURCH ENZYMKATALYSE ERHALTENE THERAPEUTISCHE SUBSTANZEN. - Dokument DE69900841T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69900841T2 02.10.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 1045897
Titel DURCH ENZYMKATALYSE ERHALTENE THERAPEUTISCHE SUBSTANZEN.
Anmelder Newbiotics Inc., San Diego, Calif., US
Erfinder SHEPARD, Michael, H., Rancho Santa Fe, US;
GROZIAK, P., Michael, Pala Alto, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69900841
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.01.1999
EP-Aktenzeichen 999041957
WO-Anmeldetag 22.01.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/01332
WO-Veröffentlichungsnummer 0009937753
WO-Veröffentlichungsdatum 29.07.1999
EP-Offenlegungsdatum 25.10.2000
EP date of grant 30.01.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.10.2002
IPC-Hauptklasse C12N 9/10
IPC-Nebenklasse C12N 9/12   C12N 5/18   C07H 19/04   C07H 19/06   C07H 19/044   A61K 51/00   A01N 43/04   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Arzneimittel-Entwicklung und im Speziellen die Konstruktion von Prodrugs, die Substrate für ein intrazelluiäres Enzym sind, das für die Resistenz gegen Therapeutika bei pathologischen Zellen entscheidend sind und vom intrazellulären Enzym in ein Zelltoxin urrigewandelt werden.

Hintergrund

In der vorliegenden Offenbarung wird immer wieder auf verschiedene Publikationen verwiesen, bei denen zunächst Autor und Datum, gefolgt von der Patentnummer oder Veröffentlichungsnummer, angegeben sind. Die vollständige bibliographische Information für jeden Verweis ist in der Beschreibung oder am Ende der vorliegenden Anmeldung, unmittelbar vor den Ansprüchen, zu finden. Diese Veröffentlichungen wurden aufgenommen, um den Stand der Technik auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, umfassender zu beschreiben.

Krebszellen sind durch unkontrolliertes Wachstum, Dedifferenzierung und genetische Instabilität gekennzeichnet. Die Instabilität findet ihren Niederschlag in anomaler Chromosomenanzahl, Chromosomen-Deletionen, -Umordnungen, -Verlust oder -Duplikation über die normale diploide Anzahl hinaus. D. J. Wilson et al. (1991). Diese genomische Instabilität kann durch mehrere Faktoren verursacht sein. Einer der am besten Charakterisierten ist die erhöhte genomische Plastizität, die beim Verlust der Tumorsuppressions- Genfunktion auftritt (z. B. A. Almasan et al. (1995)). Die genomische Plastizität führt dazu, dass sich Tumorzellen an ihre sich verändernde Umgebung anpassen können, und kann häufigere Mutation, Amplifikation von Genen und die Bildung extrachromsomaler Elemente ermöglichen. (K. A. Smith et al. (1995) und J. D. Wilson et al. (1991)). Diese Merkmale führen zu Mechanismen, die eine aggressiverer Malignität ergeben, weil sie es den Tumoren ermöglichen, rasch Resistenz gegen natürliche Wirtsverteidigungsmechanismen, biologische Therapien (J. D. Wilson et al. (1991) und H. M. Shepard et al. (1988)) sowie Chemotherapeutika (A. Almasan et al. (1995) und J. D. Wilson et al. (1991)), zu entwickeln.

Krebs ist weltweit eine der häufigsten tödlichen Erkrankungen beim Menschen. Die Behandlung mit krebshemmenden Arzneimitteln ist eine Option, die zunehmend an Bedeutung gewinnt, insbesondere für systemische Malignitäten oder für metastatische Krebse, die nicht mehr chirurgisch heilbar sind. Unglücklicherweise ist die Untergruppe von Krebsarten beim Menschen, die durch Behandlung geheilt werden kann, heute immer noch eher klein (C. M. Haskell (Hrsg.; 1995), S. 32). Der Fortschritt bei der Entwicklung von Arzneimitteln, mit denen Krebs beim Menschen geheilt werden kann, erfolgt nur langsam. Die Heterogenität bösartiger Tumoren in Bezug auf ihre Genetik, Biologie und Biochemie sowie ihre primäre oder durch Behandlung herbeigeführte Resistenz gegen Therapie beeinträchtigen die heilende Behandlung. Darüber hinaus weisen viele Antikrebs-Arzneimittel nur einen sehr niedrigen Selektivitätsgrad auf, haben oft starke oder sogar lebensbedrohende toxische Nebenwirkungen, so dass es unmöglich ist, Dosen einzusetzen, die hoch genug sind, um Krebszellen abzutöten. Die Suche nach antineoplastischen Mitteln mit verbesserter Selektivität für gegen Behandlung resistente pathologische bösartige Zellen ist daher nach wie vor eine zentrale Aufgabe der Arzneimittel-Entwicklung. Außerdem wird die weitverbreitete Resistenz gegen Antibiotika zunehmend zu einem wichtigen, weltweiten Gesundheitsproblem (M. Segovia (1994) und D. R. Snydman et al. (1996)).

Klassen von Chemotherapeutika

Zu den wichtigsten Klassen von Mitteln gehören Alkylierungsmittel, Antitumor-Antibiotika, Pflanzenalkaloide, Antimetaboliten, Hormon-Agonisten und -Antagonisten sowie eine Vielzahl verschiedener anderer Mittel. Siehe C. M. Haskell (Hrsg.; 1995) und R. T. Dorr und D. D. Von Hoff (Hrsg.; 1994).

Die klassischen Alkylierungsmittel sind hochreaktive Verbindungen, die die Fähigkeit besitzen, die Wasserstoffatome bestimmter organischer Verbindungen durch Alkylgruppen zu ersetzen. Die Alkylierung von Nucleinsäuren, insbesondere DNA, ist bei den meisten dieser Verbindungen die entscheidende zytotoxische Wirkung. Der Schaden, den sie verursachen, beeinträchtigt die DNA-Replikation und RNA-Transkription. Die klassischen Alkylierungsmittel sind Mechlorethamin, Chlorambucil, Melphalan, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Thiotepa und Busulfan. Es gibt auch eine Reihe nicht-klassischer Alkylierungsmittel, die DNA und Proteine schädigen, aber über diverse und komplexe Mechanismen, wie z. B. Methylierung oder Chlorethylierung, die sie von den herkömmlichen Alkylatoren unterscheiden. Zu den nicht-klassischen Alkylierungsmitteln gehören Decarbazin, Carmustin, Lomustin, Cisplatin, Carboplatin, Procarbazin und Altretamin.

Viele klinisch nützliche Antitumor-Arzneimittel sind natürliche Produkte verschiedener Stämme des Bodenpilzes Streptomyces. Ihre tumorizide Wirkung wird durch einen oder mehrere Mechanismen hervorgerufen. Alle Antibiotika sind zur Bindung von DNA fähig, üblicherweise durch Interkalation, gefolgt vom Aufdrehen der Helix. Diese Verwindung beeinträchtigt die Fähigkeit der DNA, als Templat für DNA-Synthese, RNA-Synthese oder beides zu wirken. Diese Arzneimittel können DNA auch durch die Bildung freier Radikale und die Chelatierung wichtiger Metallionen schädigen. Sie können auch als Inhibitoren für Topoisomerase II, ein für die Zellteilung entscheidendes Enzym, fungieren. Zu den Arzneimitteln dieser Klasse gehören Doxorubicin (Adriamycin), Daunorubicin, Idarubicin, Mitoxantron, Bleomycin, Dactinomycin, Mitomycin C, Plicamycin und Streptozocin.

Einige der nützlichsten antineoplastischen Mittel werden von Pflanzen geliefert. Drei Gruppen von Mitteln aus dieser Klasse sind die Vinca-Alkaloide (Vincristin und Vinblastin), die Epipodophyllotoxine (Etoposid und Teniposid) und Paclitaxel (Taxol). Die Vinca-Alkaloide binden sich an mikrotubuläre Proteine, die in sich teilenden Zellen und dem Nervensystem zu finden sind. Diese Bindung ändert die Dynamik der Tubulin-Addition und Verluste an den Enden von Mitosespindeln, was schlussendlich zur Mitose- Unterbrechung führt. Ähnliche Proteine bilden einen beträchtlichen Teil des Nervengewebes; daher sind diese Mittel neurotoxisch. Die Epipodophyllotoxine hemmen Topoisomerase II und haben daher tiefgreifende Wirkungen auf die Zellfunktion. Paclitaxel weist komplexe Wirkungen auf Microtubuli auf.

Die Antimetaboliten sind Strukturanaloge normaler Metaboliten, die für die Zellfunktion und -replikation erforderlich sind. Sie arbeiten typischerweise durch Wechselwirkung mit Zellenzymen. Zu den vielen Antimetaboliten, die entwickelt und klinisch getestet worden sind, gehören Methotrexat, 5-Fluoruracil (5-FU), Floxuridin (FUDR), Cytarabin, 6-Mercaptopurin (6-MP), 6-Thioguanin, Desoxycoformycin, Fludarabin, 2-Chlordesoxyadenosin und Hydroxyharnstoff.

Endokrine Manipulation stellt eine wirksame Therapie für mehrere Formen neoplastischer Erkrankungen dar. Für die potentielle Verwendung in der Onkologie ist eine große Vielzahl von Hormonen und Hormon-Antagonisten entwickelt worden. Beispiele für verfügbare hormonelle Mittel sind Diethylstilbestrol, Tamoxifen, Megestrolacetat, Dexamethason, Prednison, Aminoglutethimid, Leuprolid, Goserelin, Flutamid und Actreotidacetat.

Nachteile der heutigen Chemoterapeutika

Zu den Problemen, die heute mit der Verwendung von Chemotherapeutika zur Krebsbehandlung verbunden sind, gehören die hohen erforderlichen Dosen; die Toxizität gegenüber normalen Zellen, d. h. die mangelnde Selektivität; Immunsuppression; sekundäre Malignitäten; und die Arzneimittel-Resistenz.

Die Mehrzahl der heute in der Krebs-Chemotherapie verwendeten Mittel wirkt über einen antiproliferativen Mechanismus. Toxizität resultiert daraus, dass viele normale Zelltypen (z. B. Kolonepithel, hämatopoetische Zellen) eine hohe Proliferationsrate aufweisen. Aufgrund der Wirtstoxizität muss die Behandlung bei Dosismengen abgebrochen werden, die weit unter der Dosis liegen, die zum Abtöten aller lebensfähiger Tumorzellen erforderlich wäre.

Eine weitere Nebenwirkung, die mit heutigen Therapien einhergeht, ist die toxische Wirkung des Chemotherapeutikums auf die normalen Wirtsgewebe, die sich am raschesten teilen, wie das Knochenmark, die Darmschleimhaut und Zellen des Lymphoidsystems. Diese Mittel haben auch eine Vielzahl anderer Nebenwirkungen, einschließlich Neurotoxizität; Beeinträchtigung der Sexualität und Gonadenfunktion; sowie Herz-, Lungen-, Pankreas- und Leber-Toxizitäten; Gefäß- und Hypersensitivitätsfunktionen sowie dermatologische Reaktionen.

[Smith et al., JNCI 74, 341-347 (1985)]

Hämatologische Toxizität ist bei vielen der antineoplastischen Arzneimittel, die in der klinischen Praxis zum Einsatz kommen, die gefährlichste Form der Toxizität. Ihre häufigste Form ist die Neutropönie, die von einem hohen Infektionsrisiko begleitet ist, es können aber auch Thrombocytopönie und Blutungen auftreten und lebensbedrohend werden. Chemotherapie kann auch zu qualitativen Defekten in der Funktion sowohl polymorphonuklearer Leukozyten als auch Blutplättchen führen. Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren sind entwickelt worden, um diese wichtigen Nebenwirkungen zu beseitigen. J. D. Wilson et al. (1991) und R. T. Dorr und D. D. Von Hoff (Hrsg.; 1994).

Die meisten der üblicherweise verwendeten antineoplastischen Mittel können sowohl zelluläre als auch humorale Immunität unterdrücken. Infektionen führen häufig zum Tod von Patienten mit Krebs im fortgeschrittenen Stadium, und eine beeinträchtigte Immunität kann derartige Todesfälle mitverursachen. Krebs-Chemotherapie kann auch zu chronischer, verzögerter Immunsuppression führen.

Die wichtigsten Formen von Neurotoxizität sind Arachnoiditis; Myelopathie oder Encephalomyelopathie; chronische Encephalopathien und Somnolenz; akute Encephalopathien; periphere Neuropathien; sowie akute zerebellare Syndrome oder Ataxie.

Viele der üblicherweise eingesetzten antineoplastischen Mittel sind mutagen sowie teratogen. Einige, darunter Procarbazin und die Alkylierungsmittel, sind eindeutig karzinogen. Dieses karzinogene Potential zeigt sich primär als verzögerte akute Leukämie bei Patienten, die mit polyfunktionellen Alkylierungsmitteln und Topoisomerase II-Inhibitoren, wie z. B. Etoposid und den Anthracyclin-Antibiotika, behandelt worden sind. Chemotherapie steht auch mit Fällen von verzögertem Non-Hodgkin-Lymphom und massiven Tumoren in Zusammenhang. Durch die vorliegende Erfindung werden diese Wirkungen minimiert, da das Prodrug nur innerhalb von Tumorzellen aktiviert wird.

Der klinische Nutzen eines Chemotherapeutikums kann durch das Auftreten maligner Zellen, die gegen dieses Arzneimittel resistent sind, stark eingeschränkt werden. An der Arzneimittel-Resistenz sind vermutlich zahlreiche Zell-Mechanismen beteiligt, z. B. geänderter Stoffwechsel der Arzneimittel, Undurchlässigkeit der Zelle für die aktive Verbindung oder beschleunigte Arzneimittel-Beseitigung aus der Zelle, geänderte Spezifität eines gehemmten Enzyms, erhöhte Produktion eines Zielmoleküls, stärkere Reparatur zytotoxischer Läsionen oder die Umgehung einer gehemmten Reaktion durch alternative biochemische Wege. In manchen Fällen kann Resistenz gegen ein Arzneimittel Resistenz gegen andere, biochemisch andersartige, Arzneimittel, verleihen. Ein alternativer Mechanismus der Resistenz gegen Krebs-Chemotherapeutika kommt über den funktionellen Verlust von Tumorsuppressorgenen, insbesondere p53, RB und p16, zum Tragen.

Der Funktionsverlust dieser Genprodukte führt zu dereprimierter Expression von Enzymen, auf die Antikrebs-Arzneimittel üblicherweise abzielen (z. B. 5FU/Thymidylat-Synthase und Methotrexat/Dihydrofolat-Reductase). (V. Lee et al., Exp. Cell. Res. 234, 270-6 (1997); H. J. Lenz et al., Clinical Cancer Res. 4, 1227-34 (1998), J. Fan und). Bertino, Oncogene 14, 1191-200 (1987)). Die Amplifikation bestimmter Gene spielt bei der Resistenz gegen Bio- und Chemotherapie eine Rolle. Die Amplifikation des Gens, das für Dihydrofolat-Reductase kodiert, steht mit der Resistenz gegen Methotrexat in Zusammenhang, während die Überexpression/Amplifikation des für Thymidylat-Synthase kodierenden Gens mit der Resistenz gegen Behandlung mit 5-Fluorpyrimidinen in Zusammenhang steht. Smith (1995). Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung einiger prominenter Enzyme für Resistenz gegen Bio- und Chemotherapie.

Verwendung von Prodrugs als Lösung zur Verbesserung der Selektivität eines Chemotherapeutikums

Die schlechte Selektivität von Antikrebsmitteln ist seit langem bekannt, und es gab zahlreiche Versuche, die Selektivität zu verbessern und die Verabreichung höherer Dosen zu ermöglichen. Ein Ansatz war die Entwicklung von Prodrugs. Prodrugs sind Verbindungen, die toxologisch ungefährlich sind, aber in vivo in therapeutisch aktive Produkte umgewandelt werden können. In einigen Fällen findet die Aktivierung durch die Wirkung eines nicht-endogenen Enzyms statt, das durch Antikörper an die Zielzelle abgegeben wird ("ADEPT" oder Antikörper-abhängige Enzym-Prodrug-Therapie (US-Patent Nr. 4.975.278)) oder Gen-Targeting ("GDEPT" oder Gen-abhängige Enzym-Prodrug-Therapie (R. G. Melton und R. F. Sherwood, (1996)). Diese Technologien unterliegen starken Einschränkungen, was ihre Fähigkeit betrifft, das Blut zu verlassen und in Tumoren einzudringen. T. A. Connors und R. J. Knox (1995).

Demgemäß besteht ein Bedarf an selektiveren Mitteln, die in den Tumor eindringen können und die Vermehrung von Krebszellen, die gegen Therapie resistent geworden sind, hemmen und/oder sie abtöten können. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und bietet auch damit in Zusammenhang stehende Vorteile.

Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren potentieller Therapiemittel durch Kontaktieren einer Ziel- oder Testzelle mit einem Kandidaten-Therapeutikum oder -Prodrug beschrieben, bei dem es sich um ein selektives Substrat für ein Zielenzym in der Zelle handelt. Dieser neue Ansatz wird als "ECTA" bezeichnet, was für Enzyme Catalyzed Therapeutic Agents steht. Gemäß einer Ausführungsform ist das Zielenzym ein endogenes, intrazelluläres Enzym, das überexprimiert wird und Resistenz gegen biologische und chemotherapeutische Mittel verleiht. Bei einer anderen Ausführungsform wurde die Aktivität des Enzyms in einer Tumorzelle als Ergebnis des Verlusts der Tumorsuppressorfunktion (K. A. Smith et al. (1995) und W. Li et al. (1995)) und/oder der Selektion als Ergebnis vorherigen Einwirkens von Chemotherapie (R. G. Melton und R. F. Sherwood (1996) und U. Lonn et al. (1996)) deutlich verstärkt. Bei einer anderen Ausführungsform ist das Zielenzym ein Expressionsprodukt eines infektiösen Mittels in der Zelle.

Nachdem die Zelle in vitro und/oder in vivo mit dem Kandidaten-Prodrug in Kontakt gebracht worden ist, wird die Zelle auf die Wirksamkeit des Mittels getestet, indem festgestellt wird, ob das Mittel eine Reduktion der Zellvermehrung bewirkt hat oder ob das Mittel die Zelle abtötet. Gemäß einem Aspekt der Erfindung tötet das Prodrug die Zelle ab oder hemmt die Zellvermehrung durch die Freisetzung eines toxischen Nebenprodukts aus dem Prodrug durch das Zielenzym. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können ein oder mehrere "Zielenzyme" verwendet werden, um das Prodrug zu aktivieren, so dass es das toxische Nebenprodukt freisetzt.

Ebenfalls beschrieben werden Sets zur Verwendung beim Testen bezüglich neuer Prodrugs mit den hierin beschriebenen Eigenschaften gegen Zielenzyme. Die Sets umfassen die Reagenzien und die Anweisungen, die notwendig sind, um den Test abzuschließen und die Ergebnisse zu analysieren.

Ebenfalls beschrieben werden Verfahren und Beispiele von Molekülen zum selektiven Abtöten einer pathologischen Zelle durch Kontaktieren der Zelle mit einem Prodrug, das ein selektives Substrat für ein Zielenzym, z. B. ein endogenes, intrazelluläres Enzym wie oben definiert, ist. Das Substrat wird das intrazelluläre Zielenzym spezifisch in ein Zelltoxin umgewandelt. Gemäß einer Ausführungsform wird das Produkt einer anfänglichen Reaktion in der Folge durch ein herkömmliches zelluläres Enzym, wie z. B. eine Acylase, Phosphatase oder ein anderes "haushaltendes" Enzym (Voet et al. (1995)) oder einen herkömmlichen Zellbestandteil (z. B. Wasser) vollständig aktiviert, um das toxische Nebenprodukt aus dem Prodrug freizusetzen.

Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung eines durch pathologische, hyperproliferative Zellen gekennzeichneten pathologischen Zustandes bei einem Patienten durch Verabreichung eines Prodrugs an den Patienten, das ein selektives Substrat für ein Zielenzym ist und vom Enzym in der hyperproliferativen Zelle selektiv in ein Zelltoxin umgewandelt wird. Das Prodrug kann allein oder in Kombination mit anderen Chemotherapeutika oder alternativen Antikrebs-Therapien, wie z. B. Bestrahlungen, eingesetzt werden.

Ebenfalls beschrieben wird die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines durch pathologische, hyperproliferative Zellen gekennzeichneten pathologischen Zustands bei einem Patienten durch Verabreichung eines Prodrugs an den Patienten, das ein selektives Substrat für ein Zielenzym ist und vom Enzym in der hyperproliferativen Zelle selektiv in ein Zelltoxin umgewandelt wird.

Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zum Identifizieren des optimalen Therapeutikums für einen Patienten durch Isolieren von Zellen, die ein endogenes, intrazelluläres Enzym überexprimieren, und Kontaktieren der Zellen mit zumindest einem der hierin beschriebenen Prodrugs und anschließendes Identifizieren, welches der einen oder mehreren Prodrugs die Vermehrung hemmt oder die Zellen abtötet, wodurch das optimale Therapeutikum für den Patienten identifiziert wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verbindung mit der Struktur:

oder ein/einen pharmazeutisch annehmbares/-en Salz, Ether oder Ester davon.

Ein weiterer Aspekt der vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die eine Verbindung wie oben beschrieben und einen Träger umfasst. Gemäß einer Ausführungsform ist der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Hemmen der Vermehrung einer pathologischen Zelle in vitro, worin Thymidylat-Synthase in der Zelle überexprimiert wird, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit einer wirksamen Menge einer Verbindung wie oben beschrieben. Gemäß einer Ausführungsform ist die pathologische Zelle eine Kolonkrebszelle, eine Brustkrebszelle, eine Magenkrebszelle, eine Kopf- und Halskrebszelle, eine Leberkrebszelle oder eine Bauchspeicheldrüsenkrebszelle.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verbindung wie oben beschrieben, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des Menschen- oder Tierkörpers.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung wie oben beschrieben zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines pathologischen Zustandes, der durch pathologische Zellen gekennzeichnet ist, die Thymidylat-Synthase überexprimieren.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Entwicklung von Resistenz gegen Anti-Krebs-Modalitäten in Zellen, und die Folgen.

Fig. 2 zeigt schematisch Aktivierungswege bestimmter Prodrugs.

Fig. 3 zeigt schematisch den "High Throughput Screen" für Prodrugs, die durch intrazelluläre Enzyme aktiviert werden, die für die Arzneimittelresistenz von Bedeutung sind.

Fig. 4 zeigt schematisch, wie ein menschliches Thymidylat-Synthase- (TS-) Leit-Prodrug unter Einsatz von TS-negativem E.coli als Zelltarget gefunden werden kann.

Fig. 5 zeigt ein Beispiel für die Verwendung dieses Screens zum gleichzeitigen Optimieren des Prodrugs bezüglich Reaktivität gegen zwei Zielenzyme.

Fig. 6 zeigt eine Ausführungsform eines mehrteiligen Substrats zur Herstellung eines durch Thymidylat-Synthase (TS) aktivierbaren Prodrugs.

Box 1 stellt eine maskierte oder fehlende Phosphatgruppe R&sup7; dar. Im maskierten Zustand handelt es sich um ein Phosphoramidat oder ähnliches Derivat, das den Zelleintritt erleichtert und intrazellulär zu einem Monophosphat verarbeitet wird, das sich an TS binden kann. Wenn sie fehlt, ist R&sup7; ein Wasserstoffatom, und das Prodrug ist ein Substrat für die zelluläre Thymidin-Kinase (TK), die das erforderliche Monophosphat in vivo erzeugt.

Box 2 ist eine 2'-Desoxyribofuranose-Gruppe oder eine andere ähnliche Zucker-, Thiozucker-, carbozyklische oder azyklische Gruppe, die das Monophosphat auf eine Weise an den Pyrimidinring bindet, die die funktionelle Bindung des Prodrugs an TS und, wenn R&sup7; ein Wasserstoffatom ist, an TK, unterstützt. Diese Gruppe benötigt kein Sauerstoffatom für die Bindung an die R&sup7;-Gruppe von Box 1. Daher sind Phosphonatanaloge von Zuckerphosphaten akzeptabel.

Box 3 stellt eine Tether- (Binde-) Gruppe dar, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, die eine ein- oder mehrfach ungesättigte Elektronenleitung ist, die bewirkt, dass Elektronen vom Pyrimidinring weg und zur Abgangsgruppe R&sup4; hin geführt werden, wenn TS auf das Prodrug einwirkt. Die Tethergruppe besteht aus 0 bis 10 ungesättigten Gruppen wie z. B. azyklischen Vinyl-, Ethinyl-, Imin- oder Azoeinheiten oder zyklischen, ungesättigten, aromatischen oder heteroaromatischen Vertretern davon, die beliebig vermischt und angepasst werden können, solange ihrer Leitfähigkeit für die erforderliche Elektronenleitung sorgt.

Box 4 stellt eine Spacer-Einheit X dar, worin m eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist, die die Tether- mit der Abgangsgruppe R&sup4; verbindet. Wenn in Box 3 n = 0 ist, dann ist in Box 4 m = 1. In der bevorzugten Form ist X eine Methylen- (CH&sub2;-) Einheit, die entweder Substituenten trägt oder nicht. Außerdem jedoch kann X ein Sauerstoff-, Schwefel-, Stickstoff- oder anderes Atom sein, das zur Bildung von zumindest zwei kovalenten Bindungen fähig ist. Wenn X fehlt (Box 4, m = 0), lässt der Abgang der Abgangsgruppe R&sup4; während der Verarbeitung des Prodrugs durch TS eine Alkylierungseinheit auf Pyrimidinnucleotid-Basis zurück. Siehe Barr et al. (1983). Wenn X vorhanden ist (Box 4, m = 1), findet der Abgang der Abgangsgruppe R&sup4; früh während der Verarbeitung des Prodrugs durch TS statt.

Box 5 stellt eine Abgangsgruppe R&sup4; dar, die durch die Wirkung von TS auf das Prodrug freigesetzt wird. Sie ist selbst ein toxischer/-es Antimetabolit oder Alkylierungsmittel oder eine Einheit, die in vivo leicht einen toxischen Antimetaboliten oder ein toxisches Alkylierungsmittel erzeugt. Beispielsweise kann die Abgangsgruppe nach der Freisetzung durch TS als aktiver Metabolit der Antikrebsmittel Tepa oder Thiotepa, Phosphoramidlost, N-Acetylsphinogosin (C&sub2;-Ceramid, ein Tumorsuppressorlipid) oder Hydroxyharnstoff (ein Inhibitor von Ribonucleotid-Reductase) abgehen. Die Abgangsgruppe R&sub1; kann auch ein α,α-dihalogenierter Ether sein, und in diesem Fall ergibt sie eine Carbonsäuregruppe, wenn ein von TS freigesetzter α,α-dihalogenierter Alkohol Hydrolyse erfährt. Daher kann die Abgangsgruppe R&sup4; als Vorläufer zu Fluoracetat, Fluorcitrat, Malonsäure, Methylmalonsäure oder 3-Nitropropionsäure, abgehen, die alle starke Inhibitoren für oxidative Phosphorylierung sind.

Fig. 7 zeigt TS-Western-Blots von Zelllinien, die mit einem Plasmid transfiziert wurden, das für Neomycinresistenz kodiert, mit oder ohne HER-2-Protooncogen. Spur (1) MCF7/ HER2, (2) MCF7/neo; (3) MDA-MB-435/HER2; (4) MDA-NM-435/neo; (5) BT-20/HER2; (6) BT-20/neo.

Fig. 8 zeigt Reaktionsprodukte von Prodrug-Verbindungen mit dem Enzym Thymidylat- Synthase.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird erreicht, indem einige der entscheidenden genomischen und phänotypischen Veränderungen genutzt werden, die eng mit der Resistenz gegen Bio- und Chemotherapie von Krebszellen verbunden sind. Die Erfindung stellt ein Mittel bereit, um das Wachstum von Zellen, die durch das Einwirken von Krebstherapie (einschließlich biologischer Therapie, wie Tumornekrosefaktor- (TNF-) oder Chemotherapie) Selektion unterzogen worden sind, in vivo selektiv zu hemmen oder sie zu töten. (Siehe Tabelle 2). Als Ergebnis sind bestimmte Enzyme, die durch Mutation oder Genamplifikation aktiviert worden sind, gegen anfängliche oder weitere Therapie mit dem Mittel resistent. Anders als bei Therapien nach dem Stand der Technik, die darauf gerichtet sind, stärkere Inhibitoren endogener, intrazellulärer Enzyme zu schaffen, nutzt die vorliegende Erfindung die gegenüber normalen Zellen höhere Enzymaktivität, die mit Therapie-resistenten erkrankten Zellen und Geweben verbunden ist, und basiert nicht auf dem Hemmen des Enzyms. Gemäß einem Aspekt sind die Tumorzellen, die erfolgreich mit dem Prodrug gemäß vorliegender Erfindung behandelt werden, durch erhöhte Zielenzymaktivität gekennzeichnet und weisen daher ein viel höheres Potential zur Umwandlung des Prodrugs in seine toxische Form auf als normale Zellen, die das Zielenzym nicht überexprimieren. Der Begriff "Zielenzym" wird gemäß vorliegender Erfindung verwendet, um Enzyme zu definieren, die eine oder mehrere der oben angeführten Eigenschaften aufweisen.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, Zellbiologie und DNA-Rekombination eingesetzt, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl. (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (Hrsg.; 1987)); die Serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames und G. R. Taylor (Hrsg.; 1995)) und ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney (Hrsg.; 1987)).

Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, umfassen die Singularformen auch den Plural der Begriffe, wenn nicht der Kontext klar auf etwas anderes hindeutet. Beispielsweise umfasst der Begriff "eine Zelle" eine Vielzahl von Zellen, einschließlich Gemischen davon.

Eine "wirksame Menge" ist eine Menge, die ausreicht, um vorteilhafte oder gewünschte Ergebnisse zu erzielen. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Verabreichungen, Anwendungen oder Dosierungen verwendet werden.

Wie hierin verwendet, umfassen die Begriffe "Wirtszellen", "Zielzeilen" und "hyperproliferative Zellen" Zellen, die durch die Aktivierung durch genetische Mutation oder die endogene Überexpression eines intrazellulären Enzyms gekennzeichnet sind. Bei manchen Ausführungsformen steht die Überexpression des Enzyms mit dem Verlust der Tumorsuppressorgenproduktionsfunktion, der Arzneimittel-Beständigkeit oder der genetischen Instabilität in Zusammenhang, die mit einem pathologischen Phänotyp verbunden ist. An der Arzneimittel-Resistenz ist eine Vielzahl zellulärer Mechanismen beteiligt, z. B. veränderter Stoffwechsel des Arzneimittels, Undurchlässigkeit der Zelle in Bezug auf die aktive Verbindung oder beschleunigte Arzneimittel-Eliminierung aus der Zelle, geänderte Spezifität eines gehemmten Enzyms, erhöhte Produktion eines Zielmoleküls, erhöhte Reparatur zytotoxischer Läsionen oder das Umgehen einer gehemmten Reaktion durch alternative biochemische Wege. Zu den Enzymen, die aktiviert oder überexprimiert werden und mit der Arzneimittel-Resistenz in Zusammenhang stehen, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Thymidylat-Synthase (TS) (U. Lönn et al. (1996); H. Kobayashi et al. (1995); A. L. Jackman et al. (1995)), Dihydrofolat-Reductase (D. Banerjee et al. (1995) und J. R. Bertino et al. (1996)), Tyrosin-Kinasen (TNF-α, R. M. Hudziak et al. (1988)) ebenso wie mit Mehrfach-Arzneimittelresistenz (M. Stühlinger et al. (1994)); A. Akdas et al. (1996); und (I. F. Tannock (1996)); und Proteine, die mit ATP-abhängiger Mehrfach-Arzneimittel-Resistenz in Zusammenhang stehen (S. M. Simon und M. Schindler: (1994)) und, bei manchen Erkrankungen einschließlich Kolon- und Prostatakrebs, Topoisomerase 1 (Husain et al. (1994)). Alternativ dazu kann Resistenz gegen ein Arzneimittel Resistenz gegen andere biochemisch andersartige Arzneimittel verleihen. Die vorliegende Anmeldung betrifft zwar spezifisch Krebs, aber ein ähnlicher Ansatz kann für Enzyme eingesetzt werden, für die Human- und Tierpathogene kodieren, und bei denen die Inhibitoren aufgrund der Entwicklung von Resistenz versagt haben.

Die Amplifikation bestimmter Gene ist an der Resistenz gegen Chemotherapie beteiligt. Amplifikation von Dihydrofolat-Reductase (DHFR) steht im Zusammenhang mit Resistenz gegen Methotrexat, während die Amplifikation des Gens, das für Thymidylat-Synthase kodiert, mit Resistenz gegen Tumorbehandlung mit 5-Fluorpyrimidinen in Zusammenhang steht. Die Amplifikation von Genen, die mit Arzneimittel-Resistenz in Zusammenhang stehen, kann durch eine modifizierte Polymerasekettenreaktion (PCR) detektiert und überwacht werden, wie von Kashini-Sabet et al. (1988), US-Patent Nr. 5.085.983 beschrieben werden, oder nach dem hierin beschriebenen Verfahren. Erworbene Arzneimittel-Resistenz kann durch die Detektion zytogenetischer Anomalien überwacht werden, wie z. B. homogene Chromosomfärbungsregionen und Doppel-minute- Chromosome, die beide mit Genamplifikation verbunden sind. Alternative Tests umfassen direkte oder indirekte Enzymaktivitätstests, die beide mit Genamplifikation verbunden sind (z. B. Carreras & Santi (1995)); andere Methodiken (z. B. Polymerasekettenreaktion, T. A. Houze et al. (1997), oder Immunhistochemie (P. G. Johnson et al. (1997)).

Alternativ dazu ist die Zielzelle so charakterisiert, dass sie inaktivierte Tumorsuppressorfunktion aufweist, z. B. den Verlust oder die Inaktivierung von Retinoblastom (RB) oder p53, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von TS verstärken (W. Li et al. (1995)) oder DHFR (Bertino et al. (1996) und W. Li et al. (1995)).

Die hierin beschriebenen Prodrugs sind nützlich für Behandlung oder Linderung jeder Erkrankung, worin das mit der Erkrankung verbundene Enzym mit Arzneimittel-Resistenz gegen ein Chemotherapeutikum in Zusammenhang steht, gleichgültig, ob aufgrund des Verlusts von Tumorsuppressorfunktionalität, in vivo-Selektion durch Chemotherapie oder eine Kombination. Dazu gehören Ausführungsformen, worin das Enzym, beispielsweise das TS-Enzym, in pathologischen Zellen gegenüber normalen Zellen überexprimiert, übermäßig angehäuft oder aktiviert wird. Besonders ausgeschlossen ist das Enzym Glutathion-S-Transferase, von dem gezeigt worden ist, dass es bei manchen Human-Tumoren gelegentlich erhöht ist. A. S. Morgan et al. (1998). Die hierin beschriebenen Prodrugs sind auf der Basis unterscheidbar, dass die Zielenzyme gemäß vorliegender Erfindung in pathologischen Zellen gegenüber normalen Zellen üblicherweise überexprimiert, übermäßig angehäuft oder aktiviert werden. Die wichtigsten Prinzipien, die die vorliegende Erfindung von anderen Ansätzen unterscheiden, sind:

(1) Die Synthese von Substraten für Enzyme wie Thymidylat-Synthase. Das überexprimierte Enzym erzeugt Toxin, vorzugsweise in erkrankten Zellen. Frühere Ansätze basierten auf einem Inhibitor. Die Inhibitoren führen zu amplifizierter Expression des Enzyms und nachfolgende Resistenz gegen die Behandlung (siehe z. B. U. Lonn et al. (1996)).

(2) Der aktuelle Ansatz ist auch von anderen "Substrat-Prodrug"-Ansätzen unterscheidbar, beispielsweise den Glutthion-s-Transferase-Enzymen (siehe z. B. A. S. Morgan et al. (1998)). Die Enzyme der GST-Familie werden als Reaktion auf toxische Insulte gegen die Zelle in erhöhten Mengen exprimiert. Die Enzyme der GST-Familie weisen überlappende Substratspezifitäten auf, die es schwierig machen, ein Substrat zu konstruieren, das nur mit einer einzigen Enzymspezies mit erhöhter Expression in einer Krebszelle reaktiv ist (A. S. Morgan et al. (1998)). Da viele Enzyme (z. B. Thymidylat-Synthase, Dihydrofolat-Reductase und Thymidin-Kinase) in Bezug auf ihre Struktur und Substratspezifität einzigartig sind, ist es einfach, einzigartige Substrate zu konstruieren. Die vorliegende Beschreibung gibt mehrere Beispiele für Substrate für Thymidylat-Synthase.

(3) In manchen Fällen kann das Gen, das für das Zielenzym (z. B. Thymidylat-Synthase) kodiert, Mutationen erfahren haben, um Resistenz gegen Inhibitoren zu ergeben (K. W. Barbour et al. (1992) und A. P. Dicken et al. (1993)), ist aber weiterhin fähig, Reaktionen mit Nicht-Inhibitor-Substrat-Prodrugs einzugehen.

(4) Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass der Verlust von Tumorsuppressorfunktion für die Entwicklung von Malignität entscheidend ist. Der Großteil der Tumorzellen hat eine der p53, RB oder p16-Tumorsuppressorfunktionen verloren. Ein derartiger Verlust führt unabhängig vom vorherigen Einwirken von Chemotherapie zu erhöhter Expression von Resistenzenzymen (z. B. Thymidylat-Synthase). Die hierin beschriebenen Prodrugs sind nützlich für die Behandlung früher Stadien der Malignität sowie von Erkrankungen, die zuvor mit Chemotherapie behandelt wurden. Substrate für Enzyme wie GST erfordern das vorherige Einwirken von Chemotherapie auf den Tumor, um ausreichende Überexpression zu erreichen, um auch nur die Möglichkeit eines bescheidenen therapeutischen Richtwerts zu bieten.

Arzneimitteltest

Mittel, die therapeutisches Potential für die Behandlung hyperproliferativer oder neoplastischer Erkrankungen, z. B. Krebs, aufweisen, können nach den hierin beschriebenen Verfahren identifiziert werden. Mit dem Verfahren werden auch Mittel identifiziert, die das Wachstum von Zellen oder Zellzyklus hyperproliferativer Zellen, wie z. B. Krebszellen, hemmen. Andere Zellen, die enthalten sind, sind bakterielle, Hefe- und parasitäre Zellen, die als Ergebnis unangemessener Vermehrung im Patienten Krankheit hervorrufen. Das Mittel wird als potentielles Therapeutikum betrachtet, wenn Zellvermehrung, -replikation oder Zellzyklus in Bezug auf die Zellen in einer Kontrollprobe verringert wird. Am meisten bevorzugt werden die Zellen durch das Mittel abgetötet. Die Zellen können prokaryotisch (bakteriell, wie z. B. E.coli) oder eukaryotisch sein. Die Zellen können Säugetier- oder Nicht-Säugetierzellen, z. B. Mäusezellen, Rattenzellen, Menschenzellen, Pilze (z. B. Hefe) oder Parasisten (z. B. Pneumoystis oder Leishmania) sein, die Erkrankungen bewirken.

Wie hierin verwendet sind mit "hypoproliferativen Zellen" Zellen gemeint, die dedifferenziert, immortalisiert, neoplastisch, bösartig, metastatisch oder transformiert sind. Beispiele für solche Zellen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Sarkomzellen, Leukämiezellen, Karzinomzellen oder Adenokarzinomzellen. Im Speziellen kann die Zelle eine Brustkrebszelle, ein Hepatomzelle, eine detektierbare Krebszelle, eine Pankreas-Karzinomzelle, eine Oesophagenkarzinomzelle, eine Blasenkrebszelle, eine Eierstockkrebszelle, eine Hautkrebszelle, eine Leberkarzinomzelle oder eine Magenkrebszelle sein. Bei einer alternativen Ausführungsform kann die Zielzelle gegen ein Arzneimittel oder eine Verbindung resistent sein, die verwendet wird, um Zellen zu verhindern oder abzutöten, die mit einem infektiösen Mittel infiziert sind, das gegen herkömmliche Antibiotika resistent ist. Infektiöse Mittel sind Bakterien, Hefe und Parasiten, wie z. B. Trypanosome.

Spezifische Beispiele für Zielenzyme sind in Tabelle 2 (oben) oder Tabelle 3 (unten) angeführt. Diese Enzyme, die an der Resistenz gegen Chemotherapie beteiligt sind, in einer Zelle, die durch Resistenz gegen Krebstherapie gekennzeichnet ist, endogen aktiviert, überexprimiert oder übermäßig angehäuft werden und mit einem pathologischen Zustand oder einer Erkrankung verbunden sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Enzyme, wie z. B. Vertreter der Tyrosin-Kinase-Überfamilie, oder ATP-abhängiges MDR-assoziierte Proteine, CAD, Thymidylat-Synthase, Dihydrofolat-Reductase und Ribonucleotid-Reductase. Tabelle 3 zeigt eine Liste von Enzymen, auf die durch diesen Ansatz bei infektiöser Erkrankung abgezielt werden kann.

Tabelle 3 Enzyme, die bei infektiöser Erkrankung überexprimiert werden und zu Arzneimittel-Resistenz beitragen Enzym sorgt für erhöhte Resistenz gegen:

β-Lactamasen Penicillin und andere β-Lactam enthaltende Antibiotika

Aminoglykosidase oder Amidoglykosid amidierende Enzyme Aminoglykosid-Antibiotika (z. B. Streptomycin, Gentamycin)

Chloramphenicol-Transacetylase Chloramphenicol

Dihydrofolat-Reductase Trimethoprim

Quelle: Mechanisms of Microbial Disease, 2. Aufl., M. Schaecher, G. Medloff, B. I. Eisenstein; T. S. Satterfield (Hrsg.), Verlag Williams und Wilkins, S. 973 (1993).

Bei dem potentiell therapeutischen Mittel, das durch das hierin beschriebene Verfahren identifiziert wird, handelt es sich um ein Prodrug, das ein Substrat für das Enzym ist und intrazellulär in ein intrazelluläres Toxin umgewandelt wird. Wie hierin verwendet ist ein "Prodrug" eine Vorläufer- oder Derivatform eines pharmazeutisch aktiven Mittels oder einer Substanz, das bzw. die im Vergleich zum Arzneimittel-Metaboliten weniger zytotoxisch für Ziel- oder hyperproliferative Zellen ist und enzymatisch aktiviert oder in eine aktivere Form umgewandelt werden kann (siehe T. A. Connors (1986) und T. A. Connors (1996)). Die Toxizität des Mittels richtet sich gegen Zellen, die das konvertierende Enzym in einer Menge produzieren, die wirksam eine therapeutische Konzentration des Zelltoxins in der erkrankten Zelle erzeugen kann.

Ein rascher und einfacher Screeningtest, der die erste Identifizierung von Verbindungen mit zumindest einigen der gewünschten Merkmale ermöglicht, wird hierin ebenfalls beschrieben. Das allgemeine Schema einer Ausführungsform wird in Fig. 3 gezeigt. Diese Zeichnung beschreibt, wie der Test konstruiert ist, sowie die für seine Prozesse erforderlichen Materialien. Wie in Fig. 3 gezeigt erfordert der Test zwei Zelltypen, wobei der erste eine Kontrollzelle ist, in der das Zielenzym nicht exprimiert wird oder in einer sehr geringen Menge exprimiertwird. Der zweite Zelltyp ist die Testzelle, in der das Zielenzym in einer detektierbaren Menge, z. B. einer großen Menge, exprimiert wird. Beispielsweise ist ein prokaryotisches E.coli, das das Zielenzym TS nicht endogen exprimiert, eine geeignete Wirtszelle oder Zielzelle. Die Zelle kann ein Kontrollgegenstück aufweisen (dem das Zielenzym fehlt) oder in einer anderen Ausführungsform ein Gegenstück (das die geeignete Zielenzymspezies enthält), das genetisch modifiziert ist, um das/die Zielenzym(e) differenziert zu exprimieren. Mehr als eine Enzymspezies kann verwendet werden, um getrennte Wirtszellen getrennt zu transduzieren, so dass die Wirkung des Kandidaten-Arzneimittels auf ein Zielenzym gleichzeitig mit seiner Wirkung auf ein anderes Enzym oder ein entsprechendes Enzym von einer anderen Spezies verglichen werden kann.

Bei einer weiteren Ausführungsform wird eine dritte Zielzelle als Kontrolle verwendet, weil sie eine wirksame Menge einer Verbindung enthält, wie beispielsweise der nachstehend gezeigten Verbindungen, die sich als wirksame Prodrugs erwiesen haben. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich, um bezüglich neuer Mittel zu screenen, die durch Thymidylat-Synthase aktiviert werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden transformierte Zellinien, wie z. B. rastransformierte NIH 3T3-Zellen (ATCC, 10801, University Blvd., Manassas, VA 20110- 2209, USA) durch Engineering gebildet, um variable und erhöhte Mengen des Zielenzyms von Interesse von klonierter cDNA zu exprimieren, die für das Enzym kodiert. Transfektion erfolgt entweder vorübergehend oder permanent unter Einsatz von Verfahren, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind und von L. Chen et al. (1996), R. M. Hudziak et al. (1988) oder P. Carter et al. (1992) und im nachstehenden Experimentellen Teil beschrieben werden. Geeignete Vektoren für die Insertion der cDNA sind im Handel von Stratagene, LaJolla, CA, USA und anderen Anbietern erhältlich. Das Ausmaß an Expression von Enzym in jeder transfizierten Zeltlinie kann durch Immun-Blot und Enzymtest in Zelllysaten überwacht werden, wobei monoklonaler oder polyklonaler Antikörper verwendet wird, der zuvor zur Immundetektion gegen das Enzym erzeugt worden ist. Beispielsweise wie von L. Chen et al. (1996) beschrieben. Das Expressionsausmaß kann durch die Anzahl an Kopien der Expressionskassette, die in die Zelle eingebracht werden, oder durch Variieren der Promotor-Verwendung reguliert werden. Enzymatische Tests zum Detektieren der Menge an exprimiertem Enzym können auch durchgeführt werden, wie von C. W. Carreras und D. V. Santi (1995) im Überblick dargestellt, oder nach dem im nachstehenden Experimentellen Teil beschriebenen Verfahren. Tumorzelllinien können so gewählt werden, dass sie die Mengen an Thymidylat-Synthase erhöhen (z. B. Kolontumorzellen, wie von Copur et al. (1995) beschrieben.

Wie oben angeführt, können die Zellen, die die gewünschten genetischen Defizienzen enthalten, von Cold Spring Harbor, the Agricultural Research Service Culture Collection, oder der American Type Culture Collection erhalten werden. Die geeigneten Stämme können auch hergestellt werden, indem in die Zelle ein Gen, das für das Zielenzym kodiert, unter Einsatz von Standardtechniken insertiert wird, wie von Miller (1992), Sambrook et al. (1989) und Spector et al. (1998) beschrieben. Wachstumstests können nach Standardverfahren durchgeführt werden, wie von Miller (1992), Sugarman et al. (1985) und Spector et al. (1998) beschrieben.

Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sollte klar sein, dass der in Fig. 3 gezeigte Screen breit angelegt für die Entdeckung von Antibiotika eingesetzt werden kann. Beispielsweise könnte Thymidylat-Synthase von Hefe die von E.coli in Fig. 4 ersetzen. Das würde die Entdeckung spezifischer antifungaler Antibiotika ermöglichen, die auf mit Hefe verwandte Pathogene abzielen. Außerdem können andere Enzyme dieser Behandlung unterzogen werden. Beispielsweise könnten Prodrugs ausgewählt werden, die spezifisch auf die Dihydrofolat-Reductase-Aktivität infektiöser Mittel, wie z. B. Pneumocystis carnii, abzielen. Diese Mittei werden bezüglich der Spezifität für das Zielenzym gewählt, und es kann gezeigt werden, dass sie das Enzym des natürlichen Wirts nicht aktivieren, indem der in Fig. 3 beschriebene Screeningtest eingesetzt wird. Die zellulären Kontrollkonstrukte enthalten das entsprechende normale menschliche Enzym, um das Fehlen von Toxizität zu zeigen, wenn nur das normale menschliche Enzym vorhanden ist.

Beispielsweise und wie in Fig. 4 gezeigt kann ein fremdes Gen, z. B. ein Human-Gen, das für TS kodiert, in die Wirtszelle insertiert werden, so dass Human-TS exprimiert wird. Diese durch genetisches Engineering veränderte Zelle wird als "Testzelle" in Fig. 3 gezeigt. Die "Kontrollzelle" exprimiert das Zielenzym nicht. Bei manchen Ausführungsformen kann es notwendig sein, das Kulturmedium mit dem Proteinprodukt des Zielenzyms zu ergänzen.

Bei einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle der Wildform defizient oder exprimiert nicht mehr als ein Enzym von Interesse. Wie in Fig. 4 gezeigt erzeugt die Wirtszelle nicht endogen Thymidin-Kinase (TK) oder Thymidylat-Synthase (TS). Gene, die für das menschliche Gegenstück dieser Enzym kodieren, werden in die Wirtszelle eingebracht, um das gewünschte Expressionsausmaß zu erhalten. Das Ausmaß an Enzymexpression in jeder transfizierten Zelllinie kann durch hierin beschriebene Verfahren überwacht werden, z. B. durch Immunblot und Enzymtest in Zelllysaten, indem monoklonaler oder polyklonaler Antikörper zur Immundetektion verwendet wird, der zuvor gegen das Enzym erzeugt worden ist. Beispielsweise wie von L. Chen et al. (1996) beschrieben. Enzymatische Tests können auch durchgeführt werden, wie von C. W. Carreras und D. N. Santi (1995) zusammengefasst, indem detektierbare markierte Substituenten, z. B. Tritium-markierte Substituenten, verwendet werden. Ein möglicher Vorteil des "Zwei-Enzym"-Systems besteht darin, dass die Notwendigkeit zur Aktivierung durch zwei Enzyme, die bevorzugt in Tumorzellen überexprimiert werden, für erhöhte Sicherheit für normale Zellen sorgen würde.

Die Testzelle wird in kleinen Mehrfach-Napf-Platten gezüchtet und wird verwendet, um die biologische Aktivität von Test-Prodrugs zu detektieren. Das erfolgreiche Kandidaten- Arzneimittel blockiert das Wachstum der oder tötet die Test-Zelltype, lässt aber die Kontrollzelltype unversehrt.

Das Kandidaten-Prodrug kann dem Zellkulturmedium direkt zugegeben oder zuvor an einen Liganden konjugiert werden, der für einen Zelloberflächenrezeptor spezifisch ist, und dann dem Medium hinzugefügt werden. Verfahren zur Konjugation für zellspezifische Abgabe sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt, siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 5.459.127; 5.264.618, und die veröffentlichte Patentbeschreibung WO 91/17424 (veröffentlicht am 14. November 1991). Die Abgangsgruppe des Kandidaten-Prodrugs kann nachweisbar markiert sein, beispielsweise mit Tritium. Die Zielzelle oder das Kulturmedium wird dann bezüglich der Menge an Markierung, die vom Kandidaten-Prodrug freigesetzt wird, getestet. Alternativ dazu kann die Zellaufnahme durch Packen des Prodrugs in Liposome unter Einsatz des von D. D. Lasic (1996) beschriebenen Verfahrens oder kombiniert mit Cytofectinen, wie von J. G. Lewis et al. (1996) beschrieben, verstärkt werden.

Bei einer anderen Ausführungsform werden kultivierte Human-Tumorzellen, die das Enzym von Interesse, d. h. Zielenzym, überexprimieren, identifiziert, wie oben beschrieben. Die Zellen werden unter Bedingungen, die die Aufnahme des Mittels in den intrazellulären Bereich der Zelle begünstigen, mit dem potentiellen Therapiemittel in Kontakt gebracht. Die Zellen werden dann bezüglich zellulärer Vermehrung oder Zellabtötung getestet.

Es versteht sich, obwohl nicht immer explizit darauf hingewiesen wird, dass jede Ausführungsform weiter modifiziert werden kann, indem eine eigene Zielzelle bereitgestellt wird, die als Kontrolle fungiert, indem sie eine wirksame Menge einer Verbindung, wie beispielsweise der nachstehend gezeigten Verbindungen, erhält, die sich als wirksame Prodrugs erwiesen haben.

Ein Screen mit hohem Durchsatz zum Identifizieren biologisch aktiver Verbindungen ist in den Fig. 3, 4 und 5 dargelegt. Der Test basiert auf der einfachen genetischen Manipulation und dem Wachstum von E.coli und ähnlicher einzelliger Organismen (z. B. Hefe), siehe Miller (1992) und Spector et al. (1998). Der entscheidende Schritt ist das Beseitigen der endogenen Enzymaktivität, die einem Enzymziel für Prodrug-Konstruktion entspricht. Das kann nach jedem der Verfahren erfolgen, die von Miller (1992), Sambrook et al. (1989) oder Spector et al. (1998) beschrieben werden. Diese Verfahren umfassen chemische und biologische (z. B. virale oder Transposon-insertionale) Mutagenese, gefolgt von einem angemessenen Selektionsverfahren. Die TS-negative (TS) Zelle wird dann eine negative Kontrolle für die Identifizierung von Prodrugs, die, wenn Thymidylat-Synthase darauf einwirkt, zu Zelltoxinen werden. Ein ähnlicher Ansatz ist mit anderen Zelltypen möglichen, beispielsweise anderen Bakterien, Hefe oder anderen selektierbaren einzelligen Organismen. Beim Test werden sowohl Kontroll- als auch rekombinante Organismen bezüglich Empfindlichkeit für die Testverbindungen verglichen. Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein wird, können durch dieses Verfahren auch Prodrugs abgeleitet werden, die zwischen Enzymspezies unterscheiden. Beispielsweise können ansonsten identische Zellen, die Human- und Hefeenzyme exprimieren, verwendet werden, um Antibiotika-Produgs zu detektieren, die nur gegenüber jenen Zellen, die das Hefeenzym exprimieren, bevorzugt toxisch sind. Auf diese Weise können neue und spezifische Antibiotika entdeckt werden.

Beispiele für Zelllinien sind ras-transformierte NIH 3T3-Zellen (erhalten von der ATCC) und sie werden durch Engineering dazu gebracht, erhöhte Mengen an Human-Thymidylat-Synthase (HuTS) aus der klonierten cDNA zu exprimieren. Transfektion erfolgt auf vorübergehender oder permanenter Basis (siehe L. Chen et al. (1996), R. M. Hudziak et al. (1988) und P. Carter et al. (1992). NIH-000 (ras-transformierte Ausgangs-Zelllinie); NIH-001 (niedriger Expressor von HuTS); NIH-002 (mittlerer Expressor von HuTS); NIH- 003 (starker Expressor von HuTS). Das Ausmaß an TS-Expression in jeder Zelle wird durch Immunblot und Enzymtest in Zelllysaten überwacht, wobei für die Immundetektion Antikörper verwendet wird, der gegen HuTS-Protein gerichtet ist (wie beispielsweise von L. Chen et al. (1996) beschrieben). Enzymatische Tests werden durchgeführt wie von Carreras und Santi (1995) zusammengefasst.

Menschliche Kolorektal- und Brusttumor-Zelllinien werden auf die Expression von HuTS-Enzym gescreent. Zelllinien, die niedrige, mäßige und große Mengen an HuTS exprimieren, werden Arzneimittel-Kandidaten ausgesetzt, wie oben für die NIH 3T3-Zelllinie beschrieben. Wachstumshemmung und Zytotoxizität werden überwacht wie oben beschrieben. Ähnliche Tests können für jedes der in Tabelle 1 angeführten Enzyme durchgeführt werden.

Eine alternative Ausführungsform für ein Prodrug, bei dem TS-Überexpression in Tumorzellen genutzt wird, ist ein Desoxyuridinphosphoramidat, oder andere Modifikationen (hierin genannt), die mit einem therapeutischen Radionuklid konjugiert sind. Ein Beispiel für ein therapeutisches Radionuklid ist Rhenium 188. Der Isotyp kann im Wesentlichen wie von Callahan et al. (1989) beschrieben synthetisiert werden. Alternativ dazu ist er im Handel erhältlich, beispielsweise von Mallicrodt Medical BV, Niederlande. Das therapeutische Radionuklid kann nach Standardverfahren (beispielsweise wie von W-Y Lin et al. (1997) beschrieben) mit Desoxyuridin oder Desoxyuridin-5'-phosphoramidat oder einem anderen Derivat konjugiert werden. Das Radionuklid-hältige Desoxyuridinphosphoramidat wird vorzugsweise in die DNA von Tumorzellen aufgenommen, die Thymidylat-Synthase überexprimieren, und verursachen deren Tod durch konzentrierte Emission von β- und γ-Strahlung. Alternative Radionuklide sind Rhenium-186 und andere (D. A. Troutner (1987)).

Verabreichung in vivo

Die In vitro-Tests werden in Tiermodellen bestätigt, die Human-Tumoren tragen oder mit einem Antibiotika-resistenten Mikroorganismus infiziert sind, um die Wirksamkeit in vivo zu bestimmen.

In der vorliegenden Beschreibung wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines durch hyperproliferative Zellen gekennzeichneten pathologischen Zustandes bei einem Patienten beschrieben, das die Verabreichung einer therapeutischen Menge eines Prodrugs an den Patienten umfasst, das in einer hyperproliferativen Zellen durch ein endogenes intrazelluläres Enzym, wie hierin definiert, in ein Toxin umgewandelt wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung aus den im nachstehenden Abschnitt "Prodrugs" definierten Verbindungen ausgewählt.

Wenn das Prodrug einem Patienten, wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder einem Menschen verabreicht wird, kann das Mittel einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hinzugefügt und dem Patienten systemisch oder topisch verabreicht werden.

Um Patienten zu bestimmen, die vorteilhaft behandelt werden können, wird dem Patienten eine Tumorprobe abgenommen, und die Zellen werden bezüglich des Ausmaßes an Expression des Enzyms von Interesse getestet. Wenn die Expression über jener in normalen Zellen liegt, so dass eine toxische Menge des Prodrugs ohne unerwünschte Nebenwirkungen verabreicht werden könnte, werden der Tumor oder die Zellen als vorteilhaft behandelbar betrachtet, und somit ist die Therapie gemäß vorliegender Erfindung für den Patienten geeignet. Wenn beispielsweise das Zielenzym zumindest etwa zweimal, vorzugsweise etwa dreimal stärker exprimiert wird als in normalen Zellen, ist der Patient ein geeigneter Patient für das Therapieverfahren gemäß vorliegender Erfindung. Die therapeutischen Mengen können empirisch bestimmt werden und variieren in Abhängigkeit vom zu behandelnden pathologischen Zustand, dem behandelten Patienten und der Toxizität des umgewandelten Prodrugs oder Zelltoxins.

Bei Verabreichung an ein Tier ist das Verfahren nützlich, um die Wirksamkeit des Prodrugs weiter zu bestätigen. Als Beispiel für ein Tiermodell werden Gruppen von Nacktmäusen (Balb/c NCR nu/nu weiblich, Simonsen, Gilroy, CA, USA) jeweils subkutan mit etwa 10&sup5; bis etwa 10&sup9; hyperproliferativen Krebs- oder Zielzellen wie hierin definiert geimpft. Wenn der Tumor gebildet ist, wird das Prodrug verabreicht, beispielsweise durch subkutane Injektion um den Tumor. Tumormessungen zum Bestimmen der Reduktion der Tumorgröße werden zweimal wöchentlich unter Einsatz einer Venenlehre zweidimensional durchgeführt. Nach Bedarf können auch andere Tiermodelle verwendet werden. Lovejoy et al. (1997) und R. Clarke (1996).

Die Verabreichung in vivo kann in einer Dosis kontinuierlich oder intermittierend während des gesamten Behandlungsverlaufs erfolgen. Verfahren zum Bestimmen des wirksamsten Mittels und der wirksamsten Verabreichungsdosis sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und variieren in Abhängigkeit von der für die Therapie verwendeten Zusammensetzung, dem Zweck der Therapie, der behandelten Zielzelle und dem behandelten Patienten. Es können Einzel- oder Mehrfach-Verabreichungen durchgeführt werden, wobei die Dosismenge und das Dosismuster vom behandelnden Arzt ausgewählt wird. Geeignete Dosisformulierungen und Verfahren zur Verabreichung der Mittel sind nachstehend angeführt.

Die gemäß vorliegender Erfindung beschriebenen Mittel und Zusammensetzungen können bei der Herstellung von Medikamenten und zur Behandlung von Menschen und Tieren durch Verabreichung nach herkömmlichen Verfahren, wie als Wirkbestandteil in pharmazeutischen Zusammensetzungen, verwendet werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral, intranasal, parenteral oder durch Inhalationstherapie verabreicht werden und können die Form von Tabletten, Pastillen, Granulat, Kapseln, Pillen, Ampullen, Suppositorien oder Aerosolform haben. Sie können auch die Form von Suspensionen, Lösungen und Emulsionen des Wirkbestandteils in wässrigen oder nicht-wässrigen Verdünnern, Sirupen, Granulaten oder Pulvern haben. Neben einer Verbindung gemäß vorliegender Erfindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch andere pharmazeutisch aktive Verbindungen oder eine Vielzahl von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung enthalten.

Im Speziellen kann eine Verbindung wie gemäß vorliegender Erfindung beschrieben und hierin auch als Wirkbestandteil bezeichnet zur Therapie auf einem geeigneten Weg verabreicht werden, einschließlich oraler, rektaler, nasaler, topischer (einschließlich transdermaler, Aerosol-, bukkaler und sublingualer) vaginaler, parenteraler (einschließlich subkutaner, intrasmuskulärer, intravenöser und intradermaler) sowie pulmonaler Verabreichung. Es ist auch festzustellen, dass der bevorzugte Weg je nach dem Zustand und Alter des Rezipienten und der behandelten Erkrankung variiert.

Im Allgemeinen liegt eine geeignete Dosis für jede der oben angeführten Verbindungen im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht des Rezipienten pro Tag, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 50 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 1 bis etwa 25 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Gewichte des Wirkbestandteils als Ausgangsverbindung der Formel gemäß vorliegender Erfindung berechnet, und für Salze und Ester davon werden die Gewichte proportional erhöht. Die gewünschte Dosis liegt vorzugsweise als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Teildosen vor, die in angemessenen Intervallen über den Tag verteilt verabreicht werden. Diese Teildosen können in Einzeldosisformen verabreicht werden, die beispielsweise etwa 1 bis etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 1 bis über etwa 25 mg, und am meisten bevorzugt etwa 5 bis über etwa 25 mg, Wirkbestandteil pro Einzeldosisform enthalten. Es versteht sich, dass angemessene Dosen der Verbindungen und Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung vom Typ und der Schwere und dem Stadium der Erkrankung abhängen und von Patient zu Patient variieren können. Das Bestimmen der optimalen Dosis umfasst im Allgemeinen das Abwiegen zwischen dem Ausmaß des therapeutischen Nutzens und dem Risiko oder schädlichen Nebenwirkungen der Behandlungen gemäß vorliegender Erfindung.

Idealerweise sollte das Prodrug verabreicht werden, um Spitzenkonzentrationen der aktiven Verbindung an den erkrankten Stellen zu erzielen. Das kann beispielsweise durch intravenöse Injektion des Prodrugs, gegebenenfalls in Kochsalzlösung, oder orale Verabreichung, beispielsweise als Tablette, Kapsel oder Sirup, die bzw. der den Wirkbestandteil enthält, erfolgen. Wünschenswerte Blutspiegel des Prodrugs können durch kontinuierliche Infusion beibehalten werden, um eine therapeutische Menge des Wirkbestandteils im erkrankten Gewebe bereitzustellen. Der Einsatz operativer Kombinationen wird überlegt, um therapeutische Kombinationen bereitzustellen, die eine niedrigere Gesamtdosis jeder Komponente des antiviralen Mittels erfordert, als erforderlich sein kann, wenn jede(s) einzelne therapeutische Verbindung oder Arzneimittel alleine verwendet wird, wodurch die Nebenwirkungen reduziert werden.

Es ist zwar möglich, den Prodrug-Bestandteil alleine zu verabreichen, vorzugsweise wird er jedoch als pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die zumindest einen Wirkbestandteil wie oben definiert gemeinsam mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern dafür und gegebenenfalls anderen Therapiemitteln umfasst. Jeder Träger muss in dem Sinn "annehmbar" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für den Patienten nicht schädlich ist.

Zu den Formulierungen gehören jene, die für orale, rektale, nasale, topische (einschließlich transdermaler, bukkaler und sublingualer), vaginale, parenterale (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser und intradermaler) sowie pulmonale Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmäßig in Einzeldosisform vorliegen und können nach jedem Verfahren hergestellt werden, das auf pharmazeutischem Gebiet bekannt ist. Derartige Verfahren umfassen den Schritt des Assoziierens des Wirkbestandteils mit dem Träger, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der Wirkbestandteil gleichmäßig und eng mit flüssigen Trägern oder feinzerteilten festen Trägern oder beidem in Assoziation gebracht wird und das Produkt dann, falls notwendig, geformt wird.

Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten, wie z. B. Kapseln, Kachets oder Tabletten bereitgestellt werden, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkbestandteils enthalten; als Pulver oder Granulat; als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit; oder als flüssige Öl-in-Wasser-Flüssigemulsion oder Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion. Der Wirkbestandteil kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste bereitgestellt werden.

Eine Tablette kann durch Pressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, hergestellt werden. Gepresste Tabletten können hergestellt werden, indem der Wirkbestandteil in einer geeigneten Maschine in rieselfähiger Form, wie z. B. als Pulver oder Granulat, gegebenenfalls mit einem Bindemittel (z. B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose), Schmiermittel, inerten Verdünner, Konservierungsmittel, Abbaumittel (z. B. Natriumstärkeglykolat, vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktivem Mittel oder Dispergiermittel vermischt werden. Geformte Tabletten können hergestellt werden, indem in einer geeigneten Maschine ein Gemisch aus der gepulverten Verbindung, befeuchtet mit einem inerten flüssigen Verdünner, geformt wird. Die Tabletten können gegebenenfalls beschichtet oder eingekerbt werden und können so formuliert werden, dass für die langsame oder regulierte Freisetzung des Wirkbestandteils darin gesorgt wird, indem beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen verwendet wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil zu ergeben. Tabletten können gegebenenfalls mit einem darmlöslichen Überzug versehen werden, um für die Freisetzung in anderen Teilen der Eingeweide als dem Magen zu sorgen.

Formulierungen, die sich für die topische Verabreichung im Mund eignen, sind Pastillen, die den Wirkbestandteil in einer aromatisierten Basis umfassen, üblicherweise Saccharose, Akazie oder Traganth, Pastillen, die den Wirkbestandteil in einer inerten Basis wie z. B. Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akazie, enthalten; und Mundwässer, die den Wirkbestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen zur topischen Verabreichung gemäß vorliegender Erfindung können als Salbe, Creme, Suspension, Lotion, Pulver, Lösung, Paste, Gel, Spray, Aerosol oder Öl formuliert sein. Alternativ dazu kann eine Formulierung ein Pflaster oder einen Verband wie eine Bandage oder ein Heftpflaster umfassen, die jeweils mit Wirkbestandteilen und gegebenenfalls einem oder mehreren Exzipienten oder Verdünnern imprägniert sind.

Bei Erkrankungen des Auges oder anderer externer Gewebe, z. B. Mund oder Haut, werden die Formulierungen vorzugsweise als topische Salbe oder Creme aufgebracht, die den Wirkbestandteil in einer Menge von beispielsweise etwa 0,075 bis etwa 20 Gew.- %, vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 25 Gew.-% und am meisten bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 10 Gew.-% enthält. Wenn es in einer Salbe formuliert ist, kann das Prodrug entweder mit einer paraffinischen oder einer mit Wasser mischbaren Salbenbasis eingesetzt werden. Alternativ dazu können die Prodrug-Bestandteile in einer Creme mit einer Öl- in-Wasser-Cremebasis formuliert werden.

Falls gewünscht kann die wässrige Phase der Cremebasis beispielsweise zumindest etwa 30 Gew.-% eines mehrwertigen Alkohols, d. h. eines Alkohols mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen, wie z. B. Propylenglykol, Butan-1,3-diol, Mannit, Sorbit, Glycerin und Polyethylenglykol und Gemische davon, umfassen. Die topischen Formulierungen können wünschenswerterweise eine Verbindung umfassen, die die Absorption oder Penetration des Prodrug-Bestandteil durch die Haut oder andere betroffene Bereiche verbessert. Beispiele für solche Dermalpentrationsverstärker sind Dimethylsulfoxid und verwandte Analoge.

Die Ölphase der Emulsionen gemäß vorliegender Erfindung kann auf bekannte Weise aus bekannten Bestandteile gebildet werden. Diese Phase kann zwar lediglich einen Emulgator (der ansonsten als Reinigungsmittel bekannt ist) umfassen, umfasst aber wünschenswerterweise ein Gemisch aus zumindest einem Emulgator mit einem Fett oder einem Öl oder mit sowohl Fett als auch Öl. Üblicherweise ist ein hydrophiler Emulgator gemeinsam mit einem lipophilen Emulgator enthalten, der als Stabilisator wirkt. Es wird auch bevorzugt, sowohl ein Öl als auch ein Fett aufzunehmen. Gemeinsam bilden der/die Emulgator(en) mit oder ohne Stabilisator(en) das sogenannte Emulgationswachs, und das Wachs gemeinsam mit dem Öl und/oder Fett bildet die sogenannte Emulgationssalbenbasis, die die ölige disperse Phase der Cremeformulierungen bildet.

Zu den Emulgatoren und Emulsionsstabilisatoren, die zur Verwendung in der Formulierung gemäß vorliegender Erfindung geeignet sind, gehören Tween 60, Span 80, Cetostearylalkohol, Myristylalkohol, Glycerylmonostearat und Natriumlaurylsulfat.

Die Wahl geeigneter Öle oder Fette für die Formulierung richtet sich nach den gewünschten kosmetischen Eigenschaften, da die Löslichkeit der aktiven Verbindung in den meisten Ölen, die wahrscheinlich in pharmazeutischen Emulsionsformulierungen verwendet werden, sehr gering ist. Daher sollte die Creme vorzugsweise ein nicht-fettiges, nicht-färbendes und waschbares Produkt mit geeigneter Konsistenz sein, um das Auslaufen aus Tuben oder anderen Behältern zu vermeiden. Unverzweigte oder verzweigte, ein- oder zweibasige Alkylester, wie z. B. Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglykoldiester von Kokosnussfettsäuren, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Ethylhexylpalmitat oder ein Gemisch verzweigter Ester, das als Crodamol CAP bekannt ist, kann verwendet werden, wobei die letzteren drei bevorzugte Ester sind. Diese können je nach den erforderlichen Eigenschaften allein oder in Kombination verwendet werden. Alternativ dazu können Lipide mit hohem Schmelzpunkt, wie z. B. Petrolatum und/oder Paraffinöl oder andere Mineralöle verwendet werden.

Formulierungen, die sich zur topischen Verabreichung an das Auge eignen, umfassen auch Augentropfen, worin der Wirkbestandteil in einem geeigneten Träger gelöst oder suspendiert ist, insbesondere einem wässrigen Lösungsmittel für den Prodrug-Bestandteil. Der Prodrug-Bestandteil ist vorzugsweise in solcher Formulierung in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 20 Gew.-%; vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 10 Gew.-%, insbesondere etwa 1,5 Gew.-%, vorhanden.

Formulierungen für die rektale Verabreichung können als Suppositorien mit einer geeigneten Basis bereitgestellt werden, die beispielsweise Kokosbutter oder ein Salicylat umfasst.

Formulierungen, die für die vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Suppositorien, Tampons, Cremen, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen bereitgestellt werden, die zusätzlich zum Prodrug-Bestandteil Träger umfassen, wie sie nach dem Stand der Technik als geeignet bekannt sind.

Formulierungen, die für die nasale Verabreichung geeignet sind, worin der Träger ein Feststoff ist, umfassen ein grobes Pulver mit einer Teilchengröße beispielsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 500 um, die durch Aufschnupfen verabreicht wird, d. h. durch rasches Einatmen durch den Nasengang aus einem Behälter mit dem Pulver, der nahe an die Nase gehalten wird. Geeignete Formulierungen, worin der Träger eine Flüssigkeit ist, zur Verabreichung beispielsweise als Nasenspray, Nasentropfen oder durch Aerosol-Verabreichung durch Vernebler, sind wässrige oder ölige Lösungen des Prodrug-Bestandteils.

Formulierungen, die sich für die parenterale Verabreichung eignen, sind wässrige und nicht-wässrige, isotonische, sterile Injektionslösungen, die Oxidationshemmer, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten isotonisch machen; sowie wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdicker enthalten können, und Liposome oder andere Mikroteilchensysteme, die dazu bestimmt sind, die Verbindung auf Blutkomponenten oder ein oder mehrere Organe zu lenken. Die Formulierungen können in abgeschlossenen Einzeldosis- oder Mehrdosis-Behältern, beispielsweise Ampullen und Phiolen, bereitgestellt werden, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, beispielsweise Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Unvorbereitete Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulat und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.

Bevorzugte Eindosis-Formulierungen sind jene, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Teildosis, wie oben angeführt, oder einen angemessenen Teil davon, eines Prodrug-Bestandteils enthalten.

Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Formulierungen zusätzlich zu den oben spezifisch genannten Bestandteilen auch andere nach dem Stand der Technik bekannte Mittel enthalten können, die vom Typ der jeweiligen Formulierung abhängen, beispielsweise können jene, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, weitere Mittel, wie z. B. Süßungsmittel, Verdickungsmittel und Aromatisierungsmittel, enthalten.

Das Prodrug und die Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können auch zur Verwendung in Form veterinärer Formulierungen bereitgestellt werden, die beispielsweise nach Verfahren hergestellt werden können, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.

Nachstehend folgt eine kurze Zusammensetzung von Zellen und Zielenzymen, die für die Aktivierung verschiedener Prodrugs nützlich sind.

Tyrosin-Kinasen

Die Tyrosin-Kinase-Überfamilie umfasst den EGF-Rezeptor (EGFR), den Makrophagen- Koloniestimulationsfaktor- (CSF-1-) Rezeptor (v-fms), den Insulinrezeptor, der 30- bis 40%ige Identität mit dem Produkt des ros-Oncogens aufweist. Im Speziellen sind die Elemente dieser Überfamilie v-src, c-src, EGFR, HER2, CSF-1-Rezeptor, c-fms, v-ros, Insulinrezeptor und c-mos. Siehe Fig. 8.5 von K. B. Burck et al. (Hrsg.; 1988). Überexpression von Elementen der Typ 1-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Überfamilie ist bei vielen Krebsarten dokumentiert worden (S. A. Eccles et al. (1994-95)). Die Überexpression von Tyrosin-Kinasen ist mit dem Einwirken des biologischen α-Krebsmittels TNF-α (R. M. Hudziak et al. (1988) und R. M. Hudziak et al. (1990)) und mit Chemotherapie (Stühlinger et al. (1994)) verbunden.

Das Transformationsgen des Rous sarcoma-Virus, v-src, kodiert für ein Enzym, das Tyrosinreste auf Proteinen phosphoryliert. Das c-src-proto-Oncogen befindet sich auf Chromosom 20. Gewebe und Zelllinien, die von Tumoren mit neuroectodermalem Ursprung stammen, die einen neuralen Phänotyp aufweisen, exprimieren hohe Mengen an c-src, begleitet von hoher spezifischer Kinaseaktivität.

Mehrere Forschungsteams haben die Überexpression von c-erbB-2/neu("HER2")-Oncogen in Krebszellen berichtet. Brison (1993) hat festgestellt, dass erbB-proto-Oncogen in Human-Tumoren amplifiziert wird, was in den meisten Fällen zu Überexpression führt. Die Amplifikation des c-erbB-2/neu-Oncogens ist in Human-Brustdrüsentumoren (Slamon et al. (1987), von de Vijver et al. (1987), Pupa et al. (1993) und Andersen et al. (1995)) und in Blasentumoren (Sauter et al. (1993)) berichtet worden, und in jedem Fall war die Amplifikation von Überexpression begleitet. c-erbB-2/neu-Überexpression ist auch bei Eierstockkrebsgewebeproben (Slamon et al. (1989), Meden et al. (1994) und Felip et al. (1995)) und bei Tumoren, die vom peripheren Nervensystem stammen, berichtet worden. Sukumar und Barbacid (1990).

Um den Arzneimittel-Screeningtest durchzuführen, werden Tumorzelllinien bezüglich Expression des Oncogens getestet oder werden Engineering unterzogen, damit sie unterschiedliche Mengen an Tyrosin-Kinase exprimieren. Ausgewählte Zelllinien werden kultiviert, und Kandidaten-Arzneimittel werden in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Die Zellen werden bezüglich Zell-Abtötung oder Hemmung der Zellvermehrung getestet, wie von R. M. Hudziak et al. (1988) und R. M. Hudziak et al. (1990) beschrieben.

Dihydrofolat-Reductase

Methotrexat ist ein wirksamer Inhibitor von Dihydrofolat-Reductase, ein Enzym, das für den intrazellulären Folatstoffwechsel notwendig ist. Dihydrofolat-Reductase erfüllt die Funktion, Tetrahydrofolat aus Dihydrofolat, einem Produkt der Thymidylat-Synthasereaktion, zu regenerieren (Voet et al. (Hrsg.; 1995), S. 813). Es ist allgemein bekannt, dass ein wichtiger Mechanismus der Resistenz von Zellen gegen Methotrexat eine Zunahme der DHFR-Aktivität aufgrund der Amplifikation des DHFR-Gens ist. D. Banerjee et al. (1995), R. T. Schimke et al. (1988). U. Lönn et al. (1996) berichteten, dass die Amplifikation des DHFR-Gens bei Brustkrebspatientinnen auftrat, die zuvor nach dem chirurgischen Eingriff Hilfs-Chemotherapie (Cyclophosphamid, Methotrexat, 5-Fluoruracil [CMF]) erhalten hatten. Der Mangel an Retinoblastom (Rb) kann als Folge einer Zunahme der DHFR mRNA-Expressionsaktivität ohne Genamplifikation auch zu erhöhter MTX-Resistenz führen. W. W. Li et al. (1995). Es ist gezeigt worden, dass Zelllinien mit mutiertem p53 Genamplifikation erfahren, und die resistenten Zellen werden durch Chemotherapie selektiert. D. Banerjee et al. (1995), Y. Yin et al. (1992) und L. R. Livingston et al. (1992). Für den Zweck der Durchführung des Tests, wie hierin beschrieben, beschreibt R. T. Schimke et al. (1988) mehrere Mäuse-, Hamster- und Human-Zelllinien. Alternativ dazu wird das PCR-Verfahren von U. Lönn et al. (1996) verwendet, um DHFR-Genamplifikation zu testen und Zellen zu identifizieren, die beim Verfahren zur Identifikation von Therapiemitteln wie hierin beschrieben nützlich sind. Die Nucleotidsequenz der cDNA, die für die Human-Dihydrofolat-Reductase kodiert, wird von J. N. Masters und G. Attardi (1983) bereitgestellt, und Zellen können Engineering unterzogen werden, so dass sie unterschiedliche Mengen des Enzyms wie hierin angeführt exprimieren. A. P. Dicken et al. (1993) beschreibt ein mutantes DHFR-Gen, das durch Chemotherapie selektiert wird. Die Reinigung von DHFR und Tests, die mit der Enzymfunktion in Zusammenhang stehen, werden von T. Nakano et al. (1994) beschrieben. Alternativ dazu wird cDNA, die für DHFR kodiert, in NIH 3T3-Zellen transfiziert. Kandidaten-Arzneimittel werden in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt, und die Zell-Abtötung und die Hemmung der Vermehrung werden getestet.

Antimetaboliten, die von Dihydrofolat-Reductase-Aktivität abhängig sind, können durch die Bindung beispielsweise einer Alkylierungsgruppe entweder an der N5- oder der C6- Position von Dihydrofolat synthetisiert werden. Die Reduktion der N5-C6-Bindung durch DHFR führt zur Freisetzung des Alkylierungsmittels. Neben den Alkylierungsgruppen ist jede Gruppe nützlich, deren Freisetzung durch DHFR zur Produktion eines Toxins oder eines Antimetaboliten führt. Diese Verbindungen können durch Hinzufügung einer Phosphatase- oder Phospharamidat-Gruppe weiter modifiziert werden.

Mehrfach-arzneimittelresistente Tumoren

Mehrfach-Arzneimittelresistenz (MDR) ist eine generische Bezeichnung für die Vielzahl von Strategien, die Tumorzellen einsetzen, um die zytotoxischen Wirkungen von Antikrebs-Arzneimitteln zu umgehen. MDR ist durch eine verringerte Empfindlichkeit von Tumorzellen, nicht nur für das für die Chemotherapie eingesetzte Arzneimittel, sondern auch für ein breites Spektrum von Arzneimitteln, gekennzeichnet, die weder offensichtliche Strukturhomologie noch gemeinsame Ziele aufweisen. Diese pleiotrope Resistenz ist eines der Haupthindernisse für die erfolgreiche Behandlung von Tumoren. MDR kann aus strukturellen oder funktionellen Veränderungen an der Plasmamembran oder innerhalb des Zytoplasmas, der Zellabteile oder des Zellkerns resultieren. Molekulare MDR-Mechanismen werden in Bezug auf Modifikationen der Detoxifizierung und DNA- Reparaturwege, Veränderungen der zellulären Stellen der Arzneimittel-Sequestrierung, Verringerung der Arzneimittel-Ziel-Affinität, Synthese spezifischer Arzneimittelinhibitoren innerhalb von Zellen, verändertes oder unangemessenes Abzielen auf Proteine und beschleunigtes Entfernen oder Sekretion von Arzneimitteln erörtert.

Einer der Mechanismen, der MDR zugrundeliegt, resultiert aus der Amplifikation und Überexpression eines Gens, das als ATP-abhängiges Mehrfach-Arzneimittel-resistentes assoziiertes Protein (MRP) in durch Arzneimitteln selektierten Zelllinien bekannt ist. Ein Überblick der MDR-Mechanismen findet sich bei M. M. Gottesman et al. (1995) und Noder et al. (1996).

Um MDR-Zelllinien zu schaffen, werden Arzneimittel-Selektionen entweder in einem einzigen Schritt oder in mehreren Schritten durchgeführt, wie von M. M. Gottesman et al. (1995) und S. M. Simon und M. Schindler (1994) und den darin genannten Dokumenten beschrieben. Die Isolierung von DNA-Sequenzen, die für MDR von verschiedenen Säugetierspezies kodieren, wird von P. Gros et al. (1986), A. V. Gudkov et al. (1987) und I. B. Roninson et al. (1984) beschrieben und von M. M. Gottesman et al. (1995) im Überblick dargestellt, und Zellen können Engineering unterzogen werden, so dass sie unterschiedliche Mengen dieses Enzyms wie oben beschrieben exprimieren. Die Prodrug- Targeting-MDR basiert auf der ATPase-Aktivität dieses Transporters.

Ribonucleotid-Reductase

Das Enzym Ribonucleotid-Reductase reduziert Ribonucleosiddiphosphate zu den entsprechenden Desoxyribonucleosiddiphosphaten. Das Enzym ist ein Tetramer, das aus zwei α-Untereinheiten und zwei β-Untereinheiten besteht. Hydroxyharnstoff blockiert diese Reaktion spezifisch durch Wechselwirkung mit dem freien Tyrosyl-Radikal (Tyr- 122) des β&sub2;-Substratkomptexes. Voet et al. (1995). Das Ziel beim Targeting dieser Reaktion besteht darin, die Anhäufung des radikalischen Produkts O&sub2; zu ermöglichen, das in hohem Maße zytotoxisch ist.

Anwendung der Technologie auf andere Erkrankungen

Während das primäre Augenmerk der hierin beschriebenen Technik auf Krebs gerichtet ist, sollte festgestellt werden, dass die Technik allgemein auf andere Erkrankungen anwendbar ist, insbesondere Antibiotika-resistente bakterielle Infektionen. Die β-Lactam- Antibiotika stoßen aufgrund der Überexpression von β-Lactamasen auf Resistenz in Bakterien. J. M. T. Hamilton-Miller und J.T. Smith (Hrsg.; 1979), S. 443. Andere Enzyme, wie die Aminoglykosid-Phosphotransferase Typ III, werden durch nachfolgende Behandlung mit Aminoglykosid-Antibiotika, wie z. B. Kanamycin, induziert und selektiert. G. A. Mc-Kay et al. (1994). Es werden Prodrug-Substrate, die von bekannten Substraten stammen, hergestellt, die die Enzymaktivität nicht blockieren, sondern statt dessen die hohe Enzymaktivität nutzen, um intrazelluläre Toxine für die infektiösen Mittel zu erzeugen.

Thymidylat-Synthase

Die Überexpression von Thymidylat-Synthase ist mit Kolonkrebs, Brustkrebs, Magenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Leberkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs verbunden. Diese Erkrankungen werden zur Zeit durch Antimetaboliten-Arzneimittel (auf Uracil-Basis, Folat-Basis oder Chinazolin-Basis (siehe Tabelle I)) behandelt. In jedem dieser Fälle ist es wahrscheinlich, dass Tumorsuppressorverlust und/oder 5-Fluoruraciltherapie zu amplifizierter TS-Aktivität führen, oder bezüglich Arzneimittel-resistenter Formen des Enzyms selektieren, und dadurch zu Arzneimittel-Resistenz des Erkrankungsrückfalls führen kann. U. Lönn et al. (1996) berichteten, dass die Amplifikation des TS-Gens bei Brustkrebspatienten auftrat, die zuvor nach dem chemischen Eingriff unterstützender Chemotherapie (Cyclophosphamid, Methotrexat, 5-Fluoruracil [CMF]) erhalten hatten. Diese erhöhte TS-Expression erfolgt zusätzlich zur grundlegenden TS-Zunahme, die aus dem Verlust der Tumorsuppressorfunktion resultiert. Die Hauptreaktion, die normalerweise von TS durchgeführt wird, ist die Synthese von Desoxythymidinmonophosphat (dTMP) und Dihydrofolat (DHF) aus Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) und N(5),N(10)-Methylentetrahydrofolat (THF). Gemäß einer Ausführungsform wird ein Derivat von Uracil oder THF für Zellen bereitgestellt, die TS exprimieren. Wie hierin verwendet werden "Uracil" (nur Base) und "Uridin" (Base und Zucker) austauschbar und synonym verwendet. Tabelle 4 (unten) fasst die vielen Krebstypen zusammen, die durch erhöhte TS-Expression beeinflusst werden.

Differenzfaktor zwischen den Mittelwerten: > 2,5

Das Derivat oder "Prodrug" wird vom Enzym in stark zytotoxische Metaboliten umgewandelt. Die geringe Menge an TS, die in normalen Zellen exprimiert wird, ergibt keine toxische Menge des umgewandelten Toxins. Hohe TS-Expressionsmengen in erkrankten Geweben erzeugen mehr Toxin und führen dadurch zu einer Hemmung der Zellvermehrung und/oder Zell-Abtötung. Beispielsweise wird bei der heutigen Therapie 5- Fluordesoxyuridylat verwendet, um die TS-Aktivität zu hemmen. Während der Reaktion mit Substrat wird das Fluoratom irreversibel an das TS-Enzym gebunden und hemmt es. Das Therapeutikum kann es TS ermöglichen, die Reaktion abzuschließen, erzeugt aber ein modifiziertes Produkt, das, wenn es in DNA aufgenommen wird, eine toxische Wirkung erzeugt. Das Enzymprodukt kann auch andere entscheidende Zellfunktionen (z. B. Proteinsynthese oder Energiestoffwechsel) blockieren. Durch die Umwandlung des Prodrugs kann auch ein Metabolit wie CN freigesetzt werden, der für die Zelle toxisch ist. Es können Derivate von Uracil/dUMP und N(5)(10)-THF synthetisiert werden, die alle das Potential haben, nach Stoffwechseltransformation durch TS toxisches Produkt zu erzeugen.

Primärsequenzen zeigen, dass TS eines der am stärksten konservierten Enzyme ist. K. Perry et al. (1990). Die Kristallstrukturen von TS von mehren prokaryotischen Spezies, Lactobacillus casei (L. W. Hardy et al. (1987); J. Finer-Morre et al. (1993)) und Escherichia coli (K. Perry et al. (1990)); ein Eukaryot Leishmania major (E. R. Knighton et al. (1994)); und T4-Phage (J. S. Finer-Morre et al. (1994)) sind bestimmt worden und weisen darauf hin, dass auch tertiäre Struktur sehr gut konserviert wird. Die Sequenzausrichtung der TS-Spezies, deren dreidimensionale Strukturen bestimmt worden sind werden von C. A. Schiffer et al. (1995) gezeigt. Von diesen Aminosäuresequenzen können die DNA- Sequenzen unter Einsatz von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, abgeleitet oder isoliert werden. Sambrook et al. (1989). Alternativ dazu sind einige 29 TS-Sequenzen von verschiedenen Organismen kloniert und in den DNA- Datenbanken hinterlegt worden, wie von C. W. Carreras und D. V. Santi (1995) beschrieben. Die Sequenz von Human-Thymidylat-Synthasegen, seine Klonierung, Expression und Reinigung wird von K. Takeishi et al. (1985), V. J. Davisson et al. (1989) und V. J. Davisson et al. (1994) beschrieben. Gene, die für das TS-Protein kodieren und die erforderlichen Regulationssequenzen enthalten, werden unter Einsatz von Verfahren konstruiert, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Das für TS kodierende Gen wird durch Elektroporations-, Transformations- und Transfektionsverfahren in Zielzellen eingebracht. Sambrook et al. (1989). Alternativ dazu wird das Gen nach Verfahren in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise wie von C. W. Carreras und D. V. Santi, (1995), Miller (1992) und Spector et al. (1998) beschrieben. Der Expressionsvektor insertiert das TS-Gen in die Zellen. Die Zellen werden dann unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression und Produktion von TS-Protein begünstigen.

Die Human-Magenkrebszelllinien MKN-74, MKN-45, MKN-28 und KATO-III können im oben beschriebenen Test verwendet werden, um potentielle Therapiemittel zu identifizieren, die selektive Substrate für TS sind. MKN-74 und MKN-45 werden aus gut bzw. schlecht differenzierten Adenocarcinomas geschaffen. Diese Zelllinien und Kulturbedingungen werden von M. Osaki et al. (1997) und den darin zitierten Dokumenten beschrieben. Alternativ dazu können Tumorzelllinien wie die von S. Copur et al. (1995) beschriebenen, die durch 5-FU selektiert worden sind, um Thymidylatsynthese überzuexprimieren, verwendet werden.

Die Quantifizierung von TS kann unter Einsatz enzymatischer biochemischer Tests erfolgen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Für die Quantifizierung des Ausmaßes an TS-Protein- und TS-Gen-Expression aus Human-Tumorgewebeproben liefern die von P. G. Johnston et al. (1991) und T. Horikoshi et al. (1992) berichteten Verfahren empfindliche Tests. Alternativ dazu wird das PCR-Verfahren von U. Lönn et al. (1996) verwendet, um TS-Genamplifikation zu testen und Zellen zu identifizieren, die bei den Verfahren zur Identifikation von Therapiemitteln wie hierin beschrieben nützlich sind.

Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein wird, werden auch Kontroll-Zellkultursysteme ohne Arzneimittel und getrennt davon mit einem Vergleichs-Arzneimittel wie den nachstehend als Beispiele genannten Verbindungen getestet. Eine Leitverbindung ist eine, die bevorzugt Zielzellen mit etwa 2fach und vorzugsweise etwa 3fach höherer Aktivität als normale Zellen abtötet. Nach den hierin beschriebenen Verfahren können Mittel identifiziert werden.

Gemäß vorliegender Erfindung wird auch ein Verfahren zum Hemmen der Vermehrung einer hyperproliferativen Zelle beschrieben, indem zunächst der obige Test durchgeführt wird. Ein durch diesen Test identifiziertes Prodrug wird mit der Zelle in Kontakt gebracht und in der Zelle durch ein endogenes intrazelluläres Enzym, wie oben beschrieben, in einen toxischen Metaboliten umgewandelt. Wachstum oder Zytotoxizität von Bakterien, Hefe und anderen Zelltypen kann überwacht werden, wie von Miller et al. (1992), Sugarman et al. (1985) und Spector et al. (1998) beschrieben.

TS-Prodrugs

Gemäß vorliegender Erfindung werden zwei Klassen von durch TS aktivierten Verbindungen beschrieben, jeweils ein Derivat von 5-substituiertem Desoxyuridinmonophosphat oder einem geschützten 5-substituierten Uracil oder Desoxyuridinmonophosphat. Geschützte 5-substituierte Desoxyuridinmonophosphat-Derivate sind jene, bei denen die Phosphatgruppe durch Bindung geeigneter chemischer Schutzgruppen blockiert worden ist. Der Schutz von 5-substituierten Desoxyuridinmonophosphatderivaten kann die Löslichkeit verbessern, das Eindringen in die Zelle erleichtern, das Passieren der Blut-Hirn-Schranke erleichtern und die Wirkung von zellulärer oder extrazellulären Phosphatasen verhindern, die ansonsten zu einem Verlust der Phosphatgruppe führen könnte.

Die Einwirkung von Thymidylat-Synthase auf 5-substituierte Uridinmonophosphat-Derivate kann den Substituenten freisetzen, der an der 5-Position des Pyrimidinrings gebunden ist ("Abgangsgruppe"). Der freigesetzte Substituent ist dann entweder an sich oder nach Reaktion mit einer anderen zellulären Komponente in der Lage, als Toxin oder Inhibitor der Zellvermehrung zu wirken.

Allgemeine Synthese von Verbindungen der Klasse I

Die L- und D-Isomere der Verbindungen der Klasse I weisen folgende Struktur auf:

In den obigen Formeln ist oder enthält R&sub1; (an der 5-Position) eine Abgangsgruppe, die eine chemische Gruppe ist, die eine Moleküldimension und Elektrophilie aufweist, die mit einem Abzug aus dem Pyrimidinring durch Thymidylat-Synthase kompatibel ist, und die nach der Freisetzung aus dem Pyrimidinring durch Thymidylat-Synthase die Fähigkeit aufweist, die Vermehrung der Zelle zu hemmen oder die Zelle abzutöten.

In den obigen Formeln ist Q ein Phosphat- oder Phosphoramidatderivat, das eine chemische Gruppe enthält, die aus der aus Zuckergruppen, Thiozuckergruppen, carbozyklischen Gruppen und Derivaten davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Beispiele für Zuckergruppen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, zyklische Monosaccharidzuckergruppen, wie z. B. jene, die von Oxetanen (Zuckern mit 4-gliedrigem Ring), Furanosen (Zuckern mit 5-gliedrigem Ring) und Pyranosen (Zuckern mit 6-gliedrigem Ring) abgeleitet sind. Beispiele für Furanosen sind Threofuranosyl (von Threose, einem Vier-Kohlenstoff-Zucker); Erythrofuranosyl (von Erythrose, einem Vier-Kohlenstoff-Zucker); Ribofuranosyl (von Ribose, einem Fünf-Kohlenstoff-Zucker); Arafuranosyl (auch als Arabinofuranosyl bezeichnet; von Arabinose, einem Fünf-Kohlenstoff-Zucker); Xylofuranosyl (von Xylose, einem Fünf-Kohlenstoff-Zucker); und Lyxofuranoxyl (von Lyxose, einem Fünf- Kohlenstoff-Zucker). Beispiele für Zuckergruppenderivate sind "Desoxy"-, "Keto"- und "Dehydro"-Derivate sowie substituierte Derivate. Beispiele für Thiozuckergruppen sind die Schwefelanaloge der obigen Zuckergruppen, in denen der Ring-Sauerstoff durch ein Schwefelatom ersetzt ist. Beispiele für carbozyklische Gruppen sind C&sub4;-carbozyklische Gruppen, C&sub5;-carbozyklische Gruppen und C&sub6;-carbozyklische Gruppen, die weiters einen oder mehrere Substituenten, wie z. B. -OH-Gruppen, aufweisen können.

Bei einer Gruppe von Verbindungen ist Q eine β-D-Ribofuranosylgruppe der Formel:

worin R&sub7; aus der aus Phosphoryl, Phosphoramidat und Derivaten davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin R&sub2; und R&sub3; gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander -H oder -OH sind.

Bei manchen Verbindungen ist R&sub1; eine Alkenylgruppe, d. h. (-CH=CH)n-R&sub4;, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, und R&sub4; ein Halogen, wie z. B. I&supmin; oder Br&supmin;, CN&supmin;, oder Quecksilber ist; worin R&sub2; H ist und R&sub3; -OH ist; worin R&sub2; OH ist und R&sub3; H ist; worin R&sub2; und R&sub3; H sind; oder worin R&sub2; und R&sub3; OH sind.

Bei anderen Verbindungen ist R&sub1; eine Alkenylgruppe, d. h. (-CH=CH)n-R&sub4;, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, und R&sub4; eine Gruppe ist oder enthält, die aus der aus H, einem Halogen, Alkyl, Alken, Alkin, Hydroxy, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Heteroaryl, -S-Alkyl, -S-Aryl, einer Cyanid-, Cyanat- oder Thiocyanathalovinylgruppe, einer Quecksilberhalogenidgruppe, -S-Heteroaryl, -NH&sub2;, NH-Alkyl, -N(Alkyl)&sub2;, -NHCHO, -NHOH, -NHO- Alkyl, NH&sub2;CONHO- und NHNH&sub2; bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Bei manchen dieser Verbindungen sind R&sub2; und R&sub3; H; R&sub2; ist OH und R&sub3; ist H; R&sub2; ist H und R&sub3; ist OH; oder R&sub2; und R&sub3; sind OH.

Eine bevorzugte Ausführungsform für den Substituenten in der R&sub1;-Position ist eine, die einen Allyl-Austausch erfahren könnte, wie in Fig. 8 gezeigt.

Es ist aber anzumerken, dass in den Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung R¹ -CH=CH-Br ist, R² -H ist und R³ -OH ist, und R&sup7;

ist.

Bei einer weiteren Gruppe von Verbindungen (die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung sind), ist das Kandidaten-Therapeutikum eine Verbindung der Formel:

worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist; worin A ein Phosphoramidderivat oder eine Verbindung der Formel:

ist,

und worin Q aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H, einem unsubstituierten oder substituierten Zucker wie oben definiert und einer substituierten oder unsubstituierten carbozyklischen Gruppe wie oben definiert besteht.

In einem Fall sind die oben beschriebenen Verbindung durch Q mit der Struktur

modifiziert, worin R&sub7; aus der aus H, Phosphoryl, Phosphoramidat und Derivaten davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und worin R&sub2; und R&sub3; gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander -H oder -OH sind. Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; nicht H. Für diese Verbindungen kann R&sub1; auch die Struktur -(CH=CH)"-R&sub4; haben, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, und R&sub4; aus der aus H, einem Halogen, Alkyl, Alken, Alkin, Hydroxy, -O-Alkyl, -O-Aryl, O-Heteroaryl, -S-Alkyl, -S-Aryl, -S-Heteroaryl, -NH&sub2;, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)&sub2;, -NHCHO, einem Cyanid, Cyanat und einer Thiocyanathalovinylverbindung, einer Quecksilberhalogenidverbindung, -NHOH, -NHO-Alkyl, NHNH&sub2; und NH&sub2;CONHO- bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei wieder einer anderen Gruppe von Verbindungen (die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung sind) ist das Kandidaten-Therapeutikum eine Verbindung der Formel:

worin R = 2'-Desoxy-5-uridyl ist, m = 0 oder 1 ist und n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist.

Gegebenenfalls können die Verbindungen in einer ihrer enantiomeren, diastereomeren oder stereoisomeren Formen formuliert sein, darunter beispielsweise D- oder L-Formen, und können in jeder beliebigen stereochemischen Konfiguration vorliegen, beispielsweise der α- oder β-anomeren Form.

Die Synthese der oben angeführten 5-substituierten Pyrimidinnucleoside und 5-substituierten Pyrimidinnucleosidmonophosphate kann nach Verfahren erreicht werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise führt die Behandlung von 5- Chlormercuri-2'-desoxyuridin mit Haloalkylverbindungen, Haloacetaten oder Haloalkenen in Gegenwart von Li&sub2;PdCl&sub4; dazu, dass über eine Organopalladium-Zwischenverbindung das 5-Alkyl-, 5-Acetyl- bzw. 5-Alken-Derivat gebildet wird. Wataya et al. (1978) und Bergstrom et al. (1981). Ein weiteres Beispiel für C5-Modifikation von Pyrimidinnucleosiden und -nucleotiden ist die Bildung von C5-trans-Styrylderivaten durch Behandlung von ungeschütztem Nucleotid mit Mercuriacetat, gefolgt von der Addition von Styrol oder Ringsubstituierten Styrolen in Gegenwart von Li&sub2;PdCl&sub4;. Bigge et al. (1980). Pyrimidindesoxyribonucleosidtriphosphate wurden durch Behandlung mit Mercuriacetat in Acetatpuffer bei 50º für 3 h an der 5-Position des Pyrimidinrings mit Quecksilber derivatisiert. Dale et al. (1973). Es ist auch zu erwarten, dass eine solche Behandlung wirksam Monophosphate modifiziert; alternativ dazu könnte ein modifiziertes Triphosphat beispielsweise durch kontrollierte Behandlung mit Alkaliphosphatase, gefolgt von Monophosphat-Reinigung enzymatisch zu einem modifizierten Monophosphat umgewandelt werden. Ersatzweise können andere organische oder anorganische Gruppen mit ähnlichen Moleküleigenschaften wie Quecksilber, aber mit bevorzugten pharmakologischen Eigenschaften, verwendet werden. Allgemeine Verfahren zur Synthese substituierter Pyrimidine sind beispielsweise den US-Patenten Nr. 4.247.544, Nr. 4.267.171; und Nr. 4.948.882; sowie Bergstrom et al. (1981) zu entnehmen. Die obigen Verfahren wären auch auf die Synthese von Derivaten von 5-substituierten Pyrimidinnucleosiden und -nucleotiden anwendbar, die andere Zucker als Ribose oder 2-Desoxyribose enthalten, beispielsweise 2'-3'-Didesoxyribose, Rabinose, Furanose, Lyxose, Pentose, Hexose, Heptose und Pyranose. Ein Beispiel für einen Substituenten an der 5-Position ist die Halovinylgruppe, z. B. E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridylat. P. J. Barr et al. (1983). Diese Verbindung wird wie im nachfolgenden Experimentellen Teil beschrieben synthetisiert.

Alternativ dazu sind 5-Bromdesoxyuridin, 5-Ioddesoxyuridin und ihre Monophosphatderivate im Handel von Glen Research, Sterling, VA (USA), Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO (USA), Moravek Biochemicals, Inc., Brea, CA (USA), ICN, Costa Mesa CA (USA) und New England Nuclear, Boston, MA (USA) erhältlich.

Im Handel erhältliches 5-Bromdesoxyuridin und 5-Ioddesoxyuridin können entweder chemisch oder enzymatisch durch die Wirkung eines Kinaseenzyms in ihre Monophosphate umgewandelt werden, indem in Handel erhältliche Reagenzien von Glen Research, Sterling, VA (USA) und ICN, Costa Mesa, CA (USA) verwendet werden. Diese Halogenderivate könnten mit anderen Substituenten kombiniert werden, um neue und wirksamere Antimetaboliten zu schaffen.

Allgemeine Synthese von Verbindungen der Klasse II

Bei einem weiteren Verfahren ist das Prodrug, das mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, die Thymidylat-Synthase überexprimiert, ein L- oder D-Isomer einer Verbindung der Formei:

In den obigen Formeln ist R¹ eine Gruppe der Formel:

in den obigen Formel ist oder enthält R² eine zweiwertige Elektronen-leitende Gruppe.

Bei manchen Verbindung ist oder enthält R² eine mono- oder polyungesättigte Elektronenleitende Gruppe, die bewirkt, dass Elektronen vom Pyrimidinring weg und zur Abgangsgruppe R¹ hin geleitet werden. Bei einer Ausführungsform ist R² aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus: einer ungesättigten Hydrocarbylgruppe; einer aromatischen Hydrocarbylgruppe, die eine oder mehrere ungesättigte Hydrocarbylgruppen umfasst; und einer heteroaromatischen Gruppe, die eine oder mehrere ungesättigte Hydrocarbylgruppen umfasst.

Bei manchen Verbindungen ist R² eine ungesättigte Hydrocarbylgruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei manchen Verbindungen bilden R² und R³ gemeinsam eine Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei manchen Verbindungen ist R² eine aromatische Hydrocarbylgruppe, mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei manchen Verbindungen ist R² eine heteroaromatische Gruppe, die eine Struktur aufweist, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin J ein Heteroatom, wie z. B. -O-, -S- oder -Se-, oder eine Heteroatomgruppe, wie -NH- oder -NRALK- ist, worin RALK ein unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.

In den obigen Formeln ist R³ eine zweiwertige Spacer-Gruppe, die auch als Spacer-Einheit bezeichnet wird. Bei manchen Verbindungen ist R³ eine zweitwertige Spacer-Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die R&sup5; gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen sind.

Bei manchen Verbindungen ist R³ eine zweiwertige Spacer-Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

In der obigen Formel ist n eine ganze Zahl von 0 bis 10, und m ist 0 oder 1.

Bei manchen Verbindungen ist n eine ganze Zahl von 0 bis 10, und m ist 1. Bei manchen Verbindungen ist n = 0, und m ist 0. Bei manchen Verbindungen ist, wenn R&sup7; -H ist, n nicht 0. Bei manchen Verbindungen ist, wenn R&sup7; -H ist, m nicht 0. Bei manchen Verbindungen ist, wenn R&sup7; -H ist, R&sup4; kein Halogen (d. h. -F, -Cl, -Br, -I). Bei manchen Verbindungen ist, wenn R&sup7; -H ist und m = 0 ist, R&sup4; kein Halogen (d. h. -F, -Cl, -Br, -I). Bei manchen Verbindungen ist, wenn R&sup7; -H ist und m = 0 ist und n = 0 ist, R&sup4; kein Halogen (d. h. -F, -Cl, -Br, -I).

Es ist aber festzustellen, dass bei den Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung -(R²)n-(R³)m- -CH =CH- ist und R&sup4; -Br ist.

In der obigen Formel ist R&sup4; eine Toxophorgruppe. Wie hierin verwendet ist mit dem Begriff "Toxophor" eine Gruppe gemeint, die eine Abgangsgruppe ist oder enthält, die eine chemischen Einheit darstellt, deren Moleküldimension und -elektrophilie mit dem Abzug aus dem Pyrimidinring durch Thymidylat-Synthase kompatibel ist, und die bei der Freisetzung vom Pyrimidinring durch Thymidylat-Synthase die Fähigkeit aufweist, die Vermehrung der Zelle zu hemmen oder die Zelle abzutöten.

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält das Toxophor eine Abgangsgruppe, die durch ein in der Zelle überexprimiertes intrazelluläres Enzym aktiviert oder freigesetzt wird. Bei einer Ausführungsform ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus:

bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

worin X -Cl, -Br oder -I oder eine andere wirkungsvolle Abgangsgruppe (einschließlich, aber nicht beschränkt auf -CN, -OCN und -SCN) ist; Y gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander -H oder -F sind; und Z gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander -O- oder -S- sind.

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit der Struktur:

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit der Struktur:

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit der Struktur:

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit der Struktur:

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine Gruppe mit der Struktur:

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup4; eine chemische Gruppe, die aus der aus -Br, -I, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Heteroaryl, -S-Alkyl, -S-Aryl-, -S-Heteroaryl-, -CN, -OCN, -SCN, -NH&sub2;, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)&sub2;, -NHCHO, -NHOH, -NHO-Alkyl, NH&sub2;CONHO-, NHNH&sub2;, -N&sub3; und einem Derivat von Cisplatin, wie z. B.

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Es ist jedoch festzustellen, dass in den Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung R&sup4; -Br ist.

In den obigen Formeln ist oder enthält Q eine Zuckergruppe oder eine ähnliche Gruppe, die die funktionelle Bindung des Prodrugs an das Enzym, z. B. TS oder TK, unterstützt.

Bei manchen Verbindungen ist Q aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt,

worin die R&sup6; gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander -H, -OH, -OC(=O)CH&sub3; oder eine andere geschützte Hydroxylgruppe (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Benzoyl, -COC&sub6;H&sub5; und Toluoyl, -COC&sub6;H&sub4;CH&sub3;) sind; und R&sup7; Wasserstoff, eine Phosphatgruppe, eine Phosphoramidatgruppe oder eine andere phosphorhältige Gruppe ist.

Bei manchen Verbindungen ist Q

Bei den Verbindungen der beanspruchten Erfindung ist Q

Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; Wasserstoff. Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; nicht Wasserstoff. Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphatgruppe oder eine Phosphoramidatgruppe. Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphatgruppe oder eine Phosphoramidatgruppe. Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphoramidatgruppe.

Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphoramidatgruppe, die von einer Aminosäure stammt, beispielsweise einschließlich der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren. Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphoramidatgruppe, die von Alanin stammt. Bei den Verbindungen der beanspruchten Erfindung ist oder enthält R&sup7; eine Gruppe mit der Struktur:

Die obige Gruppe und Verfahren zu ihrer Herstellung werden von McGuigan et al. (1993) und McGuigan et al. (1996) beschrieben.

Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphoramidatgruppe, die von Tryptophan abgeleitet ist. Bei einer Ausführungsform ist oder enthält R&sup7; eine Gruppe mit der Struktur:

Die obige Gruppe und Verfahren zu ihrer Herstellung werden von Abraham et al. (1996) beschrieben.

Bei manchen Verbindungen ist R&sup7; eine Phosphatgruppe. Bei einer Ausführungsform ist oder enthält R&sup7; eine Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Die erste der beiden obigen Gruppen und Verfahren zu ihrer Herstellung werden von Freed et al. (1989); Sastry et af. (1992); Farquhar et al. (1994) und Farquhar et al. (1995) beschrieben. Die zweite der beiden obigen Gruppen und Verfahren zu ihrer Herstellung werden von Valette et al. (1996); und Benzaria et al. (1996) beschrieben.

Bei manchen Verbindungen ist oder enthält R&sup7; eine Gruppe mit einer Struktur, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist (worin R ein aromatischer Substituent ist).

Die erste der beiden obigen Gruppen und Verfahren zu ihrer Herstellung werden von Meier et al. (1997); Meier et al. (1997); und Meier et al. (1997) beschrieben. Die zweite der beiden obigen Gruppen und Verfahren zu ihrer Herstellung werden von Hostetler et al. (1997); und Hostetler et al. veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO 96/40088 (1996) beschrieben.

Bei manchen Verbindungen bildet das R&sup7; eine zyklische Gruppe innerhalb von Q. Eine solche Ausführungsform und ein Verfahren zu seiner Herstellung wird nachstehend gezeigt (worin DMTR 4,4'-Dimethoxytrityl ist, Boc t-Butyloxycarbonyl ist, CDD 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid ist und 4-DMAP 4-Dimethyiaminopyridin ist):

Bei einer Ausführungsform kann die Verbindung in jeder enantiomeren, diastereomeren oder stereoisomeren Form vorliegen, einschließlich D-Form, L-Form, α-anomerer Form und β-anomerer Form.

Bei einer Ausführungsform kann die Verbindung in einer Salzform oder einer geschützten oder Prodrug-Form oder einer Kombination davon vorliegen, beispielsweise als Salz, Ether oder Ester.

Bei einer Ausführungsform wie gemäß vorliegender Erfindung beansprucht ist das Prodrug eine Verbindung der Formel:

Gemäß einer Ausführungsform, die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung ist, ist das Prodrug eine Verbindung der Formel:

Bei einer Ausführungsform, die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung ist, ist das Prodrug eine Verbindung der Formel:

Bei einer Ausführungsform, die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung ist, ist das Prodrug eine Verbindung der Formel:

Bei einer Ausführungsform, die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung ist, ist das Prodrug eine Verbindung der Formel:

Bei einer anderen Ausführungsform (die nicht Gegenstand der beanspruchten Erfindung ist), werden die obigen Strukturen weiter modifiziert, so dass sie Thiophosphodiaziridinanstelle von Phosphodiaziridingruppen aufweisen, indem die nachstehend beschriebenen Verfahren eingesetzt werden.

Allgemeine Synthesestrategie für Verbindungen der Klasse II

Die Strukturen an der 5-Position von Uracil werden als "Tether" ("Anbinder") bezeichnet, weil sie die vorgeschlagene Abgangsgruppe (Toxophor) mit dem Heterozyklus verbinden. Nach der Aktivierung des Heterozyklus durch Reaktion mit Cys-195 in Human- TS wird eine negative Ladung von der 6-Position von Uracil in den Tether geleitet. Dieser Mechanismus ist von Barr et al. (1983) für die 5'-monophosphorylierten Versionen von (E)-5-(Bromvinyl)-2'-desoxyuridin (BVDU) und von Wataya et al. (1979), Santi (1980) und Bergstrom et al. (1984) für jene von (E)-5-(3,3,3-Trifluor-1-propenyl)-2'-desoxyuridin (TFPe-dUrd) beschrieben worden.

Der Tether-"Spacer" zwischen dem Toxin und dNMP muss ungesättigt sein, so dass er die Toxin-labilisierende negative Ladung leitet, die durch den TS-Cys-Sulfhydryl-Angriff zugeführt wird. Von den vielen ungesättigten organischen Funktionalitäten, die für diesen Zweck verfügbar sind, sind Vinyl-, Allyl- und Propargylgruppen einfach, klein und leicht synthetisch erhältlich. Die Vinyl- und Allyleinheiten haben den Vorteil, dass sie in einer von zwei nicht-interkonvertierbaren geometrischen isomeren Formen hergestellt werden können. Daher können sie als "Sonden" für die Prodrug-Aufnahme durch die TS-aktive Stelle verwendet werden. Andererseits hat die Proparagyleinheit den Vorteil, dass sie zylindrisch symmetrisch ist, so dass TS-katalysierte Toxinfreisetzung von diesem Tether-Typ nicht von seiner Ausrichtung in Bezug auf den Uracilring von dUMP abhängig ist, wie das bei den Vinyl- und Allylmolekülen der Fall ist.

Es sind zwei verschiedene Ansätze angewandt worden, um Prodrugs auf Nucleotid-Basis zu konstruieren. Einer basiert auf der Struktur von BVDU-Monophosphat und umfasst ein(e) Abgangsgruppe/Toxin, die bzw. das direkt an den Terminus eines (Poly)vinylsubstituenten an C5 von dUMP gebunden ist. Das ist der Vinyltether-Ansatz. Diese Verbindungen werden teilweise als "Klasse I"-Verbindungen bezeichnet. Der andere basiert auf der Struktur von TFPe-dUMP und ist dem ersten ähnlich, weist aber eine Methylengruppe auf, die die Abgangsgruppe/das Toxin und die ungesättigte Einheit trennt und daher eine Allyl- oder Propargyleinheit enthält, wie nachstehend als "Klasse II" beschrieben. Dabei handelt es sich um den Allyltether-Ansatz.

Strukturen für 5'-Phosphoramidat-Versionen jedes Typs werden nachstehend gezeigt:

Dem Aktivierungsmechanismus einer Propargylversion des Allyltetheransatzes geht die Wechselwirkung von sowohl 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat (EdUMP) als auch 5-(3-Hydroxy-1-propinyl)-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat (HOPdUMP) mit TS voran (Barr et al., 1981, Barr und Robins, 1983). EdUMP ist ein wirksamer TS-Inhibitor (Ki = 0,1 uM) und bildet an der aktiven Stelle mit großer Wahrscheinlichkeit eine Spezies auf Allen-Basis. HOPdUMP (Ki = 3,0 uM) zeigt ungewöhnliche Hemmungskinetik, die auf die Bildung einer Spezies auf Cumulen-Basis an der aktiven Stelle zurückzuführen sein kann.

Vor kurzem sind 5-alkylidenierte 5,6-Dihydrouracile synthetisiert worden, deren Struktur jener der Zwischenverbindung ähnlich ist, die sowohl Vinyl- als auch Allyltether-Ansatz-Mechanismen gemeinsam ist (Anglada et al., 1996). Es wurde gezeigt, dass diese in hohem Maße elektrophil sind. Ihre bereitwillige Reaktion mit Ethanol zur Erzeugung von 5-(Ethoxymethyl)uracilen geht bei den in Fig. 8 gezeigten Mechanismen der Wasserzugabe voran, die katalytisch kompetente TS regeneriert. In noch jüngerer Vergangenheit wurde durch Einfang-Studien die Existenz der lange nicht auffindbaren, von TS erzeugten C5-Methylen-Zwischenverbindung gezeigt (Barret et al. (1998)).

Die Synthese von mit C5-Propargyl- und -Allylalkohol ausgestatteten 2'-Desoxyuridinen erfolgt ohne Umwege. In der Literatur gibt es Berichte über viele davon ihre eng verwandten Derivate, und einige sind in Zusammenhang mit TS untersucht worden. Beispielsweise sind 5-Alkinyl-dUMPs einschließlich 5-(3-Methoxy-1-propinyl) und 5-(3-Hydroxy-1-propinyl) als TS-Inhibitoren untersucht worden (Barr et al. (1981)), und von einigen davon ist gezeigt worden, dass sie in die DNA von Krebszellen mit TS-Defizienz aufgenommen wurden (Balzarini et al. (1985)).

Sowohl 5-Mercuri- (Ruth et al. (1978)) als auch 5-Ioduridine (Robins et al. (1981)) kondensieren leicht in Gegenwart von Palladium-Katalysator mit Alkenen und Alkinen, was mit C5-Tether ausgestattete Uridine ergibt. Der letztere Weg ist der häufiger eingesetzte (Robins et al. (1982)), Asakura und Robins (1988) und (1990)). Kondensationen in hoher Ausbeute von geschützten 5-Iod-2-desoxyuridinen mit t-Butylimidmethylsilylpropargylether (Graham et al. (1998), De Clercq et al. (1983)), Methylpropargylether (Tolstikov et al. (1997)) und sogar Propargylalkohol selbst (Chaudhuri et al. (1995), Goodwin et al. (1993)) sind erreicht worden. Der durch die letztere Reaktion eingeführte 3-Hydroxy-1- propinylsubstituent kann auch durch DIBAL-H-Reduktion einer Methacrylatgruppe erreicht werden (Cho et al. (1994)), die selbst aus der gleichen Heck-Reaktion entsteht, wie sie für die Synthese von BVDU eingesetzt wird. Diese Palladium-katalysierten Reaktionen sind so vielseitig, dass sie eingesetzt werden können, um sehr lange und aufwändig funktionalisierte Tether auf Propargyl-Basis in 5-Iod-2'-desoxyuridine umzuwandeln (Livak et al. (1992), Hobbs (1989)). Tether auf (Z)-Allyl-Basis werden durch partielle Hydrolyse eines Propargylvorläufers über Undiar-Katalysator erzeugt (Robins und Barr (1983)), während jene auf (E)-Allyl-Basis am besten durch Heck-Kopplung eines (E)-tributylstannylierten Ethylens hergestellt werden (Crisp (1989)).

Eng den Verfahren in der Literatur folgend wird ein mit t-Butyldimethylsilylpropargylether ausgestattetes 3',5'-di-O-geschütztes 2'-Desoxyuridin (Graham et al. (1998), De Clercq et al. (1983)) hergestellt, und ein Teil davon, der in den entsprechenden (Z)-Allylether umgewandelt wird (Robins und Barr (1983)), wird reduziert. Da das RBAF-vermittelte Entfernen einer TBDMS-Gruppe ein Oxyanion erzeugt, das in situ funktionalisiert werden kann, dienen diese TBDMS-geschützten Propargyl- und (Z)-Allyl-getheterten Nucleoside als zweckmäßige Vorläufer für einige der mit Toxophor ausgestatteten Targets. Für das mit (E)-Allyl-Alkohol ausgestattete Nucleosid wird das bekannte O-Tetrahydropyranyletherderivat durch die in der Literatur zu findende Heck-Kopplung eines (E)-tributylstannylierten Ethylens hergestellt (Crips (1989)).

Unter Einsatz eines zweistufigen Verfahrens aus der Literatur (Phelps et al. (1980), Hsiao und Bardos (1981)), werden die Propargyl- und (E)- und (Z)-Allyl-Alkohole in ihre entsprechenden Bisaziridinylphosphoramidate oder -thiophosphoramidate umgewandelt, so dass TS-Behandlung der 5'-Mononucleotid-Versionen einen aktiven Metaboliten der zytostatischen Arzneimittel TEPA bzw. ThioTEPA freisetzt (Dirven et al. (1995)).

Um die mögliche hydrolytische Labilität von Estern zu vermeiden, die von den Propargyl- oder Allylalkoholen stammen, wird die Carbonsäuregruppe von Toxophoren wie 3- Nitropropionsäure "maskiert", indem sie an den Alkohol als α,α-Difluorether gebunden werden. Zu diesem Zweck wird zunächst ein Propargyl- oder Allylthioester-Tether hergestellt, indem der normale Ester mit Lawesson-Reagens (Cava und Levinson (1985)) behandelt wird und dann der Thioester auf bekannte Weise mit Tetrabutylammoniumdihydrogentrifluorid in den α,α-Difluorether umgewandelt wird. Der Tether auf α,α-Difluorether-Basis wird dann wie üblich mit einem geschützten 5-Iod-2'-desoxyuridin kondensiert. Als α,α-Difluorether ist das maskierte Toxophor stabil, bis es TS als latentes reaktives Acylfluorid freisetzt. Die nachfolgende rasche Hydrolyse erzeugt in situ das Toxophor auf Carbonsäurebasis.

p-Nitrophenylether-Derivate der mit CS-Propargyl- und (E)- und (Z)-Allyl-Alkohol ausgestatteten 2'-Desoxyuridine liefern gute Reagenzien für TS-Enzymtests in vitro, da die spektralphotometrische kinetische Bestimmung von freigesetzten p-Nitrophenol jene getetherten dUMP-Plattformen, die sich auf eine Weise an TS binden, die leichte katalytische Freisetzung einer Abgangsgruppe vom Ende des Tethers zulässt. Die erforderlichen p-Nitrophenylether werden entweder durch eine Basen-katalysierte Kondensation mit 4- Fluornitrobenzol direkt aus den Alkoholen erhalten oder de novo durch eine Heck- Kopplung eines angemessenen p-Nitrophenylpropargyl- oder -allylethers. Die für den TS-Test erforderlichen 5'-Monophosphate werden aus den Nucleosiden entweder enzymatisch oder chemisch nach einer bekannten regioselektiven 5'-Monophosphorylierungsvorschrift erzeugt (1mal et al. (1969)).

Viele 5-substituierte 2'-Desoxyuridine sind keine Substrate für Human-TK, aber interessanterweise hat sich herausgestellt, dass 5-(4-Hydoxy-1-butinyl)-2'-desoxyuridin eine Ausnahme ist (Barr et al. (1981)). Daher wird erwartet, dass einige der mit Toxophor ausgestatteten Nucleoside auch günstige TK-Substrataktivität aufweisen, und daher werden sie auf Aktivität gegen Tumorzellwachstum untersucht. Dennoch ist die Herstellung der 5'-Phosphoramidate heute mit diesem neu entwickelten radioselektiven Verfahren eine einfache Angelegenheit, und daher werden auch diese Pro-Prodrug-Versionen hergestellt und getestet.

Kombinatorische Synthese

Eine rasche Methode, eine Leitverbindung zu erhalten, ist jene durch die Verwendung kombinatorischer Methoden der Chemie. Da viel über den Wirkungsmechanismus des Thymidylat-Synthase-Enzyms bekannt ist (Schiffer et al. (1995)), werden die folgenden Probleme erwartet: Zelleintritt durch das Prodrugs, Phosphorylierung des Prodrugs durch Thymidin-Kinase und Umwandlung von Prodrug (Uridin-Derivat9 in aktives Arzneimittel durch Thymidylat-Synthase. In Bezug auf den Zelleintritt können Modifikationen eines phosphorylierten Nucleotids eingesetzt werden (siehe beispielsweise US-Patente Nr. 5.233.031 und Nr. 5.627.165). Außerdem wird die bevorzugte Phosphorylierung des Prodrugs in Tumorzellen als Ergebnis der Überexpression von Thymidin-Kinase in den meisten Tumorzellen als Ergebnis von Tumorsuppressorgen-Verlust erleichtert (Hengstschlager et al. (1996)). Auf ähnliche Weise findet die bevorzugte Aktivierung des phorphorylierten Prodrugs oder Phosphoramidat-Derivats in Tumorzellen aufgrund der Überexpression von Thymidylat-Synthase statt, die den Tumorsuppressorverlust (W. Li et al. (1995)) und Chemotherapie (G. J. Peters et al. (1995)) begleitet. Kombinatorische Chemie, die auf die 5-Position des Uridinrings (von dem das Zelltoxin erzeugt werden kann), oder die 5'-Position des Pentosezuckers abzielt (um die Bindung an Thymidylat- Synthase zu erleichtern) beschleunigt die Entdeckung von Leitverbindungen durch Optimierung der Struktur der Abgangsgruppe (Zelltoxin) aus dem Uridinring deutlich und erleichtert auch die Optimierung einer kompetenten Phosphorylierungsgruppe an der 5'- Position des Pentosezuckers. Für Zwecke des in den Fig. 3, 4 und 5 gezeigten Screens wird die getestete chemische Einheit entweder durch eine auf eine Stelle gerichtete Chemie erzeugt (Fig. 4), oder gleichzeitig an zwei Stellen auf dem Molekül (Fig. 5). Gemeinsam mit dem in Fig. 4 gezeigten Screen ist ein wirkungsvolles System für die Entdeckung von Prodrugs entwickelt worden, die auf Thymidylat-Synthase abzielen. Der Ansatz der kombinatorischen Chemie ist dem von K. S. Lam (1997) beschriebenen ähnlich. Bei einer Ausführungsform werden Prodrugs, die toxische Abgangsgruppen bereitstellen, in Fig. 6 gezeigt. Die in Fig. 6 gezeigten Uridinsubstrate nutzen Phosphoramidase (in allen Zellen vorhanden) und erhöhte Thymidylat-Synthase (TS) in Tumorzellen. Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann diese rationalisierte Arzneimittel-Konstruktion allgemein auf die Synthese anderer Prodrugs wie hierin definiert angewandt werden.

Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sollte klar sein, dass das in Fig. 3 gezeigte Screen allgemein für die Entdeckung von Antibiotika angewandt werden kann. Beispielsweise kann Thymidylat-Synthase von Hefe anstelle der von E.coli in Fig. 4 verwendet werden. Das würde die Entdeckung spezifischer antifungaler Antibiotika ermöglichen, die auf mit Hefe verwandte Pathogene abzielen. Außerdem können andere Enzyme dieser Behandlung unterzogen werden. Beispielsweise können Prodrugs, die spezifisch auf Dihydrofolat-Reductase-Aktivität infektiöser Mittel abzielen, wie Pneumocystis carnii, ausgewählt werden. Diese Mittel werden bezüglich der Spezifität für das Zielenzym ausgewählt, und es kann gezeigt werden, dass sie das Enzym des natürlichen Wirts nicht aktivieren, indem der in Fig. 3 beschriebene Screeningtest eingesetzt wird.

Die Kontroll-Zellkonstrukte würden das entsprechende normale Human-Enzym enthalten, um einen Mangel an Toxizität zu zeigen, wenn nur das normale Human-Enym vorhanden ist.

Die Arzneimittel oder Mittel wie hierin beschrieben können durch verschiedene chemische Modifikationen bessere Permeabilität erhalten, beispielsweise durch Zellembranen und durch die Blut-Hirn-Schranke. Dazu gehört das Binden verschiedener funktioneller Gruppen, die die Membran-Permeabilität verbessern, an ihre Phosphatgruppe. Zu diesen funktionellen Gruppen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, jene, die in den US-Patenten Nr. 5.233.031 und Nr. 5.627.165; von K. M. Fries et al. (1995) und C. McGuigan et al. (1984) beschrieben werden. Derartige chemische Modifikationen können auch dazu dienen, substituierte Pyrimidinmonophosphatderivate vor der Wirkung zellulärer und extrazellulärer Phosphatasen zu schützen. Während die Quecksilber- oder Halogen-Derivate wirksam sein können, wird erwartet, dass Modifikationen, die Alkylierungs- oder antimetabolitische Verbindungen freisetzen, bevorzugt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform wird in Fig. 6 gezeigt.

Derivate der Verbindungen de Klasse I und II

Salze, Ester und Ether der obigen Verbindungen, wie hierin offenbart, sind ebenfalls geeignet. Salze des Prodrugs gemäß vorliegender Erfindung können von anorganischen oder organischen Säuren und Basen abgeleitet werden. Beispiele für Säuren sind Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Toluol-p-sulfonsäure, Weinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Ameisensäure, Benzoesäure, Malonsäure, Napthalin-2-sulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Andere Säuren, wie z. B. Oxalsäure, sind zwar selbst nicht pharmazeutisch annehmbar, können aber bei der Herstellung von Salzen eingesetzt werden, die als Zwischenverbindungen zum Erhalt der Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung und ihrer pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze eingesetzt werden. Beispiele für Basen sind Alkalimetall- (z. B. Natrium-) Hydroxide, Erdalkalimetall- (z. B. Magnesium-) Hydroxide, Ammoniak und Verbindungen der Formel NW&sub4;&spplus;, worin W C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist.

Beispiele für Salze sind: Acetat, Adipat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Flucoheptanat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanat, Hexanat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Palmitat, Pectinat, Persulfat, Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanat. Andere Beispiele für Salze sind Anionen der Verbindung gemäß vorliegender Erfindung, kompoundiert mit einem geeigneten Kation, wie z. B. Na&spplus;, NH&sub4;&spplus; und NW&sub4;&spplus; (worin W eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe ist).

Zur therapeutischen Verwendung sind Salze der Verbindung gemäß vorliegender Erfindung pharmazeutisch annehmbar. Es können aber auch Salze von Säuren und Basen zum Einsatz kommen, die nicht pharmazeutisch annehmbar sind, beispielsweise bei der Herstellung oder Reinigung einer pharmazeutisch annehmbaren Verbindung.

Ester des Prodrugs gemäß vorliegender Erfindung sind Carbonsäureester (d. h. -O-C(=O)- R), die durch Veresterung von 2'-, 3'- und/oder 5'-Hydroxygruppen erhalten werden, worin R ausgewählt ist aus (1) unverzweigten oder verzweigtem Alkyl (beispielsweise n- Propyl, t-Butyl oder n-Butyl), Alkoxyalkyl (beispiels Weise Methoxymethyl), Aralkyl (beispielsweise Benzyl), Aryloxyalkyl (beispielsweise Phenoxymethyl), Aryl (beispielsweise Phenyl, gegebenenfalls z. B. substituiert mit Halogen, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy oder Amino), (2) Sulfonatester, wie z. B. Alkylsulfonyl (beispielsweise Methansulfonyl) oder Aralkylsulfonyl; (3) Aminosäureester (beispielsweise L-Valyl oder L-Isoleucyl); (4) Phosphonatester und (5) Mono-, Di- oder Triphosphatester. Die Phosphatester können weiters beispielsweise mit einem C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkohol oder einem reaktiven Derivat davon verestert werden, oder mit einem 2,3-Di-(C&sub6;&submin;&sub2;&sub4;)acylglycerin. Bei solchen Estern enthält, wenn nicht anders angegeben, jede vorhandene Alkylgruppe vorteilhaft 1 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 6 Kohlenstoffatome, im Speziellen 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Jede Cycloalkylgruppe, die in solchen Estern vorhanden ist, enthält vorzugsweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome. Jede Arylgruppe, die in solchen Estern vorhanden ist, umfasst vorteilhaft eine Phenylgruppe. Beispiele für Lyxofuranosyl-Prodrug-Derivate sind z. B. jene mit chemisch geschützten Hydroxylgruppen (z. B. mit O-Acetylgruppen), wie 2'-O-Acetyllyxo-furanoxyl; 3'-O-Acetyl-lyxo-furanoxyl; 5'-O-Acetyl-lyxo-furanoxyl; 2',3'-Di-O-acetyl-lyxo-furanoxyl und 2',3'-5'-Tri-O-acetyl-lyxo-furanosyl.

Zu den Ethern der Verbindung gemäß vorliegender Erfindung gehören Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl- und sec-Butylether.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Substrat nicht chemisch mit Pyrimidinen oder Folaten verwandt sein, sondern statt dessen auf Basis bekannter Parameter rationeller Arzneimittel-Konstruktion synthetisiert sein. Siehe W. J. Dunn et al. (1996).

Chemische Tests auf Produkte, worin beispielsweise ein Reaktionsprodukt ein Anti-Metabolit der Bromvinyl-Derivate von dUMP ist, werden in den nachstehend angeführten Beispielen oder von P. J. Barr et al. (1983) beschrieben.

Diagnostische Verwendung

Gemäß vorliegender Erfindung werden auch Verfahren zum Screenen bezüglich eines Therapiemittels beschrieben, die das Kontaktieren einer Zielzelle mit einer Prodrug-Verbindung umfassen.

Gemäß einer Ausführungsform ist das Prodrug eine Verbindung der Gruppe von Klasse II, wie hierin beschrieben, worin R&sup4;:

ist, wobei die Zielzeile die Aufnahme der Verbindung in die Zielzelle begünstigt, für den Diagnosezweck des Detektierens intrazellulärer Mengen an Thymidylat-Synthase.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele betreffen spezifisch das Zielenzym TS. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird klar sein, dass die folgenden Verfahren für die Entdeckung anderer Prodrugs modifiziert werden können, um auf Enzyme wie hierin definiert abzuzielen, oder als Kontrolle bei der Entdeckung anderer Prodrugs für TS und anderer intrazellulärer Enzyme verwendet werden können.

Synthese von Prodrugs

Es wurden ein Phosphoramidatderivat von 5-Fluor-2'-desoxyuridin (5-FUdR) und (E)-5- (2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin (BVDU) und ein Phosphoramidatderivat von BVDU synthetisiert.

BVDU wurde aus 2'-Desoxyuridin nach einem Verfahren aus der Literatur hergestellt (Dyer et al. (1991)). Nach Standardverfahren wurde es zunächst an der O5'-Position mit einer Dimethoxytrityl- (DMTr-) Gruppe und dann an der O3'-Position mit einem t-Butyldimethylsilyl- (TBDMS-) Gruppe geschützt, und dann wurde die 5'-O-DMTr-Gruppe durch Behandlung mit Säure entfernt (siehe unten).

Das so erhaltene 3'-O-TBDMS-geschützte Nucleosid reagierte mit Phenyl-L-methoxyalaninylphosphorochloridat (PMPC) (McGuigan et al. (1992)), was das 3'-O-TBDMS-geschützte PVDU-PA ergab. Unerwarteterweise wurde jedoch durch ¹H-Kernresonanz- (NMR-) Spektroskopie festgestellt, dass die Phosphoramidat-Funktionalität für die sehr schonenden Desilylierungsbedingungen von Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) auf Kieselgel labil sind. Diese Beobachtung einer Empfindlichkeit gegenüber schwach basischen Bedingungen liefert eine mögliche Erklärung dafür, dass abgesehen von einem Arabinonucleosid (McGuigan et al. (1998)), allen bisher berichteten Nucleosid-5'-phosphoramidatderivate eine 3'-Hydroxygruppen-Funktionalität fehlte (siehe z. B. McGuigan et al. (1996); McGuigan et al. (1993); McGuigan et al. (1994), Balzarini et al. (1997), Balzarini et al. (1996)). Es wurde ein neues Syntheseverfahren entwickelt, um dieses Problem zu lösen.

Um (E)-5-(Bromvinyl)-2'-desoxy-5'-uridylphenyl-L-alaninylphosphoramidat (BVDU-PA) (eine erfindungsgemäße Verbindung) zu synthetisieren, wurde eine Lösung von BVDU (420 mg, 1,26 mMol) in 2 ml wasserfreiem DMF unter Argon mit Imidazol (103 mg, 1,51 mMol) und dann tropfenweise mit Phenyl-L-methoxyalaninylphosphorachloridat (350 mg, 1,26 mMol (McGuigan et al. (1992)) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 23ºC unter Argon für 24 h gerührt. Laut DC auf Kieselgel unter Einsatz von 10% Methanol in Dichlormethan als Eluent war es zur Bildung von BVDU-PA (Rf 0,70) aus BVDU (Rf 0,53) gekommen, aber nur teilweise (etwa 15%), und daher wurden zusätzliches Imidazol (52 mg, 0,75 mMol) und PMPC-Reagens (175 mg, 0,63 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wieder bei 23ºC unter Argon für 12 h gerührt. Laut DC hatte der Reaktionsfortschritt etwas zugenommen (etwa 30% abgeschlossen). Die Lösung wurde durch Rotationsverdampfung im Volumen auf 0,75 ml reduziert und wurde dann mit demselben Volumen an Dichlormethan verdünnt und wurde direkt auf eine trockene 4 mm Kieselgel-Chromatotronplatte aufgebracht. Radialchromatographie unter Einsatz von 250 ml Dichlormethan zum Eluieren von verbleibenden DMF, gefolgt von 10% Methanol in Dichlormethan zum Eluieren von Produkt und Ausgangsmaterial ergab 144 mg (20%) BVDU-PA und 294 mg nicht umgesetztes BVDU in 67%iger Ausbeute an BVDU-PA, bezogen auf nicht-wiedergewonnenes Ausgangsmaterial. Wenn das ¹H- NMR-Spektrum des Produkts das Vorhandensein von Imidazol (δ 7,65 und 7,01) oder DMA (δ 7,95, 2,89 und 2,73) zeigte, wurde eine zusätzliche radialchromatographische Reinigung durchgeführt. Auf diese Weise wurde BVDU-PA mit einer Reinheit von zumindest 98% durch DC und ¹H-NMR als Öl oder als Schaum-Pulver erhalten. ¹H-NMR ((CD&sub3;)&sub2;SO) δ 11,4 (bs, Austausch mit D&sub2;O, 1, 3'OH), 8,28 (t, 1, H6), 7,35 (m, 2, Ph), 7,31 (δ, 1, Vinyl 1H), 7,20 (m, 3, Ph), 6,89 (d, 1, Vinyl 2H), 6,19 (pseudo-t, I, HI'), 6,08 (t, Austausch mit D&sub2;O, 1, Alaninyl NH), 5,45 (bs, Austausch mit D&sub2;O, 1, 3'OH), 4,32 (m, 1, H4'), 4,22 (m, 2, 5'CH&sub2;), 3,97 (m, 1, H3'), 3,86 (t, 1, Alaninyl CH), 3,58 (s, 3, CO&sub2;Me), 2,15 (m, 2, 2'CH&sub2;), 1,23 (t, 3, Alaninyl CH&sub3;) Jvinyl CH-Vinyl CH = 13,5, JH1'-H2' ~ 6,8, JH2'-H3' ~ 5, JH3'-H4' ~ 0, alaCH-AlaNH&sub3; NH ~ 6 Hz. ¹H/¹H COSY 2D-NMR-Spektroskopie lieferte eine Bestätigung der Spektrenzuordnungen.

Auf ähnliche Weise wurde 5-Fluor-2'-desoxy-5'-uridylphenyl-L-alaninylphosphoramidat (5FUdR-PA) in einer Reinheit von zumindest 98% laut DC und ¹H-NMR erhalten. ¹H- NMR ((CD&sub3;)&sub2;SO) δ 11,9 (bs, Austausch mit D&sub2;O, 1 N3H), 7,88 (t, 1, H6), 7,36 (m, 2, Ph), 719 (m, 3, Ph), 6,15 (Pseudo-t, 1, H1'), 6,07 (t, Austausch mit D&sub2;O, 1, Alaninyl NH), 5,42 (bs, Austausch mit D&sub2;O, 1, 3'OH), 4,21 (m, 3, H4' und 5'CH2), 3,98 (m, 1, H3'), 3,84 (t, 1, Alaninyl CH), 3,58 (s, 3, CO&sub2;Me), 2,08 (m, 2, 2'CH&sub2;), 1,22 (t, 3, Alaninyl CH3). JH6-5F = 7,1, JH1'-H2' ~ 5,2, JH2'-H3' ~ 2, JH3'-H4' ~ 0, Jalaninyl CH-Alaninyl NH ~ 6 Hz. ¹H/¹H COSY 2D-NMR-Spektrokopie lieferte die Bestätigung der Spektrenzuordnungen. Niederauflösungs-Massenspektrum (DCl-NH3) m/z 505 (MNH&sub4;+), 488 (MH+).

Es wurde die Überlegung angestellt, dass die direkte Kondensation eines ungeschützten 2'-Desoxyribonucleosids mit PMPC sehr wohl ablaufen kann, um das gewünschte Phosphoramidat zu ergeben, und auf 5'-O-regioselektive Weise, wenn sie in Abwesenheit von Base ober in Gegenwart eines Säurefängers für die gebildete HCl durchgeführt wurde. Sowohl BVDU als auch 5FUdR kondensierten in Gegenwart von Imidazol in wasserfreier DMF-Lösung mit dem McGuigan-Reagens, was das gewünschte BVDU-PA bzw. 5FUdR-PA ergab (siehe unten). Die Reaktionsbedingungen sind nicht optimiert worden, und obwohl die Reaktionen nicht vollständig abliefen, besteht das leicht trennbare Produktgemisch laut Dünnschichtchromatographie (DC) in beiden Fällen weitgehend nur aus gewünschtem Produkt und Ausgangsmaterial. Das Syntheseschema ist nachstehend zusammengefasst.

(E)-5-(Bromvinyl)-2'-desoxy-5'-uridylphenyl-L-alaninylphosphoramidat (BVDU-PA)

DC-Überwachung (10% Methanol in Dichlormethan als Eluent) zeigte die Bildung von BVDU-PA (Rf 0,70) aus BVDU (Rf 0,53). Auf diese Weise wurde BVDU-PA laut DC und ¹H-NMR in einer Reinheit von zumindest 98% erhalten. ¹H-NMR ((CD&sub3;)&sub2;SO). Ein ¹H/¹H COSY 2D-NMR-Spektrum bestätigte die Spektrenzuordnungen. Massenspektrum mit niedriger Auflösung durch direkte chemische Ionisierung (DCI) unter Einsatz von NH&sub3;, m/z 593/591 (M·NH&sub4;&spplus;), 576/574 (M·H&spplus;).

5-Fluor-2'-desoxy-5'-uridylphenyl-L-alaninylphosphoramidat (5FUdR-PA).

Auf ähnliche Weise wurde 5FUdR-Pa laut DC und ¹H-NMR in einer Reinheit von zumindest 98% erhalten. ¹H-NMR ((CD&sub3;)&sub2;SO). Ein ¹H/¹H COSY 2D-NMR-Spektrum bestätigte die Spektrenzuordnungen. Massenspektrum mit niedriger Auflösung (DCl-NH&sub3;), m/z 505 (M·NH&sub4;&spplus;), 488 (M·H&spplus;).

Gemäß vorliegender Erfindung werden Verfahren zur Herstellung eines 2'-Desoxy-3'-hydroxy-5'-phosphoramidats eines Furanosylnucleosids beschrieben, wobei die Verfahren die Umsetzung eines ungeschützten Furanosylnuclosids, das 2'-Desoxy-, 3'-Hydroxy- und 5'-Hydroxy-substituiert ist, mit einem Phosphochloridat in Gegenwart eines HCl- Fängers umfassen. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Phosphochloridat einen Phosphor-Substituenten, der von einer Aminosäure wie Alanin abgeleitet ist. Gemäß einer Ausführungsform ist das Phosphochloridat Phenyl-L-methoxyalaninphosphorchloridat. Somit betrifft ein weiteres Verfahren ein Verfahren zur Bildung einer Verbindung der Formel:

worin "Base" eine Nucleinsäurebase (wie z. B. Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin, aber vorzugsweise Uracil, oder ein Derivat davon) bezeichnet; wobei das Verfahren den Schritt des Umsetzens einer Verbindung der Formel:

mit einer Verbindung der Formel:

in Gegenwart eines HCl-Fängers umfasst.

Gemäß einer Ausführungsform ist das Furanosylnucleosid ein Uridinnucleosid. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Furanosylnucleosid ein Uridinribofuranosylnucleosid. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Furanosylnucleosid ein Uridinβ-D-ribofuranosylnucleosid. Somit betrifft eine Ausführungsform ein Verfahren zur Bildung einer Verbindung der Formel:

worin R¹ ein Substituent (beispielsweise einschließlich der oben für R¹ beschriebenen) ist; wobei das Verfahren den Schritt des Umsetzens einer Verbindung der Formel:

mit einer Verbindung der Formel:

in Gegenwart eines HCl-Fängers umfasst.

Gemäß einer Ausführungsform wird die Reaktion in Abwesenheit von Base, aber in Gegenwart eines HCl-Fängers, wie z. B. Imidazol, durchgeführt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird die Reaktion in einem nicht-wässrigen Medium durchgeführt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Reaktion in einem nicht-wässrigen Medium durchgeführt, das wasserfreies Dimethylformamid (DMF) umfasst.

Chemische Tests und Tests auf Zellbasis

Bei diesen Tests wurden zwei Zelllinien, H630R10 (Copur et al. (1995)) und normale Kolonepithelzellen, CCD18co (ATCC), verwendet. Die H630P-Zelllinie (Copur et al. (1995)) wurde bezüglich ihrer Resistenz für 10 uM 5-FU selektiert, was H630R10 ergab. Die Charakterisierung dieser Zelllinien ergibt, dass sie eine erhöhte Menge des TS-Enzyms exprimieren. Eine normale Kolonepithelzelle Typ CCD18co (erhältlich von der ATCC) wurde zum Vergleich mit H630R10 für die Empfindlichkeit für Testverbindungen verwendet. Zelllinien, die p184 -HER2 oder Neomycinmarker alleine exprimieren, wurden hergestellt, wie von Pegram et al. (1997) beschrieben, was zeigt, dass H630R und H640R10 um das 10fache mehr Thymidylat-Synthaseenzym im Vergleich zu CCD18co exprimiert, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt.

Die Fähigkeit der Testverbindungen, die Vermehrung von Zellen zu blockieren, wurde durch das Kristallviolett-Verfahren (Sugarman et al. (1985) und Antelman et al. (1995)) bestimmt.

Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1 M gelöst. Sie wurden weiter nach Bedarf in DMEM-Zellkulturmedium verdünnt und daraufhin in die ersten Näpfe der 96 Napf-Mikrotiterplatte gefüllt. Jede Konzentration der Ziel-Zelllinie wurde dreifach getestet. Es wurden Verbindungskonzentrationen von 1 uM bis 3.000 uM getestet. Die Zellen wurden für 72 h mit Verbindung inkubiert, die Platten wurden gewaschen, und die Zellen mit Methanol fixiert und mit Kristallviolett gefärbt, wie von Sugarman et al. (1995) und Antelman et al. (1995) beschrieben.

Western-Blot-Analyse von TS-Mengen in Zelllinien

Western-Blot-Versuche wurden mit dem normalen Human-Kolonepithel-Zelltyp CCD18co (erhalten von der ATCC, Manassas, VA, USA), der Kolon-Adenokarzinom-Zelllinie H630R10 (erhalten von Dr. S. Copur, Yale University), und HER2-transfizierten Brustkrebszelllinien (Pegram et al. (1997)) durchgeführt. Zellen wurden in RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, Ph 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 0,1% SDS und 0,5% Desoxycholsäure, Natriumsalz und Proteaseinhibitoren) lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Einsatz des BCA-200-Proeintestsets (erhalten von Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. 10 ug Proteine von jeder Zelllinie wurden durch 12% SDS-PAGE aufgelöst. Die abgetrennten Protein wurden auf PVDF-Membran (erhalten von Amersham, England) übertragen, gefolgt von Immunoblot mit monoklonalem Human-Thymidylat- Synthase-Primärantikörper und monoklonalem Anti-Tubulin-Antikörper (hergestellt von NeoMarkers, Fremont, CA, USA). An Meerrettichperoxidase gebundener Schaf-Anti- Maus-lg wurde als sekundärer Antikörper verwendet (Amersham). Das ECL-plus-Set (Amersham) wurde für die Detektion der Immunreaktivität eingesetzt. Die Bande, die Thymidylat-Synthase entsprechen, wurden durch Bildanalyse quantifiziert und gegenüber jener von Tubulin standardisiert (Molecular Dynarnics Storm).

RT-PCR-Analyse von TSmRNA in Zelllinien

Die Expressionsmenge von Human-Thymidylat-Synthase-Transkripten in unterschiedlichen Zelllinien wurde unter Einsatz von RT-PCR quantifiziert. Oligonucleotid-Primer für die Amplifikation der Human-Thymidylat-Synthase und B-Actin wurden wie folgt konstruiert: Thymidylat-Synthase-Sense-Primer 5'-GGGCAGATCCAACACATCC-3' (entspricht den Basen 208-266 der Thymidylat-Synthase-cDNA-Sequenz, Genbank Zugangsnr. X02308), Antisense-Primer 5'-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3' (entspricht den Basen 564-583). β-Actin-Senseprimer 5'-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3' (entspricht den Basen 2643-2661 der β-Actin-Gensequenz, Genbank Zugangsnr. M10277) und Antisense-Primer 5'-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3' (entspricht den Basen 2937-2955).

Voll-RNAs wurden aus CCD18co und H630R10-Zellen isoliert, indem das Rneasy mini- Set (erhalten von Qiagen, Valencia, CA, USA) verwendet wurde. Zur Überwachung bezüglich möglicher DNA-Verunreinigung wurden die Primer für die Amplifikation von β- Actin so konstruiert, dass sie die Exon4/Intron5/Exon5-Verbindung überspannen. Genomisches DNA-Templat führt zu einem 313 bp β-Actin-Fragment, und cDNA-Templat erzeugt ein Produkt mit 210 bp.

Reverse Transkriptionsreaktionen wurden durchgeführt, indem das SuperScript-Voramplifikationssystem (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) verwendet wurde. 3 ug Voll-RNA wurde in einem Puffer mit einem Volumen von 20 ul eingesetzt, um nach der Vorschrift des Herstellers reverse Transkriptionsreaktion durchzuführen. PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 48 ul durchgeführt, das 3 ul cDNA-Gemisch aus der reversen Transkriptionsreaktion, 3 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 20 mM Tris-Cl, pH 8,4, jeweils 0,2 mM dNTP, 0,4 uM Thymidylat-Synthase-Sense- und -Antisense-Primer und 3 Einheiten Tag-DNA-Polymerase (erhalten von Promega, Madison, WI, USA) enthielt. Die Reaktionsgemische wurden bei 94ºC 3 min nach inkubiert, gefolgt von 10 Zyklen 1-minütiger Inkubation bei 94ºC, 1-minütiger Inkubation bei 58ºC und 1-minütiger Inkubation bei 72ºC. Nach 10 Zyklen wurden Human-β-Actin-Primer in 2 ul hinzugefügt, was eine Endkonzentration von 0,2 uM ergab, wodurch das End-Reaktionsvolumen auf 50 ul gebracht wurde. PCR-Reaktion wurde bis zu insgesamt 28 Zyklen fortgesetzt, gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72ºC.

5 ul PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in 2% Agarosegel aufgelöst, gefolgt von Färbung mit SYBR-Gold-Nucleinsäurefarbe (erhalten von Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Die DNA-Bande, die der Thymidylat-Synthase entsprechen, wurden durch Molecular Dynamics Storm quantifiziert und bezüglich jener von β-Actin standardisiert.

Northern-Blot-Analyse

Northern-Blots wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) erhalten und an eine klonierte TS cDNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierungssignale wurden gegenüber ribosomalem Protein 59 als Haushaltungs-Transkript normalisiert. Ein Tumor wurde als TS mRNA überexprimierend betrachtet, wenn das standardisierte Signale im Vergleich zur normalen Gewebe-Kontrolle zumindest um das Zweifache verstärkt war.

Klonierung, Expression und Reinigung von Human-Thymidylat-Synthase

Ein E.coli-Plasmid-Expressionvektor von Human-Thymidylat-Synthase (TS) wurde unter Einsatz einer modifizierten TS cDNA in pGCHTS konstruiert. Dieser Klon, der von Dr. Dan Santi erhalten wurde, enthält den vollständigen offenen Leserahmen für Human-TS.

Für die Expression in E.coli wurde der komplette Human-TS-ORF in den T7-Promotor- Expressionvektor pET28a (Novagen Inc.) subkloniert. Der resultierende Plasmidvektor kodiert für die Synthese von Human-TS als rekombinantes Fusionsprotein mit einem 6 Histidin, gefolgt von einer Thrombin-Spaltungsstelle. Dieses Fusionsprotein fügt insgesamt 20 zusätzliche Aminosäuren zum Amino-Terminus von Human-TS hinzu. Um rekombinantes Protein zu erzeugen, wurde der Human-TS-Expressionvektor in den E.coli- Stamm BL21 (DE3) eingeführt, einen Stamm, bei dem das T7 RNA-Polymerase-Gen in das Chromosom unter der Kontrolle des lac-Operators insertiert ist.

Das Human-TS-Poly-His-Fusionsprotein wurde unter Einsatz eines Metallchelatierungsaffinitätsharzes (Novagen Inc.) gereinigt. Der Proteinreinigung folgt Elektrophorese auf 10% SDS-Polyacrylamidgels. Proteinkonzentrationen wurden unter Einsatz des Pierce BCA-Proteinests bestimmt. Etwa 10 mg Human-TS-Fusionsprotein wurden von einer 500 ml-Kultur von E.coli gewonnen. Wenn sie mit Silberfarbe sichtbar gemacht wurden, war nur die Bande erkennbar, die dem Human-TS entspricht. Die Identität der Human-TS- Bande wurde bestätigt, indem ein Western-Blot mit dem monoklonalen Anti-TS-Antikörper TS106 (NeoMarkers) durchgeführt wurde.

Thymylidylat-Synthase-Enzymaktivitätstest

Die TS-Aktivität wurde unter Einsatz des Spektrophotometrietests von Wahba und Eriedkin (1961) gemessen. Bei diesem Test wird die TS-Aktivität durch Messen der Zunahme des Absorptionsvermögens bei 340 nm überwacht, die auftritt, wenn der Cofaktor 5,10- Methylentetrhydrofolat zu Dihydrofolat oxidiert wird, wenn dUTP in dTTP umgewandelt wird. Durch dieses Verfahren hergestelltes Enzym weist eine spezifische Aktivität von 0,5 bis 0,65 Einheiten/mg Protein auf. Eine Einheit ist als die Produktion eines Mikromols dTNP pro Minute definiert. Dieser Wert ist dem ähnlich, der von Pedersen- Lane et al. (1997) berichtet wird.

Versuchsergebnisse

Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, Thymidylat-Synthase als Cytotoxin-Erzeuger in Tumorzellen zu verwenden. Bei diesem Test wurden CCD18co-Zellen (normales Kolon-Epithel) und H630R10, ein Derivat von H630P, das ein Mehrfaches an Thymidylat-Synthase exprimiert (Copur et al. (1995)), eingesetzt. Eine Western-Blot-Analyse von TS-Proteinmengen in jedem Zelltyp wurde durchgeführt und zwischen Proben durch Vergleich mit gegen Human-Tubulin gerichteten Antikörper standardisiert (Tabelle 5). Es wurde ein Ranking von H630R10 (13x) und CCD18co (1x) erhalten.

Ein Vergleich von mRNA-Mengen zwischen Zelllinien, wie durch RT-PCR bestimmt, wurde ebenfalls durchgeführt. Siehe Tabelle 5. Ähnlich wie bei der Western-Blot-Analyse war das Ranking H630R10 (24 x) und CCD18co (1x), wenn es gegenüber einem β- Actin-RT-PCR-Standard standardisiert wurde.

HER2-Protooncogen-Expression erhöht die TS-Mengen in Tumorzellen

Die TS-Expressionsmengen in Neomycin und HER2/neu-transifizierten Human-Brustkarzinomzellen wurden unter Einsatz von Immunblotting-Techniken bewertet. Die Ergebnisse (siehe Fig. 7) zeigen eine Zunahme der TS-Expression nach Transfektion und Überexpression von Human HER2/neu cDNA. Ähnliche Ergebnisse wurden mit HER-2/neutransfizieren Human-Eierstockkarzinomzellen erhalten. Die MCF7/HER2- und MCF7/ neo-Zelllinien sind Zielzellen für Test gemäß vorliegender Erfindung, da die Induktion von TS bei diesen Zelltypen am ausgeprägtesten (etwa 20fach) ist.

Das Fluorpyrimidin, 5-FUdR, hemmt das Zellwachstum über Mechanismen, die jenen von 5-FU ähnlich ist. Dazu gehören zytotoxische Wirkungen, die aus der Aufnahme in Nucleinsäure ebenso wie der Hemmung von TS-Enzymaktivität (Goodman und Gildman (1996)) resultieren. Es wird daher erwartet, dass Zellen, die größere Mengen an TS exprimieren, häufig resistenter sind (eine höher IC&sub5;&sub0; aufweisen) als Zellen, die geringere Mengen des Enzyms exprimieren. Tabelle 6 (Zeile 1) zeigt, dass das das erzielte Ergebnis ist. Weiters weist, wie aus früherer Arbeit erwartet, BVDU im Test geringe Aktivität auf (Tabelle 6; Zeile 2). Das resultiert vermutlich aus der Unfähigkeit von BVDU, durch Human-Thymidin-Kinase monophosphoryliert zu werden, eine Bedingung für die Bindung an Thymidylat-Synthase (Balzarini et al. (1987), Balzarini et al. (1993), Carreras und Santi (1995)). Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Empfindlichkeit der beiden Zelllinien für BVDU. Die Aktivierung von BVDU tritt mit Phosphoramidierung von 5'-Hydroxyl der Ribosegruppe auf. BVDU-PA (Tabelle 6, Zeile 3) weist auf der stärker exprimierenden H630R10-Zelllinie eine um mehr als das 10fache größere Aktivität auf als bei CCD18co-Zellen.

¹ Standardfehler unter 20%

Diese beiden Zelllinien wurden in Bezug auf die Empfindlichkeit für 5FUdR und das Phosphoramidatderivat von BVDU (BVDU-PA) verglichen. Da 5FUdR das Zellwachstum über den gleichen Mechanismus wie 5FU hemmt, wird erwartet, dass CCD18co empfindlicher wird (eine niedrigere IC-50 aufweist) als H630R10, da die letztere Zelllinie eine höhere intrazelluläre Menge an Thymidylat-Synthase aufweist. Die in Tabelle 7 angeführten Daten haben gezeigt, dass es sich dabei um das oben beschriebene, unter Einsatz des Kristallviolett-Tests erhaltene Ergebnis handelt. Dieses Ergebnis veranschaulicht auch eines der entscheidenden Probleme bei heutigen Krebs-Chemotherapeutika, nämlich dass sie häufig für normale Zellen stärker toxisch sind als für Krebszellen. Die in Tabelle 7 gezeigten Daten zeigen, dass normale Kolonepithelzellen (CCD18co; IC-50 = 9,5 uM) etwa 18mal so empfindlich für 5FUdR sind als die H630-R10-Kolontumorzellen (IC-50 = 169,8). Das Prodrug-Substrat, BVDU-PA kehrt diese Beziehung jedoch um. BVDU-PA, das durch TS in zytotoxische Gruppen umgewandelt wird, ist etwa 13-mal so wirksam bei der G63010-Zelle mit hoher TS-Expression (IC&sub5;&sub0; = 216,7) wie beim normalen Kolonzell-Typ (IC&sub5;&sub0; = 2810,2).

1. Repräsentative Daten von mehreren Tests

2. Test mit dreifachen Näpfen in jeder Konzentration durchgeführt. Der Standardfehler liegt unter 20%.

Dieses Ergebnis wurde unter Verwendung des Alamar Blue Assay (im Handel erhältlich von ACCUMED Int., West Lake, OH, USA) bestätigt. Die Daten in nachstehender Tabelle 8 zeigen, dass sogar 5-FU nicht-selektive Eigenschaften aufweist, die es für normale und Tumorzellen toxisch machen.

Ein weiterer Test erfordert, dass Kandidaten-Arzneimittel in Reaktionsgemischen gescreent werden, die Human-Thymidylat-Synthase mit und ohne N5N10-Methylentetrahydroflat sowie das Kandidaten-Prodrug enthalten. Die Abgangsgruppe des Kandidaten- Prodrugs (z. B. an der Pyrimidin-5-Position) wird unter Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise mit Tritium markiert. Das Konstrollsubstrat ist auf ähnliche Weise markiertes (z. B. 5-³H) dUMP, unter den gleichen Reaktionsbedingungen. Die Tests werden ähnlich durchgeführt, wie von C. Carreras und D. V. Santi (1995) und den darin zitierten Dokumenten beschrieben. Die Human-Thymidin-Synthase kann aus E.coli gereinigt werden, das die exprimierte Human-Thymidylat-Synthase enthält. Sie V. J. Davisson et al. (1989) und V. J. Davisson et al. (1994). Dieser Ansatz liefert einen abstufbaren Test, mit dem eine große Anzahl von Kandidaten-Verbindungen gescreent werden kann.

Bestimmung intrazellulärer Produkte des TS-Prodrug-Stoffwechsels

Es ist wichtig, die intrazellulären Produkte des TS-Prodrug-Stoffwechsels zu bestimmen, um den vorgeschlagenen Aktivierungs- und Wirkmechanismus zu bestätigen und Mittel zu definieren, die Kandidaten-Therapeutika sind. Eine annehmbare Blickweise auf den intrazellulären Stoffwechsels von Arylphosphodiesteramdiaten betrifft die enzymatische Umwandlung in eine Carbonsäure, die intramolekulare Umordnung des Phosphomonoesteramidats in ein 5'-Monophosphoryinucleosid (Valette et al. 81996)). Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dieser Mechanismus die intrazelluläre Verarbeitung aller Pronucleotide auf Phosphoramidat-Basis beschreibt. Beispielsweise wurde ein anderer Mechanismus für Arylphosphomonoesteramidat-Verarbeitung vorgeschlagen, nämlich einer, der die einfache direkte Umwandlung des Phosphoramidats in die Monophosphat-Spezies durch ein Phosphoramidathydrolat umfasst (McIntee et al. (1997) und Fries et al. (1995)). Unabhängig vom Mechanismus zur Demaskierung des Nucleosidmonophosphats werden mit diesem Test Produkte der TS-Umwandlung des intrazellulären Monophosphats in zytotoxische Verbindungen innerhalb der Zelle detektiert.

Die vorgeschlagenen Reaktionsprodukte von Prodrug-Verbindungen mit TS werden in Fig. 8 gezeigt. Um diese Aufgabe zu erfüllen, werden Zellen mit einer Menge an Prodrug-Verbindungen inkubiert, die 50% Wachstumshemmung von Zelllinien mit hoher TS-Expression (im obigen 72H-Test) herbeiführen. Es werden sowohl Niedrig- als auch Hoch-TS-Expresserzellen verwendet (z. B. CCD18co gegenüber H630%10). Es werden Untersuchungen im Zeitverlauf durchgeführt, bei denen behandelte Zeilen nach dem von McIntee et al. (1997) beschriebenen Verfahren bearbeitet werden. Die Zellen werden mit 60% Methanol in Wasser bei -20ºC lysiert und Teilen-Rückstände durch Zentrifugieren entfernt. Die Überstände werden getrocknet und bei -20ºC gelagert. Die Aliquoten werden zunächst durch RP-HPLC und dann durch LC-MS bewertet, um die intrazelluläre Umwandlung des Phosphoramidats in das Monophosphat und auch die nachfolgende Transformation des Monophosphats durch Thymidylat-Synthase zu dokumentieren.

Dokumentation der Substrataktivität unter Einsatz gereinigter Thymidylat-Synthase

Durch diesen Test werden die spezifischen Aktivitäten zukünftiger TS-Enzympräparate bestimmt, um die Aktivität solcher Präparate im Zeitverlauf zu gewährleisten und um zu ermitteln, ob bezüglich geeigneter Aktivität gescreente Verbindungen das TS-Enzym unter Reaktionsbedingungen in vitro inaktivieren.

Um zu ermitteln, welche Reaktionsprodukte erzeugt werden, wenn Prodrug-Verbindungen gemeinsam mit gereinigtem rekombinantem TS-Enzym inkubiert werden, werden Reaktionsbedingungen eingesetzt, die den für den TS-Aktivitätstest eingesetzten ähnlich sind, um Reaktionsprodukte in vitro zu erzeugen. Diese Reaktionsprodukte werden dann durch GC-Massenspektrometrie analysiert, um die tatsächlich gebildeten Moleküle zu identifizieren.

Wirksamkeitsuntersuchungen in vivo 1. Zelllinien und Zellkultur

MCF7/NEO- und MCF7/HER-2-transfizierte Brustzelllinien wurden von Dr. Dennis Slamon (UCLA) zur Verfügung gestellt. MCF7/HER-2-transfizierte Human-Bruskarzinomzellen sowie andere HER-2/neu-transfizierte Zelllinien zeigen eine Zunahme der TS-Expression (Pegram et al. (1997)). Daher eignen sich diese Zelllinien zusätzlich zu CCD18co und H630R10 zum Testen des Reaktionsunterschieds auf Prodrugs. Die Reaktionsunterschiede werden zunächst in vitro für MCF7/NEO- und MCF7/HER-2-Zellen zu 5-FUdR und BVDU-PA bestätigt, wobei der gleiche Versuchsansatz in vitro wie oben beschrieben eingesetzt wird. Die HT1080-Tumorzelllinien von Dr. Bertino (Banerjee et al. (1998)) werden auf ähnliche Weise charakterisiert.

2. Xenotransplantat-Modelle zum Testen von Prodrug-Verbindungen

MCF7/HER-2-Brustzellen bilden in athymischen Mäusen mit hoher Effizienz Xenotransplantate, und ihre Wachstumseigenschaften sind umfassend charakterisiert worden (Pegram et al. (1997)). Die Wachstumseigenschaften dieses Xenotransplantat-Modells sind so gleichförmig, dass von Dr. Angela Lopes und Dr. Elliot Landau im Department of Biomathematics an der Medizinischen Fakultät der UCLA Lopez et al., schwebende Einreichung) ein Computermodell entwickelt worden ist, das den Wachstumsverlauf dieser Tumoren nach der Behandlung mit unterschiedlichen Arzneimittelkombinationen vorhersagen kann. Aufgrund seiner Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit ist dieses Modell sehr nützlich für das vorklinische Testen neuer Versuchstherapeutika geworden. Beispielsweise bildete dieses Modell die Grundlage für die vorbereitende In vitro-Analyse des Arzneimittels Herceptin®, das von der US-Nahrungs- und Arzneimittelbehörde vor kurzem für die Behandlung von metastatischem Brustkrebs zugelassen worden ist (Pegram, et al. (1998)). Die Kolontumor-Zelllinien (HT1080/NEO und HT1080/E2F1.1) haben Tumorgenität gezeigt (Banerjee et al. (1998)).

Ras-transformierte NIH 3T3-Zelllinien werden subkutan in Mäuse mit Immundefizienz transplantiert. Die anfängliche Therapie kann direkte intratumorale Injektion sein. Das erwartete Ergebnis besteht darin, dass ein erhöhtes Ausmaß an Expression von Human- TS oder eines Zielenzyms zu verstärkter Antitumoraktivität durch die Arzneimittel-Kandidaten führt. Ähnliche Untersuchungen werden mit menschlichen Tumoren durchgeführt, die erhöhte Mengen an Human-TS oder eines Zielenzyms exprimieren, und zeigen, dass die Wirksamkeit als Reaktion auf Arzneimittel mit ihrem Ausmaß an Human- TS-Expression oder Zielenzym korreliert. Gegebenenfalls können Versuche wie oben durchgeführt werden, wobei jedoch das Arzneimittel intravenös in die Tiere verabreicht wird, um sich mit Fragen zu beschäftigen, die mit Wirksamkeit, Toxizität und Pharmakobiologie der Arzneimittel-Kandidaten in Zusammenhang stehen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform erhalten Kontroll-Tiere eine wirksame Menge einer Verbindung, die oben unter dem Abschnitt mit dem Titel "Prodrugs" identifiziert wird.

Im Speziellen können die Untersuchungen in vivo durchgeführt werden, indem zwei verschiedene Xenotransplantat-Modelle eingesetzt werden (siehe Tabelle 9).

Testzellen mit definierter TS-Expression (in Tabelle 9 angegeben) werden wie beschrieben (Pegram et al. (1997)) subkutan mit 5 · 10&sup6;/Stelle in den Lendenbereich von 4 bis 6 Wochen alten (20-25 g) athymischen CD-1 (nu/nu) Mäusen (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) injiziert. Für jede Behandlungsgruppe (Vehikel-Kontrolllösung oder Prodrug-Verbindungen) werden 8 Mäuse (4 Tiere pro Käfig) verwendet. Es werden zwei Xenotransplantate pro Maus gebildet, was sowohl die Anzahl an für jeden Versuch erforderlichen Tieren verringert als auch die statistische Aussagekraft bei der Detektion von Ansprech-Unterschieden zwischen den Gruppen erhöht. Einzelne Mäuse werden durch Markierungen an den Ohren identifziert, so dass zusätzlich zur Analyse von Gruppen-Mittelwerten Xenotransplantat-Verläufe für einzelne Mäuse berechnet werden. Alle im MCF-7-Brustxenotransplantat-Modell verwendeten Mäuse sind Weibchen, und werden vor der Zellinjektion mit 17B-Estradiol geprimt (Innovative Research of America, Toledo, OH, USA), das subkutan in einem biologisch abbaubaren Trägerbindemittel (1,7 mg Estradiol/Pellet) verabreicht wird, um das Tumorzellwachstum zu fördern. Voraussichtliche Tumorvolumina, berechnet als (Breite² · Länge/2 werden zweimal wöchentlich durch serielle Mikrometermessungen von einem einzigen Beobachter im Blindversuch überwacht. Die Tiere werden jeder Behandlungsgruppe so zugeordnet, dass die mittleren Ausgangs-Turmovolumina in jeder Gruppe gleich sind. Statistische Tests werden durchgeführt (Einzelfaktor-ANOVA), um die Gleichmäßigkeit der Ausgangs-Tumorvolumina zwischen den Behandlungsgruppen zu gewährleisten. Die Prodrugs oder isovolumetrische Vehikelkontrolllösung werden im ersten Versuchssatz durch eine einzige I.P.-Injektion verabreicht. Wenn bei den Anfangsversuchen Wirksamkeit festgestellt wird, werden weitere Untersuchungen durchgeführt, indem ein täglicher subkutaner Dosis-Plan · 5 Tage mit einer Gesamt-Arzneimitteldosis eingesetzt wird, die der IC&sub1;&sub0; entspricht, das in den Einzel-I.P.-Dosis-Untersuchungen definiert wurde.

Für diese Versuche bezüglich Wirksamkeit beginnt die Prodrug-Dosierung, wenn die mittlere Xenotransplantat-Volumina in jeder Gruppe 50MM³ erreichen. Mittlere Tumorvolumina von mit Prodrug behandelten in Bezug auf Kontroll-behandelte Tiere werden unter Einsatz deskriptiver Statistik mit graphischer Analyse aufgetragen. Statistische Tests (Einzelfaktor-ANOVA) werden eingesetzt, um Xenotransplantat-Volumsdifferenzen zwischen den Behandlungsgruppen zu vergleichen. Log-Transformation wird für AnOVA- Computerberechungen eingesetzt, wenn angezeigt, um die Varianz in den Xenotransplantat-Volumen-Datensätzen zu stabilisieren. Je nach der Xenotransplantat-Volumen- Datenverteilung können nach Bedarf nicht-parametrische statistische Tests eingesetzt werden. Unterschiede in der Wirksamkeit zwischen Xenotransplantat mit hoher TS-Expression zu jenen mit niedriger TS-Expression werden unter Verwendung der Prodrugbehandelten/Kontroll-behandelten Tumorvolumsverhältnis (T/C-Verhältnisse) verglichen, wobei Statistik wie beschrieben (Pegram et al. (1997)) zum Einsatz kommt. Diese Methodik kann Unterschiede in den ureigenen Wachstumsraten zwischen Xenotransplantaten mit hoher TX-Expression und Xenotransplantaten mit niedriger TS-Expression berücksichtigen.

Untersuchungen in vivo können auch durchgeführt werden, wie von M. P. Harris et al. (1996) und D. Antelman et al. (1995) beschrieben.

3. Dosisfindungsuntersuchungen bei nicht-tumortragenden athymischen Mäusen zur Definition der maximalen Toleranzdosis (MTD)

Gruppen von 6 athymischen CD-1 nu/nu-Mäusen (Charles River Laboratories) (3 Männchen, 3 Weibchen) wurde auf intraperitonealem (I.P.) Weg eine Einzeldosis Prodrug verabreicht. Die Dosierung beginnt empirisch, wobei de An(angsdosis durch die Menge eines Prodrugs definiert ist, mit der eine Serum-Konzentration gleich IC&sub5;&sub0; in vitro erreicht wird, wobei angenommen wird, dass das Verteilungsvolumen des Prodrugs auf den Gesamt-Körperwasser- (TBW-) Raum der Maus (0,6 · Körpermasse in Gramm TBWMaus) beschränkt ist. Wenn in diesem Bereich keine Toxizität beobachtet wird, schreitet die Dosis-Eskalation in Gruppen von 6 Mäusen in halb-log-Intervallen fort. Wenn bei der empirischen Dosismenge Toxizität auftritt, werden wiederholte Dosis-Eskatationsversuche beginnend mit 10% der toxischen Dosis ebenso durchgeführt. Die Mäuse werden täglich bezüglich Mobilität, Paarungsverhalten und der Fähigkeit zur Aufnahme von Nahrung und Wasser beobachtet. Das Gewicht der Mäuse wird wöchentlich ermittelt. Die MTD ist als die Dosis definiert, die während des Beobachtungszeitraums zu 10% oder weniger Körpergewichtsverlust führt, oder eine Dosis = 90% der LD&sub1;&sub0;. Wenn bei einer bestimmten Dosishöhe Letalität auftritt, wird ein Wiederholungsversuch durchgeführt (wobei angenommen wird, dass in diesem Stadium keine Toxizität beobachtet wird). Der Beobachtungszeitraum beträgt etwa 60 Tage. Die Dosis-Eskalation findet in voraussichtlichen Kohorten in 3 Wochen-Intervallen statt, wenn bei einer bestimmten Dosis-Menge keine Toxizität auftritt.

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U.S. Patent No. 5,627,165, Glazier, A. "Phosphorous Prodrugs and Therapeutic Delivery Systems Using Same" issued May 6, 1997

PCT Application WO 91/17474, published November 4, 1991

Hostetler et al., Patent Application No. WO 96/40088 (1996)


Anspruch[de]

1. Verbindung mit der Struktur:

oder ein pharmazeutisch annehmbares/-er Salz, Ether oder Ester davon.

2. Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 1 und einen Träger umfasst.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist.

4. Verfahren zum Hemmen der Vermehrung einer pathologischen Zelle in vitro, worin Thymidylat-Synthase in der Zelle überexprimiert wird, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit einer wirksamen Menge einer Verbindung nach Anspruch 1.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die pathologische Zelle eine Kolonkrebszelle, eine Brustkrebszelle, eine Magenkrebszelle, eine Kopf- und Halskrebszelle, eine Leberkrebszelle oder eine Bauchspeichedrüsenkrebszelle ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die pathologische Zelle eine Kolonkrebszelle ist.

7. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Menschen- oder Tierkörpers.

8. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines pathologischen Zustandes, der durch pathologische Zellen gekennzeichnet ist, die Thymidylat-Synthase überexprimieren.







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