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Dokumentenidentifikation DE69711661T2 17.10.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0934075
Titel MICROCOCCIN ANTIBIOTIKA ZUR PRÄVENTION UND THERAPIE DER MASTITIS
Anmelder Novartis AG, Basel, CH
Erfinder SURI, Bruno, CH-4416 Bubendorf, CH;
GEORGES, Catherine, CH-4147 Aesch, CH;
PEEL, Edmondson, John, CH-1474 Seiry, CH
Vertreter Zumstein & Klingseisen, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69711661
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.06.1997
EP-Aktenzeichen 979292265
WO-Anmeldetag 19.06.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/EP97/03212
WO-Veröffentlichungsnummer 0009748408
WO-Veröffentlichungsdatum 24.12.1997
EP-Offenlegungsdatum 11.08.1999
EP date of grant 03.04.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 17.10.2002
IPC-Hauptklasse A61K 38/05
IPC-Nebenklasse C07K 5/06   C12P 21/02   A23C 9/123   A23C 19/05   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Micrococcin-Antibiotikums zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhütung von Mastitis bei Säugern. Das Verfähren umfasst die intramammäre Injektion ode r das Eintauchen der Brust bzw. des Gesäuges bzw. des Euters mit bzw. in Micrococcin- Antibiotika, bevorzugt Micrococcin P1 oder P2, das nicht die Produktion von Käse oder Joghurt unter Verwendung von Milch von behandelten Tieren stört. Die hydrophoben Antibiotika Micrococcin P1 oder P2 können vor der Infektion verabreicht werden, um effektiv die Rate, Schwere und Dauer der anschließenden Bakterieninfektion zu unterdrücken oder können nach der Infektion verabreicht werden, um Mastitis effektiv zu behandeln. Insbesondere beschreibt die Erfindung die Verwendung von Micrococcin P1 oder P2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhütung von Rindermastitis.

Mastitis ist eine entzündliche Erkrankung der Säugerbrustdrüsen. In der Veterinärmedizin trifft man am häufigsten auf Mastitis bei Milchkühen, die für die Milchproduktion hochspezialisiert sind. Diese Spezialisierung und die Konvention, Milchkühe zwei- oder höchstens dreimal während 24 h zu melken, macht ihre Brustdrüsen empfänglich für bakterielle Infektionen. Obwohl die Brustdrüse eine Anzahl von natürlichen Abwehrmechanismen gegen bakterielle Erreger besitzt (Cullor et al., 1990), werden diese Mechanismen häufig durch hohe Spiegel bakerieller Exposition überwunden.

Das Melken wird üblicherweise durch eine mechanische Vorrichtung vorgenommen, die von Kuh zu Kuhn wandert und so das Risiko erhöht, eine Infektion von einem Tier auf ein anderes zu übertragen. Zusätzlich schwächen physiologische. Veränderung zu bestimmten Zeiten im Laktationszyklus den natürlichen Abwehrmechanismus (Cullor et al.,, 1990). Die Perioden um das Entwöhnen und das Kalben gehen mit einer hohen Mastitisinzidenz einher.

Mastitis kann durch "viele verschiedene Bakterienarten hervorgerufen werden. Diejenigen, die am häufigsten an der Rindermastitis beteiligt sind, sind entweder Wirterreger, wie Staphylococcus aureus und Streptococcus agalactiae oder Umwelterreger, wie Streptococcus uberis und Escherichia coli. Wirterreger leben auf der Haut des Euters oder im Euter und einzelne Kühe sind die Infektionsquelle für andere in der Herde. Umwelterreger andererseits kommen in der unmittelbaren Umgebung der Milchkuh vor und stellen ein konstantes Risiko dar (Cullor et al., 1990).

Durch die vorstehend charakterisierten Bakterien hervorgerufene Mastitis kann sich entweder als klinische oder subklinische Erkrankung manifestieren (Cullor et al., 1990).

Klinische Erkrankungen variieren von mild befallenen Vierteln mit Veränderungen in der Milch bis zu schwer infizierten Vierteln mit schließlichem Verlust des Viertels bis zu systemisch kranken Kühen, die sterben körnen. Mildere Manifestationen sind üblicher.

Die subklinische Mastitis ist in vielen Milchherden vorherrschend. Befallene Viertel sind mit den vorstehend beschriebenen pathogenen Bakterien infiziert, aber klinische Anzeichen fehlen. Der Gehalt an somatischen Zellen steigt in der Milch an. Diese Veränderung kann nur durch spezifische Testverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, nachgewiesen werden. Das Syndrom ist von einer erniedrigten Milchproduktion und Milchqualität begleitet. Es wurde geschätzt, dass bis zu 70% der ökonomischen Verluste, die von den Farmern als Ergebnis der Mastitis erfahren werden, auf Produktionsausfälle durch subklinische Erkrankung zurückzuführen sind (Philpot, W. N., 1984).

Gegenwärtig wird die Mastitis durch die Ausübung von peinlichster Hygiene beim Melken oder durch Nachweis subklinisch infizierter Kühe kontrolliert. Diese werden dann nach den nicht-infizierten Kühen gemolken oder werden sogar aus der Herde entfernt.

Klinische Fälle von Mastitis werden im allgemeinen mit im Handel erhältlichen Antibiotikapräparaten, wie AmpicloxTM, Koxerate plus TM, MastijetTM, Tetra deltaTM und SynoloxTM behandelt. Die Verwendung dieser Präparate macht das Zurückhalten der Milch vom Verkauf wegen vorhandener Antibiotikareste notwendig. Die Zurückhaltezeiten variieren von 4 bis 8 Melkvorgängen in Abhängigkeit von den individuellen Präparaten. Dies ist eine Ursache für ökonomische Verluste für den Farmer. Um diese Verluste zu vermeiden, wird häufig eine antimikrobielle Therapie der subklinischen Mastitis in die Entwöhnungsperiode verschoben. Jedoch ist während der Periode zwischen Etablierung der Infektion und Entwöhnen die infizierte Kuh ein Risiko für ihre Nachbarn. Die Reduktion der Bakterienzahlen in infizierten Vierteln als Ergebnis der Antibiotikabehandlung hilft, das Ausbreiten der Infektion zu verringern. Sie verbessert auch die Milchqualität, was durch Prämienzahlungen in vielen Ländern belohnt wird. So ist das Ziel der Behandlung während der Laktation der Erhalt einer maximalen Heilung entsprechend einer minimalen Behandlung und Milchverwerfungszeit und ein rasches Zurückkehren zu normaler Produktion von Milch guter Qualität.

Die Verwendung von Antibiotika zur Behandlung von Mastitis während der Laktation erzeugt ein weiteres Problem. Die Produktion von Käse und Joghurt beruht auf der bakteriellen Fermentation von Milch, und diese Prozesse werden üblicherweise durch Restantibiotika in der Milch gestört. Daher kann die Milch von Tieren während der Behandlung mit Antibiotika und die Milch von mehreren Melkungen nach Beendigung der Behandlung zur Produktion von Käse und Joghurt nicht verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal die Verwendung der Antibiotika Micrococcin P1 oder P2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung von Mastitis, ohne die Produktion von Käse und Joghurt unter Verwendung von Milch behandelter Tiere, wie Kühen, Ziegen oder Schafen zu stören, Überraschenderweise sind die Antibiotika in hohem Maße hydrophob und somit in Wasser schlecht löslich. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Micrococcin P1 oder P2 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Rindermastitis. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze dieser Antibiotika können ebenfalls verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Micrococcin P1 oder P2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung von Mastitis verwendet. Es hat sich gezeigt, dass diese Antibiotika hochaktiv gegen Krankheitserreger sind, die Rintermastitis hervorrufen. Was noch wichtiger ist, sie können verwendet werden, um Mastitis zu behandeln oder zu verhüten, ohne die Käse- und Joghurtproduktion zu stören. Dies ist bei herkömmlich verwendeten Antibiotika nicht der Fall.

Die chemische Struktur der Micrococcine P1 und P2 ist in Bycroft et al., 1978 und in dem CRC-Handbuch Antibiotic Compounds, S. 389-417, beschrieben. Sie sind mikrobielle Produkte, die aus bestimmten Mikroorganismen, wie beispielsweise Staphylococcus sciuiri, gereinigt werden können. Für diesen Zweck wurden die Mikroorganismen durch Zentrifugation gewonnen und die Micrococcine werden aus dem Zellpellet unter Verwendung geeigneter Lösungsmittel, wie reines Methanol, Ethanol oder Chloroform, extrahiert. Der Extrakt wird dann chromatographischen Standardreinigungsverfahren unterworfen, um das reine Micrococcin P1 oder P2 zu isolieren.

Das erfindungsgemäß hergestellte Arzneimittel kann in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhütung von Mastitis in einem Säuger verwendet werden, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Micrococcin- Antibiotikums, die die Produktion von Käse und Joghurt unter Verwendung von Milch der behandelten Tiere nicht stört, an das Säugetier. Ein solches Verfahren vermeidet die Zurückhaltung von Milch von Säugern, die therapeutische oder prophylaktische Dosen des Antibiotikums zur Behandlung und zur Verhütung von Mastitis erhalten haben. So kann die von den behandelten Tieren erhaltene Milch in Verfahren zur Produktion von Käse und Joghurt verwendet werden.

Der Hauptgesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung zur Behandlung oder Verhütung von Mastitis in Säugetieren, wie Kühen, Ziegen oder Schafen. Unter "Behandlung" wird Heilung oder Verbesserung der Erkrankung in einem Tier, das sich Mastitis zugezogen hat, verstanden. "Verhütung" von Mastitis bezeichnet Verhütung des Auftretens der Infektion oder Dämpfung der Schwere der Infektion, wenn sie später zugezogen wird.

Die Wirkstoffe, die erfindungsgemäß hergestellt werden, werden üblicherweise als gebrauchsfertige flüssige Formulierungen hergestellt und gelagert. Die Lösungen sind allgemein anwendbar, aber die Formulierung kann dem spezifischen Typ der Verabreichung angepasst werden. So kann die Formulierung auch nichtionische oberflächenaktive Mittel enthalten, die keine diskrete Ladung beim Auflösen tragen und sind ausgewählt aus ethoxylierten Estern von Fettsäuren und Triglyceriden. Die Formulierung kann auch EDTA enthalten, um das antimikrobielle Spektrum zu verbessern und Stabilisierungsmittel, wie Methionine, Ascorbinsäure und Konservierungsstoffe, wie Propylenglykol, enthalten.

Typischerweise werden die erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoffe durch intramammäre Injektion verabreicht. Jedoch können wirksame Dosen auch durch Eintauchen des Euters oder auf parenteralen oder oralen Wegen verabreicht werden. Der Wirkstoff kann vor der Infektion verabreicht werden und somit als Prophylaktikum dienen. Die Verabreichung während der präpartalen oder postpartalen Periode ist möglich. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verabreichung durch intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion durchgeführt. Bei Herstellung als Injektionslösungen werden die erfindungsgemäßen Wirkstoffe im Allgemeinen unter Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Exzipiens verabreicht. Geeignete Träger sind beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Mannit, Extran, Aminosäuren, Glycerin oder dgl., in verschiedenen Kombinationen. Zusätzlich kann ggf. der Träger Hilfsstoffe, wie Netz- oder Emulgiermittel, Konservierungsstoffe und pH- Puffermittel, enthalten. Der Wirkstoff liegt typischerweise im Bereich von etwa 1% bis etwa 95% (Gew./Gew.) der verabreichten pharmazeutischen Zusammensetzungen oder sogar höher oder niedriger vor, sofern geeignet.

Die parenterale Verabreichung kann üblicherweise durch intradermale, subkutane, intramuskuläre oder selbst intravenöse Injektion erzielt werden. Nadelfreie luftgetriebene Injektionsvorrichtungen können ebenfalls nützlich sein. Die parenterale Verabreichung ist auf dem Gebiet gut bekannt und kann auf Wegen, die auf dem Gebiet der Tier- oder Humanmedizin üblich sind, ausgeführt werden.

Die verzögerte Wirkung des Wirkstoffs, um eine verlängerte Freisetzung zu erzielen (die sog. "langsame Freisetzung") kann durch Formulieren des Wirkstoffs in einer Matrix erhalten werden, die physikalisch eine rasche Auflösung hemmt. Die formulierte Matrix wird in den Tierkörper injiziert, wo sie als Depot verbleibt, aus, dem das Protein langsam freigesetzt wird. Nützliche Adjuvantien in dieser Hinsicht sind Polymere und Copolymere von Lactiden und Glycosiden. Ferner können gelbildende Mittel, wie Aluminium, Calcium oder Magnesiuiumonostearat oder Kohlenhydrate (Cellulose, Pectin, Dextranderivate), Polysiloxane oder Proteine (Gelatine, Collagen) verwendet werden, um die Freisetzungszeit der erfindungsgemäßen Wirkstoffe nach der parenteralen Verabreichung auszudehnen. Die perkutane Verabreichung soll auch Implantation der Vorrichtung mit kontrollierter Freigabe umfassen. Solche Vorrichtungen aus Silicon oder Wachs oder anderen Polymermatrices können subkutan verwendet werden, um die Verbindung über die benötigte Zeitspanne abzugeben. Dies kann auch durch Implantation von Minipumpen, die Lösungen des Wirkstoffs enthalten, erzielt werden. Solche Implantationstechniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden in der medizinischen Behandlung oft verwendet.

Polysiloxanträger sind im Fachgebiet für eine Vielzahl von Hormonabgabeformen beschrieben und können der Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe angepasst werden. Ein Collagenabgabesystem zur Freisetzung von Antibiotika ist in der deutschen Offenlegungsschrift DE-34 29 038 beschrieben. Dieses System kann auch erfindungsgemäß angepasst werden.

Formulierungen mit langsamer Freisetzung oder andere pharmazeutische oder veterinärmedizinische Formulierungen können durch Anpassen der Peptid- und Proteinformulierungen, die bereits im Stand der Technik beschrieben sind, hergestellt werden.

Eine "therapeutisch wirksame Menge" eines Wirkstoffes ist eine Dosis, die ausreicht, um Mastitis in einem Patienten, dem der Wirkstoff verabreicht wird, entweder zu verhüten oder zu behandeln. Die Dosierungen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe, die Mastitis behandeln oder verhüten können, können angesichts dieser Offenbarung von einem Fachmann auf dem Gebiet durch Durchführen von Routineversuchen mit geeigneten Kontrollen bestimmt werden. Der Vergleich der geeigneten Behandlungsgruppen mit den Kontrollgruppen zeigt an, ob eine spezielle Dosierung zur Verhütung oder Behandlung einer Erkrankung, die in einer kontrollierten Stimulierung verwendet wurde, effektiv ist. Im Allgemeinen variiert die wirksame Dosierung in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg und der Wirkung. Es wurde gefunden, dass im Fall einer intramammären Injektion unter Verwendung von Micrococcin die Verabreichung einer Dosis im Bereich von 0,1 mg pro Viertel bis 200 mg pro Viertel, bevorzugt 0,5 mg pro Viertel bis 10 mg pro Viertel und am meisten bevorzugt von 1 mg pro Viertel bis 4 mg pro Viertel, ausreicht, um Mastitis infolge von Staphylococcus aureus zu bekämpfen.

Bei intramuskulärer, subkutaner oder intravenöser Verabreichung hängen wirksame Dosierungen von dem Gewicht des Tieres ab und liegen typischerweise im Bereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 200 mg/kg. Typischerweise beträgt die Dosierung mindestens etwa 0,5 mg/kg, aber weniger als 150 mg/kg.

Abgesehen von der Dosierung hängt die wirksame Verabreichung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes teilweise vor der Anzahl und dem Zeitpunkt der Dosierungen ab. Beispielsweise können multiple Verabreichungen einer Dosierung benötigt werden. Sie werden einem Tier etwa 6 bis 72 h getrennt und bevorzugt etwa 12 h getrennt verabreicht. In der meisten Fällen kann es zweckdienlich sein, das Wirkstoff mindestens zweimal zu verabreichen. Es kann sogar erwünscht sein, mehr Dosierungen dem Tier zu verabreichen, wie 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder sogar bis zu 15 Dosierungen. Wieder wird angenommen, dass die genaue Kombination der Dosierung und des Zeitpunkts einem weiten Bereich von Variationen unterliegt und dass zahlreiche Kombinationen, die zur Behandlung oder Verhütung einer Erkrankung effektiv sind, leicht von einem Fachmann auf dem Gebiet angesichts der vorliegenden Offenbarung ermittelt werden können.

Da die Erfindung nun vollständig beschrieben ist, ist es einem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich, dass viele Veränderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der beigefügten Patentansprüche abzuweichen.

Nachstehend werden mehrere Beispiele beschrieben, die die Praxis der vorliegenden Erfindung erläutern. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen den Umfang der beigefügten Ansprüche nicht beschränken.

Versuche Beispiel 1: Reinigung von Micrococcin P1

Kulturen von Stapylococcus sciuri werden nach Standardtechniken gezüchtet. Am Ende der Fermentation wird die ganze Fermentationsbrühe sterilisiert und die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird mit 6 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, für jedes Gramm Zellen gewaschen. Micrococcin wird aus dem Zellpellet durch Waschen mit reinem Methanol (3 ml pro g Zellen) extrahiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt und verworfen; der rohe Methanolextrakt wird unter Verwendung eines Rotavaps getrocknet. Der getrocknete feste Extrakt wird in dem kleinst möglichen Volumen Dichlormethan : Methanol (95 : 5) aufgelöst und auf eine Silicagelchromatographiesäule (100 g Silicagel pro g getrockneter Festextrakt) geladen. Micrococcin P1 wird von der Säule mit Dichlormethan : Methanol (95 : 5) eluiert. Die Anwesenheit von Micrococcin P1 wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;-Platten und Dichlormethan : Methanol (90 : 10) als mobile Phase sichtbar gemacht. Die Fraktionen, die Micrococcin P1 enthalten, werden vereinigt und unter Verwendung des Rotavaps getrocknet. Das trockene Material wird dann in 70% Methanol erneut aufgelöst, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu ergeben. Wasser wird zugesetzt, bis die Löslichkeitsgrenze erreicht ist. Die Lösung wird auf eine Source 15 RPC (Pharmacia)-Säule (9 ml Gel pro 100 g Micrococcin P1) geladen. Die Säule wird mit 10% Acetonitril in 0,1% TFA äquilibriert. Nach dem Beladen wird die Säule mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen und einem Acetonitrilgradienten unterworfen. Micrococcin P1 wird zwischen 30% bis 50% Acetonitril in 0,1% TFA eluiert. Die Fraktionen, die Micrococcin P1 enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert.

Beispiel 2: Antimikrobielles Spektrum von Micrococcin P1

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHC) von Micrococcin P1 gegen ein Panel von Testorganismen wurden unter Verwendung des Agarplatten-Diffusionsverfahrens bestimmt. Agarplatten wurden mit Weichagar überschichtet, der mit den Testorganismen beimpft war. Wenn sich der Agar verfestigt hatte, wurden Kavitäten mit 4 mm Durchmesser in den Agar geschnitten. 50 ul einer Reihe der zweifachen Verdünnungen des Peptids in Citratpuffer, pH 4, wurden auf die Kavitäten aufgebracht, und die Platten wurden bei 4ºC für 2 h vor der Inkubation bei 37ºC über Nacht gehalten. Die MHC wurde als niedrigste Konzentration des Peptids bestimmt, das eine klare Lysezone um die Kavität ergibt. Indikatorstämme wurden in Tryptosebrühe (Difco) gezüchtet. M17-Medium (Merck) wurde für Platten und Weichagar mit den folgenden Ausnahmen verwendet. Für Pasteurella haemolytica wurde mit 5% fötalem Kälberserum supplementierte Tryptose verwendet. Für Leuconostoc mesenteroides wurde Plattenzählagar - Merck -, + 15% Saccharose verwendet und für Bacillus cereus wurde Plattnzählagar + 0,2% Kartoffelstärke - Sigma 2004- verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1: Aktivitätsspektrum von Micrococcin P1 (MHCs in ug/ml)

Stamm MHC (ug/ml)

Staphylococcus aureus V557 1,91

Staphylococcus aureus Newbould 0,24

Staphylococcus uberis 1,49

Staphylococcus faecalis 1,98

E. coli > 1000

Pasteurella haemolytica > 1000

Listeria innocua 1,95

Bacillus cereus 0,24

Micrococcus luteus 0,015

Leuconostoc mesenteroides > 1000

Beispiel 3: Experimente zur Bewertung des Potentials von Micrococcin P1 bei subklinischer Rindermastitis

Eine Milchherde wird gehalten, um Kandidatenkühe zur Durchführung der Versuche zu ergeben. Die Kühe werden von lokalen Viehhändlern gekauft. Diese Kühe sollten eine minimale Milchproduktion von 15 l/Tag haben. Zwei Milchproben werden an einem Tag aus allen Vierteln für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Keine Kühe, bei denen Mastitiserreger gefunden werden können, werden in die Tests aufgenommen. Nichtinfizierte Kühe werden, basierend auf der Nichtisolierung von Staphylococcus aureus aus zwei Milchproben, die mit einem Tag Abstand aus allen Vierteln entnommen worden waren, ausgewählt. Dann werden drei Viertel auf dem intramammären Weg unter Verwendung einer Staphylococcus aureus-Suspension inokuliert. Das vierte Viertel dient als Kontrolle für die Melkhygienegewohnheiten. Während der zwei bis vier Wochen nach der Inokulation werden Milchproben von allen Vierteln mindestens dreimal entnommen. Diese Proben werden gezüchtet und wenn Staphylococcus aureus aus mindestens zwei davon isoliert wird, gilt das Viertel als infiziert.

Die Behandlungen werden willkürlich den infizierten Vierteln zugeordnet und über den intramammären Weg injiziert. Milchproben werden täglich bis zu einem Minimum von 14 Tagen nach der letzten Behandlung entnommen. Ein Viertel gilt als geheilt, wenn Milchproben aus dem Viertel innerhalb von 7 Tagen nach der letzten Behandlung negativ sind (d. h. kein Staphylococcus aureus kann isoliert werden) und während der folgenden 14-tägigen Probennahmeperiode negativ bleiben.

Dieses experimentelle Modell wird verwendet, um einen festen Rahmen zu haben, aufgrund dessen die Behandlungen bewertet werden. Mit Staphylococcus aureus zu arbeiten, besitzt den Vorteil, dass es das am schwierigsten zu behandelnde gram-positive Bakterium ist und eines der wichtigsten Bakterien, das Rindermastitis verursacht, ist. Daher ist zu erwarten, dass Heilungsraten niedriger sind als für andere gram-positive Bakterien, wie Streptokokken und Koagulasenegative Staphylokokken.

Diese Modell erwies sich als zufriedenstellend, da die Infektionsrate in Vierteln im Durchschnitt 60% oder 2 Viertel/Kuh betrug.

Die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zeigen den Prozentsatz der für Staphylococcus aureus positiven Viertel (d. h. Viertel, aus denen Staphylococcus aureus isoliert werden kann) während und nach der Behandlung mit drei Dosen von entweder Plazebo, 2 mg Micrococcin P1 oder 300 mg Apiclox in 12 h-Intervallen oder drei Dosen mit 4 mg Micrococcin P1 in 48 h-Intervallen.

Tabelle 2: Zusammenfassung der Ergebnisse der vorläufigen Wirksamkeitsversuche

Beispiel 4: Eintauchen der Brustdrüse und Mastitisprophylaxe

Eintauchen der Brustdrüse ist eine der am häufigsten verwendeten und wirksamsten Maßnahmen, die getroffen werden, um Mastitis in Milchkühen zu verhindern. Alle Brustdrüsen aller Kühe werden in eine antibakterielle Lösung nach jedem Melken getaucht. Der Film des antibakteriellen Mittels, der die Brustdrüse bedeckt, reduziert das Risiko, dass Bakterien die Brustdrüse kolonialisieren.

Gegenwärtig zum Eintauchen der Brustdrüse verwendete Produkte enthalten eine Vielzahl verschiedener Wirkstoffe, wie Iodophore, Chlorhexidin und das Lanthionin enthaltende Peptid Nisin.

Protokoll zum Eintauchen der Brustdrüse:

Um das Potential von Micrococcin als prophylaktisches Mittel in Rindermastitis zu bewerten, kann das folgende experimentelle Protokoll verwendet werden.

Etwa 50 Rinder werden nach dem bereits beschriebenen Protokoll für Tests dieser Mittel in der Therapie subklinischer Staphylokokken-Mastitis zusammengestellt. Dieser Versuch wird dann nach dem von dem US National Mastitis Council (NMC) (Hogan et al., 1990) zum Testen der Wirksamkeit von Brustdrüsengermiciden während experimenteller Exposition anerkannten Protokoll durchgeführt.

Während der Versuchsperiode werden alle Brustdrüsen in eine Bakteriensuspension zur Stimulierung nach dem Melken am Abend an Wochentagen eingetaucht. Die Suspensionen zur Stimulierung enthalten 15 · 10&sup7; Staphylococcus aureus und 5 · 10&sup7; Streptococcus agalactiae. Sie werden jeden Tag aus Stammsuspensionen zubereitet, die wöchentlich hergestellt werden. Aliquote der Stimulierungssuspension werden jeden Tag plattiert, um die tatsächliche Bakterienkonzentration, die zum Zeitpunkt der Stimulierung vorhanden ist, zu bestimmen.

Nach jedem Melken werden die linke vordere und die rechte hintere Brustdrüse in das Testpräparat des Germicids getaucht; die anderen zwei Brustdrüsen verbleiben als Negativkontrollen und werden nicht eingetaucht.

Vormilchproben aller Viertel werden für die bakteriologische Kultur zweimal wöchentlich während der Versuchsperiode entnommen. Jedes Viertel, aus dem einer der beiden Stimulierungsorganismen isoliert wird, wird innerhalb von 48 h erneut beprobt. Wenn der gleiche Organismus isoliert wird, dann gilt das Viertel als infiziert. Auf ähnliche Weise gilt eine Episode klinischer Mastitis, die durch einen der beiden Stimulierungsorganismen verursacht wird, als neue intramammäre Infektion.

Die Versuche dauern typischerweise von 3 bis 6 Monaten. Am Ende der Versuchsperiode wird die Anzahl der neuen intramammären Infektionen zwischen den Behandlungsgruppen verglichen.

Beispiel 5: Bewertung der Reaktionskinetiken von DelvotestP in Milch aus mit Micrococcin P1 behandelten Vierteln

Um die potentiellen Wirkungen von Micrococcin P1 auf Bakterienstämme, die bei der Käse- und Joghurtherstellung verwendet werden, zu bewerten, kann das folgende Experiment durchgeführt werden.

DelvotestP ist ein im Handel erhältlicher, weit verwendeter Detektionskit auf antimikrobielle Mittel in Milch. Er beruht auf der Hemmung des Wachstums des Indikatorbakteriums Bacillus stearothermophilus. Die Bakterien werden in einem Agarpfropfen in einem Plastikteströhrchen zusammen mit einem pH-Indikator suspendiert. Das Wachstum der Bakterien führt zu einer Säureproduktion und Farbveränderung. In Anwesenheit von Hemmsubstanzen wachsen die Bakterien nicht und es gibt keine Farbveränderung. Bacillus stearothermophilus ist ein guter Vertreter von Bakterien, die zur Käse- und Joghurtherstellung verwendet werden und wird daher vielfach als Indikatorstamm beim Nachweis von Antibiotikaresten verwendet.

Während und nach der Verabreichung von verschiedenen Behandlungen werden Proben entnommen, und sie werden unter Verwendung von DelvotestP bewertet, wie in den Empfehlungen des Herstellers ausgeführt ist. Diese Probenahme dauert an, bis alle behandelten Viertel eine negative Antwort zeigen.

Tabelle 4: Ergebnisse von DelvotestP in Milch aus Rinderbrustdüsenvierteln, die mit verschiedenen Konzentrationen von Micrococcin behandelt wurden

Die Delvotestdaten sind wie folgt.

Diese Daten zeigen an, dass die Dosis von 0,5 mg Micrococcin DelvotestP nicht stört.

Beispiel 6: Bewertung der direkten Wirkung der Behandlung der Brustdrüsenviertel mit verschiedenen Dosen antimikrobieller Mittel auf die Käse- und Joghurtherstellung

Bei der Käse- und Joghurtherstellung werden verschiedene Bakterienstämme in Milch fermentiert und eine der wichtigsten und unmittelbarsten Veränderungen als Ergebnis dieser Fermentation ist die Säureproduktion. Die Säure ist für die Kontrolle des sekundären Bakterienwachstums verantwortlich, die einen Verderb des Produkts oder noch schlimmer Krankheit für den Verbraucher verursachen könnte. Die weitere Fermentation der milchsäure-produzierenden Bakterienpopulation produziert Veränderungen im Käse, die mit den verwendeten Bakterienstämmen und den Herstellungsverfahren variieren. Diese Faktoren sind für die physikalischen Eigenschaften und das Aroma der verschiedenen Käse verantwortlich.

Die Ansäuerung ist die erste und wichtigste Stufe bei dem Herstellungsverfahren, wenn Milch fermentiert wird. Wenn die Ansäuerung normal fortschreitet, dann ist es sehr wahrscheinlich, dass alle anderen Stufen normal sind. Daher kann man die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Micrococcin P1 auf die Kinetiken der Ansäuerung von Milch durch Milchsäure-fermentierende Bakterien untersuchen.

Die Experimente werden routinemäßig unter Verwendung einer der folgenden Bakterienstämme durchgeführt.

Streptococcus thermophilus

Lactobacillus bulgaricus

Kühe, die frei von Infektionen mit Mastitiskrankheitserregern sind, basierend auf einer bakteriologischen Kultur der Milch, werden in die Versuche aufgenommen. Identische Behandlungen werden allen vier Vierteln einer einzelnen Kuh verabreicht. Milch aus der Abendmelkung wird auf 4ºC über Nacht gekühlt, um am folgenden Morgen getestet zu werden. Proben zu 500 ml werden durch Erhitzen auf 80ºC in einem Wasserbad pasteurisiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.

Lyophilisierte Kulturen, wie sie unter handelsüblichen Bedingungen verwendet werden, werden von Rudolf Wittwer, CH- 5002 Rombach, Aarau, Schweiz, erhalten. Diese Kulturen werden nach den Empfehlungen des Herstellers rekonstituiert und durch dreimalige Passage durch sterile entrahmte Milch reaktiviert. Jede Passage wird 16 bis 18 h bei der optimalen Temperatur für den Bakterienstamm inkubiert.

Die nach der dritten Passage erhaltene Kultur wird auf 2% mit ganzer steriler Milch (UHT) verdünnt, die in 10 ml- Röhrchen aliquottiert wurde und bei -20ºC zur Verwendung in Experimenten gefroren wurde.

Die vorstehend hergestellten Stammkulturen werden bei 40ºC aufgetaut, dann über Nacht bei 37ºC inkubiert und zur Inokulation von Testproben verwendet. Die Testproben werden mit 2 Vol.-% der experimentellen Kultur des zu testenden Bakterienstamms inokuliert. Die Proben werden dann vermischt und 24 h bei der optimalen Temperatur für den speziellen Bakterienstamm, der unter Bewertung ist, inkubiert. Der pH- Wert wird alle 2 h während einer 8-stündigen Periode und wieder nach 24 h gemessen. Die Rate der Ansäuerung der Milch, die verschiedene Konzentrationen an aktivem Micrococcin P1 enthält, kann dann mit den negativen Kontrollen verglichen werden.

Die in den nachstehenden Tabellen 4 und 5 angegebenen Ergebnisse wurden von Kühen erhalten, die verschiedene Mengen an Micrococcin P1 zu drei Gelegenheiten mit 12-stündigen Intervallen erhalten haben. Die Dosen sind in der Tabelle angegeben. Die Ergebnisse zeigen die Ansäuerung der von der Melkung nach der Verabreichung der letzten drei Dosen erhaltenen Milch.

Tabelle 5: Ansäuerung der Milch durch Lactobacillus bulgaricus
Tabelle 6: Ansäuerung der Milch durch Streptococcus thermophilus

Literaturstellen

Hogan, J. S., Galton, D. M., Harmon, R., Nickerson, S. C., Oliver, S. P., Pankey, J. W. (1990) Protocols for Evaluating efficacy of postmilking teat dips. J. Dairy Sci., 73, S. 2580-2585.

Philpot, W. N., (1984) Economics of mastitis control, Veterinary Clinics of North America: Large Animal Practice, 6(2), S. 233-245.

Cullor, J. S., Tyler, J. W., Smith, B. P. (1990) Disorders of the manmary gland in large animal medicine, B. P. Smith, The c.V. Mosby Company, St. Louis, Missouri 63146, USA., 5. 1047-1067.

Bycroft et al., (1978), The structures of the highly modified peptide antibiotics Micrococcin P1 and P2, J. C. S. Chem.. Comm.: S. 256-258.

J. Berdy, A. Aszalos, M. Bostian, K. L. McNitt (1980). CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Aniino acid and Peptide Antibiotics, CRC Press Boca Raton, F1. USA, 4(1), S. 389- 417.


Anspruch[de]

1. Verwendung eines Micrococcin-Antibiotikums zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung von Mastitis in einem Säuger, wobei das Arzneimittel die Produktion von Käse und Joghurt unter Verwendung von Milch von den behandelten Tieren nicht stört.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antibiotikum Micrococcin P1 oder P2 ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel eine pharmazeutische Zusammensetzung zur intramammären Injektion oder zum Eintauchen der Brustdrüse ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Säugetier eine Kuh, eine Ziege oder ein Schaf ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des Arzneimittels das Zurückhalten der Milch von dem Tier vermeidet.







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