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Dokumentenidentifikation DE69713286T2 17.10.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0880683
Titel SUBMIKRON-AUFLÖSENDES ABBILDUNGSSYSTEM MIT ABSTIMMBAREM AKUSTO-OPTISCHEM FILTER
Anmelder Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pa., US
Erfinder WACHMAN, S., Elliot, Pittsburgh, US;
FARKAS, L., Daniel, Pittsburgh, US;
NIU, Wen-Hua, Pittsburgh, US
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 28209 Bremen
DE-Aktenzeichen 69713286
Vertragsstaaten DE, FR, GB, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.02.1997
EP-Aktenzeichen 979059433
WO-Anmeldetag 14.02.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/02265
WO-Veröffentlichungsnummer 0009730331
WO-Veröffentlichungsdatum 21.08.1997
EP-Offenlegungsdatum 02.12.1998
EP date of grant 12.06.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 17.10.2002
IPC-Hauptklasse G01J 3/28

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Rückverweis auf verwandte Anmeldung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine US-Patentanmeldung mit dem Titel "Light Microscope Having Acousto-Optic Tunable Filters", die am selben Tag wie die vorliegende Anmeldung von denselben Erfindern eingereicht worden ist.

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf Abbildungssysteme vom Typ gerichtet, die keine beweglichen Teile aufweisen.

Beschreibung des allgemeinen Standes der Technik

Das Potential von abstimmbaren akusto-optischen Filtern (Acousto-Optic Tunable Filters (AOTFs)) für multispektrale Anwendungen ist seit über 20 Jahren erkannt worden. AOTFs stellen eine elektronisch steuerbare, statische Abstimmbarkeit vom Ultravioletten zum nahen Infrarot mit Bandpaßvariabilität, hohem Durchsatz und Wellenlängenschaltgeschwindigkeiten von mehreren 10 Mikrosekunden bereit. Diese Eigenschaften haben zur Verwendung von AOTFs in einer breiten Vielzahl von spektroskopischen Anwendungen geführt. Ein Interesse an AOTFs für multispektrale Abbildung hat jedoch erst kürzlich bestanden. Mehrere Gruppen haben über Versuchs-AOTF-Abbildungsdemonstrationen berichtet. Siehe Y. Cui, D. Cui und J. Tang "Study on the characteristics of an imaging spectrum system by means of an acousto-optic tunable filter", Opt. Eng. 32, S. 2899-2902 (1993); G. Gao und Z. Lin, "Acousto-optic supermultispectral imaging", Appl. Opt. 32, S. 3081-3086 (1993). Andere haben AOTFs zur Fernmessung von bodennahen Zielen erfolgreich verwendet. Siehe L. Cheng, T. Chao, M. Dowdy, C. LaBaw, C. Mahoney und G. Reyes, "Multispectral imaging Systems using acousto-optic tunable filter", Proc. Soc. Photo- Opt. Instrum. Eng. 1874, S. 224-231 (1993); T. Chao G. Reyes, E. Hegbloom und L. Cheng, "Spatial-spectral optical pattern recognition using an acousto-optic tunable filter preprocessor", Proc. Sec. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1959, S. 410-415 (1993). Andere haben AOTFs zur Fernmessung von Planetenzielen verwendet. Siehe D. A. Glenar, J. J. Hiliman, B. Seif und J. Bergstrahl, "POLARIS II: an acousto-optic imaging spectropolarimeter for ground based astronomy", in Polarization and Remote Sensing, W. G. Egan, Herausgeber, Proc. Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1747, S. 92-101 (1992); D. A. Glenar, J. J. Hillman, B. Seif und J. Bergstrahl, "Acousto-optic imaging spectropolarimetry for remote sensing", Appl. Opt. 33, S. 7412-7424 (1994). Treado et al. haben Abbildungs-AOTFs für Fluoreszenz-(H. R. Morris, C. C. Hoyt und P. J. Treado, "Imaging spectrometers for flourescence and Raman microscopy: acousto-optic und liquid crystal tunable filters", Appl. Spectr. 48, S. 857-866 (1994)) und Raman (P. J. Treado, I. W. Levin und E. N. Lewis, "High-fidelity Raman imaging spectrometry: a rapid method using an acousto-optic tunable filter", Appl. Spectr. 46, S. 1211- 1216 (1992); M. D. Schaeberle, J. F. Turner U und P. J. Treado, "Multiplexed acousto-optic tunable filter spectral imaging microscopy", Proc. Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 2173, S. 11- 20 (1994)) Mikroskopie von biologischen Proben verwendet. Die in den vorangehenden Treado et al. -Bezugnahmen verwendeten AOTFs-Abbildungssysteme enthalten eine Steuerung zum Empfangen von Fluoreszenz von einer Probe über eine Objektivlinse. Siehe auch das US-Patent Nr. 3,667,038 von Cutler et al., in dem ein Verfahren und eine Vorrichtung für eine akusto-optische HF-Spektralanalyse beschrieben ist. Ein Prisma wird zum Beugen von Licht für eine Spektralanalyse verwendet.

Eine schlechte Abbildungsqualität ist eine wiederkehrende Schwierigkeit bei dem Abbilden von AOTFs gewesen. Bis heute ist die beste gemeldete Auflösung in der Größenordnung von 8-10 mm gewesen. Während diese Ergebnisse für viele Anwendungen ausreichen, sind sie fit hochauflösende Lichtmikroskopie vollkommen ungeeignet, bei der eine räumliche Auflösung unterhalb von 0,5 mm routinemäßig erforderlich ist. Obwohl ein großes Potential für AOTFs auf dem Gebiet von hochauflösender Abbildung besteht, hat es folglich eine relativ geringe Entwicklung auf dem Gebiet seit deren erster Verwendung vor nahezu einem Jahrzehnt gegeben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf Systeme gemäß den Ansprüchen 1 und 11 mit einem abstimmbaren akusto-optischen Filter zum Empfangen von Licht an seiner Eingangsseite und Ausgeben von Licht an seiner Ausgangsseite gerichtet. Ein Steuerkreis ist zum Abstimmen des Filters vorgesehen. Ein Prisma spricht auf von dem abstimmbaren Filter ausgegebenes Licht an. Das Prisma ist unter einem Winkel in Bezug auf den Filter ausgerichtet, um eine durch den abstimmbaren Filter verursachte Dispersion des Ausgabelichts zu kompensieren.

Durch Einsetzen eines Prismas in das Fluoreszenzlichtsignal wird von dem akusto-optischen abstimmenbaren Filter verursachte Dispersion kompensiert, wodurch die Qualität des Bildes verbessert wird. Die von dem Prisma bereitgestellte Kompensation wird praktisch nicht auf Kosten der Signalintensität erzielt. Die Verwendung eines apodisierten Kristalls verringert Hintergrundintensitäten. Die Verwendung des Abbildungssystems der vorliegenden Erfindung mit einer CCD-Kamera oder dergleichen erlaubt es, das Bild zu erfassen und zu digitalisieren. Das digitalisierte Bild kann bekannten Techniken zum Normieren des Bildes, Reduzieren des Hintergrundes etc. unterzogen werden. Ein gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruiertes Abbildungssystem kann Auflösungen auf Submikron- Niveau erzielen. Diese Vorteile und Nutzen und andere Vorteile und Nutzen der vorliegenden Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich werden.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Zum klareren Verständnis und zur leichteren Realisierung der vorliegenden Erfindung wird die vorliegende Erfindung in Verbindung mit den folgenden Figuren beschrieben werden, in denen:

Fig. 1 ein gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruiertes Lichtmikroskop darstellt;

Fig. 2 eine Phasenanpassung in einem nichtkollinearen AOTF darstellt;

Fig. 3 den Lichtweg in einem idealen AOTF-Abbildungssystem darstellt;

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Lichtmikroskops ist, das ein gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruiertes Abbildungssystem enthält, das zum Durchführen von Tests verwendet wurde;

Fig. 5 ein Versuchsaufbau zum Durchführen von Wellenlängenmessungen außerhalb des Mikroskops von Fig. 4 ist;

Fig. 6a bis 6c drei Photographien von Dunkelfeldabbildungen von lichtundurchlässigen 0,12l Mikron-Perlen, die bei einer Frequenz von 74 MHz unter Verwendung von einer (Fig. 6a), zwei (Fig. 6b) und sechs (Fig. 6c) Wandlerscheiben, die jeweiligen Wandlerlängen von 0,33 Mikron, 0,66 Mikron und 1,98 Mikron entsprechen, aufgenommen wurden;

Fig. 7a bis 7c Graphiken sind, die Intensität gegenüber Wellenlängendaten (Fig. 7a), Intensität gegenüber Winkeldaten (Fig. 7c) und theoretische Ergebnisse (Fig. 7b) für die drei unterschiedlichen Bilder der Fig. 6a-6c darstellen;

Fig. 8a und 8b den Effekt von Bildentfaltung auf die Bildqualität unter Verwendung des Standard-Luftwaffen-Auflösungsziels und einer Wandlerlänge von 1,98 Mikron vor (Fig. 8a) und nach (Fig. 8b) der Faltung darstellen;

Fig. 9a, 10a und 11a AOTF-Bilder mit ultrahoher Auflösung von Actin-Fasern in Fluoreszenz sind;

Fig. 9b, 10b und 11b Graphiken sind, die Linienintenstitätsprofile wiedergeben, die entlang der unten rechts in jeder der jeweiligen "a"-Figuren gezeigten Lichtlinien aufgenommen sind;

Fig. 12a-12c eine elektronische Steuerung der AOTF-Filterbandbreite darstellen;

Fig. 13 eine Darstellung der elektronischen Steuerung der AOTF-Filterbandbreite ist;

Fig. 14a und 14b die AOTF-Parameter definieren;

Fig. 15 eine alternative Ausführungsform für den Anregungsbereich des in der Fig. 1 dargestellten Systems darstellt;

Fig. 16 einen Bereich eines gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruierten Lichtmikroskops darstellt, worin die Lichtquelle ein Multilinienlaser ist; und

Fig. 17, 18 und 19 alternative Ausführungsformen filz den Abbildungsbereich des in Fig. 1 dargestellten Systems darstellen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Obwohl Abbildungsunschärfemechanismen in AOTFs qualitativ beschrieben worden sind, ist über detaillierte Untersuchungen des Effekts und Versuche zur Korrektur desselben nicht berichtet worden. Durch Quantifizieren der Ursachen von AOTF-Abbildungsunschärfe durch experimentelle Vorführung können digitale Bildverarbeitungstechniken zum rechnerischen Beseitigen der Bildverschlechterung verwendet werden. Durch Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung können Bilder erhalten werden, in denen Details bis zur Auflösung des Mikroskops herunter klar unterschieden werden können.

Die Fig. 1 stellt ein gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruiertes Lichtmikroskop 10 dar. Das Lichtmikroskop 10 weist einen Anregungsbereich 12 auf, der eine Anregungsquelle 14 enthält. Aufgrund der den traditionell in Mikroskopen verwendeten abstimmbaren akusto-optischen Filtern und Optiken innewohnende Verluste ist es notwendig, eine starke, Punktlichtquelle bereitzustellen, um eine ausreichende Beleuchtung zum Beleuchten der Probe zu liefern. In einer Ausführungsform wird eine Lichtquelle 14 verwendet, die eine 500 Watt-Xenon-Bogenlampe mit einem kurzen Boden, z. B. einer Bogenlänge von weniger als einem Millimeter, ist. Es kann auch eine Multilinienlaserquelle verwendet werden.

Der Anregungsbereich 12 enthält einen abstimmbaren akusto-optischen Filter (AOTF) 16. Der AOTF 16 ist über den ersten von zwei unabhängigen Ausgabeverstärkern von einem Generator 17 für beliebige Signalformen abgestimmt. Eine AOTF-Steuer-Workstation 18 kann zum Steuern des Signalformgenerators 17 und zum Betrachten der an den AOTF 16 angelegten Signale vorgesehen sein. Unter gewissen hiernach im Detail erörterten Umständen ist es wünschenswert, die Signale, die zum Abstimmen des AOTF 16 angelegt sind, zu multiplexen. Durch Multiplexen von Signalen kann das Band auf von dem Filter 16 durchgelassenen Frequenzen vergrößert werden.

Es ist bekannt, daß abstimmbare akusto-optische Filter beschädigt werden können, wenn keine geeigneten Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden. Es ist auch wünschenswert, das Licht so zu verarbeiten, daß die Strahlen im wesentlichen parallel zueinander sind. Dementsprechend sind zwischen der Lichtquelle 14 und dem AOTF 16 ein Raumfilter 19, ein Infrarotfilter 20 und ein Ultraviolettfilter 22 angeordnet.

Das von der Lichtquelle 14 erzeugte Licht wird nach Hindurchtreten durch die Filter 19, 20 und 22 in den AOTF 16 gegeben. Der AOTF 16 erzeugt zwei Lichtstrahlen, einen opolarisierten und e-polarisierten. Steueroptiken, die die Form von Spiegeln 24, 25, 26 und 27 annehmen können, steuern die zwei Lichtstrahlen mit unterschiedlicher Polarisation, um die zwei Lichtstrahlen in einem kombinierten Strahl zu vereinen, der auf die Eingangsoptiken 29 des Mikroskops gerichtet ist. Man wird anerkennen, daß die von den Steueroptiken bereitgestellte Funktion auch von leitfähigen optischen Fasern durchgeführt werden könnte.

Der kombinierte Lichtstrahl wird nach Verlassen der Eingangsoptik 29 in einen Dunkelfeldkondensor 30 gegeben. Eine Probe (nicht gezeigt) wird durch herkömmliche Mittel in einer Probenebene 31 gehalten. Die Ausgabe des kombinierten Lichtstrahls von dem Dunkelfeldkondensor 30 beleuchtet die Proben in einer Weise, daß die Anregungsstrahlung, wiedergegeben durch Strahlen 32 und 34, außerhalb des Bereiches einer Objektivlinse 36 fällt. Auf diese Weise wird die Anregungsbeleuchtung von der Fluoreszenz der Probe getrennt, so daß Strahlung außerhalb der Brandbreite minimal mit Fluoreszenz von der Probe vermischt wird.

Die Objektivlinse 36 erzeugt ein Bild der Probe, das von einem zweiten abstimmbaren akusto-optischen Filter 38 gefiltert werden kann. Der AOTF 38 wird über den zweiten der unabhängigen Ausgabeverstärker von dem Generator 17 abgestimmt. Nachdem das Bild gefiltert worden ist, kann es zum Beispiel durch ein ladungsgekoppeltes Bauelement (Charge Coupled Device (CCD)) 40 erfaßt werden. Das CCD 40 befindet sich unter der Kontrolle eines Steuerteils 42, das mit einer Bildverarbeitungs-Workstation 44 in Verbindung steht. Das CCD-Element 40 kann das Bild erfassen, das in der Bildverarbeitungs-Workstation 44 gespeichert ist. Ein CCD-Steuerteil 42 ist auch vorgesehen. Nachdem das Bild gespeichert worden ist, können bekannte Softwareroutine zum Untersuchen des Bildes oder zur weiteren Verarbeitung des Bildes durchgeführt werden.

Der Anregungs-AOTF 16 kann durch einen ersten Kristall implementiert werden, währen der Emissions-AOTF durch einen zweiten Kristall implementiert werden kann, die die folgenden Parameter erfüllen und von NEOS Technologies erhältlich sind:

Die AOTF-Parameter in der vorangehenden Tabelle sind in den Fig. 14a und 14b definiert. Die AOTFs 16 und 38 können unter der Kontrolle der in Fig. 1 gezeigten Workstation 18 ein schnelles Wellenlängenumschalten, schnelles Verschließen und eine Kontrolle über die Intensität der Anregungsstrahlung bereitstellen.

Theoretischer Hintergrund

Das Vorliegen einer akustischen Welle innerhalb eines Mediums erzeugt eine periodische Modulation seines Brechungsindexes über den elastooptischen Effekt. Diese Modulation wirkt wie ein dreidimensionales sinusförmiges Phasengitter für auf den Kristall einfallendes Licht, was zu Beugung von gewissen Wellenlängen unter einem Winkel von der Richtung des einfallenden Strahls führt. In einem abstimmbaren akusto-optischen Filter wird dieses gebeugte Licht als die Filterausgabe verwendet und wird die Gitterfrequenz durch Variieren der an einen an eine der Seiten des Kristalls geklebten piezoelektrischen Wandler angelegten HF-Frequenz elektronisch gesteuert. Dies gibt einen vollelektronischen, breit abstimmbaren Spektralfilter mit Abstimmgeschwindigkeiten, die von der akustischen Laufzeit in dem Kristall (typischerweise unter 50 us) bestimmt werden.

Wenn der AOTF mit mehreren dicht beabstandeten HF-Frequenzen betrieben wird, wird er auch eine elektronisch variable Bandbreitensteuerung bereitstellen. Wie es in den Fig. 12a- 12c gezeigt ist, können Frequenzkombinationen zum Erhöhen des Lichtdurchgangs des Kristalls verwendet werden. Die Fig. 12 stellt Graphiken mit der Intensität gegenüber der Wellenlänge für eine Frequenz (Fig. 12a, Δλ = 7,5 nm), drei Frequenzen (Fig. 12b, Δλ = 23 nm) und fünf Frequenzen (Fig. 12c, Δλ = 37 nm) dar. Die Fig. 13 demonstriert die breite elektronische Abstimmung des Kristalls über das sichtbare Spektrum.

Die Wechselwirkung von akustischen und optischen ebenen Wellen in einem anisotropen Medium kann durch ein Paar gekoppelte Differentialgleichungen beschrieben werden. Es ergeben sich nützliche Lösungen für diese Gleichungen, wenn die Phasenanpassungsbedingungen erfüllt sind:

(1) kd = ki + ka,

wobei kd = 2πnd/λ, ki = 2πni/λ und ka = 2πnF/V, wobei F die Schallfrequenz, V die Schallgeschwindigkeit in dem Kristall, λ die optische Wellenlänge und ni,d die Brechungsindizes des Kristalls für die jeweiligen einfallenden und gebeugten Strahlen sind.

Für den Fall einer opolarisierten einfallenden Welle (dies ist die bevorzugte Polarisation zum Abbilden in einem TeO&sub2;-AOTF), kann die Gleichung (1) geschrieben werden:

(2) ne(λ,θd)cos(θd) - n0(λ)cos(θi) + Fλ/V sin(α) 0

ne(λ,θa)cos(θd) - no(λ)sin(θi) - Fλ/V cos(α) 0

wobei θi und θd die Winkel zwischen den Wellenvektoren der einfallenden und gebeugten Strahlen und der optischen Achse sind, ne und no die außerordentlichen und ordentlichen Brechungsindizes sind und α der Winkel zwischen dem Schallwellenvektor ka und der akustischen Achse ist, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Diese Gleichungen bestimmen die spektralen Abstimmeigenschaften von AOTFs.

Für AOTF-Abbildungsanwendungen muß auch die Bildwiedergabetreue berücksichtigt werden. Die Verwendung eines AOTF als ein Abbildungsfilter für o-polarisiertes weißes Licht ist in der Fig. 3 dargestellt. Eine abzubildende Probe 110 liegt in einer Probenebene 112. Von der Probe 110 fluoreszierendes Licht wird in Eingangsoptiken 114 gegeben, die opolarisiertes kollimiertes Licht erzeugen, das durch Lichtstrahlen 116 wiedergegeben wird. Die Lichtstrahlen 116 werden in einen AOTF 118 gegeben, der e-polarisierte abgezogene Strahlen bei Wellenlängen λ erzeugt. Die gebeugten Strahlen bei Wellenlänge λ werden in Ausgangsoptiken 120 gegeben, die ein Bild 122 auf eine Bildebene 124 fokussieren.

In der in Fig. 3 dargestellten Konfiguration verursacht jeder Punkt auf der Probe 110 ein Bündel von multichromatischen parallelen Strahlen 116, die unter einem einzigen Winkel θi auf den Kristall 118 einfallen. Wie es durch die gestrichelten Linien in der Fig. 3 gezeigt ist, sollte der gebeugte Teil dieses Bündels idealerweise den Kristall 118 als ein Bündel aus monochromatischen parallelen Strahlen verlassen, die durch einen eindeutigen θd beschrieben sind. In diesem Fall wird jeder Punkt auf der Probenebene 112 auf einen einzigen Punkt auf der Bildebene 124 abgebildet. In der Praxis hat es sich jedoch herausgestellt, daß das gebeugte Strahlenbündel aus Strahlen besteht, die den Kristall 118 über einen Bereich von unterschiedlichen Ausgangswinkeln verlassen, wie es durch die punktgestrichelten Linien in der Fig. 3 gezeigt ist. Folglich wird jeder Probenebenenpunkt auf eine Verteilung von Bildebenenpunkten abgebildet, was selbst für einen Betrieb mit fester Frequenz zu einem unscharfen Bild führt.

Ein zweiter Bildverschlechterungseffekt, Bildverschiebung, tritt auf, wenn die Hochfrequenz F variiert wird. Die Phasenanpassungsgleichungen (2) diktieren, daß Änderungen von F zu Änderungen sowohl der Wellenlänge λ als auch des Beugungswinkels θd für feste θi und α führen. Dies führt zu einer Verschiebung der Bildposition für unterschiedliche Wellenlängen. Ein geeigneter Schnitt der Kristallaustrittsfläche kann jedoch dies nahezu vollständig beseitigen.

Da der an dem AOTF 118 angebrachte Wandler (in Fig. 3 nicht gezeigt) eine endliche Länge aufweist, kann das Schallfeld, das er erzeugt, als eine Überlagerung von ebenen Wellen unter zahlreichen Schallwinkeln α beschrieben werden. Für eine Beleuchtung mit weißem Licht bei einer vorgegebenen Betriebsfrequenz F und Richtung θi des einfallenden Strahls wird jeder derartige α eine Beugungsausgabe unter einem verschiedenen Winkel θi und einer verschiedenen Wellenlänge λ erzeugen. Die Ausbreitung des Schallwinkels, die aus der endlichen Wandlerlänge resultiert, ergibt demzufolge eine Beugungsausgabe, die selbst für eine feste Richtung des einfallenden Strahls einen Bereich von Winkels und Wellenlängen enthält, was zu einem gefilterten Bild führt, das unscharf ist. Eine AOTF-Bildunschärfe ist somit hauptsächlich einer akustischen Strahldivergenz in dem Kristall zuschreibbar.

Für eine vernachlässigbare Minderung des einfallenden Lichtes (eine Näherung, die für AOTF-Wirkungsgrade von bis zu ungefähr 70% gültig ist) kann die Beziehung zwischen dem Schallwinkelintensitätsspektrum und den Beugungsausgabeintensitätsspektren explizit für ebene Wellen anhand der AOTF-Wechselwirkungsgleichungen abgeleitet werden. Für feste F und θi erhalten wir:

(3) Iout(λ,θd) = c²xIinc(λ)xIa(α) · δ[kd(θd,λ) - ki(θi,λ) - ka(α,F)].

In dieser Gleichung ist Iout die Beugungsintensität; C eine Konstante, Iinc das Wellenlängenspektrum des einfallenden Lichts; Iα das Schallwinkelintensitätsspektrum, proportional zur Quadratamplitude der Fouriertransformierten des Wandlerproflis in der Richtung der Lichtausbreitung; und drückt die Delta-Funktion δ die Phasenanpassungsanforderung aus. Im Falle einer Beleuchtung mit weißem Licht (Iinc = konstant), zeigt diese Gleichung, daß die Beugungsintensität direkt proportional zum Schallwinkelspektrum ist:

(4) Iout ~ Iα(α).

Da sowohl λ als auch θd über die Phasenanpassungsgleichungen (2) Funktionen von α sind, kann Iout entweder vermittels Wellenlänge oder vermittels Ausgabewinkel ausgedrückt werden. Wenn vermittels Wellenlänge ausgedrückt, Iλout(λ), kann sie als das Bandpaßprofil des Filters identifiziert werden; wenn vermittels Winkel ausgedrück Iθdout(θk) kann sie als das Bildunschärfeprofil interpretiert werden. Diese Gleichung zeigt, daß beide durch die Fouriertransformierte der Wandlerstruktur bestimmt werden.

Die Wichtigkeit der Schallwinkelverteilung auf dem spektralen Bandpaß eines AOTF ist allgemein bekannt, aber ist nicht gründlich untersucht worden, da für den Großteil von Abbildungs-AOTFs, die mit einer räumlichen Auflösung von 10 um oder größer arbeiten, der Effekt der Schallwinkelverteilung auf die Bildqualität unerheblich ist. Für eine Bildauflösung von einigen Mikron oder weniger, falls erforderlich, in der Mikroskopie, wird jedoch dieser Effekt äußerst wesentlich. Der folgende Versuchsaufbau wurde zum Quantifizieren dieses Effekts gestaltet.

Versuchsaufbau

Fig. 4 ist eine schematische Darstellung eines Lichtmikroskops, das ein gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruiertes Abbildungssystem enthält, das zum Durchführen von Tests verwendet wurde. In der Fig. 4 tragen Komponenten, die dieselbe Funktion wie die oben in Verbindung mit der Fig. 1 identifizierten durchführen, dasselbe Bezugszeichen. In der Fig. 4 erzeugt die Bogenlampe 14 Licht, das durch einen Anregungsfilter 46 tritt, bevor es in den Dunkelfeldkondensor 30 gegeben wird. Licht von dem Dunkelfeldkondensor 30 wird zum Beleuchten einer Probe (nicht gezeigt) verwendet, die in der Probenebene 31 gehalten wird. Die Objektivlinse 36 spricht auf das von der Probe fluoreszierte Licht an. Das von der Objektivlinse 36 gesammelte Licht wird in den zweiten AOTF 38 gegeben, der sich unter der Kontrolle des Generators 17 für beliebige Signalformen und der AOTF-Workstation 18 befindet.

Die Lichtausgabe von dem AOTF 38 tritt durch Steueroptiken, z. B. Spiegel 48, 50 zu einer Tubuslinse 52 und einen Koppler 54 mit zweifacher Vergrößerung, bevor sie in die CCD- Kamera 40 gegeben wird. Die CCD-Kamera 40 befindet sich unter der Kontrolle des CCD- Steuerteils 42 und der Abbildungs-Workstation 44.

Der für den Filter 38 verwendete AOTF-Kristall besteht aus einem fünf Zentimeter langen TeO&sub2;-Kristall mit einer optischen Apertur von siebzehn Millimetern, geschnitten für einem optischen Einfallswinkel von zwölf Grad und einen akustischen Winkel von 5,95º. Der Austrittsseitenwinkel ist auf 16,35º geschnitten, um eine Bildverschiebung zu beseitigen. Der Wandler ist in sieben Scheiben, jede mit einer Breite vom 0,33 cm, geteilt. Der Wandler weist vier unabhängige Eingangsanschlüsse auf: drei Anschlüsse sind mit jeweils zwei Scheiben verbunden und einer ist mit einer einzigen Scheibe verbunden. Das hauptsächliche besondere Merkmal dieser Gestaltung besteht in der ungewöhnlichen Länge des Kristalls und seiner Auswirkung auf die Geräteleistung, wie es unten im Detail beschrieben wird.

Treiberelektroniken werden von einem Macintosh IIci-Computer 18 gesteuert und enthalten einen 400 MHz-Generator 17 für beliebige Signalformen (LeCroy Model LW 420) und einen Einkanal-Breitband-HF-Verstärker mit vier Ausgängen (Verstärker #2) mit einer maximalen Gesamtausgabe von vier Watt (NEOS Technologies). Es ist ein Betrieb von 50-110 MHz möglich, was gebeugten optischen Wellenlängen zwischen 450-800 nm entspricht.

Der AOTF 38 ist hinter der Objektivlinse 36 in einem Fluoreszenzmikroskop vom Forschungstyp (Zeiss Axioplan) installiert. Die Probenbeleuchtung wird unter Verwendung entweder einer Fünfundsiebzig-Watt-Xenon- oder einer Hundert-Watt-Quecksilberlampe (Zeiss) in Transmission durchgeführt. Für die Fluoreszenzmessungen wird auch ein Standard- Rhodamin-Anregungs-Interferenzfilter 46 (Omega, 540DF19) verwendet. Die Mikroskopoptiken enthalten einen Dunkelfeldkondensor 30 (Zeiss Teilenr. 445315; minimale NA = 1, 2, maximale NA = 1,4) und 40x- und 100x-Ölimmersionsobjektive 36 (Olympus Uapo 340(40x), 0,65 < NA < 0,35; und UPlanFl(100x), 0,6 < NA < 1,3). Es werden Dunkelfeldoptiken zum Kompensieren der unzulänglichen Hintergrundunterdrückung des vorliegenden AOTF-Kristalls 38 verwendet.

Bilder werden unter Verwendung einer CCD-Kamera 40 mit einem 1317 · 1035-Feld aus Pixeln mit 6,8 um im Quadrat (Princeton Instruments Model CCD 1317-K; Kodak KAF1400 CCD-Feld) aufgezeichnet, die mit dem Mikroskop mit einem Koppler 54 mit zweifacher Vergrößerung (Diagnostic Instruments Model HRP-200) gekoppelt ist. Die Bilder werden auf einem Macintosh 7100-Computer 44 gespeichert und verarbeitet.

Wellenlängenmessungen werden außerhalb des Mikroskops von Fig. 4 mit der in Fig. 5 gezeigten Vorrichtung durchgeführt. Der Fünfundsiebzig-Watt-Xenon-Lampe 14 schließt sich ein Raumfilter 56 mit einer dicht geschlossen Iris an seinem Fokus an, der nahezu parallele Strahlen aus weißem Licht am Eingang des AOTF 38 erzeugt. Der den AOTF-Kristall 38 verlassende gebeugte Strahl wird in einen optischen Mehrkanalanalysator bestehend aus einem 1/4-m-Monochromator 58 (Photon Technology International) und einem Silizium- Felddetektor 60 (EG&G Model 1420 mit EG&G-Steuerteil 62 Model I46I) unter der Kontrolle eines Computers 64 gelenkt.

Versuchsergebnissse

Die Beugungsintensitätsverteilung von einem AOTF, Iout (λ, θd), wird letztendlich von der Topologie seines Wandlers bestimmt. Zur experimentellen Vorfülung dieser Beziehung plazierten wir lichtundurchlässige Polystyren-Perlen (Molecular Probes, Inc.) mit einem Durchmesser von 0,121 um in der Probenebene 31 des in Fig. 4 gezeigten Aufbaus. Bei Anregung mit der Fünfundsiebzig-Watt-Xenonlampe erscheint jede Perle als eine Quasi- Punktquelle mit weißem Licht durch die für unendlich korrigierten Optiken des Mikroskops. Dies verursacht ein Bündel von nahezu parallelen Strahlen unter θi, die in den AOTF 38 eintreten. Für eine vorgegebene Betriebsfrequenz ist somit die resultierende AOTF-Ausgabe durch die Beugungsintensitätsverteilung Iout der Gleichung (4) gut beschrieben. Eine Änderung des Wandlerproflis durch Lösen eines oder eines weiteren Wandleranschlussses sollte demzufolge zu wesentlich anderen AOTF-Perlenbildern führen.

Durch den AOTF 38 mit einem 40x-Objektiv 36 aufgenommene Dunkelfeldbilder der einzelnen Perle mit einem Durchmesser von 0,121 um sind in den Fig. 6a-6c für jeweils eine, zwei und sechs Wandlerscheiben gezeigt, die jeweiligen Wandlerlängen von 0,33 um, 0,66 um und 1,98 um entsprechen. Die Bilder wurden mit dem AOTF 38 im Betrieb bei einer Frequenz von 74 MHz und einem Wirkungsgrad von näherungsweise 60% aufgenommen. Die Farbskala in den Fig. 6a-6c ist nicht linear. Der mittlere hellere Fleck in jeder Figur gibt das primäre AOTF-Bild der Perle wieder; je schmaler dieser Fleck ist, desto besser ist die AOTF-Auflösung. Die anhand der Gleichung (4) erwartete Zunahme der Auflösung mit längerer Wandlerlänge ist klar ersichtlich. Der mittlere Fleck in der Fig. 6c, der von sechs Wandlerscheiben erzeugt ist, entspricht einer Auflösung von 1 um. Die sekundären Flecken auf jeder Seite der Mitte ergeben sich anhand der Nebenmaxima in der Wandler- Fouriertransformierten. Diese sind in der Intensität relativ zum Haupt-Peak um eine bis zwei Größenordnungen verringert. Man beachte die Unterschiede in der Anzahl, Plazierung und relativen Intensität der Seitenband-Peaks für jede der zahlreichen Wandlerkonfigurationen der Fig. 6a, 6b und 6c.

Die Fig. 7a-7c quantifizieren die Daten der Fig. 6a-6c und vergleichen sie mit der Theorie. Die Fig. 7a zeigt die Abhängigkeit der Intensität von der Wellenlänge für die Fig. 6a-6c an, die unter Verwendung des in Fig. 5 gezeigten Aufbaus gemessen sind. Die Fig. 7c zeigt die Abhängigkeit der Intensität von dem AOTF-Ausgangswinkel (er ist proportional zur Entfernung von dem mittleren Fleck) für die Fig. 6a-6c an. Diese wurden erhalten, indem Intensitätsprofile von mit dem CCD 40 von Fig. 4 erhaltenen Bildern genommen wurden, und sind in Tat Messungen von Iθd out (θd). Gemäß Gleichung (4) sollten beide Datengruppen proportional zu den Schallwinkelprofilen Iα für jede gezeigte Wandlerkonfiguration sein.

Die Fig. 7b zeigt berechnete Ergebnisse, die durch Verwendung der Quadratamplitude der Fouriertransformierten jedes Wandlerproflis rechnerisch ermittelt wurden, wobei die Scheibentrennung von näherungsweise 0,5 mm berücksichtigt wurde. Die theoretischen Kurven für diese drei Konfigurationen weisen ausgeprägte Unterschiede in der Breite des mittleren Peaks und Seitenwandstruktur auf, die die Unterschiede zwischen deren Fouriertransformierten reflektieren. Diese Merkmale sind auch in den in den Fig. 7a und 7c gezeigten Versuchsdaten auffallend ersichtlich. In der Tat ist die detaillierte Übereinstimmung zwischen gemessenen und berechneten Ergebnissen eine bemerkenswerte Bestätigung der Gleichung (4). Die Fig. 7a-7c demonstrieren quantitativ den Effekt der Wandlerstruktur auf die spektralen und winkelmäßigen Ausgabeeigenschaften des akusto-optischen Abbildungsfilters 38.

Die gezeigten Beugungsintensitätsverteilungen ergeben zwei Typen von Bildverschlechterung. Die Breite des mittleren Peaks führt zu einer verringerten Bildauflösung und die Seitenwandstruktur führt zu einem verringerten Bildkontrast. Mit den durch die Fig. 7a und 7c gezeigten quantitativen Ergebnissen können jedoch diese Effekte nun unter Verwendung digitaler Bildverarbeitungstechniken kompensiert werden. Insbesondere geben die Kurven der Fig. 7c Intensitätsprofile von AOTF-Bildern einer Punktquelle mit weißem Licht wieder. Dies ist in der Tat die gemessene Punktbildfunktion (point spread function (psf)) von weißem Licht für den AOTF in dem Mikroskop. Man beachte, daß diese psf eindimensional ist, da eine AOTF-Unschärfe nur entlang einer Achse auftritt. Mit dieser psf ist es einfach, Computerbildverarbeitung zum Entfalten des Effekts der AOTF-Bildunschärfe aus den Rohbildern zu verwenden. Erwartungs-Maximierung ist für diese Aufgabe ideal geeignet. Siehe zum Beispiel L. A. Shepp und Y. Vardi, "Maximumlikelihood reconstruction for emission tomography", IEEE Trans. Med. Imag. 1, S. 113-121 (1982) und T. Holmes, "Maximumlikelihood image restoration adapted for noncoherent optical imaging", J. Opt. Soc. Am. A 7, S. 666-673 (1988).

Die Stärke dieser Lösung ist in den Fig. 8a und 8b zu sehen. Ein Standard-Luftwaffen- Auflösungsziel (angewandtes Bild) wird über den AOTF 38 unter Verwendung einer Hellfeldbeleuchtung mit weißem Licht mit verbundenen sechs Wandlerscheiben abgebildet. Die Figur zeigt Gruppe 8 dieses Ziels sowohl vor (Fig. 8a) als auch nach (Fig. 8b) der Verarbeitung an. Eine AOTF-Unschärfe ist in der horizontalen Richtung des Rohbildes von Fig. 8a klar ersichtlich. Die Verarbeitung beseitigt viel von der seitenbandbezogenen Unschärfe sowie kompensiert teilweise die Breite des mittleren Peaks der Beugungsintensitätsverteilung. Dies ergibt eine signifikante Kontrasterhöhung in dem entfalteten Bild sowie ein ausgeprägtes Schärfen der Ziellinien. Das feinste Muster an der Unterseite der Figur besteht aus 1,1 um-Linien und -abständen. Diese sind ohne Schwierigkeit aufgelöst.

Zum Auflösen von noch kleineren Strukturen und genaueren Bestimmen des Wirkungsgrades des Entfaltungsalgorithmus wurden Actin-Fasern in 3T3-Zellen ohne Zugabe von Serum über 24 Stunden, fixiert mit Formaldehyd, angefärbt mit Rhodamin-Phalloidin, und gehalten in Gelvatol untersucht. Die Beleuchtung wurde mit der 546 nm-Linie einer Einhundert-Watt- Quecksilberlampe bereitgestellt. In diesem Fall muß gemäß Gleichung (3) die oben verwendete Weißlicht-psf nun mit dem tatsächlichen Spektrum von auf den AOTF einfallendem Licht multipliziert werden, wo:

Iinc(λ) = ηIexc(λ) + Ifl(λ),

wobei Iexc das Spektrum des Anregungslichts, Ifl das Fluoreszenzspektrum der angefärbten Fasern und η eine Konstante ist, die die Relativgröße von gestreutem Anregungslicht zu Fluoreszenz am Eingang zum AOTF 38 anzeigt.

Die Fig. 9a und 10a zeigen Bilder dieser Actin-Fasern, die mit dem 40x-Objektiv 36 durch den AOTF 38 jeweils vor und nach Entfaltung aufgenommen wurden. Die Fig. 9b und 10b sind Intensitätsprofile, die entlang den weißen Linien aufgenommen worden sind die in der unteren rechten Ecke jeder jeweiligen Fig. 9a und 10a gezeigt sind. Die in dem Rohbild von Fig. 9a auflösbare minimale Detialgröße beträgt näherungsweise 1 um. Mit Entfaltung wird die Auflösung auf ungefähr 0,8 um erhöht und wird der Bildkontrast näherungsweise dreifach verbessert. Diese erhöhte Bildauflösung und dieser erhöhte Bildkontrast durch Verarbeitung kann in den Intensitätsprofilgraphiken der Fig. 9b und 10b klar gesehen werden.

Eine höhere AOTF-Auflösung kann unter Verwendung eines 100x-Objektivs erhalten werden, wie es in der Fig. 11a gezeigt ist. Hier ist die Winkeltrennung der Strahlenbündel, die von zwei Punkten in der Probenebene austreten, um einen Faktor 2,5 relativ zu dem 40x- Objektiv vergrößert. Folglich wird die durch den AOTF eingeführte Winkelunschärfe, die unabhängig von dem Objektiv ist, proportional weniger wesentlich. Das Rohbild (nicht gezeigt), das dem entfalteten Bild in Fig. 11a entspricht, weist nahezu dieselbe Auflösung wie das bearbeitete Bild auf, obwohl mit mehrfach geringerem Kontrast. Das in der Fig. 11a gezeigte Bild entspricht dem, das durch das weiße Rechteck in der unteren Ecke der Fig. 10a markiert ist. Die in der Fig. 11b gezeigt Intensitätsprofilgraphik ist entlang derselben Linie wie in den Fig. 9a und 10a genommen. In der 100x-Graphik der Fig. 11b sind Details aufgelöst, die fast kaum in der 40x-Graphik der Fig. 10b sichtbar sind. Diese entsprechen einer Auflösung in dem 100x-Bild von näherungsweise 0,35 um, was derjenigen eines herkömmlichen Lichtmikroskops unter Verwendung von mechanischen Filterrädern gleicht.

Schlußfolgerungen

Die drei größten Beschränkungen, die bisher eine umfassende Verwendung von AOTFs zur Abbildungsspektroskopie beschränkt haben, sind deren relativ geringe Schwächung außerhalb des Bandes, geringer Durchgang (teilweise aufgrund deren Polarisationstrennschärfe) und deren geringe Abbildungsqualität. Die vorliegende Erfindung liefert einen Hauptschritt im Überwinden besagter Beschränkungen. Mit der überlegenen Geschwindigkeit und spektralen Anpassungsfähigkeit des AOTF eröffnet die vorliegende Erfindung viele neue und aufregende Anwendungen für AOTFs bei der Abbildung mit hoher Auflösung.

Die vorliegende Erfindung ist in Verbindung mit deren bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden. Experimentelle Ergebnisse sind zu Darstellungszwecken und nicht als Einschränkung bereitgestellt worden. Viele Modifikationen und Variationen der beschriebenen Ausführungsformen der Vorrichtung und des Verfahrens werden Fachleuten auf dem Gebiet ersichtlich sein. Zum Beispiel stellt die Fig. 15 eine Modifikation des Anregungsbereiches 12 dar. In der Fig. 15 tritt das kollimierte Licht wie in Fig. 1 in den AOTF 16 ein. Jedoch wird das den AOTF 16 verlassende Licht in Raumfilter 76 gegeben. Den Raumfiltern 76 schließt sich ein zweiter Anregungs-AOTF 78 an. Die Raumfilter 76 blockieren im Betrieb das ungebeugte weiße Licht und geben die zwei Polarisationen der interessierenden Lichtfrequenz in den zweiten Anregungs-AOTF 78 in einer Weise, die entgegengesetzt zu derjenigen ist, in der sie aus dem AOTF 16 abgegeben werden. Das Ergebnis besteht darin, daß die zwei Polarisationen den zweiten Anregungs-AOTF 78 als ein kollimierter Strahl 78 verlassen. Da der kollimierte Strahl 80 bereits beide Polarisationen der interessierenden Lichtwellenlänge enthält, können die Optiken 24, 25, 26 und 27 von Fig. 1 durch einfachere Steueroptiken ersetzt werden.

Wie es vorangehend erwähnt worden ist, leiden AOTFs an einer geringen Hintergrundunterdrückung. Durch Verwendung eines zweiten AOTF kann zusätzliches Anregungslicht verloren werden, aber fällt die Hintergrundunterdrückung um einen Faktor zwischen 50 und 100 ab. Typische Parameter sowohl für den AOTF 16 als auch den AOTF 78 können, wie in der oben dargelegten Tabelle gezeigt, vorliegen.

Eine weitere Modifikation der vorliegenden Erfindung ist zuvor erwähnt worden und besteht in der Verwendung des Multilinienlasers als Lichtquelle 14. Die Fig. 16 stellt einen Bereich eines gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruierten Lichtmikroskops dar, worin die Lichtquelle ein Multilinienlaser 82 ist. Das Multilinienlaserlicht 82 wird in den AOTF 16 gegeben und die Ausgabe wird durch Steuerspiegel 84 und 86 zu einer Fokussierlinse 90 gelenkt. Da die Lichtquelle ein Multilinienlaser 82 ist, ist die Notwendigkeit beseitigt, die zwei Polarisationen zu kombinieren, so daß die Spiegel 84 und 86 nur eine Steuer- und keine Vereinigungsfunktion erfüllen. Zusätzlich können zwischen den Spiegeln 84 und 86 Lochblendenöffnungen vorgesehen sein, wie es zum Reduzieren von Hintergrundstrahlung bekannt ist. Von der Fokussierlinse 90 tritt das Licht durch sich drehendes mattiertes Glas 92, wie es auf dem Gebiet bekannt ist, um den Laserstrahl gleichförmig und inkohärent zu machen. Danach wird das Licht in die Mikroskopeingangsoptiken 94 gegeben.

Es sind auch Modifikationen am Abbildungsbereich des in Fig. 1 dargestellten Systems möglich. Eine mögliche Modifikation ist in der Fig. 17 dargestellt. In der Fig. 17 wird die Ausgabe des AOTF 38 durch ein Korrekturprisma 96 in die CCD-Kamera 40 geschickt. Wie erwähnt, wirkt ein AOTF wie ein Beugungsgitter, das gewisse Lichtfrequenzen mehr als andere ablenken läßt. Wie es bekannt ist, bewirken Prismen auch eine Dispersion von Licht, aber in einer zu derjenigen eines AOTF entgegengesetzten Richtung. Durch richtige Auswahl des Winkels und des Materials für das Korrekturprisma 96 kann die von dem AOTF 38 verursachte Ablenkung des Fluoreszenzsignals in großem Maße von dem Korrekturprisma 96 kompensiert werden, wodurch ein Bild mit einer stark verbesserten räumlichen Auflösung erzeugt wird, das dann in die CCD-Kamera 40 gegeben werden kann. Der Kristall 38 kann ein apodisierter Kristall sein.

In der Fig. 18 ist eine weitere alternative Ausführungsform für den Abbildungsbereich des in der Fig. 1 dargestellten Systems gezeigt. In der Fig. 18 wird vorausgesetzt, daß ein Anregungssystem vom in der Fig. 15 oder Fig. 16 dargestellten Typ bereitgestellt worden ist. Unter diesen Umständen kann eine Unterdrückung des Hintergrundes ausreichend hoch sein, so daß die Anregungsbeleuchtung von einem Hellfeldkondensor 98 auf die Probe 31 fokussiert werden kann.

Als eine Alternative zur Konfiguration der Fig. 18 kann die Kern-Beleuchtungsanordnung der Fig. 19 verwendet werden. Wie es bekannt ist, ist ein dichroitischer Strahlteiler 100 vorgesehen, so daß die Anregungsbeleuchtung von der Objektivlinse 36 geliefert und das Fluoreszenzsignal von der Objektivlinse 36 gesammelt wird.


Anspruch[de]

1. Ein System mit einem abstimmbaren akusto-optischen Filter (38) zum Empfangen von Licht an seiner Eingangsseite und Ausgeben von Licht an seiner Ausgangsseite; einem Steuerkreis (17) zum Abstimmen besagten Filters (38); und einer Objektivlinse (36) zum Sammeln von Fluoreszenz von einer Probenebene (31) zum Zuführen zu besagter Eingangsseite besagten akusto-optischen Filters (38); dadurch gekennzeichnet, daß es ein Prisma (96), das auf Lichtausgabe an besagter Ausgangsseite besagten Filters (38) anspricht, wobei besagtes Prisma (96) unter einem Winkel in Bezug auf besagten Filter (38) ausgerichtet ist, um eine durch besagten Filter (38) verursachte Dispersion besagten Ausgabelichts zu kompensieren; und eine Ausgabeeinrichtung (40) umfaßt, die zur Bildung eines zweidimensionalen Bildes auf besagtes Prisma (96) anspricht.

2. Das System von Anspruch 1, worin besagte Ausgabeeinrichtung eine Kamera (40) zum Empfangen der Lichtausgabe von besagtem Prisma (96) ist.

3. Das System von Anspruch 1 oder 2, zusätzlich umfassend einen dichroitischen Filter (100), der derart positioniert ist, daß besagte Objektivlinse (36) die Probenebene (31) beleuchtet und von der Probenebene (31) fluoresziertes Licht sammelt.

4. Das System von Anspruch 1 oder 2, zusätzlich umfassend einen Dunkelfeldkondensor (30), der zum Beleuchten der Probenebene (31) positioniert ist.

S. Das System von Anspruch 1 oder 2, zusätzlich umfassend einen Hellfeldkondensor (98), der zum Beleuchten der Probenebene (31) positioniert ist.

6. Das System nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin besagter Filter (38) einen Tellurdioxidkristall enthält.

7. Das System von Anspruch 6, worin besagter Tellurdioxidkristall einen Kristall mit einer Länge von näherungsweise fünf Zentimetern enthält.

8. Das System nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin besagter Steuerkreis (17) einen Steuerkreis zum schnellen Umschalten der Wellenlänge enthält, auf die besagter Filter (38) abgestimmt ist.

9. Das System nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin besagter Steuerkreis (17) einen Steuerkreis zum schnellen Ein- und Ausschalten besagten Filters (38) enthält. 10. Das System nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin besagtes System ein zweidimensionales Abbildungssystem enthält und worin besagte Objektivlinse ein zweidimensionales Bild von der gesammelten Fluoreszenz bildet.

11. Ein System mit einem Dunkelfeldkondensor, der zum Beleuchten einer Probenebene (31) positioniert ist; einer Objektlinse (36), die zum Sammeln von Fluoreszenz von der Probenebene (31) positioniert ist; einem abstimmbaren akusto-optischen Filter (38) zum Empfangen von Licht von besagter Objektivlinse (36) und einem Steuerkreis zum Abstimmen besagten Filters (38), wobei das System dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Prisma (96) umfaßt, das auf die Lichtausgabe von besagtem Filter (38) anspricht, wobei besagtes Prisma (96) unter einem Winkel in Bezug auf besagten Filter (38) ausgerichtet ist, um von besagtem abstimmbaren Filter (38) verursachte Dispersion von Ausgabelicht zu kompensieren.

12. Das System nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin besagter abstimmbarer Filter (38) einen apodisierten Kristall enthält.

13. Das System von Anspruch 11, zusätzlich umfassend eine Kamera (40) zum Empfangen der Lichtausgabe von besagtem Filter (38).

14. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 10 oder 13, zusätzlich umfassend ein mit der Kamera (40) verbundenes Steuerteil (42) zum Steuern der Kamera (40) und einen mit dem Steuerteil (42) verbundenen Prozessor (44) zum Verarbeiten der Bilder.

15. Das System von Anspruch 14, worin besagter Prozessor (44) einen Speicher zum Speichern des verarbeiteten Bildes enthält.







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